capacidade de formação de biofilmes por diferentes bactérias

CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILMES POR DIFERENTES BACTÉRIAS
PATOGÊNICAS
Saskia Rosani BERGAMIN 1; Vanessa SCHUH 2; Karine DALLA COSTA2, Marina Leda
RIBEIROS2, Sheila Mello da SILVEIRA3; Alessandra Farias MILLEZI4
CNPQ/ITI – B, Estudante do Curso Técnico em Alimentos Integrado ao Ensino Médio Instituto Federal Catarinense,
Campus Concórdia/SC; 2 Graduandas do curso de Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense, Campus
Concórdia/SC; 3 Co – orientadora, Docente do Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC; 4 Orientadora, Docente
do Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC
1 Bolsista
Introdução
O termo biofilme descreve a forma de vida microbiana séssil, caracterizada pela adesão
microbiana com produção de substâncias poliméricas extracelulares, constituindo uma rede
gelatinosa que imobiliza e protege as células. Bactérias em biofilmes apresentam alterações
fenotípicas e genotípicas que as diferem das células planctônicas, as quais podem ser estratégias
de sobrevivência dos microrganismos as condições ambientais adversas (COSTERTON, et al.
1999).
Geralmente, a dinâmica de formação de um biofilme ocorre em etapas distintas.
Inicialmente temos os organismos denominados colonizadores primários, que se aderem a uma
superfície, geralmente contendo proteínas ou outros compostos orgânicos. As células aderidas
passam a se desenvolver, originando microcolônias que sintetizam uma matriz
exopolissacarídica (EPS), que passam a atuar como substrato para a aderência de
microrganismos denominados colonizadores secundários. Acredita-se que a formação de
biofilmes esteja associada, por exemplo, à proteção contra o ambiente.
Biofilmes são frequentemente encontrados nas indústrias de alimentos, infelizmente
geram uma série de fatores negativos, por ser de difícil remoção após atingirem o estágio
maduro. Os biofilmes são responsáveis pela maior parte das interferências causadas por
microrganismos em processos tecnológicos. Os impactos econômicos causados por biofilmes
são estimados em 1% do PIB em países industrializados (SCHNEIDER, 2009).
A formação de biofilmes em ambientes de processamento de alimentos eleva as
oportunidades para a contaminação microbiana do produto processado e causam deterioração
dos alimentos. A contaminação diminui o tempo de vida útil do produto e é responsável pela
transmissão de doenças veiculadas por alimentos. Em relação à redução da eficiência de
processos industriais, os biofilmes diminuem a eficácia da transferência de calor ao se tornarem
suficientemente espessos em locais como trocadores de calor (MITTELMAN, 1998). Biofilmes
são importantes agentes de biocorrosão, alguns microrganismos em biofilmes podem catalisar
reações químicas e biológicas causando corrosão do metal em ductos e tanques.
Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi estudar a capacidade de formação de
biofilme por diferentes bactérias de importância na indústria de alimentos, sendo elas: Listeria
monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila e
Pseudomonas aeruginosa.
Materiais e Métodos
As análises foram realizadas no laboratório de Microbiologia de Alimentos localizado
no Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia, SC.
As bactérias utilizadas neste estudo foram Listeria monocytogenes, Salmonella
Typhimurium, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila e Pseudomonas aeruginosa.
Para a formação do biofilme, cada bactéria foi inoculada separadamente em meio de cultura
TSA por 24/36º. Após esse período foi realizada a padronização para 108 UFC/mL (L.
monocytogenes, A. hydrophila, S. Typhimurium, P. aeruginosa) e 107 UFC/mL (S. aureus)
utilizando leitura a 630 nm em espectofotômetro Elisa (Biotek,USA).
Os biofilmes
foram inoculados em microplacas estéreis de polipropileno com 96 cavidades e incubados em
shaker orbital (Tecnal, Brasil) a 37 ºC, agitação de 80 rpm (MILLEZI et al., 2012).
Após 24 horas, foram realizadas as análises de quantificação da atividade metabólica
pelo ensaio colorimétrico de redução de sais de tetrazólio, por 3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazyl)-2,5Diphenyl-2HTetrazolium bromide (MTT) e para as bactérias consideradas fortes formadoras
de biofilme pela análise de MTT, foi realizada a quantificação de células viáveis pela contagem
de Unidades Formadoras de Colônia (UFC).
