Aula 5: Biotecnologia vegetal

Biotecnologia Vegetal
Objetivos dos
agricultores são:
Aumentar a produtividade de determinadas culturas pela
seleção de variedades que apresentem resistência a doenças e
pragas; resistência a umidade e à seca; maior resposta ou
independência a fertilizantes; tolerância a condições ambientais
hostis, como solos ácidos e/ou salgados etc.
Aumentar o valor de culturas de interesse sócio-econômico,
selecionando características como maior conteúdo de óleo;
maior valor nutritivo; maior facilidade de colheita e
armazenagem; independência da proteção por produtos
químicos.
Melhoramento
convencional
Até poucos anos atrás, a única maneira de alcançar estes objetivos era
através dos métodos clássicos de cruzamentos, ou seja, da
genética mendeliana. No entanto, estas estratégias levaram os
rendimentos das culturas a uma situação estacionária, que não foi
solucionada pelos métodos convencionais. Além disso, estes métodos
não permitem ultrapassar as barreiras naturais de cruzamentos, e até
que uma variedade com características novas possam ser lançadas no
mercado, 5 a 15 anos se passam. Outra desvantagem do cruzamento
clássico é o fato de que, além das qualidades desejáveis, qualidades
indesejáveis são transferidas porque, invariavelmente, o melhorista é
forçado a trabalhar com a informação genética inteira dos pais.
O desenvolvimento da biotecnologia pode
ser dividido em 3 fases:
1. Introdução de características agronômicas: soja Roundup Ready,
tolerante a glifosato, um ingrediente ativo do herbicida Roundup. Milho
YieldGard, possui um gene que codifica para um proteína inseticida que ocorre
naturalmente na bactéria B. thuringiensis e confere resistência a broca do
milho, inseto que reduz sua produção de 6 a 20%. Batata Achat com resistência
a vírus PVY(mosaico da batata) onde se conseguiu introduzir o gene da capa
protéica do próprio vírus, onde a batata com esse gene mostra resistência ao
vírus PVY.
2. Produção de culturas de melhor qualidade: melhoria de atributos
do feijão como flatulência e flavor; propriedade de textura e emulsificação da
soja, milho com alto teor de óleo e/ou proteína; introduzindo genes que alteram
vias metabólicas como por exemplo a produção de gordura sólida ou semisólida sem ácidos graxos trans nas sementes oleaginosas.
O desenvolvimento da biotecnologia pode
ser dividido em 3 fases:
3.
Plantas como biofábricas: alimentos nutricionalmente
fortificados e substituindo a adição de constituintes sintéticos aos
alimentos. Óleo de canola rico em caroteno. Fornecer novos
nutrientes nos grãos, como os fitoesteróis. Modulação de doenças.
Outros exemplos
Arroz dourado: geneticamente modificado para expressar alto
conteúdo de carotenóides. Três genes tirados do narcisosilvestre e da bactéria Erwinia sp foram introduzidos no arroz
para produzir um grão amarelo, com altos níveis de β-caroteno,
que é convertido em vitamina A no organismo.
Outros exemplos
Colza (Arabidopsis thaliana) com folhas
naturalmente artificiais onde se
colocou um gene novo neste arbusto,
que lhe deu a capacidade de produzir
plástico conhecido pela sigla PHBV.
Ele é feito dentro das células das
folhas do vegetal. Elas depois são
moídas e filtradas para se extrair o
produto, que poderá substituir os
atuais – derivados de petróleo - com
grande vantagem. Sua degradação é
mais rápida, demora só alguns
meses, enquanto
os similares
sintéticos permanecem até 100 anos
poluindo a natureza. Genes que
fabricam plásticos existem em várias
bactérias. Foi delas que se tirou o
DNA para colocar na colza.
Outros exemplos
Argentina - batata, girassol e trigo;
Brasil - alface, amendoim, batata, cana-de-açúcar,
eucalipto e fumo;
Chile - batata e pimentão;
Colômbia - arroz e mandioca;
Cuba - arroz, banana, batata, batata-doce, cana-deaçúcar e mandioca;
México - milho;
Peru - batata;
Trindade - cacau;
Venezuela - batata;
Uruguai – batata.
