verificação da resistência à acidez e a tolerância à

VERIFICAÇÃO DA RESISTÊNCIA À ACIDEZ E A TOLERÂNCIA À BILE
POR CEPAS DE BACTÉRIAS LÁCTICAS ISOLADAS DE KEFIR
Tais Hobold Justo (PIBIC/UNICENTRO), Loyse Tussolini (IC-Voluntário/
UNICENTRO), Osmar Roberto Dalla Santa (Orientador), e-mail:
[email protected]
Universidade Estadual do Centro-Oeste/Setor de Ciências Exatas
Departamento de Engenharia de Alimentos/Guarapuava-PR
Palavras-chave: kefir, bactérias láticas, potencial probiótico.
Resumo:
Neste estudo foi avaliado o potencial probiótico de cepas de bactérias
lácticas isoladas de kefir e dos grãos de Kefir, através da resistência á
acidez e aos sais biliares. Um dos pré-requisitos para que um microrganismo
exerça ação probiótica é a sua capacidade de sobreviver após a ingestão do
alimento. Todas as cepas de bactérias lácticas avaliadas apresentaram
resistência à acidez e alta tolerância aos sais biliares. Desta forma, em
relação a essas características as cepas de bactérias lácticas isoladas de
kefir apresentam potencial probiótico.
Introdução
Kefir é uma bebida láctea, originada do Cáucaso, produzida a partir da
fermentação alcoólica e ácido-lática do leite por grãos de kefir (CZAMANSKI,
2004). Os grãos de kefir possuem uma complexa microbiota composta por
bactérias ácido-láticas e leveduras (NINANE, 2005). Esse produto é
considerado o iogurte do século XXI (BESHKOVA, 2002) e um alimento
naturalmente probiótico (OTLES; CANGIDI, 2003).
De acordo com Otles e Cangidi (2003) alimento probiótico é aquele
que contem microrganismos vivos, que quando ingeridos em quantidades
adequadas são capazes de trazer benefícios à saúde humana,
restabelecendo a flora intestinal.
A resistência à acidez e a tolerância aos sais biliares são duas
propriedades fundamentais para que os microrganismos sejam considerados
probióticos, permitindo que sobrevivam às condições ácidas do estômago e
a presença dos sais biliares no intestino delgado durante a passagem pelo
trato gastrintestinal (ERKKILÄ; PETÄJÄ, 2000).
Na literatura são encontrados vários trabalhos que investigam o
potencial probiótico de bactérias lácticas isoladas de diferentes produtos
alimentícios. Esses estudos visam selecionar estirpes com características
adequadas para ser utilizada como starter na produção de alimentos
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fermentados, e também exercer ação probiótica (DALLA SANTA, 2008;
PENNACCHIA, et al., 2004; PAPAMANOLI et al., 2003; MACEDO, 2005).
Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi testar a resistência á acidez
e a tolerância aos sais biliares, de cepas de bactérias lácticas isoladas de
kefir, para verificar uma possível característica probiótica.
Materiais e Métodos
Isolamento das cepas de bactérias lácticas
Foram isoladas cepas dos grãos de kefir e do leite fermentado (kefir): a)
Para o isolamento de cepas dos grãos de kefir foi adicionado em um tubo
com 10 mL de água salina peptonada 1 g de grãos de kefir intactos ou
amassados, agitado, diluído e semeado em placas com Ágar Man, Rogosa e
Sharpe (MRS) adicionado de azul de anilina. Desta forma foram isoladas
cepas da superfície e do interior dos grãos de kefir. b) Para o isolamento de
cepas do kefir foi adicionado em frascos com 90 mL de água salina
peptonada 10 mL de kefir fresco ou maturado, homogeneizado, diluído e
semeado em placas com ágar MRS adicionado de azul de anilina. As placas
foram incubadas por 48 h a 37ºC. As cepas isoladas foram armazenadas em
4ºC para a realização dos testes.
