Trabalho nº 1 - Universidade Fernando Pessoa
Propaganda
UNIVERSIDADE FERNANDO PESSOA Faculdade de Ciências da Saúde TRABALHOS PRÁTICOS BIOQUÍMICA FISIOLÓGICA LICENCIATURAS EM: Análises Clínicas e Saúde Pública 2007/08 Índice Trabalho nº 1: Determinação do coeficiente de distribuição duma substância incolor 3 Trabalho nº 2: Condensação Aldólica: Preparação da Dibenzilidenoacetona. Purificação por Recristalização. ....................................................................................... 4 Trabalho nº. 3 – Doseamento de glucose em plasma humano ......................................... 6 Trabalho nº. 4 - Respiração mitocondrial ......................................................................... 9 Trabalho nº. 5 - Metabolismo de Aminoácidos: Determinação da actividade da transaminase glutâmico-pirúvica em músculo cardíaco ................................................. 12 Trabalho nº. 6 – Digestão de hidratos de carbono .......................................................... 15 Trabalho nº. 7 – Quantificação do colesterol total e do colesterol HDL ........................ 23 Trabalho nº. 8 – Análise de hormonas esteróides por TLC ............................................ 28 Trabalho nº 1: Determinação do coeficiente distribuição duma substância incolor de Material e Reagentes .2 provetas 50 ml .1 pipeta volumétrica 10 ml .1 funil de separação 250 ml e respectiva .garras e nozes rolha .100 ml de solução aquosa de ácido .2 matrazes 250ml adípico (HOOCCH2CH2CH2CH2COOH) .1 bureta 25 ml 0,01g/ml .1 argola para o funil de separação .100 ml solução de NaOH 0,02 mol dm-3 .1 suporte para a bureta .butanol .fenolftaleína Procedimento experimental Meça 30 ml da solução aquosa de ácido adípico para um funil de separação. Extraia com 30 ml de butanol. Determine a concentração da fase aquosa por titulação; para tal meça 10,00 ml da fase aquosa para um matraz de 250 ml e junte 30 ml de água e 4 gotas de fenolftaleína. Prepare uma bureta lavando-a com água destilada e depois com a solução de NaOH 0,02 mol dm-3. Encha a bureta com a solução básica e anote o valor inicial fazendo a leitura pela parte de baixo do menisco. Adicionar, gota a gota, a solução contida na bureta até que a solução do matraz apresente uma cor rosa ténue persistente. Anote o volume de NaOH. Repita o ensaio. Determine o coeficiente de distribuição do ácido adípico para o sistema butanol/água. Trabalho nº 2: Condensação Aldólica: Preparação da Dibenzilidenoacetona. Purificação por Recristalização. Objectivo As reacções de síntese em química orgânica são fundamentais e é muito importante ter uma noção de como se podem processar. O objectivo deste trabalho é fazer a síntese da dibenzilidenoacetona através duma condensação aldólica, reacção muito útil para gerar ligações carbono-carbono e também usada biologicamente para a construção de muitos complexos que ocorrem naturalmente. Ph-CHO + CH3-CO-CH3 HO- Ph-CH=CH-CO-CH3 + H2O Benzilidenoacetona HOPh-CHO + Ph-CH=CH-CO-CH3 Ph-CH=CH-CO-CH=CH-Ph + H2O Dibenzilidenoacetona Material e Reagentes .2 provetas 50 ml .100 ml solução de NaOH 10% .2 matrazes 250ml .benzaldeído .1 vidro de relógio .acetona .1 barra magnética .ácido acético glacial .1placa de aquecimento com agitação .etanol 95% .1 espátula .gelo triturado .1funil de Büchner .papel de filtro .garras e nozes Procedimento experimental Coloque 3,0 ml de benzaldeído, 1,0 ml de acetona e 25 ml de etanol 95% num matraz de 250 ml. Adicione 30 ml de NaOH 10%. Coloque a mistura sob agitação magnética durante cerca de 12-15 minutos. Inicialmente, a solução deverá ser límpida e transparente mas rapidamente adquire aspecto leitoso, com partículas amarelas de produto. Recolha o sólido amarelo por filtração sob vácuo, usando água fria para transferir completamente o sólido e, de seguida, lave o produto com o mesmo solvente. Retire o vácuo. Com uma espátula quebre a massa cristalina e, de seguida lave o sólido, sobre o papel de filtro, com uma solução gelada de 0,3 ml de ácido acético glacial em 5 ml de etanol 95%. Espere cerca de 1-2 minutos. Aplique de novo o vácuo para secar o sólido. Remova o vácuo. Com uma espátula quebre a massa cristalina e, de seguida lave o sólido, sobre o papel de filtro, com uma solução gelada de 0,3 ml de ácido acético glacial em 5 ml de etanol 95%. Espere cerca de 1-2 minutos. Lave o sólido com água fria. Aplique de novo o vácuo para secar o sólido. Recolha os cristais para um gobelet previamente tarado, seque-os na estufa, pese-os e calcule o rendimento. Trabalho nº. 3 – Doseamento de glucose em plasma humano Introdução A determinação da glicemia faz parte das análises laboratoriais mais importantes e mais frequentes. Os métodos enzimáticos para o doseamento da glucose têm sobre os outros métodos (processos de redução) a inestimável vantagem de serem simples e rigorosamente específicos da glucose. Os resultados das campanhas de despistagem precoce mostram que, em cada dois diabéticos, um não está ainda reconhecido. Mas, quanto mais cedo se estabelece o diagnóstico, tanto melhor é o prognóstico. Afecções tardias, principalmente macroe microangiopatias, podem ser evitadas ou, pelo menos, detidas pelo tratamento dietético e medicamentoso. A pesquisa de diabetes é especialmente importante em doentes com antecedentes familiares de diabetes, obesidade, lipémia, perturbações circulatórias coronária, periférica e cerebral, hipertensão, pielonefrite, durante a gravidez, em afecções crónicas cutâneas, prurido, furunculose, micose e neuropatias. As determinações da glicemia são indispensáveis tanto para o reconhecimento, como para o controle da terapêutica e da evolução de diabetes mellitus. Cerca de um terço dos diabéticos não apresentam temporariamente glicosúria, apesar de