Texto completo - Fiocruz Minas

MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS RENÉ RACHOU
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
EFEITO DA TEMPERATURA NA INFECÇÃO DE RHODNIUS PROLIXUS POR
TRYPANOSOMA CRUZI E TRYPANOSOMA RANGELI.
por
Juliana de Oliveira Rodrigues
BELO HORIZONTE
FEVEREIRO / 2013
DISSERTAÇÃO
MDIP-CPqRR
J.O. RODRIGUES
2013
MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS RENÉ RACHOU
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
EFEITO DA TEMPERATURA NA INFECÇÃO DE RHODNIUS PROLIXUS POR
TRYPANOSOMA CRUZI E TRYPANOSOMA RANGELI.
por
Juliana de Oliveira Rodrigues
Dissertação apresentada com vistas
à obtenção do Título de Mestre em
Ciências na área de concentração
Doenças Infecciosas e Parasitárias
Orientação: Dra. Alessandra Aparecida Guarneri
BELO HORIZONTE
FEVEREIRO / 2013
II Catalogação-na-fonte
Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ
Biblioteca do CPqRR
Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975
R696e
2013
Rodrigues, Juliana de Oliveira.
Efeito da temperatura na infecção de Rhodnius
prolixus por Trypanosoma cruzi e Trypanosoma
rangeli / Juliana de Oliveira Rodrigues. – Belo
Horizonte, 2013.
XVIII, 83 f.: il.; 210 x 297mm.
Bibliografia: f. 79 - 101
Dissertação (mestrado) – Dissertação para
obtenção do título de Mestre em Ciências pelo
Programa de Pós - Graduação em Ciências da Saúde
do Centro de Pesquisas René Rachou. Área de
concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias.
1. Doença de Chagas/transmissão 2. Trypanosoma
cruzi/parasitologia
3.
Trypanosoma
rangeli/parasitologia 4. Interações HospedeiroParasita/fisiologia I. Título. II. Guarneri, Alessandra
Aparecida (Orientação).
CDD – 22. ed. – 616.936 3
III MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS RENÉ RACHOU
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
EFEITO DA TEMPERATURA NA INFECÇÃO DE RHODNIUS PROLIXUS POR
TRYPANOSOMA CRUZI E TRYPANOSOMA RANGELI.
por
Juliana de Oliveira Rodrigues
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Alessandra Aparecida Guarneri (Presidente)
Prof. Dr. Rodrigo Pinto Soares
Profa. Dra. Andrea Mara Macedo
Dissertação defendida e aprovada em: 28/02/2013
IV Aos meus pais e ao meu irmão.
A todos aqueles que de alguma maneira contribuíram para a minha formação
pessoal e profissional.
V “Todo o futuro da nossa espécie, todo o governo das sociedades, toda a
prosperidade moral e material das nações dependem da ciência, como a vida do
homem depende do ar. Ora, a ciência é toda observação, toda exatidão, toda
verificação experimental. Perceber os fenômenos, discernir as relações, comparar as
analogias e as dessemelhanças, classificar as realidades, e induzir as leis, eis a
ciência; eis, portanto, o alvo que a educação deve ter em mira.”
Rui Barbosa
VI AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Alessandra Guarneri, por ter acreditado no meu potencial e
confiado a mim esse trabalho. Pela oportunidade de aprendizado e orientação que
me proporcionaram um rico conhecimento científico e profissional. Pelos conselhos
e amizade construída ao longo desses anos de convivência.
Ao Dr. Marcelo Gustavo Lorenzo, pela colaboração e disponibilidade para
enriquecedoras discussões científicas.
Ao Profo. Dr. Simon Elliot, Sam, pela colaboração nesse projeto.
Ao Profo. Dr. Olindo Assis, pelo auxílio na técnica de Citometria de Fluxo.
À Dra. Liléia Diotaiuti por ter me recebido no laboratório de Triatomíneos.
À Dra. Juliana Alves da Silva, Ju, que caiu do céu como um anjo e contribuiu
imensamente para os experimentos de biologia molecular e análises dos dados.
Pela imensurável ajuda e convivência prazerosa.
Aos professores da pós-graduação pelos ensinamentos. De maneira especial
ao Dr. João Carlos Pinto Dias pelo exemplo de profissional e pela acolhida sempre
carinhosa.
Ao Profo. Dr. Jarbas que me ingressou na carreira científica.
À Rafa Paim, pela disponibilidade em ajudar nos experimentos e escrita. Pelo
incentivo e amizade. Pelas risadas e bons momentos vividos nas viagens a
congressos.
À minha pequena grande amiga Robertinha! Pela imensurável ajuda. Pela
alegria contagiante mesmo nos dias mais difíceis. Pela paciência e conselhos. Pelos
inúmeros bons momentos vividos no cotidiano e viagens. Pela compreensão,
carinho e palavras de incentivo.
À Fellet, Thessinha, Lelê e Lu que dividiram comigo momentos de aflições e
angustias, mas, sobretudo de felicidade! Pela amizade sincera!
Ao New, por estar sempre disposto a ajudar com um sorriso no rosto.
Ao João Victor, pelo ajuda nas formatações. Pela amizade, carinho e sábios
conselhos.
Ao Luis, pelas palavras de força e estímulo.
VII À Fabi, que entrou na minha vida por acaso e conquistou minha amizade com
seu jeito alegre e admirável de viver! Pela amizade sólida e verdadeira. Pelas boas
risadas e momentos únicos!
À Gabizinha, anjinho que trouxe outro anjo para a minha vida!
À Ana Lu, amiga confidente que conquistou minha admiração e carinho. Por
entender minhas inquietudes e saber acalmar meu coração. Por estar sempre ao
meu lado mesmo com a distância física.
À Laurinha, por estar sempre presente. Por entender a minha ausência e
estar sempre disposta a momentos de descontração para aliviar o estresse. Por
todos os conselhos, incentivo e força.
À Raquelita e a Elisuda pelos momentos diários de descontração e boas
risadas!
À Gina, pela recepção tão carinhosa na minha chegada ao laboratório.
Aos demais colegas do laboratório, simplesmente pelo agradável convívio.
Em especial ao João Paulo, José Manuel, Marinely e Ivana.
Ao Thi, pelo amor sem medidas. Pela compreensão e paciência nos períodos
de estresse. Por entender o meu momento e abdicar de datas festivas para estar ao
meu lado. Pela cumplicidade e por cada gesto e demonstração de amor e carinho!
Ao meu irmão, Xand, alicerce da minha vida! Pela amizade e carinho que traz
uma leveza a mais para minha vida!
À minha mãe, meu verdadeiro exemplo de vida, fé e coragem. Pelo amor
incondicional. Por acreditar em mim sempre. Ao meu pai, meu exemplo de
superação e força. Por não terem medido esforços para a minha formação, abrindo
mão dos próprios sonhos em prol dos meus!
A Deus, meu motivo de força que nunca me deixou desistir dos meus
objetivos e sonhos. Por iluminar o meu caminho e me amparar nos momentos mais
difíceis.
Muito obrigado!
VIII Agradeço às instituições financeiras que apoiaram diretamente esse trabalho:
Ao Centro de Pesquisas René Rachou / FIOCRUZ, pela oportunidade de
realizar esse trabalho;
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde do Centro de
Pesquisas René Rachou;
A Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais – FAPEMIG,
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq;
Ao INCT, Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia.
Agradeço também a Biblioteca do CPqRR, pela catalogação e normalização
da dissertação.
IX SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ XII LISTA DE TABELAS .............................................................................................. XIV LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ............................................................ XV RESUMO ................................................................................................................ XVI ABSTRACT ........................................................................................................... XVII 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19 2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 22 2.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 22 2.2 Objetivos Específicos....................................................................................... 22 3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 24 3.1 Triatomíneos .................................................................................................... 24 3.2 Associações entre triatomíneos e o Trypanosoma cruzi.................................. 27 3.3 Associações entre triatomíneos e Trypanosoma rangeli ................................. 30 3.4 O papel da temperatura no desenvolvimento de insetos e nas interações com
seus parasitos........................................................................................................ 34 4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 38 4.1 – Triatomíneos ................................................................................................. 38 4.2 – Parasitos ....................................................................................................... 38 4.3 – Avaliação do crescimento dos parasitos em meio de cultura, submetidos a
diferentes temperaturas. ........................................................................................ 39 4.3.1 - Reagentes e Soluções ............................................................................ 39 4.3.2 – Marcação dos Parasitos ......................................................................... 40 4.3.3 – Ensaio Biológico ..................................................................................... 40 4.4 – Avaliação do desenvolvimento de insetos infectados submetidos a diferentes
temperaturas.......................................................................................................... 42 4.4.1 - Infecção por Trypanosoma cruzi ............................................................. 42 4.4.2 - Infecção por Trypanosoma rangeli .......................................................... 42 X 4.5 – Quantificação do Trypanosoma cruzi no trato intestinal de Rhodnius prolixus,
em insetos submetidos a diferentes temperaturas ................................................ 43 4.5.1 - Infecção por Trypanosoma cruzi e ensaio biológico ............................... 43 4.5.2 – Extrações de DNA .................................................................................. 45 4.5.3 – PCR quantitativo em Tempo Real .......................................................... 45 4.6 – Análises Estatísticas ..................................................................................... 47 5 RESULTADOS....................................................................................................... 49 5.1 - Avaliação do crescimento dos parasitos em meio de cultura, submetidos a
diferentes temperaturas ......................................................................................... 49 5.2 – Avaliação do desenvolvimento de insetos infectados submetidos a diferentes
temperaturas.......................................................................................................... 52 5.2.1 Insetos infectados por Trypanosoma cruzi ................................................ 52 5.2.2 Insetos infectados por Trypanosoma rangeli............................................. 56 5.3 – Quantificação do Trypanosoma cruzi no trato intestinal de Rhodnius.
prolixus, em insetos submetidos a diferentes temperaturas .................................. 62 7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 77 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 79 XI LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ciclo biológico de Rhodnius prolixus representando o desenvolvimento
do tipo paurometábolo dos triatomíneos (Foto: Newmar Pinto Marliére). Legenda: NI,
ninfa de primeiro estádio; NII, ninfa de segundo estádio; NIII, ninfa de terceiro
estádio; NIV, ninfa de quarto estádio e NV, ninfa de quinto estádio.......................24
Figura 2 – Ciclo Biológico do T. cruzi no triatomíneo (hospedeiro invertebrado).
(Adaptado de Garcia et al., 2007) .............................................................................28
Figura 3 – Ciclo biológico do T. rangeli no triatomíneo (hospedeiro invertebrado).
(Adaptado de Grisard e Steindel, 2003).....................................................................32
Figura 4 – Caixas de temperatura controladas, mantidas em estufa BOD, onde
foram realizados os ensaios.......................................................................................41
Figura 5 – Esquema do tubo digestivo de um triatomíneo. As setas indicam cada
porção do tudo digestivo (Adaptado de Garcia et al., 2007)......................................43
Figura 6 – Crescimento de epimastigotas de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma
rangeli em cultura, mantidos em diferentes temperaturas. As barras de erro
representam a média de duas repetições..................................................................50
Figura 7 – Mortalidade de epimastigotas de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma
rangeli em cultura, mantidos em diferentes temperaturas. Foram incluídos os dados
de células coradas com PI e com FDA+PI, indicativo de células mortas ou em
processo de morte celular. As barras de erro representam a média de duas
repetições..................................................................................................................51
Figura 8 – Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi no período necessário para
alcançar o terceiro estádio de ninfas de Rhodnius prolixus mantidas em diferentes
temperaturas. Os valores de p indicados em cada gráfico representam a
significância estatística das comparações entre os tratamentos (Log-Rank)............53
Figura 9 – Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi nas taxas de mortalidade de
ninfas de Rhodnius prolixus mantidas a diferentes temperaturas. Os valores de p
indicados em cada gráfico representam a significância estatística das comparações
entre os tratamentos (Log-Rank)................................................................................55
XII Figura 10 – Efeito da infecção por Trypanosoma rangeli T1 no período necessário
para alcançar o quinto estádio de ninfas de Rhodnius prolixus mantidas em
diferentes temperaturas. Os valores de p indicados em cada gráfico representam a
significância estatística das comparações entre os tratamentos (Log-Rank)...........58
Figura 11 – Efeito da infecção por Trypanosoma rangeli T2 no período necessário
para alcançar o quinto estádio de ninfas de Rhodnius prolixus mantidas em
diferentes temperaturas. Os valores de p indicados em cada gráfico representam a
significância estatística das comparações entre os tratamentos (Log-Rank)...........59
Figura 12 - Quantificação através de contagem em câmara de Neubauer do número
de parasitos de Trypanosoma cruzi no trato intestinal de Rhodnius prolixus............63
Figura 13 - Quantificação por qPCR do número de parasitos de Trypanosoma cruzi
no trato intestinal de Rhodnius prolixus, 15 dias após a infecção dos insetos..........64
Figura 14 - Quantificação por qPCR do número de parasitos de Trypanosoma cruzi
no trato intestinal de Rhodnius prolixus, 30 dias após a infecção dos insetos..........65
Figura 15 - Quantificação por qPCR do número de parasitos de Trypanosoma cruzi
no trato intestinal de Rhodnius prolixus, 60 dias após a infecção dos insetos........66
XIII LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Sequências dos iniciadores específicos para T. cruzi utilizados para
amplificação dos produtos de DNA por PCR em tempo real (Cummings e Tarleton,
2003)..........................................................................................................................46
Tabela 2 – Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi no fitness de ninfas de
Rhodnius prolixus.......................................................................................................54
Tabela 3 – Efeitos da infecção por Trypanosoma rangeli no fitness de ninfas de
Rhodnius prolixus.......................................................................................................60
Tabela 4 – Taxa de infecção de ninfas de Rhodnius prolixus 30 dias pósinfecção......................................................................................................................61
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AR – Ampola Retal
BOD – Biochemical Oxygen Demand
°C – Grau Celsius
CEUA – Comitê de Ética no Uso de Animais
CO2 – Dióxido de Carbono
CPqRR – Centro de Pesquisas René Rachou
DNA – Ácido desoxiribonucléico
FDA – Diacetato de Fluoresceina
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz
IMA – Intestino Médio Anterior
IMP – Intestino Médio Posterior
Kg - kilograma
LATEC – Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas
LIT – Liver Infusion Tryptose
mg – miligramas
nM – Nanomolar
Na2HPO4 – Sódio fosfato
pb – Pares de Bases
PBS – Phosphate Buffered Saline
PI – Iodeto de Propídeo
qPCR – PCR quantitativo em Tempo Real
T1- Tratamento 1
T2 – Tratamento 2
WHO - World Health Organization
L – Microlitro
XV RESUMO
A temperatura ambiental afeta diversos processos bioquímicos, fisiológicos e
comportamentais, especialmente em animais ectotérmicos. Mudanças nesse
parâmetro podem alterar o fitness de insetos vetores e sua distribuição no
ambiente, modificando consequentemente, a dinâmica de transmissão de
doenças. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da temperatura
no desenvolvimento da infecção de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma
rangeli em Rhodnius prolixus. Os ensaios com T. rangeli foram desenvolvidos
com parasitos submetidos a dois tratamentos. T. rangeli T1 foram obtidos
através de passagens em LIT por três meses. T. rangeli T2 foram mantidos
em LIT por um mês após uma passagem triatomíneo-camundongo.
Inicialmente, o crescimento dos parasitos em meio de cultura submetidos a
diferentes temperarturas (21, 24, 27 e 30°C) foi avaliado. O crescimento do T.
cruzi foi termodependente, com um aumento de 28 vezes da população
mantida em 30°C ao final de sete dias. A mortalidade ficou abaixo dos 10%,
exceto para os parasitos mantidos a 21°C, onde esse valor ficou próximo aos
20%. Para os dois tratamentos de T. rangeli, o crescimento máximo foi
observado a 27°C. Entretanto, as populações de T. rangeli T2 cresceram
mais do que as de T. rangeli T1 e apresentaram taxas de mortalidade mais
baixas, em torno de 5%. O próximo objetivo foi avaliar diferentes parâmetros
fisiológicos de R. prolixus infectados pelos parasitos e submetidos às mesmas
condições de temperaturas. A infecção por T. cruzi prolongou o período
intermudas em todas as temperaturas e reduziu o número de insetos
aparentemente saudáveis em 20%. A virulência do parasito foi dependente da
temperatura e do estado nutricional dos insetos. T. rangeli T1 foi mais
virulento do que T. rangeli T2, particularmente nas temperaturas mais baixas.
Finalmente, o crescimento do T. cruzi no inseto foi quantificado por qPCR e
câmara de Neubauer. Os resultados, ainda preliminares, corroboraram com
os dados do crescimento do parasito em LIT. De maneira geral, os resultados
sugerem que os dois parasitos podem ser patogênicos ao vetor na natureza,
dependendo das condições a que são submetidos.
XVI ABSTRACT
Environmental temperature affects many biochemical, physiological and behavioural
processes, especially in ectotherm animals. Changes in temperature can influence
the fitness of insect vectors and modify their distribution in the environment, altering
the dynamics for disease transmission. The aim of the present study was to evaluate
the effects of temperature on the development of Trypanosoma cruzi and
Trypanosoma rangeli in Rhodnius prolixus during infection. Assays using T. rangeli
were developed with parasites which have undergone two different treatments. T.
rangeli T1 were kept in LIT medium for more than three months with weekly
passages. T. rangeli T2 were cultured in LIT medium for only one month after a
cyclical transmission in mice and triatomines. Initially, the growth of the parasites in
culture medium under different temperartures (21, 24, 27 and 30 ° C) was evaluated.
Growth of T. cruzi epimastigotes was temperature dependent, with a 28 times
increase in population size of the culture maintained at 30°C for seven days. The
mortality rate was below 10% on average, except for the parasite culture kept at
21°C in which this value was near 20%. For both T. rangeli T1 and T2 treatments the
largest population growth was observed, at 27°C. However, populations of T. rangeli
T2 presented growth rates higher than T. rangeli T1 and mortality rates were also
lower, at around 5%. The next objective was to assess various physiological
parameters of R. prolixus infected by parasites and subjected to the same
temperature conditions. T. cruzi Infection delayed moulting times at all temperatures
and reduced the number of apparently healthy insects in 20%. Parasite virulence was
dependent on temperature and nutritional status of the insects. T. rangeli T1 was
more virulent than T. rangeli T2, particularly at lower temperatures. Finally, the
growth of T. cruzi in the insect was quantified by qPCR and parasite counts using a
Neubauer chamber. The results, although preliminary, seem to corroborate the data
for parasite growth from LIT medium culture. Overall, the results suggest that the two
parasites may be pathogenic to the vector in nature, depending on the conditions
which they are subjected.
XVII INTRODUÇÃO
XVIII 1 INTRODUÇÃO
A distribuição espacial e a abundância da maioria dos seres vivos são
resultantes de interações entre parâmetros bióticos e abióticos dentro de um
ecossistema (Blanford e Thomas, 2000). A temperatura ambiental é um fator abiótico
que apresenta um efeito direto na sobrevivência de diferentes animais,
principalmente os ectotérmicos. Em insetos, as variáveis climáticas podem promover
alterações na fisiologia (Li, et al., 2011; Amarasekare e Savage, 2012), no
comportamento (Martin et al., 2011; Ipekdal e Caglar, 2012) e no tamanho do corpo
(Reiskind e Zarrabi, 2012). Para os insetos hematófagos a temperatura também
apresenta um papel fundamental como estímulo para a localização de seus
hospedeiros (Abdullah, 1961).
