EFEITO DOS COMPOSTOS ORAGANOCALCOGÊNEOS (PhSe)2 E

EFEITO DOS COMPOSTOS ORAGANOCALCOGÊNEOS (PhSe)2 E (p-Cl-PhSe)2
SOBRE A VIABILIDADE DO BIOFILME FORMADO POR Candida albicans
Marília Toledo Braga, Isabela Bueno Rosseti, Maricilia Silva Costa
Universidade do Vale do Paraíba /Laboratório de Bioquímica aplicada a Engenharia Biomédica
(IP&D), Av Shishima Hifumi, 2911 – Urbanova – São José dos Campos – SP, [email protected]
Resumo – Os fungos do gênero Candida são capazes de produzir infecções superficiais ou
sistêmicas em indivíduos com baixa resposta imunológica. Estes fungos promovem infecções a partir
da sua capacidade de formar biofilmes. Os biofilmes formados por C. albicans são mais resistentes
aos tratamentos antifúngicos convencionais. Portanto o objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar
o potencial antifúngico dos compostos organocalcogêneos (PhSe)2 e (p-Cl-PhSe)2 sobre os biofilmes
de C. albicans. Suspensões de C. albicans foram incubadas para a formação do biofilme e estes
foram tratados com os compostos organocalcogêneos por 24 horas. Os resultados obtidos
demonstraram o potencial antifúngico de ambos compostos sobre o biofilme formado por C. albicans,
inibindo a viabilidade do biofilme e reduzindo a quantidade de células planctônicas. Esses compostos
apresentaram uma resposta terapêutica promissora, uma vez que as opções para tratamento de
infecções fúngicas é limitado.
Palavras-chave: Candida albicans, Compostos Organocalcogêneos, biofilme
Área do Conhecimento: Ciências da Saúde
Introdução
As espécies de Candida são fungos oportunistas, que vivem comensalmente na microbiota
humana, porém podem causar infecções graves em indivíduos imunossuprimidos (MCNEIL et al.,
2001). A C. albicans é a espécie responsável pelo maior número casos de morbidade e mortalidade
em indivíduos hospitalizados infectados por fungos, pois podem causar infecções tanto superficiais
como sistêmicas (BOONYASIRI et al., 2013; BASSETTI et al., 2011; MORGAN et al., 2005). Os
fatores de virulência desse fungo estão associados à imunidade dos pacientes e à sua capacidade
em formar biofilmes, um complexo de células planctônicas, pseudo-hifas e hifas envoltas por uma
matriz extracelular (MUKHERJEE et al., 2005). Esses biofilmes apresentam três fases de
desenvolvimento, a inicial que se caracteriza pela adesão das células no período de 0 à 11 horas de
contato com a superfície biótica ou abiótica; a fase intermediária caracterizada pela secreção da
matriz extracelular e proliferação das células e ocorre no período de 12 à 30 horas após o contato; e
a fase de maturação que ocorre no período de 31 à 72 horas, quando as células já estão envoltas em
uma matriz completamente formada (SHAPIRO et al, 2011; WHITEWAY, M., BACHEWICH, C.,
2007). Os biofilmes demonstram resistência às terapias antifúngicas convencionais, uma vez que a
matriz extracelular impossibilita a difusão completa dos fármacos (DAVIES, 2003).
O desenvolvimento de novas terapias é necessário devido à resistência que os fungos têm
demonstrado ao uso intensivo de fármacos convencionais. Além disso, os antifúngicos promovem
efeitos colaterais às células animais, pois ambas são eucariontes (TRABULSI et al., 2008). Os
compostos organocalcogêneos estão sendo estudados como novos fármacos antifúngicos. Esses são
formados por elementos da família dos calcogêneos da tabela periódica e têm demonstrado efeitos
antioxidante e antimicrobianos promissores (MACHADO et al., 2009; MULLER et al., 1984).
Dois compostos desenvolvidos a partir do elemento Selênio, (PhSe)2 e (p-Cl-PhSe)2,
demonstraram atividade antimicrobiana, inibindo o crescimento e a formação de tubos germinativos
de C. albicans (ROSSETI et al, 2011; BILLACK et al., 2009; NOGUEIRA et al., 2004; ROSSETI et al.,
2015).
Este trabalho teve como objetivo estudar o efeito dos compostos organocalcogêneos (PhSe)2 e (pCl-PhSe)2 sobre a viabilidade e a morfologia do biofilme de Candida albicans em diferentes fases de
desenvolvimento.