terem hiperglicemia significante. Ainda mais importante que a análise da glicemia em jejum, que na diabetes ligeira pode estar dentro dos limites normais, é a determinação da glicemia duas horas depois duma refeição rica em hidratos de carbono. Reconhece-se mais exactamente uma perturbação metabólica diabética com o “teste de sobrecarga de glucose” que permite verificar a presença não só da diabetes manifesta, como também da latente. Como método simples de pesquisa de diabetes, depois da realização do teste de sobrecarga de glucose pode determinar-se somente o importante valor da glicemia após 2 horas. Teste oral de tolerância à glucose. Sobrecarga de glucose com 50 g de glicose Em jejum Após 1 hora Após 2 horas < 100 mg/dl < 160 mg/dl < 120 mg/dl valores normais 100-130 mg/dl 160-220 mg/dl 120-150 mg/dl suspeito > 130 mg/dl > 220 mg/dl > 150 mg/dl diabético Tabela nº 1. Valores obtidos no teste oral de tolerância à glucose em jejum e 1 ou 2 horas após a ingestão de 50 g de glucose. No ser humano, as concentrações normais de glicemia oscilam nos seguintes valores: 70 - 110 mg/dl pela manhã e em jejum. Objectivo Neste trabalho prático será efectuada a determinação enzimática da concentração de glucose em duas amostras de plasma provenientes do mesmo indivíduo, colhidas em jejum e 60 min após a ingestão de 100 g de glucose. O aluno deverá saber interpretar o significado clínico e patológico dos resultados obtidos. Princípio O método utilizado é um método indirecto e enzimático em que a glucose é inicialmente oxidada a ácido glucónico e peróxido de hidrogénio numa reacção catalisada pela glucose oxidase: glucose + 2 H2O + O2 glucose oxidase ácido glucónico + H2O2 O peróxido de hidrogénio formado, na presença da peroxidase, reage com a 4aminoantipirina e o p-hidroxibenzenossulfonato para formar a quinoneimina, que possui um máximo de absorção ao comprimento de onda de 505 nm. A intensidade da cor produzida pela reacção é directamente proporcional à concentração de glucose na amostra: 2H2O2 + p-hidroxibenzenossulfonato + 4-aminoantipirina peroxidase quinoneimina + 4H2O Material . Espectrofotómetro UV/Vis . Células (acrílico, volume reduzido) . Pipetador . Micropipeta automática de 1000 l . Micropipeta automática de 20 l . Suporte para tubos eppendorf . Tubos eppendorf . Cronómetro Reagentes . 2 Amostras de plasma humano liofilizado e reconstituído, identificadas como: - J (amostra colhida em jejum); - 1H (amostra colhida ao fim de 1 hora após ingestão de 50 g de glucose); . Solução padrão de glucose (100 mg/dl) . Reagente para a determinação de glucose com a seguinte composição (pH=7,0 0,1): - 4-aminoantipirina 5 x 10-4 mol/l - p-hidroxibenzenossulfonato 2 x 10-2 mol/l - glucose oxidase 15 000 U/l - peroxidase 10 000 U/l Procedimento experimental 1. Ligar o espectrofotómetro e ajustar o comprimento de onda para 505 nm 2. Usar água destilada para estabelecer o zero de absorvância 3. Identificar uma série de tubos eppendorf com as seguintes designações: Branco; Padrão; J e 1H 4. Pipetar 1 mL da solução “reagente para a determinação de glucose” para cada um dos tubos 5. Pipetar 5 l de água desionisada para o tubo com a designação Branco e inverter para agitar 6. Aguardar 45 seg e pipetar 5 l de solução padrão de glucose para o tubo com a designação Padrão, agitar por inversão. 7. Respeitando um intervalo de 45 seg, pipetar também 5 l de cada uma das amostras de plasma para os respectivos tubos (J e 1H). Misturar por inversão suave dos tubos 8. Incubar à temperatura ambiente durante exactamente 16 min (contando o tempo a partir da última adição de plasma). 9. Ler as absorvâncias (a 505 nm) segundo a ordem de preparação dos tubos e respeitando um intervalo de 45 seg entre as amostras. Resultados Determine a concentração de glucose para cada amostra usando uma interpolação linear: - A cada medição, subtrair a absorvância do tubo “branco”, a fim de eliminar a contribuição da cor do reagente. - Calcular a concentração de glucose nas amostras, por proporcionalidade directa com o padrão. Diga se o plasma testado lhe parece pertencer a um indivíduo com um distúrbio metabólico. Trabalho nº. 4 - Respiração mitocondrial Introdução Este exercício serve para examinar várias reacções da respiração mitocondrial. A preparação foi feita a partir de bife de coração de vaca. Preparou-se uma solução de citoplasma, uma de mitocôndrias e uma que é a mistura das duas. A transferência de electrões é evidenciada pela redução (descoloração) do DCIP (2,6-dicloroindofenol) que, tal como o azul de metileno, é azul escuro na sua forma oxidada e passa a transparente na sua forma reduzida. Procedimento Experimental Parte I (Realizada pelo professor) – Preparação dos extratos celulares de coração de vaca 1. Separar 5,0-7,5 g de músculo e colocar num copo de vidro; 2. Adicionar 50 mL de fosfato de potássio, 0.1 M a pH=7.4 e liquefazer usando uma varinha mágica; 3. Transferir a mistura para tubos Falcon de 50 mL; 4. Centrifugar esta solução espessa a 6000 rpm durante 10 minutos; 5. O sedimento forma uma fase compacta e rosada na parte inferior do tubo e uma fase superior menos compacta e cinzenta (que contém as mitocôndrias) com um fluído sobrenadante vermelho claro (citosol); 6. Remover o sobrenadante cuidadosamente; distribuir por dois tubos. Um dos tubos deve ser guardado congelado para o trabalho prático das reacções de transaminação. 7. Adicionar suavemente 20 mL de tampão fosfato à fase cinzenta contendo as mitocôndrias. Ressuspender suavemente as mitocôndrias (tendo cuidado para não ressuspender os detritos celulares) e retirar para novo tubo; 8. Centrifugar o tubo das mitocôndrias e o tubo do citosol a 6000 rpm durante 10 minutos; 9. Depois da centrifugação, o citosol (citoplasma) é transferido para novo tubo, tentando evitar qualquer contaminação com material insolúvel presente no primeiro - esta solução será chamada CITOPLASMA; 10. Retirar o sobrenadante do tubo das mitocôndrias e descartar; 11. Ressuspender as mitocôndrias em 15 mL de tampão fosfato – esta solução será chamada MITOCÔNDRIAS. 