Sabe-se também que a temperatura ambiental pode influenciar a interação
entre hospedeiros e seus parasitos, tanto na habilidade do parasito em colonizar o
seu vetor quanto do vetor em se defender dos parasitos (Thomas e Blandford,
2003). Mudanças na temperatura podem alterar o fitness de insetos vetores,
modificando sua distribuição no ambiente e, consequentemente, alterando a
dinâmica de transmissão de doenças (Moore et al., 2002). Além disso, muitos
estudos vêm demonstrando que a capacidade de um agente patogênico matar o seu
hospedeiro depende fundamentalmente da temperatura corporal do hospedeiro, e de
como esta varia com as condições ambientais externas (Blanford e Thomas, 1999;
Inglis et al., 1997; Thomas e Blanford, 2003 ).
Os triatomíneos (Hemiptera: Reduviidae) são insetos de hábitos noturnos e
hematófagos,
que
necessitam
de
sangue
em
todas
as
suas
fases
de
desenvolvimento. São primariamente insetos silvestres, vivendo em seus ambientes
naturais associados a animais de sangue quente (Lent e Wygodzinsky, 1979).
Algumas espécies, no entanto, podem colonizar ambientes humanos, e deste modo,
o homem e seus animais domésticos tornam-se sua fonte de alimentação (Schofield,
1994).
Além disso, os triatomíneos também são vetores de protozoários parasitos,
como o Trypanosoma cruzi e o Trypanosoma rangeli. O T. cruzi é o agente
19 etiológico da doença de Chagas, e não tem sido relacionado como patogênico aos
seus hospedeiros invertebrados. O T. rangeli, embora compartilhe os mesmos
hospedeiros com o T. cruzi, não causa doença ao homem. Entretanto, este parasito
promove diferentes níveis de patogenicidade para o inseto vetor, principalmente às
espécies de gênero Rhodnius (Brecher e Wigglesworth, 1944; Friend e Smith, 1967;
D'Alessandro 1976; Eichler e Schaub, 1998; Ferreira et al, 2010). A principal
diferença no ciclo biológico dessas duas espécies, é que o T. cruzi se desenvolve
exclusivamente no interior do trato intestinal dos triatomíneos, enquanto que o T.
rangeli pode também invadir a hemocele e colonizar as suas glândulas salivares.
A influência da temperatura ambiental vem sendo amplamente estudada para
os triatomíneos (Okasha, 1964, Di Luciano, 1983, Lazzari, 1991, Guarneri et al.,
2003). Diversos estudos mostram que a temperatura pode afetar diferentes
parâmetros biológicos dessas espécies, tais como oviposição, fecundidade,
maturidade sexual, dispersão e seleção de esconderijos (Clark, 1935, Lehane et al.,
1992, Lazzari, 1991, Schofield et al., 1992, Lorenzo e Lazzari, 1999, Botto-Mahan,
2006). Embora exista uma grande quantidade de estudos associando os fatores
climáticos e seus efeitos sobre os processos fisiológicos e comportamentais nas
diferentes fases de desenvolvimento dos triatomíneos, até o momento pouco se
sabe sobre o papel das condições abióticas na capacidade vetorial dessas espécies
considerando os efeitos da interação entre hospedeiros e patógenos. Diante disso, o
estudo das relações parasito-hospedeiro-fatores abióticos se torna essencial para
um entendimento mais amplo dos fenômenos de interação entre as espécies.
20 OBJETIVOS
21 2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos da temperatura ambiental no desenvolvimento da infecção de
Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi em Rhodnius prolixus.
2.2 Objetivos Específicos
1. Avaliar se a temperatura ambiental afeta o desenvolvimento dos parasitos em
meio de cultura;
2. Avaliar parâmetros de desenvolvimento, como período intermudas, mortalidade e
ecdise, em insetos infectados submetidos a diferentes temperaturas;
3. Avaliar quantitativamente o crescimento do T. cruzi nas diferentes porções do
trato intestinal em insetos submetidos a diferentes temperaturas e em diferentes
momentos da infecção.
22 REVISÃO DA LITERATURA
23 3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Triatomíneos
Os triatomíneos são classificados como insetos pertencentes à família
Reduviidae, subfamília Triatominae (Hemiptera, Heteroptera), definida por seu hábito
hematófago que está presente em todas as espécies desse grupo. Os triatomíneos
são paurometábolos, apresentando cinco fases ninfais e a fase adulta, sendo o
repasto sanguíneo fundamental em todos os estágios evolutivos (Figura 1).
Figura 1 - Ciclo biológico de Rhodnius prolixus representando o desenvolvimento do
tipo paurometábolo dos triatomíneos (Foto: Newmar Pinto Marliére). Legenda: NI,
ninfa de primeiro estádio; NII, ninfa de segundo estádio; NIII, ninfa de terceiro
estádio; NIV, ninfa de quarto estádio e NV, ninfa de quinto estádio.
Atualmente são reconhecidas 140 espécies de triatomíneos, divididas em
cinco tribos e 15 gêneros, sendo a maioria delas encontradas na América Latina
(Schofield e Galvão, 2009). Desse total, 61 espécies estão presentes no Brasil
(Galvão et al., 2003).
Os triatomíneos são primitivamente insetos silvestres, característica esta
mantida ainda hoje pela maioria das espécies encontradas nos focos naturais, onde
vivem associadas a uma grande variedade de animais silvestres (Sherlock, 1979).
Seu habitat primário é o interior de abrigos, tocas e ninhos de animais de sangue
quente em ocos de árvores, palmeiras, fendas de rochas, entre outros (Lent e
Wygodzinsky, 1979). Esses micro-ambientes normalmente protegem os insetos das
24 variações extremas de temperatura e umidade relativa além de permitir o fácil
acesso a fonte alimentar. Alimentam-se de uma série de hospedeiros, dentre eles,
aves, marsupiais, edentados, roedores, primatas e morcegos de várias espécies,
além de vertebrados ectotérmicos (Lent e Wygodzinsky, 1979). Os triatomíneos são
capazes de subsistir com alimentações sanguíneas abundantes e ocasionais, uma
vez que, entre os repastos, podem permanecer por longos períodos de tempo sem
desidratar-se e, aparentemente, sem sofrer danos fisiológicos (Friend e Smith,
1985).
Seu aparato bucal está adaptado para a penetração na pele do hospedeiro,
para o encontro de vasos sanguíneos apropriados e para a alimentação rápida.
Além disso, na saliva desses insetos estão presentes substâncias anticoagulantes,
anestésicas e vasodilatadoras que auxiliam na ingestão do sangue (Hellmann e
Hawkins, 1964, Ribeiro et al., 2004, Araujo et al., 2009).
Assim como os demais insetos hematófagos, os triatomíneos apresentam
uma maquinaria sensorial bem desenvolvida para localizar e escolher seus
hospedeiros (Guerenstein e Lazzari, 2009). Os triatomíneos têm em suas antenas
uma diversidade de pêlos sensoriais denominados sensilas. Essas estruturas estão
distribuídas ao longo da antena e são capazes de detectar diferentes estímulos
mecânicos, químicos, térmicos ou de umidade (Guerenstein e Lazzari, 2009). O
calor, a umidade e odores liberados pelos hospedeiros (ex. CO2, ácido lático) estão
diretamente envolvidos no processo de busca do hospedeiro pelos triatomíneos
(Barrozo et al., 2003; Lazzari e Núñez, 1989; Lehane, 2005).
Os triatomíneos são insetos de hábito noturno e desenvolvem a maioria das
suas atividades como a busca por alimento, parceiros sexuais e refúgio durante o
período da noite (Núñez, 1987, Lorenzo e Lazzari, 1993). Apresentam dois picos de
atividade, sendo um no início da escotofase, relacionado com a busca por
hospedeiro, e outro no início da fotofase, relacionado com a volta ao abrigo (Lazzari,
1992, Lorenzo e Lazzari, 1996, Guarneri et al., 2003). Além disso, apresentam
fototaxia negativa (Reisenman et al., 1998, Reisenman e Lazzari, 2006),
permanecendo na maior parte do tempo escondidos em seus abrigos em estado de
akinesis e agregados aos seus coespecíficos (Guerenstein e Lazzari, 2009; Lazzari,
1992; Lorenzo e Lazzari, 1996, Bodin et al., 2009).
25 A ação antrópica sobre a vegetação das Américas Central e do Sul permitiu a
dispersão dos triatomíneos para novos ambientes. A colonização de novos ecótopos
por triatomíneos silvestres depende de uma série de fatores, dentre eles sua
constituição genética, que confere mecanismos fisiológicos que possibilitam a
adaptação a um novo contexto ambiental, como temperatura, umidade e fontes
alimentares provavelmente diferentes dos seus ecótopos naturais (Aragão e Dias
1956, Forattini, 1980, Burgos et al., 1994, Curto de Casas et al., 1994, Schofield,
2000). Dessa maneira, algumas espécies são capazes de invadir e colonizar
ambientes peridomésticos como galinheiros e currais, e domicílios humanos, onde o
homem e seus animais domésticos, tais como o gato, cachorro, rato e coelho,
passam a funcionar como fontes de alimentação (Schofield, 1994).
Além das lesões ocasionadas pela picada e a espoliação sanguínea que
causam ao hospedeiro, os triatomíneos podem também transmitir parasitos, como o
T. cruzi e o T. rangeli. A doença de Chagas, causada pelo T. cruzi e também
conhecida como tripanossomíase americana, é uma doença humana tropical
endêmica em grandes áreas da América do Sul e Central. Entre as doenças
parasitárias, é classificada como uma das mais importantes da América Latina em
termos de impacto social e econômico (DNDi América Latina, 2010). É transmitida
aos seres humanos principalmente através das fezes de triatomíneos infectados que
são liberadas durante o repasto sanguíneo e entram em contato com a injúria
causada pela picada. Outras formas de transmissão incluem a via congênita, a
transfusional, a ingestão acidental de T. cruzi, além de outras de menor relevância
epidemiológica (Dias, 1979; Schofield, 1994). Estima-se que 10 milhões de pessoas
estão infectadas em todo o mundo, principalmente na América Latina onde a doença
é endêmica, e mais de 25 milhões de pessoas se encontram em áreas de
transmissão (WHO, 2012).
As taxas de infecção natural de triatomíneos por T. cruzi variam muito entre
espécies e de acordo com a sua proximidade de contato com os reservatórios de
parasitos. Entre a maioria dos triatomíneos domésticos, não mais do que 5% são
infectados (ver revisão Coura e Borges-Pereira, 2010).
O R. prolixus é um dos vetores mais eficientes na transmissão do T. cruzi
(Borges-Pereira et al., 1988). Assume-se que essa espécie evoluiu de uma forma
26 ancestral de Rhodniini da região Amazônica, tornando-se altamente adaptado ao
habitat doméstico e peridoméstico, em diversos países da América Central e do Sul,
sobretudo na Venezuela e Colômbia, onde continua a ser um importante vetor
doméstico de T. cruzi (Schofield e Galvão, 2009). Isto se deve a alta susceptibilidade
desse triatomíneo à infecção pelo T. cruzi e a sua elevada capacidade reprodutiva,
podendo chegar a três gerações por ano. A espécie também possui uma alta
capacidade de disseminação e domiciliação além de apresentar taxas de infecção
que podem ser superiores a 30% (Peñalver, 1958; Dorn et al., 2001; Monroy et al.,
2003).
Assim como pode ocorrer em outras espécies de triatomíneos do gênero
Rhodnius, o R. prolixus pode manter infecções mistas de T. cruzi e T. rangeli que
podem ser igualmente transmitidas aos hospedeiros mamíferos, inclusive o homem.
Este fato tem importância médica e epidemiológica, uma vez que a infecção humana
pelo T. rangeli ocasiona reações sorológicas cruzadas com o T. cruzi, dificultando o
diagnóstico da doença de Chagas (Hudson et al., 1988).
Apesar de não ser encontrado no Brasil, R. prolixus é amplamente utilizado
como modelo experimental uma vez que vários processos fisiológicos de insetos
foram inicialmente estudados na espécie (Wigglesworth, 1934, 1936, 1940).
3.2 Associações entre triatomíneos e o Trypanosoma cruzi
O T. cruzi pertence à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae. É um
protozoário heteroxênico que infecta triatomíneos e mamíferos nas Américas. Este
parasito apresenta alta plasticidade controlada geneticamente, o que lhe confere
adaptação para cerca de 40 espécies de triatomíneos e para mais de 1.000 espécies
de mamíferos, cumprindo diversas exigências metabólicas em seu complexo ciclo de
vida (Teixeira et al., 2009). Entretanto, ao longo da história evolutiva entre
hospedeiros e tripanosomas, ambos vêm desenvolvendo mecanismos estratégicos
para facilitar o desenvolvimento do parasito, no caso dos tripanosomas, ou
interromper seu desenvolvimento, no caso dos hospedeiros (Gaunt e Miles, 2000;
Azambuja, 2005; Garcia, 2007).
27 O T. cruzi tem um ciclo evolutivo complexo que apresenta formas
morfológicas e funcionais distintas, alternando entre as fases de divisão e fases não
replicativas. Entre as formas de divisão estão as epimastigotas, presentes no
intestino do vetor e também observadas durante a fase logarítmica de crescimento
em culturas axênicas, e amastigotas, encontradas em células de mamíferos. Já as
formas não replicativas incluem tripomastigotas metacíclicos encontrados nas fezes
e na urina do vetor e na fase estacionária de crescimento em culturas axênicas do
parasito, e tripomastigotas encontrados na corrente sanguínea de mamíferos e em
fase líquida de cultura de parasitos em célula (Hoare e Wallace, 1966; Tyler e
Engman, 2001).
No hospedeiro invertebrado o ciclo do parasito inicia-se quando o triatomíneo
ingere formas tripomastigotas durante o repasto sanguíneo em mamíferos
infectados. O parasito se diferencia e divide sob a forma epimastigota no intestino
médio posterior do inseto (Ferreira et al., 2011) e se diferencia na ampola retal em
formas tripomastigotas metacíclicas que serão liberadas juntamente com as fezes e
poderão ser transmitidas a outros mamíferos no próximo repasto (Figura 2). No
hospedeiro mamífero, as formas tripomastigotas são capazes de invadir diferentes
tipos celulares onde se diferenciam em formas amastigotas que se dividem e vão
gerar os tripomastigotas sanguíneos, que entram na circulação e são as formas
infectantes para o triatomíneo (Brener, 1973; Zeledon, 1987; Garcia e Azambuja,
1991).
Figura 2 – Ciclo Biológico do T. cruzi no triatomíneo (hospedeiro invertebrado)
(Adaptado de Garcia et al., 2007).
28 A presença do T. cruzi no intestino do hospedeiro invertebrado desencadeia
uma série de reações imunológicas que irão interagir com o parasito, interferir na
sua capacidade de colonização e afetar a sua sobrevivência. Fatores como
temperatura, pH e estado nutricional do vetor também podem interferir nessa
interação. Além disso, substâncias produzidas pelo inseto como, por exemplo,
componentes da saliva, lisozimas, defensinas, lectinas e aglutininas estão também
envolvidas na resposta imunológica do vetor à presença do T. cruzi (ver revisão
Garcia et al., 2010). Embora a maioria das bactérias presentes ao longo do intestino
dos triatomíneos seja considerada comensal (Schaub 2009), algumas espécies
apresentam atividade tripanolítica, podendo provocar a lise de determinadas cepas
do parasito (Azambuja et al., 2004).
O intestino médio anterior de R. prolixus produz um fator hemolítico, que afeta
o desenvolvimento do T. cruzi (Azambuja et al., 1983). Além disso, as glândulas
salivares de T. infestans produzem uma proteína, denominada de trialisina, que tem
a capacidade de lisar tripomastigotas de T. cruzi (Amino et al., 2002). Além dos
fatores presentes no lúmen e tecidos intestinais do vetor, um período de jejum muito
prolongado dos insetos pode levar a uma escassez nutricional dos parasitos e
culminar na eliminação da infecção (Schaub et al., 1989). O T. cruzi presente no
intestino do vetor parece competir por nutrientes, uma vez que em situações de
jejum, a resistência dos insetos é reduzida (Schaub, 1989). Um dos nutrientes
provenientes do sangue ingerido e sabidamente utilizado pelo T. cruzi é o heme, que
não é produzido pelo parasito e precisa ser adquirido de seus hospedeiros (Salzman
e cols., 1982; Lombardo e cols., 2003).
Embora exista uma intensa colonização do intestino do vetor por diferentes
cepas de T. cruzi, a literatura sugere que este parasito não é patogênico ao seu
hospedeiro invertebrado (Eichler e Schaub, 2002). Estudos de microscopia
eletrônica revelaram que a infecção do T. infestans pelo T. cruzi não afeta a
produção das membranas perimicrovilares que se formam após a alimentação
(Billingsley e Downe, 1983) ou as microvilosidades do intestino posterior, sendo que
aparentemente, os parasitos permanecem aderidos ao epitélio intestinal pelos
flagelos (Kollien et al., 1998). A análise do desenvolvimento dos simbiontes Nocardia
29 sp. e Rhodococcus rhodnii no intestino de Triatoma infestans e R. prolixus,
respectivamente, na presença do T. cruzi, mostrou que o parasito não afeta as taxas
de crescimento dessas bactérias (Eichler e Schaub, 2002).
Estudos prévios não demonstraram uma influência do parasito no
desenvolvimento do vetor (Juarez, 1970; Zeledón, 1970; Santos e Lacombe, 1985;
Schaub 1978, 1988), entretando, Lima et al., (1992) mostraram uma diminuição no
número de ovos postos por fêmeas de Panstrongylus megistus infectadas pelo T.
cruzi. Um estudo experimental com Mepraia spinolai infectados através de repetidas
alimentações em camundongos infectados por T. cruzi demonstrou que os insetos
tiveram um prolongamento no tempo de muda e apresentaram uma redução em
diferentes variáveis relacionadas ao tamanho do corpo, inclusive no tamanho das
gônadas (Botto-Mahan et al., 2008).
Alterações comportamentais também têm sido observadas em triatomíneos
infectados por T. cruzi. Botto-Mahan et al. (2006) demonstraram que Mepraia
spinolai infectados pelo T. cruzi respondem mais rapidamente a sinais da presença
de potenciais hospedeiros quando comparados a insetos não infectados. Além
disso, M. spinolai infectados picam mais vezes e defecam mais rapidamente que
insetos não infectados, o que poderia implicar em um aumento nas chances de
transmissão do parasito ao hospedeiro vertebrado (Botto-Mahan et al., 2006).
Rodrigues et al. (2008) avaliaram o comportamento de fototaxia negativa de
ninfas de R. prolixus infectadas por T. cruzi e não encontraram diferenças em
relação aos insetos controle. Entretanto, a atividade locomotora de ninfas infectadas
foi reduzida na escotofase (Marliére et al., 2011), período em que os triatomíneos
saem dos abrigos à procura de fontes de alimentação ou parceiros sexuais.
3.3 Associações entre triatomíneos e Trypanosoma rangeli
O Trypanosoma rangeli é também um parasito heteroxênico que compartilha
com o T. cruzi os mesmos hospedeiros invertebrados e vertebrados, incluindo o
homem e animais domésticos. Apesar de não ser patogênico ao homem, o parasito
é capaz de induzir uma resposta imune humoral com elevados títulos de anticorpos,
os quais determinam uma elevada reatividade cruzada com antígenos do T. cruzi,
30 dificultando o diagnóstico sorológico da doença de Chagas, especialmente em sua
fase crônica (Schotelius, 1987; Grisard et al., 1999). Ao analisar formas
epimastigotas de cultura do T. rangeli, Afchain e colaboradores (1979) verificaram
que este compartilha cerca de 60% de sua constituição antigênica solúvel com o T.
cruzi, o que explicaria a reatividade sorológica cruzada e os consequentes
resultados falso-positivos que incorrem em um elevado custo sócio-econômico.