Teste de resistência à acidez
Para verificar a resistência à acidez, as 20 cepas das bactérias lácticas
isoladas foram reativadas por dois cultivos sucessivos em tubos com 5 mL
de caldo MRS, incubados por 12-14 h a 37ºC. Uma alíquota de 1 mL desta
suspensão (concentração superior a 9 log10 Unidades Formadoras de
Colônia - UFC) foi utilizada para inocular tubos com 9 mL de tampão fosfato
salina (PBS) com pH ajustado a 3,0 utilizando HCl 5 mol/L. A solução de
PBS foi preparada dissolvendo NaCl (9 g/L), Na2HPO4.2H2O (9 g/L) e
KH2PO4 (1,5 g/L) em água destilada (ERKKIÄ; PETÄJÄ, 2000). As
suspensões foram incubadas em estufa por 3 horas a 37ºC. Após este
período foram feitas diluições decimais em água peptonada 0,1% e a
população viável foi determinada pela contagem em placas com ágar MRS.
Teste de tolerância aos sais biliares
Para avaliar a tolerância à bile, as cepas das bactérias foram reativadas
conforme descrito no item acima. Após, 1 mL da última cultura
(concentração superior a 9 log10 UFC) foi utilizado para inocular tubos com 9
mL de caldo MRS adicionado de 0,3% de sais biliares. Os tubos foram
incubados por 4 h a 37ºC. Em seguida, foram feitas as diluições decimais
adequadas da cultura e a tolerância aos sais biliares foi verificada pela
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contagem em placas com ágar MRS depois da incubação em estufa por 48
h a 37ºC (PENNACCHIA, et al., 2004).
Resultados e Discussão
No gráfico da Figura 1 estão os resultados dos testes realizados para
verificar a resistência a acidez e a tolerância aos sais biliares das cepas de
bactérias lácticas isoladas dos grãos de kefir e do kefir.
10
8
Bili 0,3%
6
Acidez
[inóculo]
4
2
0
KI
7
KA 01
K 03
KAA02
G
KI 04
KA 7 0
G 3
KA 01
0
KI 1
KM 0 4
0
KI 2
KI 0 1
KI 7 02
7
KA 20
1
KI G02
72
K 0
KI I7 2 4
7 2 03
04
KI B
K 03
KAA04
G
KM03
01
Concentração em log (UFC/ml)
12
Cepas de Bactérias Láticas
Figura 1: Concentração inicial (inóculo) e viabilidade das cepas de bactérias lácticas após exposição à acidez e à
presença de sais biliares.
Pela análise dos resultados apresentados na figura 1, verificou-se que
as cepas de bactérias lácticas avaliadas não foram afetadas de forma
significativa pela presença de bile. Algumas cepas foram capazes de
crescer, aumentando a população final, o que indica que são resistentes a
concentração de 0,3% de sais biliares.
O efeito da acidez foi mais limitante que a presença de bile para o
desenvolvimento das cepas de bactérias lácticas avaliadas. Diferenças entre
as cepas podem ser observadas, algumas foram tolerantes ao pH 3,0,
permanecendo em número semelhante ao inicial, já outras diminuíram a
população. A cepa KAG03 foi a mais sensível para a acidez.
Desta forma, em relação às características avaliadas, as cepas de
bactérias lácticas isoladas dos grãos do kefir e do kefir apresentam potencial
probiótico, pois têm condições de sobreviver ou se multiplicar na presença
de 0,3% de sais biliares, concentração média de bile encontrada no trato
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gastrintestinal humano, bem como podem sobreviver ao pH 3,0, sendo este
o pH estomacal com alimento (PENNACCHIA, et al., 2004).
Conclusões
Com este estudo foi possível selecionar cepas de bactérias lácticas isoladas
de grãos de kefir e do kefir, com capacidade de sobreviver às condições
ácidas do estômago e aos sais biliares no intestino delgado, durante a
passagem pelo trato gastrintestinal, dessa maneira apresentam potencial
probiótico.
Agradecimentos
A UNICENTRO por possibilitar o desenvolvimento deste estudo e pela bolsa
PIBIC/UNICENTRO.
Referências
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