XX Encontro Latino Americano de Iniciação Científica, XVI Encontro Latino Americano de Pós-Graduação e VI
Encontro de Iniciação à Docência – Universidade do Vale do Paraíba.
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Metodologia
As culturas de C. albicans (ATCC 10-231) foram semeadas em ágar Sabouraud dextrose (Merck)
e incubadas em ar atmosférico (37°C). Após 48 horas de incubação uma amostra das células foi
ressuspendida em solução fisiológica estéril (0,85% NaCl) em diferentes densidades (105, 106 e 107
células/ml) determinadas por câmara de Neubauer.
As suspensões de célula em densidade de 105, 106 e 107 células/ml foram incubadas com RPMI
(Roswell Park Memorial Institute), em placas de microtitulação de 96 wells à 37°C durante 6 ou 24
horas.
Após 6 ou 24 horas de incubação para a formação do biofilme os poços foram lavados três vezes
com PBS (Phosphate Buffered Saline) e incubados por mais 24 horas na presença de (PhSe)2 ou (pCl-PhSe)2 nas concentrações finais de 2, 5, 10, 20µM com RPMI.
As soluções de organocalcogêneos foram preparadas utilizando DMSO como solvente. A
concentração de DMSO foi mantida em 1% (v/v) em todos os experimentos, inclusive nos
experimentos controle. Nesta concentração, DMSO não foi capaz de inibir o crescimento de C.
albicans.
Após a incubação com (PhSe)2 ou (p-Cl-PhSe)2, o biofilme foi lavado três vezes com PBS e
mantidos com 200µl de PBS para a análise morfológica do biofilme. Logo depois foi acrescentado
20µl de XTT (2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H- Tetrazolium-5-Carboxanilide) na razão
9:1 (9 partes de XTT 1mg/ml e 1 parte de Menadione 0,4mM). O meio de reação foi incubado por
aproximadamente 2 horas a 37°C. Então foi determinada a absorbância em 490nm utilizando um
leitor de placa Synergy HT Multi-Detection (Bio-Tek, Winooski, VT).
Resultados
Os resultados deste estudo foram obtidos para avaliar o efeito dos compostos (PhSe)2 e (pCl-PhSe)2 sobre os biofilmes formados por C. albicans durante o período de 6 e 24 horas.
Analisando a Figura 1, pode-se observar o efeito de ambos os compostos sobre o biofilme
formado durante 6 horas nas três diferentes densidades de células.
Figura 1: Efeito de diferentes concentrações de (PhSe)2 e (p-Cl-PhSe)2 sobre o biofilme de 6 horas formado por
C. albicans. ■=105, ●=106 e ▲=107 células/ml. Os dados apresentados na figura representam a média e DP de 7
experimentos (n=7).
Na Figura 1A estão representados os biofilmes tratados com (PhSe)2, observando-se
diferentes resistências à ação do composto. Os biofilmes formados com a densidade de 105
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células/ml sofreram uma inibição de aproximadamente 50% na viabilidade do biofilme, quando
submetido à tratamento com a maior concentração do composto. Nesta mesma concentração, notase uma inibição em cerca de 40% e 25% da viabilidade do biofilme formado com as densidades de
106 e 107 células/ml, respectivamente.
Logo, em 1B, que demonstra os biofilmes de 6 horas tratados com (p-Cl-PhSe)2, observa-se
inibição aproximada de 35%, 30% e 25% da viabilidade do biofilme, nas respectivas densidades de
células 105, 106 e 107 células/ml.
A Figura 2 representa os biofilmes formados por 24 horas em diferentes densidades de
células tratados pelos compostos organocalcogêneos.
Figura 2: Efeito de diferentes concentrações de (PhSe)2 e (p-Cl-PhSe)2 sobre o biofilme de 24 horas formado por
C. albicans. ■=105, ●=106 e ▲=107 células/ml. Os dados apresentados na figura representam a média e DP de
10 experimentos (n=10).
Em 2A estão representados os resultados obtidos do tratamento dos biofilmes de 24 horas
com (PhSe)2, podendo observar-se inibição aproximada de 40% da viabilidade do biofilme nas
densidades de células de 105 e 106 células/ml. Na densidade de 107 células/ml, nota-se a inibição de
cerca de 30% da atividade mitocondrial.