Estes dados foram confirmados em um estudo que utilizou diferentes cepas e
formas do T. rangeli e soros de pacientes apresentando distintas formas clínicas da
doença de Chagas (Moraes et al., 2008).
Pouco se sabe a respeito do curso da infecção no hospedeiro vertebrado,
sendo que vários estudos demonstram que a taxa de infectividade de diferentes
cepas deste parasito frente a linhagens celulares distintas (fagocíticas e não
fagocíticas) é sempre muito baixa e os parasitos tendem a desaparecer ao longo do
tempo
de
interação,
sugerindo
a
ausência
de
multiplicação
intracelular,
especialmente observada em macrófagos (Molyneaux, 1973; Osorio et al., 1995;
Tanoura et al., 1999; Eger-Mangrich et al., 2001).
Nos
hospedeiros
invertebrados,
o
ciclo
inicia-se
quando
formas
tripomastigotas são ingeridas durante o repasto sanguíneo em um hospedeiro
mamífero infectado. Quando atingem o intestino médio anterior, os parasitos se
diferenciam em formas epimastigotas e tornam-se capazes de se multiplicar
colonizando todo o trato intestinal do inseto (Ferreira et al., 2011). As formas
epimastigotas podem cruzar o epitélio intestinal e atingir a hemocele. Uma vez na
hemolinfa, os parasitos continuam se dividindo, migram e invadem as glândulas
salivares, onde se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos, formas infectantes
que podem ser transmitidas para os hospedeiros vertebrados durante o repasto
sanguíneo do vetor (D'Alessandro, 1976; D'Alessandro-Bacigalupo e Saraiva,1992).
31 Figura 3 – Ciclo biológico do T. rangeli no triatomíneo (hospedeiro invertebrado)
(Adaptado de Grisard e Steindel, 2003).
A presença do parasito no trato intestinal do vetor pode persistir ao longo de
toda a vida do inseto. Entretanto, diferentemente da forma clássica de transmissão
do T. cruzi, as formas encontradas nas fezes do vetor não parecem ser infectivas
(Rentifo et al., 1950; D’Alessandro, 1976; Tobie, 1964; Hecker et al., 1990).
Em infecções naturais, a porcentagem de insetos que apresentam parasitos
ao longo do trato intestinal e também na hemolinfa e glândulas salivares é variável,
ficando entre 2 e 50% (Añez et al., 1987; Groot, 1954; Hecker et al., 1990;
Marinkelle, 1968; Tobie, 1965, 1970; Ferreira et al., 2010). Ainda não se sabe os
fatores envolvidos no desenvolvimento de infecções completas por T. rangeli.
Pequenas alterações nos resíduos de açúcar das glicoproteínas de superfície
presentes nos trypanosomatídeos poderiam contribuir para o aumento ou diminuição
da porcentagem de parasitos que conseguem penetrar o epitélio intestinal e alcançar
a hemocele e as glândulas salivares (Rudin et al.,1989).
Uma importante descoberta sobre a interação do T. rangeli com o hospedeiro
invertebrado foi a influência que a infecção pelo parasito tem sobre as populações
32 de simbiontes do intestino de R. prolixus (Eichler e Schaub, 2002). A diminuição no
número de simbiontes ocasionada pela presença do T. rangeli pode levar a uma
série de efeitos deletérios ao vetor, que incluem o retardo do desenvolvimento ninfal
(Brecher e Wigglesworth, 1944; Lake e Friend, 1967), aumento nas taxas de
mortalidade (Harrington, 1960), distúrbios na digestão e excreção (Brecher e
Wigglesworth, 1944; Eichler e Schaub, 1998) e reduções do sistema traqueal
(Eichler e Schaub, 1998).
Uma vez na hemolinfa, o T. rangeli é reconhecido pelo sistema de defesa do
inseto e inicia-se uma série de eventos celulares e humorais que irão atuar como
fatores limitantes para o desenvolvimento do parasito, incluindo a produção de
lisozimas de atividade tripanolítica, ativação do sistema pró-fenoloxidase, fagocitose
e microagregação de hemócitos, aglutinação e produção de ânions superóxido (ver
revisão Garcia et al., 2010). Sabe-se que a resposta imune do inseto é voltada
preferencialmente formas curtas do parasito enquanto que formas longas seriam
responsáveis pela manutenção da infecção bem como, pela invasão das glândulas
salivares (Mello et al., 1995, 1999; Gomes et al., 1999, 2003). Deste modo, estas
formas epimastigotas longas do T. rangeli estariam funcionando como o escape do
parasito frente às respostas imunológicas do inseto. A presença do parasito na
hemolinfa pode afetar a sobrevivência do inseto bem como prolongar o seu
desenvolvimento. Além disso, insetos que apresentam infecções massivas na
hemolinfa podem exibir alterações morfológicas (Grewal, 1957; Tobie, 1961; Añez,
1984). Outra característica marcante em insetos que apresentam altas taxas de
infecção é a elevada mortalidade durante o processo de muda, além daqueles que
não conseguem sair da antiga cutícula (Añez, 1984). Recentemente, Ferreira et al.
(2010) demonstraram que a infecção pelo T. rangeli leva a um aumento na
quantidade de lipídeos e de corpos gordurosos na hemolinfa de R. prolixus e que a
sua presença exclusivamente na hemolinfa é suficiente para provocar alterações no
desenvolvimento dos insetos, inclusive prolongando o período entre mudas.
O último estágio de desenvolvimento do T. rangeli no hospedeiro invertebrado
ocorre no interior das glândulas salivares. Os mecanismos de invasão utilizados
pelos epimastigotas para penetrar nas glândulas salivares do hospedeiro
invertebrado ainda estão pouco esclarecidos. Sabe-se que lectinas e carboidratos
presentes na superfície do parasito estão envolvidos neste processo (Basseri et al.,
33 2002). Uma redução significativa das proteínas estocadas nas glândulas salivares
de R. prolixus, incluindo aquelas com funções anti-hemostáticas como as
nitroforinas, foi observada durante a infecção pelo T. rangeli (Paim et al., 2013). Esta
redução afeta o comportamento alimentar do inseto, levando a um aumento
significativo no número de picadas e reduzindo a sua habilidade de ingerir sangue
de hospedeiros vertebrados, consequentemente, aumentando as chances de
transmissão do T. rangeli (Garcia et al.,1994). Um estudo recente também
demonstrou que a infecção pelo T. rangeli promove a inibição da atividade de uma
tirosina fosfatase levando a uma redução da atividade da enzima responsável pela
produção de óxido nítrico, o que poderia contribuir para o aumento no tempo de
ingestão sanguínea pelo vetor (Gazos-Lopes et al., 2012).
A infecção por T. rangeli também promove alterações comportamentais no
inseto vetor. Ninfas de R. prolixus infectadas pelo parasito apresentaram uma
redução no comportamento de fototaxia negativa, permanecendo mais tempo
expostas à luz do que os insetos controle (Ferreira et al., 2011). A infecção também
alterou a atividade locomotora dos insetos que foi maior do que a exibida pelos
insetos do grupo controle durante a escotofase e a fotofase (Marliére et al., 2011). A
avaliação do comportamento de utilização de refúgios mostrou que insetos
infectados apresentaram uma movimentação mais intensa na presença de estímulos
provenientes de um hospedeiro vertebrado e se mantiveram fora do abrigo após a
retirada do estímulo, mesmo durante a fase de iluminação (Marliére et al., 2010).
3.4 O papel da temperatura no desenvolvimento de insetos e nas interações
com seus parasitos
As associações parasito-hospedeiro são elementos não aparentes dentro de
uma comunidade ecológica e afetam as relações de competição intra e
interespecíficas, a distribuição e abundância de espécies e a própria composição da
comunidade (Horwitz e Wilcox, 2005; Thomas et al., 2005). Sendo assim, os
parasitos e seus hospedeiros não podem ser considerados isoladamente nem serem
separados da comunidade da qual fazem parte, sendo necessário incluir também
nos estudos de interação as propriedades do ambiente onde habitam (Thrall et al.,
2007).
34 A maioria dos estudos evolutivos sobre mudanças adaptativas na resistência
ou suscetibilidade de hospedeiros e/ou virulência de parasitos normalmente não
consideram os fatores bióticos e abióticos como tendo algum papel nas interações
parasito-hospedeiro (Bull, 1994; Frank, 1996; Kraaijeveld et al., 1998; Dieckmann et
al., 2002). Como resultado, o efeito de fatores extrínsecos na resistência ou
virulência durante uma interação tem recebido pouca atenção. Entretanto, diversos
estudos vêm demonstrando que a suscetibilidade do hospedeiro e a virulência do
parasito são dependentes de condições abióticas (ex. Ferguson e Read, 2002; Elliot
et al., 2002) e que uma condição chave parece ser a temperatura ambiental
(Thomas e Blanford, 2003).
Já está bem estabelecido que a temperatura afeta processos bioquímicos,
fisiológicos e comportamentais em animais e existem muitos trabalhos explorando a
sensibilidade térmica dos organismos e os fatores que influenciam a evolução das
curvas de performance térmicas (ver revisão Thomas e Blanford, 2003). Em insetos
que vivem nos trópicos, a curva de sobrevivência populacional tem a forma de um U
invertido, com a sobrevivência declinando profundamente nas temperaturas
máximas e mínimas e se mantendo constante nas temperaturas intermediárias
(Amarasekare e Sifuentes, 2012). Assim como para os demais insetos, diversos
autores têm avaliado os efeitos da temperatura sobre o desenvolvimento de vetores
como Aedes aegypti (Yang et al., 2009), Anopheles gambiae (Bayoh e Lindsay,
2004), Culex tarsalis (Dodson et al., 2012), Aedes albopictus (Reiskind et al., 2012) e
Pediculus sp. (Gallardo et al., 2009).
Os efeitos dos fatores climáticos sobre a fisiologia e o comportamento dos
triatomíneos vêm sendo estudados, dada a sua importância na distribuição desses
insetos e a sua potencial influência na capacidade dos triatomíneos de colonizar
domicílios humanos (Schofield e Patterson, 1977; Salvatella et al., 1991). A
temperatura ambiental afeta diferentes parâmetros biológicos dos triatomíneos,
como a eclosão de ovos (Clark, 1935; Guarneri et al., 2003), a fecundidade e a
maturidade sexual (Ehrenfield et al., 1998; Jörg, 1960), a dispersão de adultos
(Lehane et al., 1992) e a seleção de esconderijos (Lorenzo e Lazzari, 1999). Por
outro lado, os triatomíneos são capazes de perceber gradientes térmicos
(Wigglesworth e Gillet, 1934; Lazzari e Núñez, 1989) e de escolher a temperatura
preferida de acordo com o seu estado fisiológico (Di Luciano, 1983; Lazzari, 1991;
35 Canals et al., 1997; Pires et al., 2002; Schilman e Lazzari, 2004; Guarneri et al.,
2003).
Com relação às interações hospedeiro-parasito, existe uma gama de
possíveis influências da temperatura que incluem efeitos sobre os períodos de
infecção latente (Blanford e Thomas, 1999), expressão de doença latente (Mohamed
et al., 1985), cura do hospedeiro e mortalidade do parasito (Carruthers et al., 1992;
Kobayashi et al., 1981; Sigsgaard, 2000), replicação do parasito (Kobayashi et
al.,1981) e virulência do parasito e/ou resistência do hospedeiro (Blanford e Thomas,
1999; Arthurs e Thomas, 2000; Menti et al., 2000; Elliot et al., 2002; Blanford et al.,
2003).
As mudanças no comportamento ou na fisiologia dos insetos causadas pela
infecção e moduladas pela temperatura podem promover uma transmissão mais
eficiente do parasito ao seu hospedeiro definitivo, provavelmente aumentando o
fitness destes parasitos e possivelmente diminuindo o fitness do vetor. Tais
mudanças no comportamento do vetor podem ter potenciais implicações
epidemiológicas (Moore, 2002).
Embora exista um grande número de trabalhos publicados sobre os efeitos da
presença do parasito no desenvolvimento, fisiologia e comportamento de seus
hospedeiros, e sabendo-se que a temperatura é um fator crítico para a sobrevivência
de animais ectotérmicos, é de fundamental importância compreender o papel da
temperatura nas interações vetor/parasito. Dentro desse contexto, torna-se relevante
compreender a dinâmica de interação entre triatomíneos e tripanosomas bem como
compreender como essa relação ocorre na natureza. Espera-se que os resultados
obtidos neste trabalho possam contribuir para o desenvolvimento de estratégias e
ferramentas de controle desses vetores.
36 MATERIAIS E MÉTODOS
37 4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 – Triatomíneos
Os exemplares da espécie R. prolixus utilizados neste trabalho são
provenientes do insetário do Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da
Doença de Chagas (LATEC), de uma colônia iniciada a partir de insetos coletados
em Honduras. Os insetos foram mantidos em condições semi-controladas de
temperatura (26 ± 1°C) e umidade relativa (65 ± 10%) e em ciclo de iluminação
natural.
Os triatomíneos foram criados em frascos de plástico ou acrílico cilíndricos,
fechados com tecido de algodão, forrados com papel filtro para absorção de
umidade e contendo uma tira de cartolina no centro do pote dobrada em sanfona
para permitir uma maior superfície de contato para o inseto e facilitar a alimentação.
Os insetos foram alimentados semanalmente em galinhas ou camundongos
Swiss anestesiados (Thionembutal a 2%), ou sangue de coelho citratado obtido do
Cecal (Centro de Criação de Animais de Laboratório da Fundação Oswaldo Cruz,
FIOCRUZ – RJ).
Todos os protocolos que utilizaram animais seguiram as normas da FIOCRUZ
para a experimentação animal e foram aprovadas pelo Comitê de Ética na Utilização
de Animais (CEUA-FIOCRUZ-MG) sob o número L-058/08.
4.2 – Parasitos
Neste estudo utilizou-se a cepa CL de T. cruzi, multiclonal, isolada a partir do
vetor Triatoma infestans naturalmente infectado (Brener e Chiari, 1963) e a cepa
CHOACHI de T. rangeli, isolada das glândulas salivares de Rhodnius prolixus
naturalmente
infectado,
originado
no
Estado
de
Cundinamarca,
Colômbia
(Schotelius,1987).
Epimastigotas de T. cruzi (cepa CL) e de T. rangeli (cepa CHOACHI) foram
cultivados através de duas passagens semanais em meio LIT (Liver Infusion
38 Tryptose) acrescido de 15% de soro fetal bovino e antibiótico na concentração de
100 unidades de penicilina e 100µg de estreptomicina por mL. Os parasitos foram
cultivados em tubos cilíndricos de vidro em volume final de 3mL e mantidos em
estufa BOD à temperatura de 27°C.
A cepa de T. rangeli foi mantida através de dois diferentes tratamentos. No
primeiro (T1), os parasitos foram mantidos exclusivamente em meio LIT por um
período superior a 90 dias. No segundo tratamento (T2), os parasitos foram
mantidos em meio LIT por 30 dias, após terem sido submetidos a uma passagem
em triatomíneos, transmitidos destes para camundongos e recuperados por
hemocultura. Os dois tratamentos foram utilizados para todos os experimentos
desenvolvidos com esta espécie.
4.3 – Avaliação do crescimento dos parasitos em meio de cultura, submetidos
a diferentes temperaturas.
4.3.1 - Reagentes e Soluções
A solução estoque de Diacetato de Fluoresceína (FDA – F7378, Sigma) foi
obtida através da diluição do corante em acetona (1mg/mL) e conservada a -20°C. O
FDA é um corante vital, não polar, capaz de penetrar a membrana íntegra de células
viáveis, se difundindo passivamente. No citoplasma celular, o FDA é hidrolisado por
esterases produzindo a fluoresceína, componente que exibe fluorescência verde
quando excitado por luz azul (488nm). No ensaio, foi utilizado como marcador de
células vivas.
A solução estoque de Iodeto de Propídeo (PI – P4170, Sigma) foi obtida
através da diluição do corante em água para injeção estéril (1mg/mL), protegida da
luz e conservada a -20°C. O PI penetra em células em processo de apoptose e se
liga ao DNA de dupla fita da célula. O corante tem espectro de absorção entre 287 e
488nm e quando excitado a 630nm emite cor vermelha. No ensaio, foi utilizado
como marcador de células mortas ou em processo de morte.
39 Para a quantificação dos parasitos foi utilizada uma quantidade fixa e
conhecida de microesferas fluorescentes (FlowCountTM Fluorospheres Beckman
Coulter, PN7508092-E, LOT 7548025, concentração de 986/µL).
4.3.2 – Marcação dos Parasitos
Três diferentes procedimentos de marcação foram utilizados para cada
amostra: FDA (7 µg/mL), PI (25 µg/mL) e FDA + PI (nas mesmas concentrações).
Uma amostra sem marcação foi utilizada como controle. Um volume final de 220µl,
contendo 50µl de cultura, os corantes, 20µl de fluorosferas e PBS estéril (0.15 M
NaCl em 0.01 M de sódio fosfato (Na2HPO4), pH 7,2) foram analizados em um
citômetro de fluxo (modelo FACScan, Becton Dickinson). As análises foram
realizadas utilizando-se o programa FlowJo7.6.
4.3.3 – Ensaio Biológico
Para avaliar o crescimento dos parasitos em meio de cultura, garrafas de
cultura de 25cm2 receberam uma concentração inicial de 1x106 parasitos/mL em um
volume final de 8mL de meio LIT por garrafa. As garrafas foram imediatamente
transferidas para caixas com temperatura controlada e mantidas nas mesmas
condições durante sete dias (Figura 4). As temperaturas testadas foram de 21, 24,
27 e 30°C. Para cada nível de temperatura foram testadas simultaneamente duas
garrafas.
Diariamente uma amostra de 50L de cada garrafa foi coletada, marcada com
os corantes fluorescentes, e o número de células vivas e mortas foi contado no
citômetro de fluxo. Uma vez que o citômetro de fluxo somente conta número de
eventos sem correlacioná-los com volume, o número de parasitos foi estimado
através da sua comparação com uma quantidade conhecida de fluorosferas.
40 Figura 4 – Caixas de temperatura controladas, mantidas em estufa BOD, onde
foram realizados os ensaios.
41 4.4 – Avaliação do desenvolvimento de insetos infectados submetidos a
diferentes temperaturas
4.4.1 - Infecção por Trypanosoma cruzi
Ninfas de segundo estádio com aproximadamente sete dias de jejum foram
alimentadas em alimentador artificial contendo sangue de coelho inativado (56°C,
30min), e uma suspensão de epimastigotas de cultura de T. cruzi numa
concentração de 1 x 107 parasitos/mL. Insetos alimentados apenas com sangue
foram utilizados como controle. Um dia após a alimentação, os insetos foram
transferidos para placas de Petri contendo papel de filtro como substrato (grupo
infectado, n=126 e grupo controle, n=132; máximo oito insetos por placa). As placas
foram mantidas em câmaras com temperaturas de 21, 24, 27 e 30°C (Figura 4).
Neste ensaio foram avaliados o tempo de duração do estádio e a mortalidade
dos insetos durante um período de 90 dias após a ocorrência da ecdise. No final do
ensaio, os insetos sobreviventes foram examinados para a presença de parasitos.