Para a análise de MTT, utilizou-se protocolo descrito por Freimoser et al. (1999), com
modifiçaões. Após 24 horas de formação dos biofilmes, realizou-se a lavagem da placa com
água destilada estéril para remoção de células planctônicas, após, foram adicionados 200 µL de
solução MTT em cada poço. A placa foi incubada no escuro por 2 h e 30 min a 36 oC, após, o
conteúdo da placa foi descartado e procedeu-se à aplicação de 200 µL de DMSO por 15 min.
Depois desse período, foi realizada a leitura em espectrofotômetro Elisa a 630 nanômetros.
Para quantificação das células viáveis (UFC), estas foram submetidas por 6 minutos ao
banho ultrasson
(Unique, Brasil). Procedeu-se à diluição seriada das
amostras
e plaqueamento em superfície de Ágar Triptona de Soja – TSA, utilizando a técnica
de microgota. Após 24 horas de incubação realizou-se a contagem das células viáveis em
biofilmes (SILVA et al. 2010).
Para a confecção do gráfico utilizou-se o software Prisma (GrafPad Software).
Resultados e Discussão
Biofilmes não incluem somente microrganismos, mas também todo material
extracelular produzido, bem como qualquer material aprisionado dentro da matriz resultante;
são constituídos principalmente de água (95%) e matéria orgânica. Os biofilmes contêm
partículas de proteínas, lipídeos, fosfolipídios, carboidratos, sais minerais e vitaminas, entre
outros, que formam uma espécie de crosta debaixo da qual os microrganismos continuam a
crescer, formando um cultivo puro ou uma associação com outros microrganismos (MACÊDO,
2000).
Das bactérias analisadas nesse trabalho, verificou-se que que P. aeruginosa e A.
hydrophila foram as únicas classificadas como fortes formadoras de biofilme devido à alta
capacidade de aderência no polipropileno. A. hydrophila alcançou OD = 0,40 e P. aeruginosa
OD = 0,70 (figura 1); sendo que o parâmetro utilizado na literarura para bactérias com forte
capacidade de biofilme é OD = 0,2 nanômetros (FREIMOSER et al.,1999).
Figura 1 – Quantificação de atividade metabólica utilizando análise de MTT
Conforme mostra a Figura 2, na quantificação de células viáveis, A. hydrophyla teve
crescimento de 6,6 log10 CFUcm-2 e P. aeruginosa 7,9 log10 CFUcm-2 De acordo com a
literatura, o valor de 5 log10 CFUcm-2 já é considerado que houve a formação de biofilme
Figura 1 – Células viáveis em biofilme (Unidades Formadoras de Colônias)
Conclusões
Concluiu-se com esse trabalho que as bactérias A. hydrophila e P. aeruginosa
apresentaram forte capacidade de formar biofilme na superfície de polipropileno, sendo que
dessas duas espécies, P. aeruginosa foi a mais eficiente formadora de biofilme.
Referências
COSTERTON, J.W., GEESEY, G.G. and CHENG, K.J. Bacterial biofilms: A common cause
of persistent infections. Science. New York, v. 284, 1318–1322, 1999.
FREIMOSER, F. M.; JAKOB, C. A.; AEBI, M.; TUOR, U. The MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay is a fast and reliable method for colorimetric
determination of fungal cell densities. Applied and environmental Microbiology 65(8):37273729. 1999.
MACÊDO, J. A. B. Biofilmes bacterianos, uma preocupação da indústria farmacêutica. Revista
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MILLEZI, F. M., PEREIRA, M. O., BATISTA, N. N., CAMARGOS N., AUAD I.,
CARDOSO, M. D. G. AND PICCOLI, R. H. Susceptibility of monospecies and dual-species
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SCHNEIDER, R. P. Biofilmes Microbianos. Microbiologia em Foco. n 2, v. 1, p 4 – 12. 2007.
SILVA, N., JUNQUEIRA,V.C.A., SILVEIRA, N.F.A., TANIWAKI, M.H., SANTOS, R.F.S.,
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p. 624, 4th Ed.,Varela, São Paulo, Brazil.
Agradecimentos: CNPQ e Instituto Federal Catarinense.