Fator estimulante de colônias de macrófagos
granulócitos humanos (GM-CSF)
Aplicações clínicas
Acúmulo limitado a 0,02% do total de proteínas
solúveis em plantas sob condições de campo
Ainda inviável economicamente.
Ácido p-hidróxi-benzóico (pHBA) -Bioplástico
Biopolímero (bioplástico);
Até 7,3% do peso seco das folhas;
Sem anormalidades no crescimento e
desenvolvimento.
Poli-3-hidroxibutirato (PHB)
Produto biodegradável;
1,88% do peso seco das folhas;
Sem prejuízos ao crescimento e
desenvolvimento.
Transformação de células
A transformação de células vegetais
pode ultrapassar as barreiras
sexuais, de tal modo que qualquer
gene, de qualquer organismo pode
ser introduzido numa planta;
Para ser útil, tem que ser expresso
no órgão, tecido, célula desejada e a
proteína por ele codificada tem de ter
uma função de interesse.
Transformação de células
Os experimentos pioneiros na transferência de genes
foram conduzidos com tabaco e outras espécies
cultivadas, como milho, trigo, arroz, algodão, girassol
e beterraba, dentre outras;
No entanto, apesar da existência de uma grande
variedades de técnicas de transformação
genética, até o presente momento ainda não foi
encontrado um sistema ideal de transferência de
genes que possa ser aplicado a todas as espécies
vegetais.
Definições
Totipotencialidade:
capacidade de qualquer
célula vegetal gerar um
indivíduo completo;
Técnica também
chamada de
micropropagação ou
propagação in vitro.
Transformação de células
Inicialmente, os métodos de introdução de DNA
em células vegetais baseavam-se na
transformação mediada por Agrobacterium;
Objetivos: além de caracteres de interesse
agronômico, também biorremediação, produção
de fármacos, proteínas animais e biopolímeros
de alto valor comercial.
Transformação de células- técnicas
A
utilização
de
Agrobacterium
tumefaciens;
Aceleração de partículas (biobalística);
Polietilenoglicol (PEG);
Eletroporação;
Sonicação;
Micropartículas de carboneto de sílica;
Microlaser;
Micro e macroinjeção.
Transformação de células
Algumas
limitações
desses métodos é a falta
de
controle
da
integração do DNA no
genoma da planta, que
ocorre
ao
acaso;
o
silenciamento de genes
e a interação entre os
diferentes
transgenes,
resultando em padrões
não
esperados
de
expressão
dos
genes
introduzidos.
Métodos de transformação de plantas
Métodos de transformação de plantas
Direto (processos físico-químicos):
– Biobalística;
– Eletroporação de protoplastos;
– Polietilenoglicol (PEG);
Indireto (DNA exógeno é inserido no
genoma pela ação de um vetor biológico):
– Via Agrobacterium tumefaciens;
– Imersão de explantes em soluções de
DNA;
– Macroinjeções.
Biobalística
Objetivo inicial: introduzir material genético no genoma
nuclear de plantas superiores.
Outras aplicações têm sido avaliadas, demonstrando
ser um processo também efetivo e simples para a
introdução e expressão de genes em bactérias,
protozoários, fungos, algas, insetos e tecidos animais.
Recentemente, foi demonstrada sua aplicação na
introdução e expressão de genes em animais in vivo e na
indução de resposta imune utilizando DNA, processo
denominado imunização genética
Biobalística
Biobalística
Neste
processo
emprega-se
microprojéteis (que podem ser de
ouro ou tungstênio) que são
acelerados
a
velocidades
superiores a 1500 Km/h por
sistemas de aceleração;
Geração de uma onda de choque
com energia suficiente para
deslocar
uma
membrana
carreadora
contendo
as
micropartículas cobertas com
DNA ou por meio de uma
descarga de hélio a baixa pressão
acelerando o microprojétil.
A onda de choque pode
ser gerada por:
Micrografia eletrônica de varredura
das micropartículas cobertas com
DNA: (A) tungstênio; (B) ouro.