4.4.2 - Infecção por Trypanosoma rangeli
A infecção dos insetos por T. rangeli foi realizada de acordo com Ferreira et
al. (2010). Ninfas de quarto estádio com sete dias de jejum foram inoculadas com
1µL de PBS estéril contendo 50 epimastigotas de cultura (5x104 par/mL). O inóculo
foi realizado diretamente na cavidade celomática do inseto utilizando-se uma seringa
Hamilton de 50µL com uma agulha acoplada (13 × 3,30 G, ½''). Um dia após o
inóculo, as ninfas foram alimentadas em camundongos anestesiados e 24 horas
após, transferidas para placas de Petri contendo papel de filtro como substrato
(n=120 para T1 e 80 para T2, máximo de seis ninfas por placa). Para cada uma das
temperaturas, insetos inoculados com o mesmo volume de PBS estéril foram
utilizados como controle (n=120 para T1 e 76 para T2, máximo de seis ninfas por
placa). As placas foram mantidas em câmaras com temperaturas de 21, 24, 27 e
30°C (Figura 4). Para os dois tratamentos de T. rangeli foram avaliados o tempo de
duração do estádio e a mortalidade dos insetos durante um período de 30 dias após
42 a ocorrência da ecdise. No final do ensaio, os insetos sobreviventes foram
examinados para a presença de parasitos na hemolinfa e nas glândulas salivares.
Para o exame da positividade da hemolinfa foi feito um corte com o auxílio de
uma tesoura fina no tarso do primeiro par de patas de cada ninfa e uma pequena
gota foi coletada diretamente em lâmina e visualizada em microscópio. Para o
exame das glândulas, a cabeça de cada ninfa foi retirada com o auxílio de pinças
finas e as glândulas foram transferidas para lâminas contendo solução salina 0,9%.
Uma lamínula foi colocada sobre o material para a visualização em microscópio em
aumento de 400x.
4.5 – Quantificação do Trypanosoma cruzi no trato intestinal de Rhodnius
prolixus, em insetos submetidos a diferentes temperaturas
4.5.1 - Infecção por Trypanosoma cruzi e ensaio biológico
Camundongos B6.129S7-IFN knockout (KO) obtidos do Biotério Central do
CPqRR foram infectados via intraperitoneal com 5.000 epimastigostas de T. cruzi.
No sétimo dia pós-infecção, a parasitemia foi contada segundo a metodologia
descrita por Brener (1962).
Ninfas de quinto estádio foram individualmente pesadas e individualizadas em
frascos plásticos (3,5 x 2cm), contendo papel de filtro como substrato e cobertos
com tecido de forma a permitir a alimentação dos insetos.
Para
a
alimentação
das
ninfas,
o
camundongo
foi
anestesiado
intraperitonealmente com uma mistura de ketamina a 150 mg/kg (Cristalia; Brasil) e
xilazina 10 mg/kg (Bayer; Brasil) e a cada ninfa foi permitido ingerir o equivalente a
30mg de sangue. Após a alimentação, as ninfas foram mantidas em câmaras com
temperaturas controladas de 21, 24, 27 e 30°C (Figura 4). No dia seguinte à
infecção, os insetos foram retirados das câmaras, alimentados em alimentador
artificial contendo sangue de coelho citratado para realizarem a alimentação
completa. Em seguida foram transferidos novamente para as câmaras com
temperatura controlada até a realização dos ensaios. Os insetos que permaneceram
43 nas câmaras por períodos superiores a 30 dias receberam uma segunda
alimentação no 45º dia pós-infecção.
A avaliação do número de parasitos foi realizada nos dias 15, 30 e 60 após a
infecção. Para cada período e temperatura testados, quatro insetos foram
individualmente dissecados e seus intestinos médio anterior, médio posterior e
ampola retal (Figura 5) transferidos para tubos cônicos contendo 20L de PBS
estéril. Durante o processo de dissecação as amostras foram mantidas em gelo e
posteriormente estocadas a -20ºC até a extração do DNA.
Para cada temperatura avaliada, amostras de dois ou mais insetos foram
também utilizadas para contagem em câmara de Neubauer. Para isso, as amostras
foram homogeneizadas e 5l de cada uma das partes dissecadas, diluídas em 45l
de PBS e 10l do material diluído utilizados para contagem.
Figura 5 – Esquema do tubo digestivo de um triatomíneo. As setas indicam cada
porção do tudo digestivo (Adaptado de Garcia et al., 2007).
44 4.5.2 – Extrações de DNA
As amostras obtidas no item 4.5.1 (de intestino médio anterior, intestino médio
posterior e ampola retal de insetos individuais) foram submetidas à extração de DNA
utilizando-se o Kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega) seguindo-se o
protocolo sugerido pelo fabricante para extração de DNA de amostras de sangue,
que se baseia em quatro etapas. Primeiramente uma solução de lise celular foi
utilizada para lisar a membrana das células, seguindo-se uma segunda solução de
lise para romper o núcleo das células. Na terceira etapa foi utilizada uma solução de
precipitação de proteínas. Para melhor visualização do pellet de DNA, 4µl de
glicogênio (40mg/mL, Invitrogen) foram adicionados a cada amostra e em seguida
uma solução de isopropanol foi utilizada para precipitar o DNA obtido. Uma solução
de álcool a 70% foi utilizada para lavar o DNA e eliminar qualquer material
inespecífico. Após esse procedimento de lavagem foi feita uma centrifugação e o
sobrenadante foi descartado. O pellet de DNA obtido foi ressuspenso em água ultra
pura (Gibco) e quantificado em um aparelho Nanodrop (Thermo Scientific). Para
essa quantificação, foram utilizados 2µL do total obtido.
Amostras de DNA foram também extraídas de parasitos mantidos em meio de
cultura e também de sangue de camundongos IFN-KO não infectados e infectados
com T. cruzi para serem utilizadas como controle positivo da reação de PCR. Além
disso, amostras de intestinos de insetos não infectados e sangue de camundongo
IFN-KO foram utilizados para controle negativo da reação. Novamente, o Kit Wizard
Genomic DNA purification foi utilizado, seguindo-se neste processo o protocolo
sugerido para amostras de cultura de células e para amostras de sangue.
4.5.3 – PCR quantitativo em Tempo Real
Os produtos obtidos nas extrações de DNA foram submetidos à análise por
PCR em tempo real (qPCR) para se obter uma quantificação molecular do número
de parasitos. Para as reações de qPCR foram utilizados iniciadores específicos para
amplificar um fragmento de 182pb de T. cruzi (TCZ) (Cummings e Tarleton, 2003), e
as reações foram realizadas em um equipamento ABI Prism 7500 Sequence
45 Detection System (Applied Biosystems). As sequências dos iniciadores utilizados
para a amplificação de DNA específico para o T. cruzi estão listadas na tabela 1.
Tabela 1 – Sequências dos iniciadores específicos para T. cruzi utilizados para
amplificação dos produtos de DNA por PCR em tempo real (Cummings e Tarleton,
2003).
Iniciadores
TCZ – F
Sequências
5’ GCTCTTGCCCACAMGGGTGC 3’
Onde M = A ou C
TCZ – R
5’ CCAAGCAGCGGATAGTTCAGG 3’
As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o Power
SYBR Green PCR Master Mix Kit (Applied Biosystems) de acordo com as
recomendações do fabricante. A análise dos resultados foi feita pelo ABIPRISM
7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Cada reação foi realizada
em triplicata, contendo 2µl do DNA molde, 300nM de cada iniciador, 12,5µl do Power
SYBR Green PCR Master Mix em um volume final de 25µl. As condições de
amplificação foram: desnaturação inicial a 95°C por 10 minutos, 40 ciclos de
desnaturação a 95°C por 15 segundos, ligação dos iniciadores e extensão a 60°C por
1 minuto. Durante as reações, foram feitas análises das curvas de dissociação dos
amplificados de cada amostra a fim de verificar se as qPCRs estavam gerando mais
de um produto.
Um controle negativo (sem adição de DNA) foi incluído para o conjunto de
iniciadores e utilizado para confirmar a ausência de DNA genômico inespecífico e
para verificar se houve formação de dímeros de iniciadores ou de qualquer
contaminação nas reações.
46 Uma curva padrão foi gerada como descrito por Caldas et al. (2012),
utilizando-se 8 diluições seriadas em água (1:10). Para isso, foi preparada uma
mistura de amostras de DNA extraídos de sangue de camundongo B6.129S7 INFKO não infectado e de parasitos de meio de cultura, de forma que a concentração
inicial fosse equivalente a 5.106 parasitos/100µl de sangue .
4.6 – Análises Estatísticas
As análises do crescimento dos parasitos em meio de cultura foram focadas
nos efeitos da temperatura nas taxas de crescimento e foram realizadas no
programa (R) pelo colaborador do estudo, Dr. S.L. Elliot. O primeiro passo foi
determinar as taxas de crescimento (ou seja, as curvas de regressão) para cada
replicata (garrafa) em cada tratamento de temperatura. Para isso, os tamanhos das
populações de parasitos vivos foram log-transformados (ou seja, logarítimo do
número de parasitos + 1) e modelos de efeitos mistos lineares foram utilizados para
a análise de medidas repetidas (ou seja, dias 1, 2, 3, etc). Esta análise gerou oito
curvas de crescimento para cada um dos três parasitos testados (duas repetições de
quatro temperaturas). Estas foram submetidas a análises de regressão para avaliar
possíveis efeitos da temperatura nas taxas de crescimento.
O efeito da infecção na duração do período intermudas e na sobrevivência
dos insetos mantidos nas diferentes temperaturas, foi analisado através da
comparação de curvas de sobrevivência, utilizando-se o Teste Log-Rank. As taxas
de sobrevivência, ecdise e defeitos na muda foram analisadas através do teste Z de
proporções para amostras independentes. A infecção das glândulas salivares entre
insetos submetidos a diferentes temperaturas foi avaliada através do teste Quiquadrado, comparando-se os pares através de bipartição. Para todas as análises o
nível de significância considerado foi de p<0,05.
47 RESULTADOS
48 5 RESULTADOS
5.1 - Avaliação do crescimento dos parasitos em meio de cultura, submetidos a
diferentes temperaturas
O crescimento in vitro da população de T. cruzi aumentou com o aumento da
temperatura de 21-30°C (Figura 6A; p<0,0001 para o efeito da temperatura), com as
maiores populações sendo obtidas na temperatura de 30ºC (386 x 103 parasitos). Os
parasitos mantidos nas temperaturas de 21 e 24°C não mostraram um aumento
expressivo no crescimento ao longo dos sete dias de acompanhamento. O melhor
ajuste da regressão da curva de crescimento versus temperatura (Figura 6B) não foi
curvado, indicando que o pico de crescimento deve ter ocorrido a 30°C ou mais. De
modo geral, o perfil de crescimento do T. cruzi foi maior (entre 6-60 vezes) que o
encontrado para o T. rangeli quando os parasitos foram submetidos às mesmas
condições (Figura 6A, C e E).
Os dois tratamentos de T. rangeli também cresceram mais em temperaturas
mais altas, mas nestes casos, os melhores ajustes de regressão foram funções
quadráticas, indicando que as curvas tiveram seus picos de crescimento em 27°C
para os dois tratamentos (Figuras 6C-F; p<0,01 para ambos os tratamentos). O T.
rangeli T1 (parasitos que foram mantidos exclusivamente em meio LIT) apresentou
as menores taxas de crescimento, não ultrapassando 60 x 103 parasitos em
nenhuma das temperaturas a que foi submetido (Figura 6C). Entre as temperaturas
avaliadas, o perfil de crescimento do parasito foi menor em 21 e 30ºC (Figura 6C). A
maior população alcançada para o T. rangeli T2 (parasitos mantidos em meio LIT
por 30 dias, após terem sido submetidos a uma passagem em triatomíneos e
camundongos e posteriormente recuperados por hemocultura) foi obtida em 27°C
(120 x 103 parasitos). Para as temperaturas de 24 e 30°C o crescimento foi
semelhante e aproximou-se de 100 x 103 parasitos no sétimo dia. Assim como para
todos os outros parasitos estudados, a temperatura de 21°C foi a que apresentou as
menores taxas de crescimento.
As taxas de mortalidade de T. cruzi ficaram abaixo de 10%, com exceção dos
parasitos mantidos em 21°C que apresentaram valores acima dos 20% (Figura 7A).
Para o T. rangeli T1, as taxas de mortalidade ficaram entre 10 e 40%, a temperatura
de 27°C mostrando as mortalidades mais baixas (Figura 7B). As taxas de
49 mortalidade para o T. rangeli T2 foram consistentemente mais baixas do que 10%,
independentemente da temperatura a que foram expostos (Figura 7C).
Trypanosoma cruzi
A
21°C
24°C
27°C
30°C
5000
B
4300
4500
Inclinação (média + e.p.)
Log (parasito + 1) (média + e.p.)
5500
4000
3500
3000
4200
4100
4000
3900
3800
3700
2500
3600
1
3
4
C
5
6
21
7
24
27
30
Trypanosoma rangeli T1
4500
3450
Inclinação (média + e.p.)
Log (parasito + 1) (média + e.p.)
5000
2
4000
3500
3000
D
3400
3350
3300
3250
3200
3150
3100
2500
1
3
4
5
E
6
21
7
24
27
30
Trypanosoma rangeli T2
4500
4000
F
3950
Inclinação (média + e.p.)
Log (parasito + 1) (média + e.p.)
5000
2
4000
3500
3000
3900
3850
3800
3750
3700
3650
2500
1
2
3
4
5
6
21
7
Dias
24
27
30
Temperatura (°C)
Figura 6 - Crescimento de epimastigotas de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma
rangeli em cultura, mantidos em diferentes temperaturas. As barras representam o
erro da média de duas repetições.
50 Trypanosoma cruzi
A
Mortalidade (%, média + e.p.)
50
40
30
21°C
24°C
27°C
30°C
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
Dias
Trypanosoma rangeli T1
Trypanosoma rangeli T2
Mortalidade (média + e.p.)
B
C
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
Dias
Dias
Figura 7 - Mortalidade de epimastigotas de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma
rangeli em cultura, mantidos em diferentes temperaturas. Foram incluídos os dados
de células coradas com PI e com FDA+PI, indicativo de células mortas ou em
processo de morte celular. As barras representam o erro da média de duas
repetições.
51 5.2 – Avaliação do desenvolvimento de insetos infectados submetidos a
diferentes temperaturas
5.2.1 Insetos infectados por Trypanosoma cruzi
O objetivo desse experimento foi avaliar se o período intermudas e as taxas
de mortalidade de insetos infectados e saudáveis variavam com a temperatura.
Como esperado, independentemente da presença da infecção, a temperatura afetou
o período intermudas em todos os tratamentos, uma vez que o tempo para alcançar
o terceiro estádio foi reduzido conforme a temperatura foi aumentada (Figura 8, LogRank; p=0,00001 para os dois tratamentos). Independentemente da temperatura a
que os insetos foram expostos, a infecção pelo T. cruzi prolongou o tempo
necessário para as ninfas atingirem o terceiro estádio (Figura 2; Log-Rank, p<0,0002
para todos os tratamentos). Os tempos médios para as ninfas do grupo controle
alcançarem o terceiro estádio foram de 32,1+8,3, 23,2+9,5, 17,8+8,9 e 13,3+3,2 dias
para as temperaturas de 21, 24, 27 e 30°C, respectivamente. Para os insetos
infectados, o tempo médio para a ocorrência da ecdise foi de 43,5+9,2, 30,0+7,7,
23,6+6,3 e 23,3+10,4 dias para as temperaturas de 21, 24, 27 e 30°C,
respectivamente. Além de prolongar o tempo de muda para o terceiro estádio, a
infecção pelo T. cruzi também diminuiu o sucesso de ecdise dos insetos mantidos a
21°C (Teste Z, p=0,002) e 30°C (Teste Z, p=0,007) (Tabela 2). A porcentagem de
mudas com defeito foi baixa em todas as temperaturas e tratamentos testados,
ficando em torno dos 10% (Tabela 2).
As taxas de mortalidade foram inicialmente avaliadas ao final de trinta dias
após a primeira muda de cada grupo e dentro desse período não foram observadas
diferenças significativas entre insetos infectados e saudáveis nas temperaturas
avaliadas, exceto para os insetos infectados mantidos a 24°C, que apresentaram
uma taxa de mortalidade 20% maior do que os insetos do grupo controle mantidos
na mesma temperatura (Tabela 2; Teste Z, p=0,008).
Com objetivo de avaliar o efeito global da infecção, os insetos que ao longo
do experimento morreram, não mudaram ou apresentaram defeitos na ecdise foram
somados e comparados entre os tratamentos. De modo geral, a infecção por T. cruzi
promoveu um decréscimo de 20% na população, sendo as comparações
52 estatisticamente significativas para os grupos mantidos a 21, 24 e 30°C (Tabela 2;
Teste Z, p=0,01 para 21 e 24°C, p=0,03 para 30°C).
Para avaliar a interação da infecção com a temperatura e o jejum, a
mortalidade das ninfas foi acompanhada por um período de 60 dias além daquele
avaliado inicialmente (Figura 9). Independentemente da infecção, no final dos 90
dias de acompanhamento, praticamente todos os insetos mantidos a 27 e 30ºC já
haviam morrido, enquanto cerca da metade daqueles mantidos em 21 e 24°C
permaneceram vivos (Figura 9). A comparação deste parâmetro ao longo do tempo
entre os tratamentos mostrou um aumento na mortalidade em insetos infectados
mantidos em 24°C (Figura 9B; Log-Rank, p=0,02) e 27°C (Figura 9D; Log-Rank,
p=0,0001).
A
100
21°C
B
100
24°C
80
80
Ecdise (%)
60
60
40
40
20
p=0,0004
p=0,001
20
0
0
0
5
10
15
25
30
35
40
45
27°C
C
100
20
50
Controle
Infectado
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
45
50
30°C
D
100
80
5
80
Ecdise (%)
60
60
40
40
20
p=0,005
0
p=0,0001
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Dias
Dias
Figura 8 – Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi no período necessário para
alcançar o terceiro estádio de ninfas de Rhodnius prolixus mantidas em diferentes
temperaturas. Os valores de p indicados em cada gráfico representam a
significância estatística das comparações entre os tratamentos (Log-Rank).
53 Tabela 2 - Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi no fitness de ninfas de Rhodnius prolixus
Temperatura
(ºC)
21
24
27
30
Status
Controle
25,0
Infectado
25,0
34,4
9,4
68,8
Controle
3,1
12,5
0
15,6
Infectado
23,5
Controle
6,4
Infectado
18,2
Controle
9,7
Infectado
6,1
Teste Z
n.s.
p=0,007
Não mudaram (%)
Teste Z
6,2
p=0,001
n.s
11,7
6,4
n.s
12,5
2,9
Teste Z
n.s
n.s
3,2
n.s
6,1
0
n.s
Defeito na muda
(%)
Taxa de
mortalidade
acumulada
(%)
Taxa de
Mortalidade (%)
3,0
p=0,007
3,0
0,01
43,7
0,01
38,1
16,0
n.s
0
18,2
Teste Z
n.s.
27,3
9,7
n.s
0,03
27,3
54 100
A
100 B
Mortalidade acumulada (%)
21°C
24°C
80
80
60
60
40
40
p=0,02
30 dias
60 dias
90 dias
20
20
0
0
Controle
Mortalidade acumulada (%)
100
C
Infectado
Controle
27°C
100
80
80
60
60
Infectado
30°C
D
40
40
p=0,0001
20
20
0
0
Controle
Controle
Infectado
Infectado
Figura 9 - Efeito da infecção por Trypanosoma cruzi nas taxas de mortalidade
de ninfas de Rhodnius prolixus mantidas a diferentes temperaturas. Os valores
de p indicados em cada gráfico representam a significância estatística das
comparações entre os tratamentos (Log-Rank).
55 5.2.2 Insetos infectados por Trypanosoma rangeli
De maneira geral, o período intermudas observado para os dois
diferentes tratamentos testados com o T. rangeli foi similar ao perfil encontrado
para os insetos infectados com o T. cruzi, ou seja, o período intermudas foi
mais curto para os insetos mantidos nas temperaturas mais altas,
independentemente da presença do parasito (Figuras 10 e 11; Log-Rank,
p=0,00001 para todos os tratamentos).