12. Se não forem usadas imediatamente, as soluções de citoplasma e mitocôndrias devem ser guardadas no congelador, devidamente identificadas. Nota: Normalmente, um eppendorf de cada uma destas soluções é suficiente para cada grupo. 13. Retirar 5mL da solução de mitocôndrias e 5 mL da solução de citoplasma e misturar num novo tubo - esta solução será chamada EXTRATO DE CORAÇÃO DE VACA. Parte II – Que substratos são oxidados pelo extracto de coração de vaca? A oxidação é indicada pela redução (descoloração) do DCIP (solução stock: 0.5mM ou 0.145mg/mL). O tampão é 0.1M fosfato de potássio, pH=7.4. Protocolo experimental: 1. Preparar 5 tubos de reacção; 2. Colocar 4 gotas de tampão e 2 gotas de DCIP em cada tubo: I. Controlo sem substrato: 12 gotas de água; II. Citrato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de citrato de sódio; III. -cetoglutarato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de -cetoglutarato (sal de sódio); IV. Succinato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de succinato de sódio; V. NADH: 10 gotas de água, 2 gotas de 10mM de NADH (7.09 mg/mL). 3. 4. 5. 6. As reacções são iniciadas pela adição de 2 gotas de extracto de coração de vaca; Misturar bem; Deixar os tubos à temperatura ambiente durante 10 minutos; Avaliar a mudança de cor nos vários tubos. Parte III – Identificação das fracções celulares activas que promovem as reacções de oxidação Protocolo experimental: 1. Preparar 3 tubos com a seguinte composição: 4 gotas de tampão 2 gotas de DCIP em cada tubo 10 gotas de água 2 gotas de 0.1M de succinato de sódio; 2. Preparar 3 tubos com a seguinte composição: 4 gotas de tampão 2 gotas de DCIP em cada tubo 10 gotas de água 2 gotas de 10 mM de NADH; 3. Para cada grupo de 3 tubos adicionar: 2 gotas de extracto de coração de vaca no primeiro tubo; 2 gotas de solução de citoplasma no segundo tudo; 2 gotas de solução de mitocôndrias no terceiro tubo. 4. Avaliar a mudança de cor nos vários tubos. Questões de trabalho : 1. Que substratos são usados pelo extracto de coração? 2. Em que compartimento(s) celular(es) decorrem as actividades oxidantes que foram observadas? 3. Que outros reagentes serão necessários para se ver oxidação do citrato e do cetoglutarato? 4. Indicar num diagrama da cadeia de transporte de electrões, onde é que o DCIP está a aceitar electrões e qual é o complexo inibido pelo malonato. Trabalho nº. 5 - Metabolismo de Aminoácidos: Determinação da actividade da transaminase glutâmico-pirúvica em músculo cardíaco Introdução Numa reacção de transaminação, o grupo -amino de um aminoácido é transferido para um -cetoácido, produzindo-se os respectivos -cetoácido e -aminoácido correspondentes. R1.CHNH3+.COO+ R2.CO.COO- R1.CO.COO+ R2.CHNH3+.COO- Muitas reacções de transaminação ocorrem nos tecidos, catalisadas por transaminases específicas para um determinado par aminoácido/cetoácido. As reacções são reversíveis, sendo o equilíbrio da reacção deslocado de acordo com os reagentes em excesso. As duas transaminases mais importantes, em termos de actividade quantitativa são: 1 - Transaminase glutâmico-oxaloacética (GOT), também designada por aspartato: -cetoglutarato transaminase, que catalisa a reacção: L-Aspartato + -cetoglutarato Oxaloacetato + L-glutamato 2 - Transaminase glutâmico-pirúvica (GPT), também designada por alanina:cetoglutarato transaminase, que catalisa a reacção: L-Alanina + -cetoglutarato Piruvato + L-glutamato Estas transaminases utilizam como grupo prostético o piridoxal-fosfato. A actividade das transaminases em tecido pode ser investigada, incubando um homogeneizado com o respectivo par aminoácido-cetoácido. A transaminação ocorrida pode ser observada por cromatografia pela formação do novo aminoácido. A reversibilidade da reacção pode ser demonstrada, utilizando o par aminoácido-cetoácido complementar, como reagentes iniciais. Procedimento Experimental Reagentes Piruvato de sódio 0,1M L-glutamato 0,1M Leucina 0,1M α-cetoglutarato 0.1 M D-glutamato 0,1 M Tampão fosfato pH 7,4 Etanol Padrões: L-alanina e L-glutamato Placas de T.L.C. (sílica gel) Solução de naftoquinona Solvente: propanol:NH4OH a 33% (70:30) Material Banho Material de vidro: tubos de centrífuga e pipetas Pipeta automática Método A - Incubação do extracto com vários substratos 1 - Preparar 8 tubos de centrífuga: A, B, C, D, E, F, G e H. 2 - Pipetar os seguintes reagentes: Piruvato Na (mL) L-Glutamato (mL) L-Leucina (mL) D-Glutamato (mL) L-Alanina (mL) -Cetoglutarato (mL) Fosfato 0,05M (mL) A 0,5 0,5 B 0,5 C 0,5 D 0,5 E F G 0,5 0,5 0,5 H 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 3 - Adicionar 0,5 mL de extracto de coração (preparado no trabalho da Respiração Mitocondrial) a cada tubo. 4 - Incubar a 37ºC, durante 30 minutos. 5 - Parar a reacção com a adição de 1,5 mL de etanol. 6 - Esperar um pouco e centrifugar os tubos. 7 - Testar os sobrenadantes por T.L.C. C - T.L.C. 1 - Aplicar 5 l das amostras a testar e ao mesmo tempo padrões de L-alanina e Lglutamato de acordo com o esquema: º Ala º A º B º C º Glu º D º E º F º Ala º G º H º Glu 2 - Desenvolver a placa durante pelo menos de 40 min. Secar a placa. 3 - Pulverizar com a solução de naftoquinona e colocar na estufa 3 a 5 minutos. Resultados 1 - Faça um esquema das placas de cromatografia. 2 - Que conclusões pode tirar no que respeita à especificidade da enzima e reversibilidade da reacção? 