- uma explosão química
(pólvora seca);
- por uma descarga de hélio
a alta pressão;
- pela vaporização de uma
gota de água decorrente
de descarga elétrica;
- por uma descarga de ar
comprimido.
Biobalística
Biobalística
As micropartículas aceleradas penetram na parede e
membrana celular de maneira não-letal, localizando-se
aleatoriamente nas organelas celulares.
Em seguida, o DNA é dissociado das micropartículas pela ação
do líquido celular, ocorrendo o processo de integração do
gene exógeno no genoma do organismo a ser modificado.
Uma das vantagens do sistema é que este permite a
introdução e expressão gênica em qualquer tipo celular.
Biobalística
µ
Métodos de transformação de plantas
Direto (processos físico-químicos):
– Biobalística;
– Eletroporação de protoplastos;
– Polietilenoglicol (PEG);
Indireto (DNA exógeno é inserido no
genoma pela ação de um vetor biológico):
– Via Agrobacterium tumefaciens;
– Imersão de explantes em soluções de
DNA;
– Macroinjeções.
Eletroporação de protoplastos
Protoplastos:
celular;
células
desprovidas
de
parede
Eletroporação: pulsos de eletricidade tornam a
membrana plasmática reversivelmente permeável,
permitindo que macromoléculas como o DNA sejam
transportadas para dentro da célula vegetal;
Utiliza-se uma descarga de capacitores para
produzir pulsos de alta voltagem que induz a
abertura de poros na membrana celular, o que
permite a penetração e a eventual integração dos
genes no genoma.
É o método preferencial escolha quando se trata de
plantas monocotiledôneas como milho, trigo, etc.
Esquema representativo do isolamento e
purificação de protoplastos de Nicotina
tabacum
Eletroporação de protoplastos
O sucesso da metodologia depende:
- Da otimização das condições de cultivo e
regeneração de plantas a partir de protoplastos;
- Da sensibilidade dos protoplastos às condições
de
eletroporação
(tampão,
voltagem,
concentração do DNA e do protoplasma).
Eletroporação de protoplastos
Vantagens
Rápido e eficiente;
Grande
controle
experimentais;
das
Desvantagens:
Necessidade de protoplastos;
Custo do equipamento.
condições
Métodos de transformação de plantas
Direto (processos físico-químicos):
– Biobalística;
– Eletroporação de protoplastos;
– Polietilenoglicol (PEG);
Indireto (DNA exógeno é inserido no
genoma pela ação de um vetor biológico):
– Via Agrobacterium tumefaciens;
– Imersão de explantes em soluções de
DNA;
– Macroinjeções.
Via protoplastos
Pode ser mediado por PEG ou por
eletroporação.
PEG ou polietilenoglicol faz com que a
molécula de DNA se aproxime da
membrana
por
causa
de
sua
viscosidade.
PEG
Policátions, como o polietilenoglicol
(PEG), polivinil álcool (PVA ) ou DEAEdextran podem ser usados com agentes
químicos que permitem a passagem
passiva do DNA para dentro da célula
vegetal.
No contato do protoplastos com os
policátions,
a
permeabilidade
da
membrana é aumentada pela interação
das cargas positivas dos policátions com
as cargas negativas do DNA e da
membrana, facilitando a penetração
daquele.
Os
policátions
também
protegem o DNA exógeno contra a ação
das nucleases da célula vegetal.
PEG
Plantas transgênicas de fumo foram obtidas por meio da
incubação de protoplastos em presença de PEG, em uma
concentração final entre 13 e 20%.
Diversas espécies vegetais de interesse agronômico (canola,
couve-flor, limão e, mais recentemente, arroz e milho) já
foram transformadas por essa técnica.
Entretanto, a freqüência de transformação é relativamente
baixa (entre 1/1000 e 1/10000), podendo ser calculada pelo
número de explantes que resultaram em pelo menos uma
planta transgênica, em relação ao número inicial de explantes
tratados. A maior limitação do uso desta técnica consiste na
obrigatoriedade do uso de protoplastos.