A Figura 2B, por sua vez, demonstra os biofilmes tratados com (p-Cl-PhSe)2 que apresentou
inibições menores, como cerca de 20% de inibição na viabilidade dos biofilmes nas densidades de
105 e 106 células/ml. Enquanto que a densidade de 107 células/ml demonstrou inibição da viabilidade
do biofilme de 15%, aproximadamente.
As figuras seguintes representam a morfologia dos biofilmes formados em 6 horas por C.
albicans, na densidade de 105 células/ml. A Figura 3 representa os biofilmes tratados nas diferentes
concentrações de (PhSe)2. Nesta, pode-se observar a redução no número de células planctônicas e
de filamentos alongados.
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Figura 3: Análise da morfologia do biofilme formado em 6 horas por C. albicans após o tratamento com (PhSe)2
por Microscópio Óptico Invertido. A densidade de células utilizada para a formação do biofilme foi de 105
células/ml. As concentrações de (PhSe)2 são A=Controle, B=2µM, C=5µM, D=10µM e E=20µM. Bar, 20μm.
A Figura 4 representa os biofilmes tratados com (p-Cl-PhSe)2, avaliando-se que os filamentos
alongados não diminuíram, demonstrando apenas redução no número de células planctônicas.
Figura 4: Análise da morfologia do biofilme formado em 6 horas por C. albicans após o tratamento com (p-ClPhSe)2 por Microscópio Óptico Invertido. A densidade de células utilizada para a formação do biofilme foi de 105
células/ml. As concentrações de (p-Cl-PhSe)2 são A=Controle, B=2µM, C=5µM, D=10µM e E=20µM. Bar, 20μm.
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Discussão
Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram o efeito de dois compostos
organocalcogêneos estruturalmente diferentes sobre os biofilmes de 6 e 24 horas, em três diferentes
densidades de células. Nesses resultados foi possível observar que os compostos apresentaram
capacidade inibitória relativa à maturação do biofilme e a densidade de células utilizadas para a
formação deste.
A primeira análise que pode ser feita é a comparação do efeito inibitório dos compostos sobre
os diferentes tempos de maturação do biofilme. Os biofilmes formados durante 6 horas são muito
mais susceptíveis ao tratamento do que os biofilmes formados em 24 horas. Esse resultado corrobora
com o estudo realizado por Davies (2003), que demonstrou a dificuldade do fármaco em se difundir
pela matriz extracelular produzida pelas células. Ou seja, quanto mais maduro o biofilme maior é a
secreção de matriz extracelular e, consequentemente, mais resistente o biofilme. Ainda relacionado à
matriz extracelular, Kojic e Darouiche (2004) demonstraram que o fármaco atinge as células do
biofilme em uma concentração menor e somente as células que estão na superfície são atingidas, o
que pode justificar a maior inibição de células planctônicas do que de filamentos alongados.
White e colaboradores (1998) demonstraram que a densidade de células também é um
importante fator de resistência dos biofilmes. Dessa forma, como pode ser observado, os biofilmes
que foram formados com a densidade de 105 células/ml sofreram maior inibição quando comparados
aos biofilmes de densidade de 107 células/ml, independente do composto utilizado.
Comparando o efeito inibitório dos compostos (PhSe)2 e (p-Cl-PhSe)2 é possível notar que há
uma diferença no potencial antifúngico. O composto (PhSe)2 foi mais capaz em inibir a viabilidade do
biofilme, em qualquer estágio de seu desenvolvimento e nas três densidades de células. Entretanto, o
composto (p-Cl-PhSe)2 também apresentou capacidade em inibir a viabilidade do biofilme nos
diferentes estágios de maturação e nas diferentes densidades de células, porém seu efeito foi menor
em comparação ao anterior. O mesmo foi demonstrado por Rosseti e colaboradores (2011) ao avaliar
o crescimento de C. albicans na presença desses compostos. Apesar da capacidade de (p-Cl-PhSe)2
em reduzir a formação de tubos germinativos, sua capacidade em inibir o crescimento desses fungos
foi menor.
Conclusão
O efeito antifúngico demonstrado pelo composto (PhSe)2 foi maior quando comparado ao
composto (p-Cl-PhSe)2. Entretanto ambos apresentaram potencial inibitório, sendo esta uma resposta
promissora frente às limitadas opções para o tratamento de infecções fúngicas.