3 - Indique se o extracto utilizado continha quantidades detectáveis de aminoácidos ou cetoácidos. Trabalho nº. 6 – Digestão de hidratos de carbono Introdução A nutrição é definida como um conjunto de fenómenos físico-químicos e fisiológicos que ocorrem no interior do organismo e mediante os quais este recebe e utiliza os materiais fornecidos pelos alimentos, que lhe são necessários para a formação e manutenção da sua matéria viva e para a realização das actividades, próprias quer da vida vegetativa, quer da vida de relação e trabalho. No conceito anglo-saxónico, nutrição é o estudo dos nutrientes contidos nos alimentos, desde que são ingeridos até que os produtos finais do seu metabolismo são excretados. Assim, inclui os processos de digestão e absorção, as reacções catabólicas e anabólicas e o estudo das necessidades de nutrição para todos os segmentos do organismo da pessoa saudável. O conjunto de acções sofridas pelos alimentos no tubo digestivo, desde a boca, que levam ao “desdobramento” dos hidratos de carbono, das gorduras e das proteínas em partículas suficientemente pequenas para passarem a parede intestinal e entrarem na circulação, corresponde à digestão. Os sistemas complexos de que dispõem o aparelho digestivo do homem para separar os alimentos nos seus nutrientes que vão ser, posteriormente, absorvidos, assentam num processo básico, que consiste na actualização de enzimas desagregadoras das grandes moléculas dos constituintes alimentares, sendo os hidratos de carbono convertidos em glicose e outros açucares simples (6 átomos de carbono), as gorduras em ácidos gordos e glicerol e as proteínas em aminoácidos. As enzimas estão contidas nos sucos digestivos da boca, estômago e intestino e são produzidas por glândulas específicas, controladas pelos sistemas nervoso e endócrino. As bactérias da parte terminal do intestino podem desempenhar algum papel na digestão de certos alimentos, em especial dos constituintes do tipo da celulose, ou fibra, que, resistindo às enzimas digestivas, podem sofrer modificações por acção das celulases bacterianas. Normalmente, mais de 90% dos hidratos de carbono, das gorduras e das proteínas que formam os alimentos são completamente digeridos e absorvidos, mas os ácidos gordos e os aminoácidos essenciais são absorvidos em mais de 98%. Em fisiologia, a absorção é a penetração de uma substância através das mucosas ou da pele ou da membrana celular para o meio interno do organismo ou para o protoplasma celular. Em nutrição, a absorção corresponde à passagem através da mucosa do tubo digestivo dos nutrientes que fazem parte da constituição dos alimentos e atingem a corrente sanguínea. A absorção faz- -se, principalmente, ao nível do intestino delgado e do cólon, de forma selectiva para cada um dos nutrientes. Os processos fisiológicos da absorção são para certos nutrientes através de mecanismos simples, por osmose, mas na generalidade envolvem reacções complexas de passagem para o interior das células da mucosa e, posteriormente, do meio interno destas para os capilares sanguíneos ou linfáticos. Nestas reacções, muito delas ainda mal conhecidas, intervêm iões e moléculas ionizadas, enzimas e hormonas. Introdução A maior parte dos alimentos é ingerida sob formas que o organismo não pode utilizar directamente, por serem sólidos ou não serem absorvidos no tubo digestivo. Desta forma, os alimentos precisam de sofrer a mastigação para se produzir a ruptura de parte das suas estruturas e, posteriormente, serem decompostos em moléculas suficientemente pequenas para passarem a mucosa da parede intestinal e atingirem a corrente sanguínea. A desintegração dos alimentos ingeridos em formas assimiláveis é facilitada pelas operações prévias de cozedura, e constitui o processo inicial de digestão. Na boca, os alimentos vão libertando os seus hidratos de carbono simples e complexos, que começam a ser desintegrados pelos processos de trituração e da digestão enzimática, em resultado dos movimentos de mastigação, pela acção múltipla da saliva, que actua pela sua qualidade de líquido humidificante e lubrificante e veículo da enzima amilase e de elementos minerais. A saliva é produzida por três pares de glândulas salivares e é formada por cerca de 99,5% de água, pelo que favorece a dissolução de moléculas que a mastigação vai libertando dos alimentos sólidos, e inicia o ataque, pela amilase, dos polissacarídeos que são sensíveis à sua acção. A amilase actua sobre o amido e o glicogénio, em presença de cloro, que é indispensável, desdobrando-os em dextrinas e maltose, de que é corrente apercebermos o sabor adocicado. Mas este efeito não tem significado relevante em digestão porque é de curta duração, e cessa quando o bolo entra em contacto com o suco gástrico estomacal. Este é praticamente inactivo no desdobramento dos polissacarídeos. No intestino, o conteúdo do estômago (quimo) chegado intermitentemente, de consistência cremácea, vai sofrer desde o duodeno, e após se tornar alcalino, a acção de enzimas pancreáticas (amilase pancreática de efeito semelhante ao da amilase salivar) e intestinais segregadas pelas glândulas de Brunner do duodeno e de Lieberkuhn (dissacaridases: sacarase, lactase, maltase e isomaltase). Sabe-se que existem várias dissacaridases, dentro das designações genéricas indicadas, sendo quatro particularmente importantes: - maltase Ia: hidrolisa 50% da maltose e toda a isomaltose. - maltase Ib (invertase ou sacarase): hidrolisa a totalidade da sacarose e 25% da maltose. Possui uma rápida actividade. - Maltases II e III: dissociam os restantes 25% de maltose. No intestino grosso há acção variável da flora intestinal, actuando pelas enzimas hidrolases sobre alguns polissacarídeos não decompostos na parte superior do intestino, como a hemicelulose e, em menor extensão, a celulose, que além