O tempo necessário para os insetos mudarem para o 5° estádio variou
entre 11 e 57 dias para o grupo infectado pelo T. rangeli T1 e entre 11 e 37
dias para o seu respectivo grupo controle (Figura 10). Para os insetos
infectados pelo T. rangeli T2 esses valores variaram entre 13 e 55 dias e para
os respectivos controles entre 12 e 51 dias (Figura 11). Em geral, ambos os
tratamentos de T. rangeli promoveram um atraso no período intermudas. Para
o grupo infectado com T. rangeli T1, este atraso foi dependente da
temperatura, sendo evidente somente nos insetos infectados mantidos nas
temperaturas de 21 e 24°C (Figura 10, Log Rank, p=0,00001 para 21 e 24°C).
As taxas de eclosão de insetos infectados também foram afetadas nas
temperaturas baixas (Tabela 3, teste Z, p=0,04 para insetos mantidos a 21°C
and p=0,01 para insetos mantidos a 24°C). A exposição às diferentes
temperaturas não promoveu alterações morfológicas nos insetos dos grupos
controle. Entretanto, a frequência dessas alterações foi aumentada nos insetos
infectados mantidos a 27°C (Tabela 3, teste Z, p=0,001). Um aumento nas
taxas de mortalidade de insetos infectados pelo T. rangeli foi induzido pelas
temperaturas mais baixas. A proporção de insetos infectados encontrados
mortos no final do período de avaliação chegou a 30% na temperatura de 21°C,
enquanto apenas 3,3% das ninfas haviam morrido no correspondente grupo
controle (Tabela 3, teste Z, p=0,003). Na temperatura de 24°C esse valor foi de
50% para os insetos infectados e de 6,6% para os insetos do grupo controle
(Tabela 3, teste Z, p=0,0001). Os efeitos cumulativos da infecção foram de
mais de 25% nos insetos mantidos a 21, 24 e 27°C, alcançando 60% naqueles
mantidos a 24°C (Tabela 3, teste Z, p<0,001 para todos os tratamentos). No
final do experimento, os insetos infectados pelo T. rangeli tiveram sua
56 hemolinfa e glândulas salivares examinadas para a presença do parasito. Não
foi
observada
infecção
nas
glândulas
salivares
de
nenhum
inseto,
independentemente da temperatura a que foi submetido. Em relação à infecção
da hemolinfa, ninfas mantidas a 30°C apresentaram uma redução nas taxas de
infecção quando comparadas com aquelas mantidas nas demais temperaturas
(Tabela 4, 2 partição, p=0,006).
Para os insetos infectados pelo T. rangeli T2, o prolongamento do
período intermudas foi independente da temperatura, ocorrendo em todos os
grupos infectados (Figura 11, Log Rank, p=0,00001 para insetos mantidos a
21°C; p=0,0002 para insetos mantidos a 24°C; p=0,00005 para insetos
mantidos a 27°C; p=0,00002 para insetos mantidos a 30°C). Apesar de
prolongar o processo de muda, o T. rangeli T2 não afetou as taxas de
mortalidade nem de ecdise, ou produziu alterações morfológicas significativas
nos insetos. A única exceção a essa tendência foi observada para insetos
infectados mantidos a 21°C, que apresentaram uma diminuição na taxa de
ecdise em relação ao grupo controle (Tabela 3, teste Z, p=0,03). Entretanto,
quando os efeitos patogênicos foram somados e comparados entre os grupos,
um aumento significativo dos efeitos da infecção foi observado nos insetos
infectados mantidos a 24 e 30°C (Tabela 3, teste Z, p=0,02 para ambos os
grupos). Trinta dias após a muda para o quinto estádio, todas as ninfas
infectadas apresentaram parasitos na sua hemolinfa (Tabela 4). Entretanto, a
infecção nas glândulas salivares foi reduzida nos insetos mantidos a 21 e 30°C
(Tabela 4, 2 partição, p=0,008).
57 Ecdise (%)
21°C
A
100
80
80
60
60
40
24°C
B
100
40
p<0,00001
p<0.00001
20
20
0
0
0
10
20
40
50
60
10
20
30
40
50
60
40
50
60
30°C
D
100
80
Ecdise (%)
0
27°C
C
100
30
80
60
Controle
Infectado
60
40
40
20
20
0
0
0
10
20
30
40
50
60
Dias
0
10
20
30
Dias
Figura 10 – Efeito da infecção por Trypanosoma rangeli T1 no período
necessário para alcançar o quinto estádio de ninfas de Rhodnius prolixus
mantidas em diferentes temperaturas. Os valores de p indicados em cada
gráfico representam a significância estatística das comparações entre os
tratamentos (Log-Rank).
58 Ecdise (%)
21°C
A
100
80
80
60
60
40
40
p=0,00001
20
24°C
B
100
p=0,0002
20
0
0
0
10
20
30
40
50
60
0
10
20
C
100
40
50
60
D
100
80
Ecdise (%)
30
30°C
27°C
80
60
60
Controle
Infectado
40
40
20
20
p=0,00005
0
p=0,00002
0
0
10
20
30
Dias
40
50
60
0
10
20
30
Dias
40
50
60
Figura 11 – Efeito da infecção por Trypanosoma rangeli T2 no período
necessário para alcançar o quinto estádio de ninfas de Rhodnius prolixus
mantidas em diferentes temperaturas. Os valores de p indicados em cada
gráfico representam a significância estatística das comparações entre os
tratamentos (Log-Rank).
59 Tabela 3 - Efeitos da infecção por Trypanosoma rangeli no fitness de ninfas de Rhodnius prolixus.
Tratamento
Temperatura (%)
Infecção
Taxas de
Mortalidade (%)
Controle
3,3
21
Infectado
30,0
Controle
6,6
Infectado
50,0
Controle
6,7
13,3
Controle
16,6
30
13,3
Controle
5,2
21
Infectado
5,0
Controle
5,2
24
Infectado
15,0
Controle
10,5
27
Infectado
21,0
Controle
10,5
30
Infectado
5,0
30,0
p=0,02
26,3
p=0,04
0
0
21,0
10,5
n.s
0
5,2
15,8
n.s
0
n.s.
n.s
10,0
0
31,5
20,0
0
n.s
n.s
5,2
n.s
0
0
n.s.
16,6
0
p=0,03
n.s
16,6
n.s
3,3
15,0
p=0,002
36,6
0
0
n.s
6,7
p=0,001
n.s
0
p<0,0001
69,9
23,3
0
p=0,0004
9,9
0
n.s
0
9,9
n.s
6,6
0
Teste Z
49,9
0
p=0,01
13,3
Efeito total
(%)
n.s
3,3
3,3
n.s
Teste Z
0
16,6
n.s
Infectado
Mudas com
defeito (%)
p=0,04
n.s
Infectado
Teste Z
6,6
p<0,0001
27
T2
Insucesso na
muda (%)
p=0,002
24
T1
Teste Z
n.s.
21,0
n.s.
21,0
52,5
p=0,02
60 Tabela 4 - Taxa de infecção de ninfas de Rhodnius prolixus 30 dias pós-infecção.
Tratamento
T1
T2
Temperatura
(°C)
Positividade Hemolinfa
(%)
Qui-quadrado
Positividade glândulas
salivares (%)
21
90,9
24
86,7
27
88,9
0
30
57,1
0
21
100
52,6
24
100
27
100
93,3
30
100
38,5
Qui-quadrado
0
p=0,006
-
0
76,5
-
p=0,008
61 5.3 – Quantificação do Trypanosoma cruzi no trato intestinal de Rhodnius.
prolixus, em insetos submetidos a diferentes temperaturas
A quantificação do T. cruzi no trato intestinal de ninfas de R. prolixus foi feita
separadamente nas três porções do intestino (intestino médio anterior - IMA,
intestino médio posterior – IMP, e ampola retal - AR). Uma vez que não existem
trabalhos quantificando parasitos no trato intestinal de triatomíneos pela qPCR, a
técnica teve que ser padronizada para o presente estudo. Para verificar a qualidade
da qPCR, a maioria dos insetos analisados também teve amostras dos conteúdos
intestinais quantificados pela câmara de Neubauer (n=110 amostras). Em mais de
70% das amostras avaliadas, a qPCR deu resultados iguais ou superiores ao
observado na contagem da câmara de Neubauer. Em 30% das amostras, as duas
metodologias foram negativas para a presença do T. cruzi, sendo esses resultados
mais observados nas amostras de intestino médio anterior (Figuras 12, 13, 14 e 15).
Em 35,45% das amostras, a quantificação da qPCR foi maior do que a observada na
contagem da câmara de Neubauer. Entretanto, nos 34,55% restantes das amostras,
a quantidade de parasitos foi maior na câmara de Neubauer. A quantificação do
DNA total na maioria dessas amostras sugere ter havido perda de material durante o
processo de extração.
A avaliação da contagem em câmara de Neubauer não detectou parasitos na
porção do IMA em nenhuma das temperaturas ou períodos avaliados (Figura 12). Já
as quantificações do IMP e da AR foram bastante variáveis entre os insetos
analisados. Para o IMP as maiores quantificações foram observadas nas
temperaturas mais baixas (21 e 24°C) a partir dos 15 dias de infecção. A AR foi a
porção do trato intestinal onde foram encontrados mais parasitos em todos os
períodos avaliados. Contagens superiores a 1.000 par/µl foram encontradas nos
primeiros 15 dias após a infecção, mas apenas naqueles insetos mantidos nas
temperaturas mais altas, ou seja, 27 e 30°C (Figura 12).
62 9000
7000
15 DIAS
8000
30 DIAS
6000
7000
5000
Parasitos / ul
6000
5000
4000
4000
3000
3000
2000
2000
1000
1000
0
0
21
24
27
30
21
24
27
30
21
24
27
21
30
24
27
30
21
24
27
30
21
24
27
30
Temperatura (°C)
Temperatura (°C)
7000
60 DIAS
6000
5000
Parasitos / ul
Intestino médio anterior
Intestino médio posterior
Ampola retal
4000
3000
2000
1000
0
21
24
27
30
21
24
27
30
21
24
27
30
Temperatura (°C)
Figura 12 - Quantificação através de contagem em câmara de Neubauer do número de parasitos de Trypanosoma cruzi no trato
intestinal de Rhodnius prolixus.
63 Da mesma forma que o verificado pela contagem em câmara de Neubauer, a
avaliação pela qPCR não detectou parasitos no IMA nos primeiros 15 dias de
infecção (Figura 13). Entretanto, das 27 amostras de IMA avaliadas nos outros
períodos, 40% foram positivas para a presença do T. cruzi, com quantidades
bastante variáveis entre as amostras (Figuras 14 e 15). A quantificação do número
de parasitos no IMP e AR seguiu o mesmo padrão observado nas contagens em
câmara de Neubauer, ou seja, as maiores quantificações foram obtidas nas
amostras de AR em insetos mantidos nas temperaturas mais altas.
15 dias
80000
Intestino médio anterior
Intestino médio posterior
Ampola retal
60000
40000
Parasitos / ul
20000
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
21
24
27
30
21
24
27
30
21
24
27
30
Temperatura (°C)
Figura 13 - Quantificação por qPCR do número de parasitos de Trypanosoma cruzi
no trato intestinal de Rhodnius prolixus, 15 dias após a infecção dos insetos.
64 30 dias
55000
Intestino médio anterior
Intestino médio posterior
Ampola retal
50000
45000
14000
Intestino médio anterior
Intestino médio posterior
Ampola retal
12000
Parasitos / ul
10000
8000
6000
4000
30 dias
2000
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
21
24
27
30
21
24
27
30
21
24
27
30
Temperatura (°C)
Figura 14 - Quantificação por qPCR do número de parasitos de Trypanosoma cruzi
no trato intestinal de Rhodnius prolixus, 30 dias após a infecção dos insetos.
65 60 DIAS
54000
52000
22000
Intestino médio anterior
Intestino médio posterior
Ampola retal
20000
18000
16000
14000
12000
10000
Parasitos / ul
8000
6000
2D Graph 1
4000
2000
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
21
24
27
30
21
24
27
30
21
24
27
30
Temperatura (°C)
Figura 15 - Quantificação por qPCR do número de parasitos de Trypanosoma cruzi
no trato intestinal de Rhodnius prolixus, 60 dias após a infecção dos insetos.
66 DISCUSSÃO
67 6 DISCUSSÃO
Para
compreender
como
a
temperatura
afeta
a
virulência
de
tripanosomatídeos em hospedeiros invertebrados, primeiramente avaliamos o
crescimento de T. cruzi e T. rangeli em meio de cultura em diferentes temperaturas.
Nessas condições, os parasitos dispunham de nutrientes ad libitum fornecidos pelo
meio de cultura sem a presença da resposta imunológica do inseto. Neste sistema,
aparentemente a única variável que poderia comprometer a sobrevivência dos
parasitos seria a temperatura.
Os resultados mostraram que a temperatura afetou diferentemente as duas
espécies de tripanosomas estudadas. O crescimento da população de parasitos de
T. cruzi foi diretamente relacionado com o aumento da temperatura. De fato, em um
período de sete dias, parasitos mantidos a 30ºC apresentaram um aumento
expressivo (crescimento cerca de 28 vezes) na sua população, alcançando 386 x
103 parasitos, quase duas vezes mais do que o crescimento registrado a 27ºC.
Estudos prévios demostram que epimastigotas de T. cruzi crescem mesmo quando
submetidos à temperaturas de 37°C (Florin-Christensen et al., 1997).
Temperaturas mais baixas, particularmente 21ºC, parecem apresentar um
efeito nocivo sobre esta população de T. cruzi, uma vez que a taxa de mortalidade
observada nessa temperatura foi cerca de 20% no final do ensaio. Já foi
demonstrado que temperaturas baixas afetam o transporte e o processo de
endocitose de vesículas endocíticas, bem como a taxa de transporte de transferrina
para os reservosomos em epimastigostas de T. cruzi (Figueiredo e Soares, 2000). O
bloqueio da endocitose em temperaturas baixas parece não ser especifico para
protozoários, uma vez que tem sido descrito também em outras células eucarióticas
(Dunn et al., 1980; Haylett e Thilo, 1991; Punnonen et al., 1998; Brickman et al.,
1995).
Para o T. rangeli, a sensibilidade à temperatura variou de acordo com o
tratamento a que os parasitos foram submetidos. T. rangeli T1 foram mais sensíveis
às temperaturas extremas, uma vez que praticamente não foi observado
crescimento nas culturas submetidas a 21 e 30ºC. De maneira geral, os parasitos
desse tratamento não cresceram adequadamente em nenhuma das temperaturas
testadas, provavelmente em consequência da alta mortalidade observada durante
68 todo o experimento (entre 15 e 40%). Mesmo quando mantidos na temperatura mais
adequada (27ºC), a população não ultrapassou os 60.000 parasitos.
Apesar de ter crescido cerca de sete vezes menos do que as populações de
T. cruzi, os epimastigotas de T. rangeli T2 foram mais resistentes a baixas
temperaturas, aumentando sua população em até três vezes quando mantidos em
21ºC. A baixa mortalidade dos parasitos observada nessa temperatura reforça essa
ideia. Entretanto, contrariamente ao observado para T. cruzi, os epimastigotas de T.
rangeli T2 também foram sensíveis à 30ºC, mas com uma menor intensidade do que
os parasitos do tratamento 1 (T. rangeli T1).
De maneira geral, o melhor desenvolvimento em meio de cultura observado
para o T. cruzi poderia estar relacionado com a utilização do meio LIT como fonte
nutricional, uma vez que esse meio de cultura foi desenvolvido especialmente para a
espécie (Yager, 1960). Já foi demonstrado que o T. rangeli é maior do que o T. cruzi
em todas as suas formas de desenvolvimento (Herbig-Sandreuter, 1957), o que
poderia levar a uma maior necessidade de nutrientes e limitar seu crescimento no
meio LIT. É importante ressaltar que as populações de T. rangeli T2 sempre se
tornam T. rangeli T1 quando são mantidas em meio LIT por mais de dois meses,
modificando suas características infectivas para o inseto vetor. Estes dados reforçam
a ideia de que o meio LIT não é uma fonte nutricional completa para o T. rangeli,
sendo que os parasitos necessitam de passagens pelos hospedeiros vivos para
crescerem adequadamente. Neste sentido, seria desejável que as cepas de T.
rangeli
utilizadas
em
experimentação
fossem
regularmente
passadas
em
triatomíneo-hospedeiro vertebrado para que suas características infectivas sejam
mantidas.
A temperatura tem um relevante papel no desenvolvimento de vários outros
parasitos protozoários. Espécies de Leishmania diferem na sua suscetibilidade ao
estresse por temperatura, o que é refletido na sua habilidade em estabelecer
infecções em diferentes áreas do corpo de mamíferos (Zilberstein, 1994). A
resistência à temperatura em diferentes espécies de Leishmania tem sido
correlacionada com o tropismo do parasito, sendo as espécies viscerais mais
resistentes do que as espécies cutâneas (Callahan et al., 1996). Para o
Trypanosoma brucei, foi demonstrado que a temperatura é importante tanto na
69 regulação do potencial de membrana através da membrana plasmática quanto na
regulação do pH interno (Kuile, 1994). Além disso, foi demonstrado que a redução
da temperatura de 37 para 27ºC além da adição de cis-aconitato são suficientes
para promover a transformação de T. brucei monomórficos sanguíneos para
tripomastigotas procíclicos em meio de cultura (Czichos et al., 1986).
Vários estudos têm demonstrado que a temperatura afeta o desenvolvimento
de muitas interações entre insetos e microorganismos, alterando particularmente as
taxas de replicação ou o nível de virulência dos microorganismos (revisado por
Thomas e Blanford, 2003). Conhecendo-se a dinâmica de desenvolvimento das
duas espécies de Trypanosoma em diferentes regimes de temperatura, o próximo
passo foi avaliar os graus de patologia induzidos por estes parasitos nos seus
hospedeiros invertebrados quando os mesmos foram infectados e submetidos às
mesmas condições de temperatura testadas anteriormente.
Contrariamente aos resultados observados com outras espécies de
triatomíneos (Juarez, 1970; Zeledón et al., 1970; Schaub, 1978, 1988; Lima et al.,
1992), as ninfas de segundo estádio de R. prolixus tiveram seu período de muda
prolongado quando infectadas pelo T. cruzi, independentemente da temperatura a
que foram expostas. Dependendo do regime de temperatura, os insetos infectados
prolongaram o período intermudas em mais de 10 dias em um único estágio de
desenvolvimento. Levando-se em consideração o ciclo de vida completo, seria
possível que insetos infectados prolongassem em mais de um mês o tempo
necessário para alcançar o estádio adulto, o que possivelmente afetaria seu fitness
em relação aos seus coespecíficos saudáveis.
Avaliando outros parâmetros biológicos que poderiam ser afetados pela
infecção pelo T. cruzi, como as taxas de mortalidade e de ecdise, bem como as
alterações morfológicas ocorridas durante a ecdise, ficou claro que os efeitos
isolados de cada um dos parâmetros não foram patogênicos para os insetos,
independentemente da temperatura. De fato, efeitos patogênicos significativos não
foram observados em nenhuma das temperaturas testadas. Entretanto, quando o
número de insetos que sofreram algum tipo de injúria em consequência da infecção
foi somado para cada nível de temperatura, foi possível observar que, exceto para
70 aqueles insetos mantidos em 27°C, a infecção pelo T. cruzi afetou significativamente
a sustentabilidade da população.