Métodos de transformação de plantas
Direto (processos físico-químicos):
– Biobalística;
– Eletroporação de protoplastos;
– Polietilenoglicol (PEG);
Indireto (DNA exógeno é inserido no
genoma pela ação de um vetor biológico):
– Via Agrobacterium tumefaciens;
– Imersão de explantes em soluções de
DNA;
– Macroinjeções.
Transformação indireta via
Agrobacterium tumefaciens.
Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria
do solo que causa uma doença denominada
galha-de-coroa formando tumores na planta
hospedeira;
Agrobacterium rhizogenes causa doença
neoplásica chamada de raiz em cabeleira;
Possui plasmídeo denominado Ti (indutor de
tumor) e Ri ( no caso do A. rhizogenes).
Sistema planta-Agrobacterium:
colonização genética
1. A planta sofre um ferimento. Isto atrai o Agrobacterium
porque a planta secreta compostos fenólicos nas regiões de
ferimento para ser proteger do MO e para cicatrizá-la. Portanto
ocorre sinalização química;
2. o MO se instala e a bactéria irá se desenvolver;
3. Processo de tumor. O MO transfere a região T do plasmídeo
para a célula vegetal. Este DNA é integrado ao DNA da planta.
4. As proteínas produzidas a partir desse gene são precursores
de hormônios do crescimento e opinas (aa conjugados com
açúcares), que favorecem o Agrobacterium.
Agrobacterium tumefaciens
Dinâmica da transformação da planta
pelo patógeno
Agrobacterium: colonização genética
Agrobacterium: colonização genética
PLASMÍDEO DE A. tumefaciens
Regiões do PLASMÍDEO DE A.
tumefaciens
a) Região T-DNA (ou DNA de transferência) – contém
a porção de DNA que será transferida, na forma de um
fio único. Qualquer sequência de bases que for inserida
entre essas duas extremidades, será integralmente
transferida para a planta, independente de seu
tamanho, e inserida, ao acaso, ao seu genoma.
b) Região Vir (Vir = virulência) – Genes desse
agrupamento codificam para: expressão de produtos
responsáveis pelo processo de exportação do T-DNA da
bactéria para a planta. Na Região Vir estão os
agrupamentos A, B, C, D, E, F e G, que contêm os
genes VirA, VirB, VirC, VirD, VirE, VirF e VirG, todos
participantes ativos do processo geral de transformação
da planta pelo patógeno.
Regiões do PLASMÍDEO DE A. tumefaciens
REGIÃO VIR
A
B
G
C
D
E
F
Região A: produz proteína que age como sensor de fenóis;
Região B: produz proteína responsável pelo canal que liga o
Agrobacterium à celula;
Região C: regenerar o DNA que foi clivado;
Região D: cortam a fita do TDNA e a transfere para o núcleo;
Região E: codifica peptídeos que vão enrolar o TDNA;
Região F: envolvida com o espectro de hospedeiro;
Região G: codifica para uma proteína reguladora G que vai
ativar as regiões B, C, D e E a serem transcritas.
Regiões do PLASMÍDEO DE A.
tumefaciens
c) Região Occ – Nesse grupamento estão os
genes
que
codificam
para
síntese
e
catabolismo de opinas.
d) Região Rep – Aqui estão os genes
responsáveis
pela
auto-replicação
do
plasmídeo.
e) Região Tra – A expressão de genes
situados nessas duas regiões origina produtos
que governam a transferência do plasmídeo Ti
para
outras
espécies
compatíveis
de
Agrobacterium.
PLASMÍDEO DE A. tumefaciens
A expressão dos genes do plasmídeo resulta na
síntese de auxinas e citocininas, que levam à
formação de tumores em plantas, e aminoácidos
modificados (opinas), substâncias necessárias para a
sobrevivência da bactéria.
Desta forma, o Agrobacterium transfere alguns de seus
genes para a planta, com os seus plasmídeos Ti, que
representam vetores naturais de transferência de
material genético para plantas.
Fase 1 – A bactéria penetra e necessita ligar-se a sítios
receptores na parede da célula vegetal.