de fermentações gasosas, podem produzir alguma glicose. Princípio A função aldeídica ou cetónica é susceptível de ser oxidada; as aldoses e cetoses vão, portanto, comportar-se como redutores e, em particular, vão poder reduzir os sais metálicos, em solução alcalina, até ao estado de metal ou até ao grau de oxidação inferior. Um dos reagentes mais utilizados para detectar a presença de açucares redutores e para os dosear consiste num sal cúprico (Cu2+). O processo de oxidação das oses ocorre com a redução do hidróxido cúprico, em meio alcalino, de cor azul e solúvel, em hidróxido cuproso, amarelo e insolúvel. Pelo aquecimento à fervura, este desidrata-se e converte-se em óxido cuproso, dando origem a um precipitado vermelho-tijolo: açúcar reduzido + 2 Cu(OH)2 2 CuOH açúcar oxidado + CuOH + H2O Cu2O + H2O Esta reacção ocorre com todas as moléculas de aldoses e cetoses que têm, senão um grupo aldeídico ou cetónico livre, pelo menos pseudoaldeídico ou pseudocetónico susceptível de fornecer um grupo livre à medida que o estado de equilíbrio da solução se desloca em função da própria reacção. A maltose, um di-holósido redutor (a função hemiacetálica de uma das oses está envolvida numa ligação osídica com um hidroxilo alcoólico da segunda ose), é um produto intermediário da hidrolise - ácida ou enzimática - de poli-holósidos, tais como o amido e o glicogénio. É formada pela união de duas moléculas de Dglucose através de uma ligação -1,4-glicosídica. Figura 1. Estrutura química da maltose. O amido é a forma de reserva glucídica nos vegetais. Encontra-se em geral na forma de grãos de amido cuja morfologia só varia de acordo com a espécie vegetal. Na maior parte dos casos é formado por dois constituintes: - a amilose, um poli-holósido de cadeias lineares, formada de unidades de Dglucose ligadas entre si por ligações -1,4-glicosídicas. Adimite--se hoje, graças ao estudo dos espectros de raios-X, que a cadeia está disposta em hélice com 6 anéis glucopiranósicos, de configuração em cadeira, em cada volta. Esta estrutura explica a cor azul obtida com o iodo: as moléculas de halogéneo dispor-se-ão ao longo do eixo da hélice sob a forma de um complexo iodo-amilose devido a forças dipolares electrostáticas. Esta propriedade desaparece pela fragmentação da molécula de amilose, na hidrólise. Figura 2. Estrutura química da amilose. - a amilopectina, um polissacarídeo cuja massa molecular pode atingir muitos milhões e é formado de cadeias principais idênticas às da amilose, mas sobre as quais vêm ligar-se, através de ligações -1,6-glicosídicas, as cadeias laterias que apresentam estrutura idêntica à das cadeias principais e cujo comprimento varia de 20 a 25 resíduos de glucose. Material . Estufa a 37ºC (incubação das amostras) . Placa de aquecimento com banho-maria (100 ºC) . Tubos de ensaio em vidro (10 mL) . Suporte e molas para tubos de ensaio . Pipetas volumétricas (3 mL, 4 mL, 5 mL) . Pipetas Pasteur . Vórtex . Pipetador . Cronómetro Soluções - (já preparadas) . Solução de amido: dissolver 1 g de amido em 100 mL de H2O destilada com aquecimento. . Lugol: dissolver 1 g de iodo e 2 g de iodeto de potássio em 300 mL de água. . Reagente de Benedict: Dissolver 5 g de carbonato de calcio; 8,5 g de citrato de sódio e 0,85 g de sulfato de cobre em 500 mL de H2O. . Solução de -amilase (tipo VI-B) diluída de forma a ficar 300 unidades/mL (equivalente à saliva). Experiência 1 Identificação de amilopectina) amido (homopolissacárido de glucose; amilose T1 0.1 mL de amido diluído 3 mL de H2O 1 gota de lugol ----------------------------------------------Observar a cor ----------------------------------------------Incubar a 37ºC até mudança de cor Incubar a 100ºC até mudança de cor ----------------------------------------------Observar a cor ----------------------------------------------Arrefecer em H2O fria Observar a cor Numa tabela registe as diversas cores obtidas e explique o seu significado. Experiência 2 Identificação de açúcares redutores Açúcar redutor + 2 Cu(OH)2 (aldose/cetose) 2 CuOH açúcar oxidado + CuOH + H2O Cu2O + H2O temperatura T1 1 mL glucose 0.25 % (m:v) 3 mL de Benedict agitar e ferver 5’ Observar a cor Qual a cor final ? Que conclusão retira quanto à glucose ? e Experiência 3 Hidrólise ácida de sacarose (dissacárido não-redutor de glucose + frutose) T1 T2 T3 3 mL sacarose 0.25 % 3 mL sacarose 0.25 % 3 mL sacarose 0.25 % 0.1 mL HCl conc. 0.1 mL HCl conc. 0.1 mL H2Od ferver 2’ não ferver não ferver ---------------------------------------------------------------------------------------------------------Arrefecer o tubo Adicionar 3 mL de Benedict Agitar e ferver 5’ Observar a cor Qual a cor final ? Que conclusões retira ? Que conclui acerca da estrutura da sacarose ? Experiência 4 1. Identificar 4 tubos de ensaio (A1; A2; A3 e A4). 2. Adicionar a um deles (A1) 2,0 mL de H2O destilada. 3. Colocar nos restantes 2,0 mL de solução de - amilase. 4. Ferver em banho de água o tubo A4 durante 3 min e deixar arrefecer. 5. Adicionar (na hotte) 3 gotas de HCl concentrado ao tubo A3 e agitar. 6. Adicionar a cada um dos 4 tubos 2,0 mL de solução de amido e agitar no vórtex. 7. Incubar na estufa a 37 C durante 20 min. 8. Identificar mais 4 tubos de ensaio como B1; B2; B3 e B4. 9. Transferir metade do volume existente no tubo A1 (ou seja 2 mL), para o tubo B1. Repetir o procedimento para os outros tubos. 10. Ao conjunto dos tubos A adicionar 3 gotas de solução de Lugol e observar o resultado. 