Estabelecimento de linhas celulares estáveis que expressem
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Estabelecimento de culturas de linhas celulares estáveis que expressem proteínas fluorescentes Cristina Duque Luís Flores Introdução B No centro da divisão celular está o fuso mitótico, cuja função é segregar os cromossomas para pólos opostos da célula. B O fuso mitótico é constituído por microtúbulos e centrossomas. University of Toronto. http://www.mie.utoronto.ca/labs/lcdlab/biopic/biofigures.htm Thomas J. Deerinck. Fluorescently labeled cell culture. Confocal Microscopy Microtúbulos BConstituídos por um heterodímero de tubulina α e tubulina β; B As extremidades dos microtúbulos estão dispostas no fuso mitótico de acordo com a sua polaridade; Cooper et al. The Cell. 2nd ed Alberts et al. MBOC4 Microtúbulos > Os microtúbulos encontram-se associados a diversas proteínas que participam na regulação das suas propriedades dinâmicas; > A instabilidade dinâmica dos microtúbulos desempenha um importante papel ao longo da mitose, permitindo que ocorra a segregação dos cromossomas. Centrossomas > Os centrossomas são os centros organizadores dos microtúbulos; > Cada um é constituído por um par de centríolos e proteínas associadas, como a γ-tubulina; Alberts et al. MBOC4 Cromossomas > O centrómero é uma região dos cromossomas com sequências de DNA e proteínas específicas, que contém os dois locais de ligação ao fuso mitótico, os cinetocóros. Alberts et al. MBOC4 Objectivo BEstabelecer uma linha celular estável que expresse uma proteína fluorescente, obtendo a mesma expressão proteica ao longo das gerações, permitindo o estudo continuado da proteína marcada em células VIVAS. Neste trabalho foram marcadas: 1) Em células HeLa (células tumorais humanas) CLASP 2α com a GFP. 2) Em células Schneider 2 (células embrionárias de Drosophila) que já expressavam GFP-α-tubulina ou GFP-centrossomina cid com mCherry 3) Em células 1182-4 (células acentriolares de Drosophila) α-tubulina com GFP Proteínas de fluorescência ÏAtravés de marcações com proteínas fluorescentes, podemos fazer com que a célula passe a ter uma proteína semelhante a uma das proteínas endógenas a emitir fluorescência. ÏAs proteínas fluorescentes usadas neste trabalho foram a GFP e a mCherry. Green Fluorescent Protein Aequorea victoria Tsien lab Website. http://www.tsienlab.ucsd.edu DsRed DNA-Gdańsk. http://www.dnagda.com/labgen.html Discosoma sp. University of Queensland: Biomolecular Modelling. http://www.ccms.uq.edu.au/research_biomolecular.htm Ch er ry m Ta ng er in e m St ra wb er ry m at o td To m O ra ng e m Ba na na m m Ho ne yd ew A escolha da mCherry Shaner et al. (2004) Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. Tsien lab Website. http://www.tsienlab.ucsd.edu Proteínas marcadas • A α-tubulina é uma das proteínas constituintes dos microtúbulos. • A cid (centromere identifier) é uma proteína aparentada com as histonas-H3, mas que só existe ligada à zona do cinetocóro. Este proteína de Drosophila é homóloga à CENP-A humana. Proteínas marcadas • A centrossomina é uma proteína ligada ao centrossoma que se pensa estar relacionada com o seu funcionamento durante a segregação dos cromossomas. • A γ-tubulina é uma proteína também existente nos centrossomas. Proteínas marcadas • A CLASP 2α (CLIP associating protein) pertence a uma família de proteínas (+TIPs) associadas à extremidade (+) dos microtúbulos; • As CLASPs desempenham um papel na manutenção da bipolaridade no fuso mitótico, na ligação dos microtúbulos aos cinetocóros e na congressão dos cromossomas; • A CLASPs ligam-se aos cinetocóros durante a mitose; • A CLASP 1α tem um domínio central de ligação a microtúbulos e um terminal C de domínio cinetocoriano, aparecendo também no centrossoma e no mid-body (citocinese). Maiato et al, Human CLASP1 Is an Outer Kinetochore Component that Regulates Spindle Microtubule Dynamics,2003 Métodos • • • • • • • • Construção do plasmídeo Proteína de fusão Transformação de bactérias competentes Screening das colónias Amplificação do plasmídeo de interesse Transfecção estável das células eucarióticas Selecção das culturas Microscopia Plasmídeo Xba I Ampicilina GFP Sal I Hi gr om ic in a Sal I αtu b ul in a Sac II Proteína de fusão Green Fluorescent Protein. http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm Green Fluorescent Protein. http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm Transformação Adaptado de Cooper et al. The Cell - A Molecular Approach (2nd ed). Sinauer Associates, Inc Transformação Meio com Ampicilina Transformação Colónia Screening Amplificação Alberts et al. Molecular Biology of the Cell (4th ed). Garland Publishing Transfecção Nikon's MicroscopyU. http://www.microscopyu.com Selecção das culturas Meio com antibiótico Microscopia de fluorescência Resultados e Discussão 1) GFP CLASP 2α : Microscopia de Fluorescência DNA CLASP 2α DNA CLASP 2α DNA CLASP 2α DAPI GFP-CLASP2α Merge Western Blotting 250 KDa 150 KDa 100 KDa 75 KDa 50 KDa 37 KDa Anticorpos Primários 1:2500 α-GFP AbCam (Rabbit) 1:1000 α-TUB (Mouse) Anticorpos Secundários 1:1000 α-Rabbit-HRP 1:5000 α-Mouse-HRP Os resultados obtidos sugerem um erro na sequência codificante: • Ausência de fluorescência nos cinetocoros; • Menor peso molecular da proteína (<170KDa). Erro durante o PCR- DNA Polimerase Pfu • A síntese proteica terminou prematuramente, eliminando o domínio cinetocoriano da CLASP 2α; • Não se observou nenhuma anomalia decorrente desta ausência, devido à existência da própria proteína endógena. Resultados 484nm GFP-α-tubulina 610nm mCherry-cid DIC GFP-α-tubulina mCherry-cid cid α-tubulina cid α-tubulina DIC Futuro • Técnicas de microcirurgia laser permitindo manipular ainda melhor alguns dos constituintes celulares, observando-se imediatamente os seus efeitos Agradecimentos Dra Sara Pereira Dra Ana Pereira Prof Doutor Hélder Maiato Dra Irina Matos Dra Rita Maia Algumas referências... • • • • • • Rieder C. Mitosis and Meiosis. Cell Biology, Virtual Text. Ergito.com. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York: Garland Publishing; 2002. Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2005 Dec; 2(12):905-9. Nikon MicroscopyU [homepage on the Internet]. Introduction to Fluorescent Proteins. http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/fpintro.html Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 2004 Dec;22(12):1567-72. Wadsworth P, Rusan NM, Tulu US, Fagerstrom C. Stable expression of fluorescently tagged proteins for studies of mitosis in mammalian cells. Nature Methods. 2005 Dec;2(12):981-7.