Fase 2 – Após a ligação da célula bacteriana a sítios receptores
na parede da célula da planta, inicia-se a expressão dos genes
Vir, localizados na região Vir do Plasmídeo Ti, devido à
presença de moléculas liberadas pela planta no local do
ferimento (fenóis, açúcares e também de prótons),
O processo infectivo – eventos e requerimentos
O ponto crítico para a bactéria conseguir
infectar a planta é estarem as células dessa
última "competentes" ou em "estado de
competência" para receber o fragmento de
genoma a ser inserido.
Os ferimentos são essenciais para que a
infecção aconteça, não só por serem portas
de entrada como também por alterarem a
fisiologia do tecido no local e facilitar o
contato entre as células do patógeno e do
hospedeiro, por exporem sítios receptores
nas últimas.
O processo infectivo – eventos e requerimentos
Outro evento importante é a tentativa
de reparo realizada pela planta. Assim
que o ferimento ocorre, células da
planta sofrem alguns ciclos de divisão
com este fim, como se fosse uma
tentativa imediata e biológica de
cicatrização.
Embora ainda não esteja muito claro de
que forma, parece que essa divisão
celular, de algum modo, aumenta a
eficiência com que o T-DNA é
transferido.
O processo infectivo – eventos e requerimentos
Quando o ferimento ocorre, células do
hospedeiro circunvizinhas do local iniciam uma
resposta inespecífica de defesa que inclui a
síntese de compostos fenólicos, de
açúcares envolvidos na síntese da parede
celular e há liberação de íons H+ nos espaços
intercelulares, o que culmina com o
abaixamento do pH no local do ferimento.
Fenóis, juntamente com os açúcares e os
íons H+ são reconhecidos bioquimicamente
pela bactéria infectante e servem para
desencadear os fenômenos seguintes.
Transformação genética de plantas
Para aproveitar-se destas propriedades naturais para a
transferência de genes de interesse em plantas, é
necessário eliminar as características indesejáveis do
T-DNA, mantendo a sua capacidade de integrar-se ao
genoma da planta hospedeira e, no lugar deles, devem ser
inseridos os genes de interesse.
Com as enzimas de restrição, é possível executar a
substituição destes genes sem interferir nas propriedades
que permitem a integração do T-DNA ao DNA da célula
hospedeira.
Assim, qualquer gene pode ser introduzido em uma célula
vegetal utilizando-se esta ferramenta oferecida pela própria
natureza.
Linhagem desarmada
É
a
linhagem
de
Agrobacterium que teve
seus
oncogenes
deletados
Desarmamento de cepa
Agrobacterium tumefaciens
Transformação genética de plantas
Inserção de TDNA
Avaliação da eficiência da transformação uso de marcadores visuais
Contagem do número de células ou tecidos que
expressem um gene reporter: GUS (β-glucuronidase- cor
azul), GFP (proteína verde fluorescente). Assim que eles
chegam na planta são facilmente identificados pela
coloração ou outro método.
Resumo da transformação
genética de célula vegetal
1. Preparo do plasmídeo- deleção dos oncogenes (cerca de 7)
e substituição por genes de interesse e gene de resistência a
uma antibiótico e/ou marcador visual;
2. Inserção do plasmídeo modificado na bactéria A.
tumefaciens = linhagem desarmada;
3. Cultivo da bactéria com os explantes (fragmentos dos
tecidos da planta) para que ocorra a infecção;
4. Eliminação das células não transformadas por ação de
um antibiótico;
4. Regeneração da planta a partir de células transformadas,
que vai produzir a nova característica adicionada à planta por
meio da transformação genética.
Referências
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http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio32/nutricional_32.pdf.
SERAFINI, L. A.; BARROS, N. M; AZEVEDO, J. L. Biotecnologia na agricultura
e na agroindústria. Cap 8. Plantas transgênicas. Guaíba: livraria e editora
agropecuária, 2001.
VIDAL, M. S. Regeneração e Transformação Genética de Plantas. Circular
técnica.
2002.
Disponível
em:
https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CNPA/19611/1/CIRTEC64.pdf;
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genes para plantas. Biotecnologia - Ciência e desenvolvimento. Disponível em:
http://www.cestadual.com/2012/agrobacterium.pdf.
ANDRADE, S. R. M. Transformação de plantas. EMBRAPA, 2003. Disponível
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