11. À serie de tubos B adicionar 2,0 mL de reagente de Benedict e colocar em banho de água a ferver durante 2 min. Retirar os tubos do banho e observar. Questões várias: Identifique, explicando, os tubos que não reúnem as condições experimentais necessárias para uma eficaz actuação da amilase. Que conclusões se podem tirar quando o teste de Benedict e o teste do Iodo são ambos positivos? Estes resultados seriam alterados se o tempo de incubação fosse prolongado? Explique, recorrendo aos resultados obtidos, como é que a actividade da amilase é influenciada pelo pH e pela temperatura. Esquematização da experiência 4 A1 A2 A3 A4 2 mL H2Od 2 mL -amilase 2 mL -amilase 2 mL -amilase adicionar 3 gotas de HCl conc., agitar 2 mL amido dil. 2 mL amido dil. 2 mL amido dil. ferver 3’ e arrefecer 2 mL amido dil. Incubar a 37ºC durante 20’ -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- A1 B1 (2 mL) + 3 gotas de lugol (2 mL) + 2 mL Benedict ferver 5’ Observar a cor e concluir (Repetir o procedimento para os outros tubos) Trabalho nº. 7 – Quantificação do colesterol total e do colesterol HDL Introdução Como componente de células e tecidos o substracto para a síntese de numerosos compostos, o colesterol desempenha um papel importante no nosso metabolismo. Para realizar essas tarefas, o organismo humano dispõe de colesterol quer exógeno (absorvido com os alimentos), quer endógeno (sintetizado pelo próprio organismo). Figura 1. Estrutura química do colesterol. Hábitos alimentares diferentes fazem variar muito a quantidade de colesterol fornecido pelos alimentos. Uma alimentação exclusivamente vegetariana não fornece colesterol, enquanto que os produtos alimentares de origem animal fornecem cerca de 1 g de colesterol por dia. A síntese endógena do colesterol tem lugar principal no fígado, a partir de acetilCoA que se forma no organismo por degradação dos hidratos de carbono, proteínas e, principalmente, gorduras. Além disso, são local de síntese a mucosa do intestino delgado e outros tecidos e órgãos (com excepção do cérebro do adulto). É possível que entre a absorção fisiológica normal através dos alimentos e a biossíntese endógena hepática exista um mecanismo de regulação específico que procure estabelecer o equilíbrio do nível de concentração de colesterol no soro. Um vegetariano pode ter uma concentração sérica de colesterol que não se distingue da concentração apresentada por outro indivíduo saudável que faça uma alimentação mista. Naquele caso, a síntese endógena é reforçada para se atingir o valor normal. Num indivíduo que absorve grande quantidade de gorduras, principalmente animais, a síntese endógena fica inibida, mas só para além dos valores normais da concentração do colesterol no soro. A diminuição da absorção de colesterol diminui a colesterolémia; o tratamento medicamentoso reforça esta medida. Parte do colesterol endógeno é lançado na corrente sanguínea através da linfa, parte é transformado em ácidos biliares e hormonas esteróides e, parte é integrada na membrana celular e no tecido nervoso. O colesterol exógeno é emulsionado por sais biliares no intestino, ficando igualmente ao dispor das vias de síntese atrás referidas. O colesterol absorvido por biossíntese e o colesterol absorvido com os alimentos constituem o pool de colesterol que, no adulto, é aproximadamente 130 a 150 g. Esta quantidade de colesterol distribui-se do seguinte modo: i) cérebro: 30 g; ii) músculos esqueléticos: 30 g; iii) pele: 15 g; iv) sange: 10 g; v) fígado: 5 g; vi) glândulas supra-renais: 0,5 g; vii) restantes tecidos: 40 a 60 g. A parte de colesterol que o organismo utiliza como produto de síntese é excretada por três vias, de acordo com o metabolismo: pelas fezes, sob a forma de sais biliares e de esteróides pela urina, como catabolito de hormonas pela pele, evidentemente em quantidade insignificante São as lipoproteínas que fazem o transporte do colesterol no sangue. Existem várias lipoproteínas (Lps) que podem ser representadas pela estrutura geral demonstrada na Figura 4. fosfolípido Figura 2. Lipoproteína plasmática. proteína colesterol O colesterol é o maior componente das lipoproteínas de baixa densidade (designada por fracção LDL) e das lipoproteínas de muito baixa densidade (fracção VLDL) e um componente menor da fracção HDL (lipoproteínas de alta densidade). A designação de colesterol total inclui todas as formas de colesterol encontradas nas lipoproteínas. Há evidências científicas de que valores elevados de colesterol no sangue, nomeadamente da fracção LDL, associados a outros factores de risco como sejam a hipertensão e a condição de fumador, contribuem para o aparecimento da aterosclerose. Por outro lado, a concentração da fracção HDL no sangue está inversamente relacionada com o risco de doenças cardiovasculares. Todas as Lps são formadas por uma fracção protéica (apoproteina ou apolipoproteina) e uma fracção lipídica (colesterol livre e esterificado, triglicerídeos e fosfolípidos), em proporções diferentes, segundo o tipo de Lp: -lipoproteínas ou HDl pré--lipoproteínas ou VLDL -lipoproteínas or LDL quilomicras Do colesterol que aparece no sangue, 70% encontra-se sob a forma esterificada. Depois da decomposição enzimática do éster, o colesterol esterificado e o colesterol livre no soro são doseados sob a forma de colesterol total. A sua concentração depende da idade, sexo e hábitos de vida do indivíduo. É problemática a fixação de valores normais de colesterol. As chamadas determinações do valor normal, que se baseiam em análise duma amostra populacional clinicamente saudável, não excluem que nesta amostra figurem indivíduos cujas doenças ateroscleróticas não sejam ainda detectáveis e cujo nível lipídico é, portanto, erradamente considerado normal. Os valores normais indicados não devem ser interpretados como limites decisivos de opção terapêutica, sendo sempre necessário considerar o quadro global dos factores de risco. Deve considerar-se valor limite de risco elevado de enfarte do miocárdio uma concentração de 220 mg de colesterol/100 mL de