Precipitação de proteínas As proteínas são identificadas por meio de reações de precipitação e reações de coloração. Neste trabalho serão executadas reações com proteínas do leite, que se obtém separando-se a caseína por precipitação, restando o soro que contém os outros componentes do leite. A precipitação da caseína nada mais é do que a preparação da coalhada ou iogurte. Essa precipitação ocorre quando o pH do leite abaixa até atingir o pI (ponto isoelétrico) da caseína, que é: pHi = 4,6. Em pH 4,6 as cargas elétricas da molécula da caseína se equivalem, isto é, existe igual quantidade de cargas elétricas positivas e negativas e nesta condição a caseína se precipita. Cada proteína tem o seu ponto isoelétrico característico. O abaixamento do pH pode se processar: a. quimicamente : pela adição de ácidos (acético, cítrico, lático, etc.) ao leite, lentamente (gota a gota) até que se verifique a formação do coágulo. Isto deve ser feito com agitação e a uma temperatura de 42 C. b. microbiologicamente: pela contaminação do leite com uma cultura de microrganismos que produzem ácidos. Qualquer microrganismo que produza ácidos pode ser utilizado para o preparo do iogurte, ou seja, para a precipitação da caseína. Pode-se utilizar, por exemplo, pastilhas ou injeções de lactobês, lactosin (que são culturas de lactobacilos). A temperatura também precisa ser conservada durante umas 4 horas a 42 C. Conforme a cultura utilizada, o iogurte terá um sabor diferente. Para a alimentação, o iogurte preparado microbiologicamente, tem maior valor nutritivo, porque além das proteínas do leite existem os microrganismos. Objetivos: Realizar a separação de uma das proteínas do leite, a caseína, através de precipitação no ponto isoelétrico. Precipitar proteínas do soro obtido a partir do leite, com o uso de alcaloides. Procedimento: 1. Extração da caseína Preparar um banho-maria a 42º C. Preparar uma diluição de 100 mL de leite e 100 mL de água. Deixar o leite em banho-maria durante pelo menos 60 minutos. Juntar gota a gota ácido acético 2 mol L-1 (cerca de 20 a 40 gotas) agitando sempre com um bastão de vidro até que o pH esteja entre 4 e 5 (verificar com papel). Depois da precipitação da caseína deixar em repouso três minutos para decantar melhor. Separar o soro vertendo o mesmo, filtrando com um pedaço de gaze para um recipiente de vidro. O resíduo (precipitado) é a caseína impura. Teremos então: o precipitado ............. que é a caseína o filtrado ...................que possui todos os outros componentes do leite ( lactose, sais minerais, lactoalbumina, lactoglobulina, vitaminas, água etc.), exceto a caseína. 2. Preparo do desproteinizado a partir do filtrado A desproteinização, que é uma manobra largamente empregada em análises bioquímicas, será usada para comprovar a presença da proteína. Colocar em um erlenmeyer: 2 mL de filtrado 16 mL de H2SO4 2 mL de tungstato de sódio Agitar e filtrar, usando o papel de filtro colocado sobre o funil adaptado a um tubo de ensaio. Obtém-se dessa maneira uma solução desprovida de proteínas, o desproteinizado. 3. Precipitação com reativo de alcaloides: Reativos que podem ser utilizados: ácido pícrico, ácido sulfosalicílico, ácido tânico, ácido fosfotúngstico. Colocar 2 mL do filtrado em um tubo de ensaio. Juntar algumas gotas de ácido fosfotúngstico. Notar a formação do precipitado (sais de proteínas) Repetir com o filtrado desproteinizado e comparar. Explicação: Os reagentes de alcaloides são ácidos e agem pelo seu ânion. Neste caso, formam-se verdadeiros sais de proteínas que agem pelo cátion (pH abaixo do seu ponto isoelétrico).