Uma vez que os triatomíneos vivem primariamente associados a ninhos de
aves e mamíferos, onde o suprimento sanguíneo não é constante, eles se
adaptaram para sobreviver por longos períodos sem alimentação. Sendo assim, nós
decidimos avaliar as taxas de mortalidade por mais 60 dias, para verificar se o
parasito poderia afetar esse parâmetro quando os insetos estão sob estresse
nutricional (Figura 4). A associação entre temperatura e jejum afetou diferentemente
a sobrevivência dos insetos. Temperaturas altas associadas com jejuns prolongados
foram letais para os insetos, independentemente da presença do parasito. Já é bem
conhecido que temperaturas altas promovem um aumento no metabolismo de
insetos (revisado por Brown et al., 2004). Sendo assim, seria esperado um aumento
nas taxas de mortalidade de insetos em jejum submetidos a essas temperaturas,
como já relatado em estudos prévios (Luz et al., 1998). De acordo com os resultados
do crescimento dos parasitos em meio de cultura, seria esperado uma alta
mortalidade nos insetos infectados em decorrência da presença de uma grande
população de parasitos. Entretanto, não foram observadas diferenças nas taxas de
mortalidade entre insetos infectados e saudáveis mantidos a 30°C. Provavelmente, o
estado de jejum dos insetos, com poucos recursos nutricionais disponíves, reduziu o
crescimento da população de T. cruzi. Já foi demonstrado que triatomíneos podem
perder infecções pelo parasito após longos períodos de jejum (Kollien e Schaub,
1998), o que reforça essa ideia. A infecção pelo T. cruzi não alterou as taxas de
mortalidade de insetos mantidos a 21°C, possivelmente em decorrência do baixo
desenvolvimento do parasito nessa temperatura. A virulência do parasito se
expressou nas temperaturas intermediárias (24 e 27°C) quando as taxas de
mortalidade
aumentaram
nos
grupos
infectados.
Possivelmente
nessas
temperaturas, as reservas nutricionais foram suficientes tanto para a sobrevivência
dos insetos quanto para o desenvolvimento dos parasitos, permitindo ainda o
estabelecimento de uma grande população de flagelados, particularmente em 27°C,
o que pode ter levado aos efeitos patogênicos observados.
Os efeitos patogênicos do T. rangeli para R. prolixus foram mais evidentes
naqueles parasitos que foram mantidos em meio LIT por longos períodos antes da
infecção (T1) e especialmente naqueles insetos mantidos em temperaturas mais
71 baixas. Insetos submetidos a esse tratamento somente tiveram um prolongamento
do período intermudas quando mantidos a 21 e 24°C. As taxas de mortalidade e
ausência de ecdise também somente foram aumentadas nessas temperaturas.
Todos esses parâmetros alterados produziram um aumento de mais de quatro vezes
no efeito cumulativo da infecção, sugerindo um elevado desenvolvimento do parasito
nos insetos infectados e mantidos em temperaturas baixas, contrariamente ao baixo
crescimento desses parasitos no meio de cultura. Esses resultados reforçam a ideia
de que o meio LIT não é suficiente para permitir o bom desenvolvimento do T.
rangeli. Como tem sido observado em infecções de rotina no laboratório, no
presente estudo o T. rangeli T1 não conseguiu invadir as glândulas salivares de
ninfas de R. prolixus. Não havendo a possibilidade de colonização das glândulas e
mantendo-se o processo de multiplicação celular, parasitos do tratamento T1
provavelmente promoveram uma infecção massiva na hemocele dos insetos, o que
teria levado a todos os efeitos patogênicos observados. Ferreira et al. (2010)
mostraram que a presença do T. rangeli somente na hemolinfa do inseto já é
suficiente para levar a alterações patológicas. A presença de mudas defeituosas foi
o único parâmetro alterado nos insetos infectados pelo T. rangeli T1 e mantidos
27°C. É interessante mencionar que aqueles insetos mantidos a 24°C apresentaram
uma taxa de mortalidade bastante elevada, sendo que mais de 50% das mortes
ocorreram durante o processo de ecdise (dados não mostrados). Estes resultados
sugerem que o aumento da temperatura em três graus permitiu aos insetos
infectados sobreviverem e mudarem, apesar da infecção, embora a maioria deles
tenha apresentado problemas para completar o processo de maneira correta. Não
foram observados efeitos patogênicos naqueles insetos infectados pelo T. rangeli T1
mantidos a 30°C, provavelmente porque os parasitos não toleram este nível de
temperatura. Essa idéia é suportada pelo baixo grau de desenvolvimento dos
parasitos em LIT na temperatura de 30°C bem como pelas reduzidas taxas de
infecção observadas nos insetos infectados pelo T. rangeli T1 e mantidos a 30°C.
T. rangeli T2 não foi virulento ao hospedeiro invertebrado, uma vez que os
parasitos não aumentaram as taxas de mortalidade dos insetos infectados em
relação aos dos insetos do grupo controle. Os parasitos desse tratamento foram
selecionados através da contínua exposição a ambos hospedeiros vertebrados e
invertebrados. Este tratamento garantiu uma elevada taxa de infecção das glândulas
72 salivares dos insetos, particularmente naqueles mantidos em temperaturas
intermediárias (24 e 27°C). Ensaios preliminares têm demonstrado uma significativa
redução no número de parasitos na hemolinfa quando as glândulas salivares são
colonizadas (dados não mostrados). Uma menor população de parasitos na
hemolinfa poderia responder pela redução dos efeitos patogênicos observados em
insetos infectados por T. rangeli T2. Apesar disso, o período intermudas dos insetos
infectados foi prolongado em todas as temperaturas avaliadas. Adicionalmente,
quando todos os parâmetros de fitness foram somados e o efeito cumulativo da
infecção foi avaliado, os efeitos patogênicos do parasito puderam ser observados,
dependendo da temperatura a que os insetos foram expostos. É importante ressaltar
que apenas um estágio de desenvolvimento foi acompanhado. Da mesma forma que
o sugerido para infecções com T. cruzi, possivelmente, o acúmulo dessas alterações
ao longo da vida do inseto afete significativamente seu fitness em relação aos
insetos saudáveis da colônia.
Sabendo-se como a temperatura afeta o crescimento do parasito e a sua
virulência para o hospedeiro invertebrado, restava ainda investigar o papel do inseto
no desenvolvimento do parasito. A quantificação dos parasitos no trato intestinal de
insetos mantidos em diferentes temperaturas, comparando-se com os dados obtidos
do seu crescimento em meio de cultura, poderia dar uma ideia da relevância das
respostas geradas pelo inseto frente à infecção. Sendo assim, o último objetivo do
presente estudo foi avaliar quantitativamente o crescimento do T. cruzi em R.
prolixus em diferentes momentos da infecção e sob diferentes níveis de temperatura.
Diferentes estudos têm sido realizados a fim de detectar e quantificar o DNA
de T. cruzi pela técnica de qPCR em amostras de sangue e tecido de pacientes
chagásicos, bem como em infecções experimentais (Piron et al., 2007, Qvarnstrom
et al., 2012 e Caldas et al., 2012). Entretanto, não existem estudos quantificando
tripanosomas no trato intestinal de triatomíneos. Sendo assim, a técnica teve que ser
padronizada para as condições avaliadas no presente estudo. A contagem em
câmara de Neubauer foi simultaneamente utilizada para avaliar a qualidade dos
ensaios moleculares, e mostrou que em pelo menos 30% das amostras avaliadas,
os baixos valores encontrados pela qPCR provavelmente não refletiram a
quantidade de parasitos presentes no inseto. Possivelmente, nestes casos, parte do
73 material tenha sido perdido durante o processo inicial de extração do DNA das
amostras.
Uma vez que foram testados três diferentes porções do intestino, quatro
níveis de temperatura e três períodos de infecção, o número de insetos avaliados
por tratamento teve que ser reduzido para que os ensaios fossem concluídos dentro
do prazo do presente estudo. Além disso, a carga parasitária variou enormemente
entre os insetos. Sendo assim, não são possíveis ainda proposições conclusivas a
respeito desse relevante tópico. Um ajuste nos protocolos de extração e repetições
dos ensaios para aumentar o número de indivíduos por amostra possibilitarão uma
comparação mais precisa entre os tratamentos. Entretanto, mesmo com um número
reduzido de exemplares avaliados, alguns relevantes aspectos da interação
puderam ser encontrados. O primeiro deles foi a constatação de que a temperatura
de 21ºC promove uma redução do crescimento dos parasitos, corroborando os
dados obtidos nos ensaios de crescimento em meio de cultura. Além disso, também
foi possível demonstrar que temperaturas mais altas aceleram o desenvolvimento do
ciclo do T. cruzi no inseto, promovendo o aparecimento de parasitos na ampola retal
em infecções mais recentes.
A técnica de qPCR se mostrou mais sensível, quantificando um número maior
de parasitos, do que a contagem em câmara de Neubauer. Além disso, através
desse método foi possível detectar a presença de T. cruzi no intestino médio anterior
em infecções com mais de 15 dias. Provavelmente, estes parasitos não foram
encontrados pela contagem em câmara de Neubauer por estarem aderidos ao
epitélio intestinal. De fato, um exame preliminar de lâminas coradas por Giemsa
mostrou a presença de formas aparentemente teciduais do parasito, o que aumenta
a relevância do encontro (dados não mostrados). Ferreira et al. (2011)
demonstraram que insetos alimentados em camundongos infectados com T. cruzi
diminuíram drasticamente a quantidade de parasitos no intestino médio anterior nas
primeiras 24 horas pós-infecção, sem contudo ser observado um aumento na
quantidade de flagelados no intestino médio posterior, indicando que o T. cruzi não
estaria cruzando rapidamente o IMA. Os dados de quantificação pelas duas técnicas
utilizadas no presente estudo corroboram essa ideia, uma vez que em infecções
com 15 dias nenhum parasito foi encontrado nesta porção do intestino. O encontro
do T. cruzi no IMA em infecções crônicas poderia ser decorrente de uma re-entrada
74 do parasito nesta porção intestinal naqueles insetos com cargas parasitárias
elevadas. De fato, todas as amostras com IMA positivo foram provenientes de
insetos com um número elevado de parasitos no IMP e AR. Novos ensaios serão
desenvolvidos com o objetivo de identificar estes parasitos com técnicas de
microscopia que permitam a determinação da forma e do tipo de aderência no
epitélio intestinal do inseto.
Triatomíneos do gênero Rhodnius vivem em palmeiras em associação com
ninhos de aves e roedores (Teixeira et al., 2001; Abad-Franch et al., 2005; Stehling
Dias et al., 2011), onde podem abrigar o T. cruzi e o T. rangeli em infecções simples
ou mistas (Stehling Dias et al., 2008; Thekisoe et al., 2010). A temperatura média
nesses refúgios fica em torno de 25°C (Heger et al., 2006), a mesma escolhida pela
espécie em estudos utilizando gradientes de temperatura (Schilman e Lazzari,
2004). De acordo com os resultados obtidos no presente estudo, é possível sugerir
que ambos os parasitos podem estar promovendo efeitos patogênicos nos seus
hospedeiros invertebrados, pelo menos nas espécies de Rhodnius, nos seus
ecótopos naturais. As implicações desses efeitos no processo de invasão do peri e
intradomicílio pelos insetos, bem como na própria transmissão dos parasitos precisa
ainda ser melhor investigada. Além disso, o T. cruzi parece ser melhor adapatado à
temperaturas altas do que o T. rangeli, já que o último, independentemente de como
foi mantido antes dos ensaios, mostrou uma queda no número total de parasitos na
temperatura de 30ºC. Estas características poderiam ser relacionadas ao
desenvolvimento dos parasitos em seus hospedeiros invertebrados, já que o T.
rangeli somente completa seu ciclo de desenvolvimento em espécies do gênero
Rhodnius, que normalmente habitam microambientes com temperaturas amenas
(Heger et al., 2006). A capacidade do T. cruzi em se desenvolver numa ampla gama
de temperaturas poderia ter contribuído para sua adaptação a um número maior de
espécies de triatomíneos, distribuídas em ecossistemas com temperaturas mais
elevadas.
75 CONCLUSÕES
76 7 CONCLUSÕES
 A temperatura afetou diferentemente o crescimento de T. cruzi e de T. rangeli
em meio de cultura; enquanto o crescimento do T. cruzi foi diretamente
relacionado com o aumento da temperatura, para o T. rangeli as maiores
populações foram obtidas em 27ºC;
 A manutenção do T. rangeli através de passagens em camundongos e
triatomíneos (T2) permitiu um melhor crescimento dos parasitos em meio de
cultura;
 A infecção por T. cruzi prologou o período intermudas dos insetos infectados;
a virulência do parasito foi dependente da temperatura e do estado nutricional
do inseto;
 Os efeitos patogênicos do T. rangeli para R. prolixus foram mais evidentes
naqueles parasitos que foram mantidos em meio LIT por longos períodos
antes da infecção (T1), especialmente naqueles insetos mantidos em
temperaturas mais baixas;
 Apesar de não ser virulento para o hospedeiro intermediário, o T. rangeli T2
prolongou o período intermudas e, dependendo da temperatura, promoveu
um aumento significativo no número de insetos com algum tipo de efeito
patogênico;
 Embora os dados de quantificação de parasitos sejam ainda preliminares, foi
possível constatar que a quantificação do T. cruzi através da técnica de qPCR
se mostrou mais sensível, detectando um número maior de parasitos, bem
como sua presença no IMA em infecções acima de 15 dias;
 Temperaturas mais altas aceleraram o desenvolvimento do T. cruzi dentro do
inseto, promovendo o aparecimento de parasitos na ampola retal em
infecções recentes.
77 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
78 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abad-Franch F, Palomeque FS, Aguilar HM, Miles MA. Field ecology of sylvatic
Rhodnius populations (Heteroptera, Triatominae): risk factors for palm tree infestation
in western Ecuador. Trop Med Int Health. 2005; 10(12): 1258-66.
Abdullah M. Behavioral effects of temperature on insects. Ohio J Sci. 1961 Jul; 61(4):
212.
Afchain DL, Fruit DJ, Capron A. Antigenic make-up of Trypanosoma cruzi culture
forms: Identification of a specific component. J Parasitol. 1979; 65: 507-514.
Amarasekare
P,
Savage
V.
A
Framework
for
Elucidating
the temperature dependence of fitness. American Naturalist. 2012; 179(2), 178-191.
Amino R, Martins RM, Procopio J, Hirata IY, Juliano MA, Schenkman S. Trialysin, a
novel pore-forming protein from saliva of hematophagous insects activated by limited
proteolysis. J Biol Chem. 2002; 22; 277 (8): 6207- 13.
Añez N, Nieves E, Cazorla D. Studies on Trypanosoma rangeli Tejera, 1920. IX.
Course of infection in different stages of Rhodnius prolixus. Mem Inst Oswaldo
Cruz.1987; 82(1): 1-6.
Añez N. Studies on Trypanosoma rangeli Tejera, 1920. VII – Its effect on the survival
of infected triatomine bugs. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1984; 79(2): 249-55.
Aragão MB, Dias E. Aspectos climáticos da doença de Chagas. I: considerações
sôbre a distribuição geográfica do Triatoma infestans. Rev Brasileira Malariol D Trop
1956; 8: 633-641.
Araujo RN, Soares AC, Paim RM, Gontijo NF, Gontijo AF, Lehane MJ et al. The role
of salivary nitrophorins in the ingestion of blood by the triatomine bug Rhodnius
prolixus (Reduviidae: Triatominae). Insect Biochem Mol Biol. 2009; 39(2): 83-9.
79 Azambuja P, Feder D, Garcia ES. Isolation of Serratia marcescens in the midgut
of Rhodnius prolixus: impact on the establishment of the parasiteTrypanosoma
cruzi in the vector. Exp Parasitol. 2004; 107(1): 89-96.
Azambuja P, Guimarães JA, Garcia E. Haemolytic factor from the crop of Rhodnius
prolixus: Evidence and partial characterization. J Insect Physiol. 1983; 24; 29 (11):
833 – 37.
Azambuja P, Garcia ES, Ratcliffe NA. Gut microbiota and parasite transmission by
insect vectors. Trends Parasitol. 2005; 21 (12):568 – 572.
Barrozo R, Manrique G, Lazzari CR. The role of water vapour in the orientation
behaviour of the blood-sucking bug Triatoma infestans (Hemiptera, Reduviidae). J
Insect Physiol. 2003; 49 (4): 315 – 21.
Basseri HR, Tew IF, Ratcliffe NA. Identification and distribution of carbohydrate
moieties on the salivary glands of Rhodnius prolixus and their possible involvement
in attachment/invasion by Trypanosoma rangeli. Exp Parasitol. 2002; 100(4): 226234.
Bayoh MN, Lindsay SW. Temperature-related duration of aquatic stages of the
Afrotropical malaria vector mosquito Anopheles gambiae in the laboratory. Med Vet
Entomol. 2004; 18(2):174-9.
Begon M. Grasshopper populations and weather: the effect of insolation on
Chorthippus brunneus. Ecol Entomol. 1983; 8(4): 361-70.
Bernheim HA, Bodel PT, Askance PW, Catkins E. Effects of fever on host defence
mechanism after injection in the lizard Dipsosaurus dorsalis. Br J Exp Pathol. 1978;
59(1): 76-84.
Berry L, Cloudsley-Thompson JL. Autumn temperatures in the Red Sea hills. Nature
1960; 188 (4753): p. 843.
80 Björkman C, Kindvall O, Höglund S, Lilja A, Bärring L, Eklund K. High Temperature
Triggers Latent Variation among Individuals: Oviposition Rate and Probability for
Outbreaks. PLoS ONE. 2011; 27; 6(1): 1 - 7.
Blanford S, Thomas MB, Pugh C, Pell JK. Temperature checks the Red Queen?
Resistance and virulence in a fluctuating environment. Ecol Letts. 2003; 6(1): 2-5.
Blanford S, Thomas MB. Host thermal biology: the key to understanding insect–
pathogen interactions and microbial pest control? Agric Forest Entomol. 1999; 1(3):
195–202.
Bodin A, Vinauger C, Lazzari CR. State-dependency of host-seeking in Rhodnius
prolixus: The post-ecdysis time. J Insect Physiol. 2009; 55 (6) 574 – 79.
Borges EC, Machado EMM, Garcia ES, Azambuja P. Trypanosoma cruzi: effects of
infection on cathepsin D activity in the midgut of Rhodnius prolixus. Exp Parasitol.
2006; 112(2): 130–3.
Borges-Pereira J, Pessoa I, Coura JR. Observações sobre as dejeções e o número
de T. cruzi eliminados por diferentes espécies de triatomíneos durante a
alimentação. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1988; 83(1): 7.
Botto-Mahan C, Cattan PE, Medel R. Chagas disease parasite induces behavioural
changes in the kissing bug Mepraia spinolai. Acta Tropica. 2006; 98 (3): 219–23.
Botto-Mahan C, Sepúlveda M, Vidal M, Acuña-Retamar M, Ortiz S, Solari A.
Trypanosoma cruzi infection in the sylvatic kissing bug Mepraia gajardoi from the
Chilean Southern Pacific Ocean coast. Acta Tropica. 2008; 105 (2): 166-169.
Brecher G, Wigglesworth VB. The transmission of Actinomyces rhodnii Erikson in
Rhodnius prolixus Stal (Hemiptera) and its influence on the growth of the host.
Parasitology. 1944; 35(4): 220-24.
Brecher G, Wigglesworth VB. The transmission of Actinomyces rhodnii Erikson in
Rhodnius prolixus Stal (Hemiptera) and its influence on the growth of the host.
Parasitol. 1944; 35(4): 220-24.
81 Brener Z, Chiari E. Variações morfológicas observadas em difererntes amostras de
Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop São Paulo. 1963; 5: 220 – 224.
Brener Z. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally infected
with Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop São Paulo. 1962; 4: 389 –96.
