PEPTIDIOS BIOATIVOS E CONSTRUCAO DE

PEPTÍDEOS BIOATIVOS E CONSTRUÇÃO DE FILMES NANOESTRUTURADOS COM
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
Jessyca Christina Fortes Ramos (bolsista do PIBIC/CNPq),José Roberto de Sousa Almeida Leite
(Orientador, Núcleo de Pesquisa em Biodiversidade e Biotecnologia, BIOTEC - UFPI)
INTRODUÇÃO
Desde de sua descoberta a nanotecnologia vem revolucionando o mundo da ciência, trazendo
muita expectativa para a melhoria da qualidade de vida e na preservação do meio ambiente. As várias
alternativas para a construção de materiais a nível nanométrico tem sido a partir da fabricação de filmes
automontados, através da técnica de deposição
LbL (do inglês, Layer-by-Layer), baseando-se em
interações eletrostáticas de camadas de materiais que possuem cargas elétricas opostas, visando à
adsorção alternada entre as espécies catiônicas e aniônicas sobre substratos sólidos (PATERNO et
al.,2001). Dentre os agentes formadores de filmes encontram-se as Dermaseptinas 01 (DS 01) que são
biomoléculas encontradas nas secreções cutâneas de anfíbio do gênero Phyllomedusa cuja estrutura
primária varia entre 28 e 32 aminoácidos. A DS 01 encontra-se inclusa na classe dos peptídeos
antimicrobiano, apresentando atividade contra uma gama de microrganismos, como bactérias gramnegativas e gram-positivas, fungos e protozoários em concentração micromolar (BRAND et al., 2006).
Este trabalho teve como objetivo a fabricação de nanocompósitos contendo peptídeo antimicrobiano
(DS 01), para a realização de ensaios antimicrobianos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Síntese e purificação do peptídeo
A purificação da DS 01 foi feita no laboratório do Núcleo de Pesquisa em Biodiversidade e
Biotecnologia (BIOTEC) da Universidade Federal do Piauí do Campus Parnaíba. Inicialmente o peptídeo foi
diluído em água ultrapura (sistema MilliQ) e injetado manualmente no Cromatógrafo Liquído de Alta
Eficiência, HPLC (Shimadzu prominence, AUTO SAMPLER SIL-10AF, CTO-20A, LC-6AD, CBM-20A, SPD20A), fase reversa. As amostras foram fracionadas em uma coluna Kinetex C18 100A.Ax e equilibradas com
água a 0,1% de TFA. A eluição ocorreu utilizando um gradiente Linear de ACN (5% a 65%) com o fluxo e de
20 mL por minuto.
Avaliação da atividade antibacteriana do peptídeo DS 01
Para avaliar as propriedades antibacterianas da solução do peptídeo DS 01 foram utilizadas duas
bactérias: Staphylococcus aureus ATCC 29213 (Gram- positiva) e Escherichia coli ATCC 25922 (Gramnegativa). Previamente ao teste, os micro-organismos foram inoculados em ágar Mueller-Hinton a 37°C por
24 horas em condições aeróbicas. Logo após, uma suspensão bacteriana com uma densidade óptica
correspondente à escala de McFarland de 0.5 foi feita em solução de cloreto de sódio a 0.9%, sendo
utilizada como inóculo no experimento descritos a seguir.
A determinação da concentração inibitória mínima foi realizada utilizando-se o método de
microdiluição em placa de 96 poços conforme CLSI (2003), na qual o agente passou por uma diluição
seriada de razão 2 resultando em concentrações que variaram de 160 a 10 μg/ml em caldo Mueller-Hinton.
O inoculo bacteriano dos poços tinha um valor de 5x105 UFC/ml. Como controles foram utilizados poços
sem inoculo, poços sem o peptídeo e com o inoculo, e poços com antibióticos padrões para ambas as
bactérias com concentrações que variaram de 16 a 0,5 μg/ml. A CIM foi definida como a menor
concentração do agente que inibiu o crescimento visível do micro-organismo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Cromatograma Referente a purificação do peptídeo DS01
O cromatograma obtido com o fluxo escolhido apresentou pico simétrico, com tempo de retenção
23.525 característico do peptídeo DS 01, como demonstrado na figura 1. Durante o estudo, o volume de
injeção foi fixado em 20 µL. Os parâmetros cromatográficos utilizados encontram-se no tabela 1.
Figura 1. Cromatograma referente a purificação do peptídeo sintético DS 01 em sistema HPLC em fase
reversa, em coluna analítica.
Tabela 1. Parâmetros cromatográficos utilizados para a purificação do peptídeo DS 01
Parâmetro
Condição
Detecção
216nm a 280nm
Fluxo
3,0mL/min
Coluna
Vydac
Temperatura
25°C
Volume da injeção
20µL
Tempo de corrida
50 min
Atividade antibacteriana
A DS 01 promoveu uma CIM de 80 μg/ml para o S. aureus e 20 μg/ml para E. coli. Sabe-se que as
dermaseptinas parecem atuar sobre a parede celular bacteriana. O mais potente efeito sobre a E. coli pode
ser justificado por esta bactéria que é Gram-negativa possuir uma parede celular mais delgada (pobre em
peptidoglicano) que a da Gram-positiva (Tabela 2).
Tabela 2. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) das bactérias S. aureus e E. coli.
Bactéria
CIM (DS 01)
CIM (antibiótico)
S. aureus
80 µg/ml
<0.5 µg/ml (Oxacilina)
E. coli
20 µg/ml
<0.5 µg/ml (Meropenem)
CONCLUSÃO
A purificação do peptídeo foi obtida com êxito, no qual o cromatograma mostrou um tempo de
retenção de 23.525 minutos característico do peptídeo DS 01.
A DS 01 promoveu uma CIM de 80 μg/ml para o S. aureus e 20 μg/ml para E. coli. Sabendo-se que
esse peptídeo parece atuar sobre a parede celular bacteriana, de acordo com LEITE et al., 2007. O mais
potente efeito sobre a E. coli pode ser justificado por esta bactéria que é Gram- negativa que a da S. aureus
(gram-positiva).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BRAND, G.D.; KRAUSE, F.C.; SILVA, L.P.; LEITE, J.R.S.A.; MELO, J.A.T.; PRATES. M.V.; PESQUERO,
J.B.; SANTOS, E.L.; NAKAIE, C.R.; COSTA-NETO, C.M.; BLOCH JR., C. Bradykinin-related peptides from
Phyllomedusa Hypochondrialis. Peptides. v. 27, p. 2137-46, set. 2006.
LEITE, J.R.S.A.; BRAND, G.D.; SILVA, L.P.; KÜCKELHAUS, S.A.S.; BENTO, W.R.C.; ARAUJO,A.L.T.;
MARTINS, G.R.; LAZZARI, A.M.; BLOCH, C. Dermaseptins from Phyllomedusa oreades and Phyllomedusa
distincta: Secondary structure, antimicrobial activity, and mammalian cell toxicity. Comparative
Biochemistry and Physiology. Part A ,mar. 2007.
PATERNO, L.G.; MATTOSO, L.H.C.; OLIVEIRA Jr., O.N. Filmes poliméricos ultrafinos produzidos pela
técnica de automontagem: preparação,propriedades e aplicações. Quim. Nova, Vol. 24, n. 2, 228235, mar./apr. 2001.
APOIO: BioTec, UFPI e CNPq.
Palavras-chave: Filmes LbL, DS 01, Ensaios antibacteriano.