soro. Este valor foi obtido do estudo de Framingham, cujo dispendioso método de doseamento fornece valores concordantes com os do teste colorimétrico enzimático. O “Adult Treatment Panel of National Cholesterol Education Program U.S.A.” considera: valores desejáveis da concentração de CT: < 200 mg/dl limites aceitáveis entre 200 - 239 mg/dl valores elevados: 240 mg/dl valores desejáveis da concentração de LDLc: < 130 mg/dl limites aceitáveis entre 130 - 159 mg/dl valores de risco elevado: 160 mg/dl valores desejáveis da concentração de HDLc: H: > 45 mg/dl ; M: > 65 mg/dl valores de risco moderado: H: 35 - 45; M: 45 - 65 mg/dl valores de risco elevado: H: < 35 mg/dl ; M: < 45 mg/dl CT: Colesterol Total; H: Homens; M: Mulheres. Verificou-se que pelo menos 10% da população apresenta hiperlipoproteinémia que, na maioria dos casos, não provoca perturbações, mas pode produzir graves alterações patológicas das paredes dos vasos, especialmente, das coronárias, cujas consequências são insuficiência circulatória e lesão de órgãos de importância vital. Estudos epidemiológicos revelaram, igualmente, que a hipercolesterolémia, favorecida por hipertensão e tabagismo, também é responsável pelas coronariopatias. Angina do peito, insuficiência coronária, enfarte do miocárdio, morte súbita manifestam-se tanto mais frequentemente num período de 10 anos, quanto mais elevada for a concentração sérica de colesterol. Em caso de hipercolesterolémia, a dieta deve ser rica em ácidos gordos insaturados, como o ácido linoléico, e pobre em colesterol. Quando a dieta não baixa suficientemente a concentração, administram-se medicamentos hipolipemizantes. Objectivo A determinação quantitativa dos níveis de colesterol total e da fracção HDL são de grande importância no diagnóstico e avaliação de doenças cardiovasculares, da aterosclerose, servindo, igualmente, como um indicador das funções hepática e biliar, da absorção intestinal, do funcionamento tiroidéio e das glândulas adrenais. Diversos factores como o stress, a idade, a hereditariedade, o (des)equilíbrio hormonal e a gravidez são susceptíveis de afectar os níveis normais de colesterol num indivíduo. Neste trabalho utilizar-se-á um kit de diagnóstico, no qual a quantificação do colesterol em cada uma das fracções é determinada após hidrólise enzimática e oxidação. A determinação da fracção HDL necessita a prévia separação das fracções VLDL e LDL. Esta separação pode ser efectuada por ultracentrifugação ou por precipitação selectiva, sendo o sobrenadante posteriormente analisado. No presente método, são utilizadas soluções de ácido fosfotúngstico e de cloreto de magnésio como agentes precipitantes das fracções VLDL e LDL, permanecendo a fracção HDL em suspensão. O doseamento do colesterol HDL é efectuado a partir deste sobrenadante, recorrendo-se ao mesmo método enzimático indirecto que foi utilizado para o doseamento do colesterol total. Princípio Os ésteres de colesterol são inicialmente hidrolisados a colesterol e a ácidos gordos livres por acção da colesterol esterase. O colesterol produzido nesta reacção é seguidamente oxidado a 4-colesteno-3-ona e peróxido de hidrogénio numa reacção catalisada pela colesterol oxidase: ésteres de colesterol + H2O colesterol + O2 colesterol esterase colesterol oxidase colesterol + ácidos gordos 4-colesteno-3-ona + H2O2 O peróxido de hidrogénio de hidrogénio formado, na presença da peroxidase, reage com a 4-aminoantipirina e o ácido hidroxibenzóico para formar a quinoneimina, um corante que atinge um máximo de absorção ao comprimento de onda de 505 nm. A intensidade da cor produzida pela reacção é directamente proporcional à concentração de colesterol na amostra: peroxidase 2H2O2 + p-hidroxibenzenossulfonato + 4-aminoantipirina 4H2O quinoneimina + Material . Espectrofotómetro UV/Vis . Células (acrílico, volume reduzido) . Estufa ou incubadora com temperatura constante a 37 ºC . Vórtex . Pipetador . Pipeta volumétrica (1 mL) . Micropipeta automática (20 l) . Suporte para tubos eppendorf . Tubos eppendorf . Cronómetro Reagentes - (já preparados) . 1 Amostra de plasma humano liofilizado e reconstituído . Solução padrão de colesterol total (200 mg/dl) . Solução padrão de colesterol HDL (50 mg/dl) . Solução de ácido fosfotúngstico (30,3x10-3 mol/l) e de cloreto de magnésio (0,1 mol/l) . Reagente para a determinação do colesterol com a seguinte composição (pH 6,6): - 4-aminoantipirina 2,5 x 10-4 mol/l -ácido hidroxibenzóico 1,0 x 10-2 mol/l - colesterol oxidase 100 U/l - colesterol esterase 1 250 U/l - peroxidase 800 U/l Procedimento experimental a) Preparação da amostra de colesterol HDL (realizado pelo professor): 1. Pipetar 125 l de amostra de plasma para um tubo eppendorf 2. Adicionar 25 l de solução de solução de ácido fosfotúngstico/cloreto de magnésio 3. Centrifugar a 3 000 rpm durante 10 min b) Determinação de colesterol total e HDL: 1. Ligar o espectrofotómetro e ajustar o comprimento de onda para 505 nm 2. Usar água destilada para estabelecer o zero de absorvância 3. Identificar uma série de tubos eppendorf com as seguintes designações: Branco; Padrão total; Amostra total; Amostra HDL; Padrão HDL 4. Pipetar 1 mL da solução “reagente para a determinação do colesterol” para cada um dos tubos 5. Pipetar 10 l de água desionizada para o tubo com a designação Branco e inverter para agitar 6. Aguardar 45 seg e pipetar 10 l de solução padrão de colesterol total para o tubo com a designação Padrão total, agitar por inversão 7. Respeitando um intervalo de 45 seg, pipetar também 10 l da amostra de plasma para o respectivo tubo. Misturar por inversão suave dos tubos; 6. Aguardar 45 seg e pipetar 10 l de solução padrão de colesterol HDL para o tubo com a designação Padrão HDL, agitar por inversão 7. Respeitando