Referências
BASSETI, M., TARAMASSO, L., NICCO, E., MOLINARI, M.P., MUSSAP, M., VISCOLI, C.
Epidemiology, species distribution, antifungal susceptibility and outcome of nosocomial candidemia in
a tertiary care hospital in Italy. PLoS One, v. 6(9):e24198, 2011.
BILLACK, B.; SANTORO, M.; LAU-CAM, C. Growth Inhibitory Action of Ebselen on FluconazoleResistant Candida albicans: Role of the Plasma Membrane H+ - ATPase. Microb Drug Resist. 15(2):
77-83, 2009.
BOONYASIRI, A., JEARANAISILAVONG, J., ASSANASEN, S. Candidemia in Siriraj Hospital:
epidemiology and factors associated with mortality. J Med Assoc Thai. v. 96:S91-7, 2013.
DAVIES, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov, v. 2(2),
114-22, 2003.
MACHADO, M. DA S.; VILLELA ,I. V.; MOURA, D. J.; ROSA, R. M.; SALVADOR, M.; LOPES, N. P.;
BRAGA, A. L.; ROESLER, R.; SAFFI, J.; HENRIQUES, J.A. 3’3-Ditrifluoromethyldiphenyl diselenide:
XX Encontro Latino Americano de Iniciação Científica, XVI Encontro Latino Americano de Pós-Graduação e VI
Encontro de Iniciação à Docência – Universidade do Vale do Paraíba.
5
A new organoselenium compound with interesting antigenotoxic and antimutagenic activities.
Mutation Research, v. 673 (2): 133-140, 2009.
MCNEIL MM, NASH SL, HAJJEH RA et al. Trends in mortality due to invasive mycotic diseases in the
United States, 1980-1997. Clin Infect Dis, v. 33, 641-647, 2001.
MORGAN J, MELTZER MI, PLIKAYTIS BD et al. Excess mortality, hospital stay, and cost due to
candidemia: a case-control study using data from population-based candidemia surveillance. Infect
Control Hosp Epidemiol, 26: 540-7, 2005.
MUKHERJEE, P. K.; ZHOU, G.; MUNYON, R.; GHANNOUM, M. A. Candida biofilm: a well-designed
protected environment. Med Mycol, v. 43(3), 191-208, 2005.
MULLER, A.; CADENAS, E.; GRAF, P.; SIES, H. A novel biologically active seleno-organic
compound. I. Glutathione peroxidase-like activity in vitro and antioxidant capacity of PZ 51 (ebselen).
Biochem. Pharmacol., v. 33, 3235-3239, 1984.
NOGUEIRA, C. W.; ROCHA, J. B. Comparative studies on dicholesteroyl diselenide and diphenyl
diselenide as antioxidant agents and their effect on the activities of Na+/K+ ATPase and deltaaminolevulinic acid dehydratase in the rat brain. Neurochem Res, V. 33(1): 167-178, 2008.
ROSSETI, I. B.; WAGNER, C.; FACHINETTO, R.; TAUBE JUNIOR, P.; COSTA, M. S. Candida
albicans growth and germ tube formation can be inhibited by simple diphenyl diselenides [(PhSe)2,
(MeOPhSe)2, (p-Cl-PhSe)2, (F3CPhSe)2] and diphenyl ditelluride. Rev. Mycoses 54 (6): 506-513,
2011.
ROSSETI, I.B., ROCHA J.B.T., COSTA, M.S. Diphenyl diselenide (PhSe)2 inhibits biofilm formation by
Candida albicans, increasing both ROS production and membrane permeability. Journal of Trace
Elements in Medicine and Biology, v. 29, p. 289-295, 2015.
SHAPIRO, R. S.; ROBBINS, N.; COWEN, L. E. Regulatory circuitry governing fungal development,
drug resistance, and disease. Microbiol Mol Biol Rev, v. 75(2), p.213, 2011.
TRABULSI, L. R.; TOLEDO, M. R. RF Microbiologia, 5 ed. São Paulo: Atheneu, 2008.
WHITEWAY, M.; BACHEWICH, C. Morphogenesis in Candida albicans. Annu Rev Microbiol, v. 61,
p.529, 2007.
XX Encontro Latino Americano de Iniciação Científica, XVI Encontro Latino Americano de Pós-Graduação e VI
Encontro de Iniciação à Docência – Universidade do Vale do Paraíba.
6