Brickman MJ, Cook JM, Balber AE. Low temperature reversibly inhibits transport
from tubular endosomes to a perinuclear, acidic compartment in African
trypanosomes. Eur J Cell Biol. 1995; 108(Pt 11): 3611-21.
Brown JH, Gillooly JF, Allen AP, Savage VM, West GB. Toward a metabolic theory of
ecology. Ecology. 2004; 85(7): 1771–89.
Bull JJ. Perspective: virulence. Evolution. 1994; 1423–1437.
Burgos JJ, Curto de Casas SI, Carcavallo RU, Galindez GI. Global climate change
influence in the distribution of some pathogenic complexes (malaria and
Chagas’disease) in Argentina. Entomol Vect. 1994; 1: 69-78.
Caldas S, Caldas IS, Diniz L de F, Lima WG, Oliveira R de P, Cecílio AP, et al Realtime PCR strategy for parasite quantification in blood and tissue samples of
experimental Trypanosoma cruzi infection. Acta Tropica. 2012; 123(3): 170-7.
Callahan HL, Portal IF, Bensinger SJ, Grogl M. Leishmania spp: Temperature
sensitivity of promastigotes in vitro as a model for tropism in vivo. Exp Parasitol.
1996; 84(3): 400-9.
Canals M. Thermal ecology of small animals. Biol Res. 1998; 31: 367-374.
Carmichael LM, Moore J. A comparison of behavioral alterations in the brown
cockroach Periplaneta brunnea, and the American cockroach, Periplaneta
americana, infected with the acanthocephalan, Moniliformis moniliformis. J
Parasitol.1991; 77(6): 931–6.
82 Catalá S, Giojalas L, Crocco L. Temperature effect upon blood consumption in
Triatoma infestans. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1992; 87(4): 473-6.
Clark N. The effect of temperature and humidity upon the eggs of the bug Rhodnius
prolixus (Heteroptera, Reduviidae). J Anim Ecol. 1935; 4(1): 82–87.
Coura JR, Borges-Pereira J. Chagas disease: 100 years after its discovery. A
systemic review. Acta Tropica. 2010; 115(1-2): 5-13
Cummings KL, Tarleton RL. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue
by real-time PCR. Mol Biochem Parasitol. 2003; 129(1):53-9.
Curto de Casas SI, Carcavallo RU, Galindez Giron I, Jurberg J, Mena Segura CA.
Geographical distribution and alti-latitudinal dispersion of species of Panstrongylus
(Hemiptera, Reduviidae, Triatominae, Triatomini). Entomol Vect. 1996; 3: 43-58.
Czichos J, Nonnengaesser C, Overath P. Trypanosoma brucei: cis-Aconitate and
temperature reduction as triggers of synchronous transformation of bloodstream to
procyclic trypomastigotes in vitro. Exp Parasitol. 1986; 62(2): 283–291.
D’Alessandro A. Biology of Trypanosoma (Herpetosoma) rangeli Tejera, 1920. In:
Lumsden WHR, Evans DA. (editores). Biology of Kinetoplastida. Academic Press.
1976, 328–403.
D’Alessandro-Bacigalupo A, Saraiva NG. Trypanosoma rangeli. In: Kreir JP, Baker J.
(editores.). Parasitic Protozoa. Academic Pres. 1992; 1–54.
Di Luciano VS. Orientation of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) to
environmental temperatures. J Med Entomol. 1983; 21, 20 (4): 446-54.
Dias E. Observações sobre eliminação de dejeções e tempo de sucção em alguns
triatomíneos sulamericanos. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1956; 54(1): 115–24.
Dias JCP, Silveira AC, Schofield CJ. The impact of Chagas disease control in Latin
America: a review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002; 97(5): 603–12.
83 Dias JCP. Control of Chagas' disease in Brazil. Parasitol Today. 1987; 3(11): 336-41.
Dias JCP. Mecanismos de transmissão. In: Andrade Z, Brener Z. Trypanosoma
cruzie doença de Chagas. Rio de Janeiro: Guanabara – Koogan. 1979; 89-151.
DNDi América Latina. Doenças Negligenciadas/Doença de Chagas [online] 2010.
[Citado em 2012 Nov 29] Disponível em: http://www.dndi.org.br/pt/doencasnegligenciadas/doenca-de-chagas.html
Dodson BL, Kramer LD, Rasgon JL. Effects of larval rearing temperature on
immature development and West Nile virus vector competence of Culex tarsalis.
Parasit Vectors. 2012; 11; 5:119.
Dorn PL, Flores J, Brahney B, Gutierrez A, Rosales R, Rodas A, Monroy C.
Comparison of Polymerase Chain Reaction on Fresh Tissue Samples and Fecal
Drops on Filter Paper for Detection of Trypanosoma cruzi in Rhodnius prolixus. Mem
Inst Oswaldo Cruz. 2001; 96(4): 503 - 5.
Dunn WA, Hubbard AL, Aronson NN Jr. Low temperature selectively inhibits fusion
between pinocytic vesicles and lysosomes during heterophagy of 125I-asialofetuin by
perfused rat liver. J Biol Chem. 1980; 255(12): 5971-8.
Eger-Mangrich I, Oliveira MA, Grisard EC, De Souza W, Steindel M. Interaction of
Trypanosoma rangeli Tejera, 1920 with different cells line in vitro. Parasitol Res.
2001; 87(6): 505–9.
Ehrenfield MJ, Canals M, Cattan PE. Population parameters of Triatoma spinolai
under constant and variable environmental conditions. J Med Entomol. 1998; 35(5):
740-44.
Eichler S, Schaub GA. Development of symbionts in Triatomine bugs and the effects
of infections with trypanosomatids. Exp Parasitol. 2002; 100(1): 17-27.
84 Eichler S, Schaub GA. The effects of aposymbiosis and of an infection with
Blastocrithidia triatomae (Trypanosomatidae) on the tracheal system of the reduviid
bugs Rhodnius prolixus and Triatoma infestans. J Insect Physiol. 1998; 44(2):131140.
Elliot SL, Adler FR, Sabelis MW. How virulent should a parasite be to its vector?
Ecology. 2003; 84(10): 2568-74.
Elliot SL, Blanford S, Thomas MB. Host-pathogen interactions in a varying
environment: temperature, behavioural fever and fitness. Proc Roy Soc London-B.
2002; 269(1500): 1599-1607.
Fang J, McCutchan TF. Thermoregulation in a parasite's life cycle. Nature. 2002; 418
(6899): 742.
Fellowes MDE, Kraaijeveld AR, Godfray HCJ. Cross resistance following artificial
selection for increased host defence against parasitoids in Drosophila melanogaster.
Evolution. 1999; 53(3): 966-72.
Ferguson HM, Read AF. Genetic and environmental determinants of malaria parasite
virulence in mosquitoes. Proc Roy Soc London-B. Series B: Biol Sciences. 2002;
269.(1497): 1217-1224.
Ferreira LL, Lorenzo MG, Elliot SL, Guarneri AA. A standardizable protocol for
infection of Rhodnius prolixus with Trypanosoma rangeli, which mimics natural
infections and reveals physiological effects of infection upon the insect. J Inverteb
Pathol. 2010; 105(1): 91-7.
Ferreira LL, Lorenzo MG, Guarneri AA. Leaving the dark side: infection by
Trypanosoma rangeli weakens the negative phototaxis of Rhodnius prolixus nymphs.
XXVII Annual Meeting of the Brazilian Society of Protozoology. XXXVIII Annual
Meeting on basic research in Chagas’ Disease; 2011 Set 19-21; Foz do Iguaçu, PR,
Brasil. Sociedade Brasileira de Protozoologia, 2011. p 215.
Ferreira RC, Ferreira AM, Guarneri AA. XXVII. Triatomine-Trypanosoma interaction:
do Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli colonize the Rhodnius prolixus
anterior midgut? Annual Meeting of the Brazilian Society of Protozoology. XXXVIII
Annual Meeting on basic research in Chagas’ Disease; 2011 Set 19-21; Foz do
Iguaçu, PR, Brasil. Sociedade Brasileira de Protozoologia, 2011. p 211.
85 Filho FR, Schall JJ. Thermal Ecology of a Malarial Parasite and its Insect Vector:
Consequences for the Parasite's Transmission Success. J Animal Ecology. 1995;
64(5): 553-62.
Figueiredo RCBQ, Soares MJ. Low temperature blocks fluid-phase pinocytosis and
receptor-mediated endocytosis in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitol Res.
2000; 86(5): 413-8.
Florin-Christensen M, Florin-Christensen J, Isola ED, Lammel E, Meinardi E, Brenner
RR, et al. Temperature acclimation of Trypanosoma cruzi epimastigote and
metacyclic trypomastigote lipids. Mol Biochem Parasitol. 1997; 88(1-2): 25–33.
Forattini OP. Biogeografia, origem e distribuição da domiciliação de triatomíneos no
Brasil. Rev Saúde Públ 1980; 14: 143-149.
Fraenkel and L. D. Gunn. 1940. The Orientation of Animals. Oxford. 318.
Frank SA. Models of parasite virulence. Quart Rev Biol. 1996; 37-78.
Friend WG, Smith JJB. Factores biologicos y ecologicos en la enfermedad de
Chagas. In: Carcavallo RU, Rabinovich JE, Tonn RJ, editores. Epidemiologia.
Vetores, Centro Panamericano de Ecologia Humana y Salud OPS, OMS, Argentina;
1985; 55-72.
Gallardo A, Mougabure Cueto G, Picollo MI. Pediculus humanus capitis (head lice)
and Pediculus humanus humanus (body lice): response to laboratory temperature
and humidity and susceptibility to monoterpenoids. Parasitol Res. 2009; 105(1):1637.
Galvão C, Carcavallo R, Rocha DS, Jurberg J. A checklist of the current valid species
of the subfamily Triatominae Jeannel, 1919 (Hemiptera: Reduviidae) and their
geografical distribution with nomenclatural and taxonomic notes. Zootaxa. 2003; 30
(202): 1-36.
86 Garcia ES, Azambuja P. Development and interactions of Trypanosoma cruzi within
the insect vector. Parasitol Today. 1991; 7 (9): 240-244
Garcia ES, Castro DP, Figueiredo MB, Azambuja P. Immune homeostasis to
microorganisms in the guts of triatomines (Reduviidae): a review. Mem Inst Oswaldo
Cruz. 2010; 105(5): 605-10.
Garcia ES, Mello CB, Azambuja P, Ribeiro JM. Rhodnius prolixus: Salivary
antihemostatic components decrease with Trypanosoma rangeli infection. Exp
Parasitol. 1994; 78(3): 287-93.
Garcia ES, Ratcliffe NA, Whitten MM, Gonzalez MS, Azambuja P. Exploring the role
of insect host factors in the dynamics of Trypanosoma cruzi–Rhodnius prolixus
interactions. J Insect Physiol. 2007; 53(1): 11-21.
Gazos-Lopes F, Mesquita RD, Silva-Cardoso L, Senna R, Silveira AB, et
al. Glycoinositolphospholipids from Trypanosomatids Subvert Nitric Oxide Production
in Rhodnius prolixus Salivary Glands. PLoS ONE. 2012; 7(10):e47285.
Gomes SAO, Feder D, Garcia ES, Azambuja P. Suppression of the
prophenoloxidase system in Rhodnius prolixus orally infected with Trypanosoma
rangeli. J Insect Physiol. 2003; 49(9); 829-37.
Gomes SAO, Feder D, Thomas NES, Garcia ES, Azambuja P. Rhodnius prolixus
infected with Trypanosoma rangeli: in vivo and in vitro experiments. J Inverteb
Pathol. 1999; 73(3): 289-93.
Gonçalves L, Almeida FS, Mota FM. Effects of temperature on the development and
reproduction of Edessa meditabunda (Fabricius, 1794) (Hemiptera: Pentatomidae).
Acta Biol Par. 2008; 37 (1, 2): 111-21.
Gotelli NJ, Moore J. Altered host behaviour in a cockroach-acanthocephalan
association. Animal Behaviour. 1992; 43 (6): 949–59.
Grewal MS. Pathogenicity of Trypanosoma rangeli Tejera, 1920 in the invertebrate
host. Exp Parasitol. 1957; 6(2): 123-30.
87 Grisard EC, Campbell DA, Romanha AJ. Mini-exon gene sequence polymorphism
among Trypanosoma rangeli Straits isolated from distinct geographical regions.
Parasitology. 1999; 118:375-382.
Groot H. Estudios sobre los trypanosomas humanos (T. rangeli y T. ariarii). Ann Soc
Biol Bogotá. 1964; 6: 109-126.
Guarneri AA, Lazzari CR, Xavier AAP, Diotaiuti L, Lorenzo MG. The effect of
temperature on the behaviour and development of Triatoma brasiliensis. Physiol
Entomol. 2003; 28(3): 185–91.
Guerenstein PG, Lazzari CR. Host-seeking: How triatomines acquire and make use
of information to find blood. Acta Tropica. 2009; 110(2-3):148-58
Guinnee MA, Moore J. The effect of parasitism on host fecundity is dependent on
temperature in a cockroach–acanthocephalan system. J Parasitol. 2004; 90(4): 67377.
Gunn, DL. The Temperature and humidity relations of the cockroach. II. Temperature
preference. Zeit F Vergl Physiol. 1934; 20: 617-625.
Harrington JS. Studies on Rhodnius prolixus: growth and development of normal and
sterile bugs, and the symbiotic relationship. Parasitology. 1960; 50(1-2): 279–86.
Haylett T, Thilo L. Endosome-lysosome fusion at low temperature. J Biol Chem.
1991; 266(13): 8322-7
Hellmann K, Rosemary I. Hawkins. Anticoagulant and fibrinolytic activities from
Rhodnius prolixus Stal. Nature. 1964; 201: 1008-1009.
Hecker H, Schwarzenbach M, Rudin W. Development and interactions of
Trypanosoma rangeli in and with the reduviid bug Rhodnius prolixus. Parasitol Res.
1990; 76(4):311-18.
88 Heger TJ, Guerin PM, Eugster W. Microclimatic factors influencing refugium
suitability for Rhodnius prolixus. Physiol Entomol. 2006; 31: 248-56.
Herbig-Sandreuter, A. Further studies on Trypanosoma rangeli Tejera. 1920. Acta
Tropica. 1957; 14: 193-207.
Hoare CA, Wallace FG. Developmental stages of trypanosomatid flagellates: a new
terminology. Nature. 1966; 212: 1385–86.
Horwitz P, Wilcox BA. Parasites, ecosystems and sustainability: an ecological and
complex systems perspective. Internat J Parasitol. 2005; 35(7): 725–32.
Hudson L, Guhl F, Sanchez N, Bridge D, Jaramillo CA, Young A. Longitudinal studies
of the immune response of Colombian patients infected with Trypanosoma cruzi and
Trypanosoma rangeli. Parasitology. 1988; 96 (3): 449-60.
Hurd H, Hogg JC, Renshaw M. Interactions between blood-feeding, fecundity and
infection in mosquitoes. Parasitol Today. 1995; 11(11):411–16.
Hurd H. Manipulation of medically important insect vectors by their parasites. Annu
Rev Entomol. 2003; 48: 141–61.
Inglis DG, Johnson DL, Goettel MS. () Effects of temperature and sunlight on
mycosis (Beauveria bassiana) (Hyphomycetes: Sympodulosporae) of grasshoppers
under field conditions. Environ Entomol. 1997; 26 (2), 400–409.
Ipekdal K, Caglar SS. Effects of temperature on the host preference of pine
processionary caterpillar Thaumetopoea wilkinsoni Tams, 1924 (Lepidoptera:
Notodontidae). Turk J Zool. 2012; 36(3): 319-328.
Jöerg ME. Influencia de temperaturas fijas en períodos anuales sobre metamorfosis
y fertilidad de Triatoma infestans. Bol Chile Parasitol. 1960; 17: 2-6.
89 Kollien AH, Schmidt J, Schaub GA. Modes of association of Trypanosoma cruzi with
the intestinal tract of the vector Triatoma infestans. Acta Tropica 1998; 70(2): 127141.
Kollien AH, Schaub GA. The development of Trypanosoma cruzi in triatominae.
Parasitol Today. 2000; 16(9): 381-7.
Kraaijeveld AR, Van Alphen JJM, Godfray HCJ. The coevolution of host resistance
and parasitoid virulence. Parasitology. 1998; 116(S1): S29-S45.
Kuile, BH. Membrane-related processes and overall energy metabolism in
Trypanosoma brucei and other kinetoplastid species. J Bioenerg Biomembr. 1994;
26(2): 167-72.
Lactin DJ, Johnson DJ. Temperature-dependent feeding rates of Melanoplus
sanguinipes nymphs (Orthoptera: Acrididae) in laboratory trials. Environ Entomol.
1995; 24(5):1291-96.
Lake P, Friend WG. A monoxenic relationship, Nocardia rhodnii Erikson in the gut of
Rhodnius prolixus Stal (Hemiptera: Reduviidae). P Entomol Soc Ontario. 1967; 98:
53-7.
Lara FA, Sant´anna C, Lemos D, Laranja GA, Coelho MG, Reis Salles I et al. Heme
requirement and intracellular trafficking in Trypanosoma cruzi epimastigotes.
Biochem Bioph Res Co. 2007; 355(1):16–22.
Lazzari CR, Núñez JA. The response to radiant heat and the estimation of the
temperature of distant sources in Triatoma infestans. J Insect Physiol. 1989; 35 (6):
525 – 29.
Lazzari CR. Circadian organisation of locomotion activity in the haematophagous bug
Triatoma infestans. J Insect Physiol. 1992; 38(11): 895-903.
Lazzari CR. Temperature preference in Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae).
Bull Entomol Res. 1991; 81(3): 273–276.
90 Le Morvan C, Troutard D, Deschaux P. Differential effects of temperature on specific
and nonspecific immune defences in fish. J Exp Biol. 1998; 201: 165-8.
Lehane MJ, McEwen PK, Whitaker CJ, Schofield CJ. The role of temperature and
nutritional status in flight initiation by Triatoma infestans. Acta Tropica. 1992; 52 (1):
27-38.
Lehane MJ. The Biology of Blood-Sucking in Insects. 2nd ed. Cambridge (NY)
University Press. 2005.
Lent H, Wygodzinsky M. Revision of the Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) and
their significance as vector of Chagas disease. Bull Am Mus Nat Hist. 1979; 163(3):
123-520.
Li HB, Shi L, Lu MX, Wang JJ, Du YZ. Thermal tolerance of Frankliniella occidentalis:
Effects of temperature, exposure time, and gender. J Ther Biol. 2011; 36(7):437-442.
Libersat F, Moore J. The parasite Moniliformis moniliformis alters the escape
response of its cockroach host Periplaneta americana. J Insect Behavior. 2000;
13(1): 103–10.
Lima MM, Pereira JB, Santos JAA, Pinto ZT, Braga MV. Development and
reproduction of Panstrongylus megistus (Hemiptera: Reduviidae) infected with
Trypanosoma cruzi, under laboratory conditions. Ann Entomol Soc Am. 1992; 85(4):
458-61.
Lima-Camara TN, Bruno RV, Luz PM, Castro MG, Lourenço-de-Oliveira R, Sorgine
MHF, et al. Dengue Infection Increases the Locomotor Activity of Aedes
aegypti Females. PLoS ONE. 2011; 8; 6(3): e17690.
Luz C, Fargues J, Grunewald J. The effect of fluctuating temperature and humidity on
the longevity of starved Rhodnius prolixus (Triatominae). J Appl Ent. 1998; 122: 219222.
Loeb J. Forced Movements, Tropisms and Animal Conduct. J B Lippincott Co.,
Philadelphia. 1918; 155.