um intervalo de 45 seg, pipetar também 10 l da amostra de HDL para o tubo Amostra HDL. Misturar por inversão suave dos tubos; 8. Incubar à temperatura de 37ºC durante exactamente 5 min 9. Ler as absorvâncias respeitando também um intervalo de 45 seg entre amostras 10. Garantir que todas as absorvâncias são lidas durante os 45 min após a incubação Resultados Determine a concentração de colesterol total e colesterol HDL para a amostra usando interpolações lineares convenientes, com explicado no trabalho 1. Diga se algum dos plasmas testados lhe parece pertencer a um indivíduo com um distúrbio metabólico. Trabalho nº. 8 – Análise de hormonas esteróides por TLC Introdução O sistema endócrino, com a sua grande quantidade de hormonas, afecta todos os tecidos do corpo humano. Em resposta a um sinal apropriado, um mensageiro químico é libertado e transferido para um tecido alvo, cuja actividade é subsequentemente modificada. Em associação com o sistema nervoso autónomo, algumas hormonas mantêm a homeostasia; outras, por exemplo, permitem a gestão do stress. As características sexuais, o tamanho e as formas do corpo humano são determinas pelas hormonas esteróides. Estruturalmente, as hormonas esteróides são derivados esteróides dos triterpenos, possuindo um núcleo ciclopentanoperidrofenantreno, como está representado na Figura 5.. Este grupo é de natureza alicíclica constituído por três anéis hexagonais com composição fenantrénica, designados por A, C D B e C, e por um pentagonal, o anel D. Com base na estrutura e na actividade biológica, as A B hormonas esteróides podem ser agrupadas em 4 categorias Figura 5. Núcleo esteróide. funcionais: androgénios, estrogénios, progestogénios e corticosteróides. Os androgénios são responsáveis pelo desenvolvimento dos caractéres sexuais secundários masculinos, sendo o androgénio mais importante a testosterona, que é segregada principalmente pelos testículos e, secundariamente, pelo córtex das supra-adrenais. Os estrogénios promovem o aparecimento dos caractéres sexuais secundários femininos, sendo a principal hormona o –estradiol. Os estrogénios são segregados, pelos ovários, ciclicamente, em que níveis elevados destas hormonas alternam com níveis mais reduzidos. O nível máximo de estrogénios atinge-se na ovulação. Os corticosteróides são hormonas do córtex supra-adrenal e podem subdividir-se em duas classes funcionais: os glucocorticóides e os mineralocorticóides, sendo segregados por duas regiões distintas do córtex. Os mineralocorticóides (como por exemplo a aldosterona e a desoxicorticosterona) são produzidos pela zona glomerulosa e estão envolvidos na regulação dos iões sódio e, consequentemente, potássio. Níveis elevados destes corticosteróides estão associados à hipertensão, alterações de níveis de sódio e potássio, cirrose ou problemas de coração ou de rins. Os glucocorticóides são segregados pelas zonas fasciculada e reticulada do córtex supra-adrenal e intervêm no metabolismo dos hidratos de carbono, proteínas e gorduras. Os glucocorticóides mais potentes são a corticosterona, a cortisona e a hidrocortisona (ou cortisol). Valores elevados de glucocorticóides no sangue estão associados com a gravidez, hiperplasia adrenal e stress devido a doença, intervenção cirúrgica ou queimadura. Objectivo Este trabalho compreende a separação, pela cromatografia em camada fina (TLC Thin Liquid Chromatography), de hormonas derivadas do colesterol, designadamente, da testosterona (androgénio), –estradiol (estrogénio) e do hidrocortisona (glucocorticóide) presentes nas amostras fornecidas aos alunos. Pretende-se, igualmente, proceder à identificação dos compostos analisados, calcular os respectivos valores de Rf e, finalmente, determinar a solubilidade relativa das hormonas ensaiadas. Material . Placas para TLC (de sílica gel com indicador de fluorescência F-254) . Câmara cromatográfica . Lâmpada de luz UV ( = 254 nm) . Capilares . Óculos de protecção com filtro UV . Provetas de vidro . Régua, lápis Reagentes - (já preparados) . Soluções padrão das hormonas esteróides (1,0 mg/mL) nomeadamente: testosterona, hidrocortisona, -estradiol . Amostras para análise contendo hormonas esteróides; . Solvente de desenvolvimento: 160 mL de tolueno/acetato de etilo/acetona (6:1:1) Procedimento experimental 1. Sem danificar a placa de TLC, e sem lhe tocar com as mãos, marcar com um lápis a linha de origem a 1,5 cm de uma das extremidades 2. Aplicar 10 µL de amostra na placa sem ferir o adsorvente: encostar a ponta à placa mantendo-a quase na vertical e deixar sair o conteúdo. 3. Repetir este procedimento para as restantes soluções padrão e também para as amostras, respeitando os locais previamente marcados. Devido à sua difícil detecção, o padrão de estradiol deve ser aplicado novamente (mais 10 µL) exactamente no mesmo local da aplicação anterior, após a evaporação da primeira gota de solvente. 4. Deixe secar e coloque a placa, cuidadosamente, na câmara cromatográfica 5. Esperar pelo menos 30 min para desenvolver o cromatograma pelo solvente ascendente 6. Remover a placa e marcar a frente do solvente. Deixe secar na “”hotte” durante aproximadamente 10 min. 7. Colocar a placa já seca sob a lâmpada de luz UV para observar os pontos de aplicação. 8. Delimitar com um lápis as manchas observadas. Analisar o cromatograma e com uma régua medir as distâncias de cada mancha à origem. Resultados Calcular os valores dos factores de retenção, Rf, para os padrões e para cada amostra usando a seguinte expressão: Rf D mancha D solvente onde, Dmancha - distância desde a origem até à mancha em cm Dsolvente - distância desde a origem até à frente do solvente em cm Com base nos valores calculados indique qual é a solubilidade relativa dos esteróides analisados.
