aula prática 8 Quantificação do ácido lático em
Propaganda
II Curso de Monitoramento Teórico e Prático da Fermentação Etanólica Quantificação do ácido lático em fermentação etanólica M.Sc. Ricardo Ventura [email protected] © 2008 Maiores produtores mundiais de etanol* Brasil EUA Produção 2006 17,5 bilhões litros 18,3 bilhões litros Monitoramento da fermentação Contagem bactérias; pH; acidez total Quantificação de Metabólitos Equipamento utilizado Microscópio ótico; pHmetro HPLC * Aproximadamente 70% Glicólise (S. cerevisiae; BAL) Glicólise Destino do piruvato - BAL Lactato oxidase Relação estimada entre número de bactérias na fermentação etanólica e respectivas perdas equivalente em álcool Bactérias (UFC/mL) Perda de álcool1 (% v/v) Perda de álcool2 (litros) 105 0,1 – 0,2 303.000 106 0,2 – 0,4 848.000 107 0,6 – 1,0 2.120.000 108 0,9 – 1,2 2.544.000 109 1,0 – 1,5 3.180.000 1 Depende da linhagem da bactéria lática. 2 Perda máxima calculada com base em uma produção de 151.000 m3/ano. Bases teóricas para quantificação de ácido lático em fermentação etanólica ¾ Crescimento da população de microrganismos X quantidade de produtos metabólicos (Pelczar, 1996) ¾ Predominância de BAL na fermentação etanólica (MacKenzie & Kenny, 1965; Rosales, 1989; Gallo, 1992; Skinner e Leathers, 2004) ¾ A produção de ácido lático segue a mesma tendência da contaminação bacteriana na fermentação alcoólica (Alves, 1994) ¾ Ácido lático (principal produto do metabolismo das bactéria contaminantes) é um indicador bastante preciso do grau de contaminação (Amorim, 1996) ¾ O nível de ácido lático aumenta com a contaminação da fermentação etanólica (Skinner & Leathers, 2004) Principais rotas metabólicas nas BAL Homofermentação 2 Ácido lático Glucose Heterofermentação Ácido lático + etanol + CO2 Ácido lático • Ácido 2-hidroxipropanóico: CH3CH(OH)COOH; p.f. 18°C; p.e. 122 °C • Produzido por bactérias e tecidos de vertebrados em anaerobiose • Principal produto das BAL (Lehninger et al.,2000) • Primeiro ácido orgânico produzido industrialmente por processo fermentativo (EUA, 1880) • Produto de valor comercial e inúmeras aplicações • Inibidor da fermentação etanólica Transporte do ácido lático em S. cerevisiae CH3CH(OH)COOH Ácido lático (pKa = 3,86) 95,8% não dissociado CH3CH(OH)COO – + H+ 92,7% dissociado Meio externo pH 2,5 Citoplasma pH 5,4 ATP H+ Representação de célula de levedura, adaptado de Narendranath et al. (1997) Pontos de amostragem Fermentação etanólica com recirculação de levedura Como medir o ácido lático? ¾Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ¾Titulometria (indireto) ¾Colorimetria ¾Spectrofotometria ¾Reagentes enzimáticos ¾Biosensor enzimático /Amperométrico ¾Biosensor enzimático / Fotométrico Tecnologia enzimática – fotométrica Princípio de funcionamento 1) Lactato + medf1 piruvato + mediador red Lox 2) Med.red + fosfomolibdato medf2 azul de molibdênio + Interpretação dos resultados Contagem microscópica Teor ácido (bast./mL) lático Condição da fermentação < 5x105 Excelente < 300 5x105 – 5x106 301 – 500 Bom 6x106 – 5x107 600 – 1200 Regular 6x107 – 9x107 1300 – 1900 Preocupante >1x108 ≥ 2000 Muito Ruim Fatores que interferem na dosagem de ácido lático • Temperatura da amostra • Temperatura do ambiente • Turbidez / cor da amostra (para sistemas colorimétricos) • Período de fabricação dos reagentes • Condições de guarda dos reagentes • Quantidade de amostra inserida no equipamento • Formação de bolhas na câmara de amostra