91 Lombardo ME, Araujo LS, Batlle A. 5-Aminolevulinic acid synthesis in epimastigotes
of Trypanosoma cruzi. Int J Biochem Cell Biol. 2003; 35(8): 1263–71.
Lopes dos Santos S, Freitas LM, Lobo FP, Rodrigues-Luiz GF, Mendes TA, Oliveira
ACS, et al. The MASP Family of Trypanosoma cruzi: Changes in Gene Expression
and Antigenic Profile during the Acute Phase of Experimental Infection. PLoS Negl
Trop Dis. 2012; 6(8): e1779.
Lorenzo MG, Lazzari CR. Dynamics of the use refuges by Triatoma infestans. Mem
Inst Oswaldo Cruz. 1993; 88: 265.
Lorenzo MG, Lazzari CR. Temperature and relative humidity affect the selection of
shelters by Triatoma infestans, vector of Chagas disease. Acta Tropica. 1999; 72(3):
241-49.
Lorenzo MG, Lazzari CR. The spatial pattern of defecation in Triatoma infestans and
the role of faeces as a chemical mark of the refuge. J Insect Physiol. 1996; 42(9):
903–07.
Marinkelle CJ. Pathogenicity of Trypansomoa rangeli for Rhodnius prolixus Stal in
nature (Hemiptera: Reduviidae) (Kinetoplastida: Trypanosomatidae). J Med Entomol.
1968; 5(4): 497-9.
Marliére NP, Lorenzo MG, Guarneri AA. The infection by Trypanosoma rangeli
changes the shelter use behavior of Rhodnius prolixus. XXVI Annual Meeting of the
Brazilian Society of Protozoology. XXXVII Annual Meeting on basic research in
Chagas’ Disease; 2010 Out 25-27; Foz do Iguaçu, PR, Brasil. Sociedade Brasileira
de Protozoologia, 2010. p 259.
Marliére NP, Lorenzo MG, Guarneri AA. Trypanosoma rangeli induces an increase in
the rates of predation endured by Rhodnius prolixus. XXVII Annual Meeting of the
Brazilian Society of Protozoology. XXXVIII Annual Meeting on basic research in
Chagas’ Disease; 2011 Set 19-21; Foz do Iguaçu, PR, Brasil. Sociedade Brasileira
de Protozoologia, 2011. p 212.
Marliére NP, Rodrigues JO, Ferreira LL, Carrasco D, Lorenzo MG, Guarneri AA. The
The locomotor activity of Rhodnius prolixus is differently afected by infection of
92 Trypanosoma cruzi or Trypanosoma rangeli. XXVII Annual Meeting of the Brazilian
Society of Protozoology. XXXVIII Annual Meeting on basic research in Chagas’
Disease; 2011 Set 19-21; Foz do Iguaçu, PR, Brasil. Sociedade Brasileira de
Protozoologia, 2011. p 210.
Martin F, Riveron J, Alcorta E. Environmental temperature modulates olfactory
reception in Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 2011; 5 7 (12): 1631-1642.
Mello CB, Garcia ES, Ratcliffe NA, Azambuja P. Trypanosoma cruzi and
Trypanosoma rangeli: Interplay with hemolymph components of Rhodnius prolixus. J
Inverteb Pathol. 1995; 65(3): 261-8.
Mello CB, Garcia ES, Ratcliffe NA, Azambuja P. Trypanosoma cruzi and
Trypanosoma rangeli: Interplay with hemolymph components of Rhodnius prolixus. J
Invert Pathol. 1995; 65: 261-268.
Mello CB, Nigam Y, Garcia ES, Azambuja P, Newton RP, Ratcliffe NA. Studies on a
Haemolymph Lectin Isolated from Rhodnius prolixus and Its Interaction with
Trypanosoma rangeli. Exp Parasitol. 1999; 91(4): 289–96.
Mendelssohn M. Uber den Thermotropismuseinzelliger Organismen. Arch Ges
Physiol. 1895; 60: 1-27.
Molyneaux D. Division of the human trypanosome, Trypanosoma (Herpetosoma)
rangeli. Ann Trop Med Parasitol. 1973; 67: 371-372.
Monroy C, Rodas A, Mejía M, Rosales R, Tabaru Y. Epidemiology of Chagas
Disease in Guatemala: Infection Rate of Triatoma dimidiata, Triatoma nitida and
Rhodnius prolixus (Hemiptera, Reduviidae) with Trypanosoma cruzi and
Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida, Trypanosomatidae). Mem Inst Oswaldo Cruz.
2003; 98(3): 305 -10.
Moore J, Freehling M, Gotelli NJ. Altered behavior in two species of blattid
cockroaches infected with Moniliformis moniliformis (Acanthocephala). J Parasitol.
1994; 80 (2): 220–3.
93 Moore J, Freehling M. Cockroach hosts in thermal gradients suppress parasite
development. Oecologia. 2002; 133(2): 261-66.
Moore J, Gotelli NJ. Moniliformis moniliformis increases cryptic behaviors in the
cockroach Supella longipalpa. J Parasitol. 1992; 78(1):49–53.
Moore J. Altered behavior in cockroaches (Periplaneta americana) infected with an
Archiacanthocephalan, Moniliformis moniliformis. J Parasitol. 1983; 69(6): 1174–76.
Moraes MH, Guarneri AA, Girardi FP, Rodrigues JB, Eger I, Tyler KM et al. Different
serological cross-reactivity of Trypanosoma rangeli forms in Trypanosoma cruziinfected patients sera. Parasites Vectors. 2008; 1–20.
Nicholson AJ. Influence of temperature on the activity of sheep blowflies. Bull
Entomol Res. 1934; 25: 85-99.
Núñez JA. Behaviour of Triatominae bugs. In: Brenner RR, Stoka AM (editores),
Chagas Disease Vectors. CRC Press. 1987; 2: 1–19.
Núñez JA. Food source orientation and activity in Rhodnius prolixus Stal (Hemiptera,
Reduviidae). Bull Entomol Res. 1982; 72(2): 253–62.
O’Daly JA, Carrasco H, Fernandez V, Rodríguez MB. Comparison of chagasic and
non-chagasic myocardiopathies by ELISA and immunoblotting with antigens of
Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli. Acta Tropica. 1994; 56(4): 265–87.
Okasha AYK. Effects of sub-lethal high temperature on an insect, Rhodnius prolixus
(Stål). III. Metabolic changes and their bearing on the cessation and delay of
moulting. J Exp Biol. 1968a; 48: 475 – 86.
Okasha, AYK. Effects of high temperature in Rhodnius prolixus (Stål). Nature. 1964;
204: 1221– 22.
Osorio Y, Travi BL, Palma G, Saravia NG. Infectivity of Trypanosoma rangeli in a
promonocytic mammalian cell line. J Parasitol. 1995; 81(5): 687–93.
94 Padmanabha H, Bolker B, Lord CC, Rubio C, Lounibos LP. Food availability alters
the effects of larval temperature on Aedes aegypti growth. J Med Entomol. 2011;
48(5): 974–984.
Paim RM, Araújo RN, Soares AC, Lemos LC, Tanaka AS, Gontijo NF, et al. Influence
of the intestinal anticoagulant in the feeding performance of triatomine bugs
(Hemiptera; Reduviidae). Int J Parasitol. 2011; 41(7): 765-73.
Paim RM, Pereira MH, Araújo RN, Gontijo NF, Guarneri AA. The interaction between
Trypanosoma rangeli and the nitrophorins in the salivary glands of the triatomine
Rhodnius prolixus (Hemiptera; Reduviidae). Insect Biochem Mol Biol. 2013;
43(3):229-236.
Peñalver LM. Estado actual de la enfermedad de Chagas en Guatemala. In F
Aguilar, Homenaje al Cincuentenario del Descubrimiento de la Enfermedad de
Chagas, Ministerio de Salud, Guatemala, 1959: 32-52.
Piron M, Fisa R, Casamitjana N, López-Chejade P, Puig L, Vergés M, et al.
Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood
samples. Acta Tropica. 2007; 103, (3):195-200
Prosser CL. Comp Animal Physiol. Saunders Co., Philadelphia, 1952. p. 374
Punnonen EL, Ryhänen K, Marjommaki VS. At reduced temperature, endocytic
membrane is blocked in multivesicular carrier endosomes of cardiac myocytes. Eur J
Cell Biol. 1998; 75(4):344-52
Qvarnstrom Y, Schijman AG, Veron V, Aznar C, Steurer F, Silva A. Sensitive and
Specific Detection of Trypanosoma cruzi DNA in Clinical Specimens Using a MultiTarget Real-Time PCR Approach. PLoS Negl Trop. 2012, 6(7): e1689.
Reisenman CE, Lazzari CR, Giurfa M. Circadian control of photonegative sensitivity
in the haematophagous bug Triatoma infestans. J Comp Physiol A. 1998; 183: 533–
41.
95 Reisenman CE, Lazzari, CR. Spectral sensitivity of the photonegative reaction of the
blood-sucking bug Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae). J Comp Physiol A
Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 2006; 192(1): 39–44.
Reiskind MH, Zarrabi AA. Is bigger really bigger? Differential responses to
temperature in measures of body size of the mosquito, Aedes albopictus. J Insect
Physiol. 2012; 58(7): 911-7.
Rentifo S, Groot H, Uribe C. Contribución al estudio de tripanosomas humanos y de
animales en Colombia. Rev Hyg. 1950; 24: 4-12.
Ribeiro JMC, Andersen J, Silva-Neto MAC, Phama VM, Garfield MK, Valenzuela JG.
Exploring the sialome of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Insect Biochem
Mol Biol. 2004; 34: 61–79.
Rocha DS, Juberg J, Carcavallo RU, Presgrave OAF, Cunha V, Galvão C. Influência
da temperatura e umidade no desenvolvimento ninfal de Rhodnius robustus. Rev
Saúde Pública. 2001; 35 (4): 400 – 6.
Rodrigues JO, Lorenzo MG, Guarneri AA. A infecção por Trypanosoma cruzi não
afeta a fototaxia negativa de Rhodnius prolixus. 24a Reunião de Pesquisa Aplicada
em doença de Chagas e 12a Reunião de Pesquisa Aplicada em Leishmanioses;
2008 Out. 23-25; Uberaba, MG, Brasil. Universidade Federal do Triangulo Mineiro;
2008. p 189.
Rudin W, Schwarzenbach M, Hecker H. Binding of lectins to culture and vectors
forms of Trypanosoma rangeli Tejera, 1920 (Protozoa, Kinetoplastida) and to
structures of the vector gut. J Protozool. 1989; 36: 532-538.
Salvatella R, Basmadjián Y, Rosa R., Martínez M, Mendaro G, Civila E. Hallazgo de
Triatoma platensis Neiva, 1913 (Hemiptera, Triatominae) en el estado brasileño de
"Rio Grande do Sul". Rev Inst Med Trop São Paulo.1991; 33(1), 1-5.
Salzman TA, Stella AM, Xifra W, Batlle AM, Docampo R, Stoppani AO. Porphyrin
biosynthesis in parasitic hemoflagellates: functional and defective enzymes in
Trypanosoma cruzi. Comp Biochem Physiol B. 1982; 72(4): 663–7.
96 Schaub GA. Development of isolated and group-reared first instars of Triatoma
infestans infected with Trypanosoma cruzi. Parasitol. 1988; 74(6): 593-4.
Schaub GA. Interactions of trypanosomatids and triatomines. Adv Insect Physiol.
2009; 37:177-242.
Schaub GA. The effects of trypanosomatids on insects. Adv Parasitol. 1992; 31:
255–319.
Schaub GA. Trypanosoma cruzi: quantitative studies of development of two strains in
small intestine and rectum of the vector Triatoma infestans. Exp Parasitol. 1989;
68(3): 260-73.
Schilman PE. Factores que afectan la reproducción de las vinchucas: aspectos
fisiológicos y comportamentales. PhD Thesis, University of Buenos Aires, Argentina,
1998, 126 pp.
Schmitz H, Trenner S, Hofmann MH, Bleckmann H. The ability of Rhodnius prolixus
(Hemiptera; Reduviidae) to approach a thermal source solely by its infrared radiation.
J Insect Physiol. 2000; 46(5): 745–751.
Schofield CJ. Biosystematics and evolution of the Triatominae Biossistemática e
evolução de triatomíneos. Cad Saúde Pública. 2000; 16 (2): 89-92.
Schofield CJ, Galvão C. Classification, evolution, and species groups within the
Triatominae. Acta Tropica. 2009. 110(2), 88-100.
Schofield CJ, Lehane MJ, McEWEN P, Catala SS, Gorla DE. Dispersive flight
by Triatoma infestans under natural climatic conditions in Argentina. Med Vet
Entomol. 1992; 6: 51–56.
Schofield CJ, Matthews JNS. Theoretical approach to active dispersal and
colonization of houses by Triatoma infestans. J Trop Med Hyg. 1985; 88 (3): 211 –
22
97 Schofield CJ, Tims S. Triatominae: Biología y control. West Sussex: Eurocommunica
Publications. 1994; 80.
Schofield GJ, Patterson JW. Assembly pheromone of Triatoma infestans and
Rhodnius prolixus nymphs (Hemiptera: Reduviidae)." J Med Entomol. 1977; 13(6):
727-734.
Schotelius J. Neuraminidase fluorescent test for differentiation of Trypanosoma cruzi
and Trypanosoma rangeli. Trop Med Parasit. 1987; 38: 323-327.
Sherlock, I.A. Vetores. In: Z Brener, Z Andrade. Trypanosoma cruzi e doença de
Chagas, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1979, p. 42-89.
Sigsgaard L. The temperature-dependent duration of development and parasitism of
three cereal aphid parasitoids, Aphidius ervi, A. rhopalosiphi, and Praon
volucre. Entomol Exp Appl. 2000; 95(2): 173-184.
Silva GI. Influência da temperatura na biologia de triatomíneos VII. Rhodnius prolixus
Stal, 1859 (Hemiptera, Reduviidae). Ver Pat Trop. 1988; 17(2): 145-155.
Silveira AC. Situação do controle da transmissão vetorial da doença de Chagas nas
Américas. Cad Saúde Pública. 2000; 16 (2): 35-42.
Stehling Dias FB, de Paula AS, Belisario CJ, Lorenzo MG, Bezerra CM, Harry M, et
al. Influence of the palm tree species on the variability of Rhodnius nasutus Stal,
1859 (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae). Infect Genet Evol. 2011; 11(5): 869-77.
Stehling Dias, FB, Bezerra CM, de Menezes Machado EM, Casanova C, Diotaiuti L.
Ecological aspects of Rhodnius nasutus Stal, 1859 (Hemiptera: Reduviidae:
Triatominae) in palms of the Chapada do Araripe in Ceara, Brazil. Mem Inst Oswaldo
Cruz. 2008; 103(8): 824-30
Tanoura K. Trypanosoma rangeli – in vitro metacyclogenisis and fate of metacyclic
trypomastigotes after infection to mice and fibroblast cultures. J Eukaryot Microbiol.
1999; 46: 43-48.
98 Teixeira ARL, Gomes C, Lozzi SP, Hecht MM, Rosa AC, Monteiro PS. et al.
Environment, interactions between Trypanosoma cruzi and its host, and health. Cad
Saúde Pública. 2009; 25(1): S32-S44.
Teixeira ARL, Monteiro PS, Rebelo JM, Argañaraz E, Vieira D, Lauria-Pires L, et al.
Emerging Chagas disease: trophic network and cycle of transmission of
Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerg Infect Dis. 2001; 7(1):
100–112.
Thekisoe OMM, Rodriguez CV, Rivas F, Coronel-Servian AM, Fukumoto S, Sugimoto
C, et al. Detection of Trypanosoma cruzi and T. rangeli infections from Rhodnius
pallescens bugs by Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP). Am J Trop Med
Hyg. 2010; 82(5): 855-60.
Thomas F, Adamo S, Moore J. Parasitic manipulation: where are we and where
should we go? Behav Process. 2005; 68 (2005) 185–199.
Thomas MB, Blanford S. Thermal biology in insect-parasite interactions. Trends Ecol
Evol. 2003.18, 344-350.
Thrall PH, Hochberg ME, Burdon JJ, Bever JD. Coevolution of symbiotic mutualists
and parasites in a community context. Trends Ecol Evol. 2007; 22(3): 120-26.
Tobie EJ. Biological factors influencing transmission of Trypanosoma rangeli by
Rhodnius prolixus. J Parasitol. 1965; 51(5): 837-41.
Tobie EJ. Experimental transmission and biological comparison of strains of
Trypanosoma rangeli. Exp Parasitol. 1961; 11(1): 1-9.
Tobie EJ. Observations on the development of Trypanosoma rangeli in the hemocoel
of Rhodnius prolixus. J Invertebrate Pathol. 1970; 15(1): 118-25.
Tyler KM, Engman DM. The life cycle of Trypanosoma cruzi revised. Inter J Parasitol.
2001; 31: 472–81.
99 Vallejo GA, Guhl F, Schaub GA. Triatominae-Trypanosoma cruzi/T. rangeli: Vectorparasite interactions. Acta Tropica. 2009; 110 (2-3): 137–47.
Vinhaes MC, Dias JCP. Doença de Chagas no Brasil. Cad Saúde Pública. 2000;
16(2): 7-12.
Whitman DW. Function and evolution of thermoregulation in the desert grasshopper
Taeniopoda eques. J Anim Ecol. 1988; 57(2): 369-83.
WHO, World Health Organization. Chagas disease (American trypanosomiasis) [on
line]
Ago
2012
[capturado
3
Jan.
2013].
Disponível
em:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/index.html
Wigglesworth VB. The Determination of Characters at Metamorphosis in Rhodnius
prolixus (Hemiptera). J Exp Biol. 1940; 17:201-223.
Wigglesworth VB. Memoirs: The function of the Corpus Allatum in the Growth and
Reproduction of Rhodnius prolixus (Hemiptera). Quart J Micros Science. 1936; s279:91-121
Wigglesworth VB. Memoirs: The Physiology of Ecdysis in Rhodnius Prolixus
(Hemiptera). II. Factors controlling Moulting and ‘Metamorphosis’. Quart J Micros
Science. 1934; s2-77:191-222
Wigglesworth VB, Gillet JD. The function of the antennae in Rhodnius prolixus
(Hemiptera) and the mechanism of orientation to the host. J Exp Biol. 1934; 11: 120139.
Willott SJ, Hassell M. Life-history responses of British grasshoppers (Orthoptera:
Acrididae) to temperature change. Funct Ecol. 1998; 12(2): 232-41.
Wilson K, Edwards J. The effects of parasitic infection on the behaviour of an
intermediate host, the American cockroach, Periplaneta americana, infected with the
Acanthocephalan, Moniliformis moniliformis. Animal Behaviour. 1986; 34: 942–944.
100 Wood SF. Importance of feeding and defecation times of insect vectors in
transmission of Chagas disease. J Econ Entomol. 1951; 44: 52–54.
Yaeger RG. A method of isolating trypanosomes from blood. J Parasitol. 1960; 46:
288.
Yang HM, Macoris MLG, Galvani KC, Andrighetti MTM, Wanderley DMV. Assessing
the effects of temperature on the population of Aedes aegypti, the vector of dengue.
Epidemiol Infec. 2009; 137; 1188-1202.
Zeledón R. Life cycle of Trypanosoma cruzi in the insect vector. Chagas Disease
Vectors. 1987; 2: 59-75.
Zeledón R, Alvarado R, Jirón LF. Observations on the feeding and defecation
patterns of three triatomines species (Hemíptera-Reduvidae). Acta Tropica. 1977;
34(1): 65–77.
Zilberstein D. The role of pH and temperature in the development of Leishmania
parasites. Annu Rev Microbiol. 1994; 48:449-70
101