Lázaro Moreira Marques Neto - IPTSP

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
LÁZARO MOREIRA MARQUES NETO
Construção e expressão de uma proteína de fusão
recombinante, em Escherichia coli, a partir de antígenos
imunodominantes do Mycobacterium tuberculosis
Goiânia
2014
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA
DISPONIBILIZAR AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de
Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e
Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº
9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura,
impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir
desta data.
1. Identificação do material bibliográfico:
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a):
Lázaro Moreira Marques Neto
E-mail:
[email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página?
[ X] Dissertação
[X]Sim
[ ] Tese
[ ] Não
Vínculo empregatício do autor
Agência de fomento:
Conselho Nacional de Desenvolvimento Sigla:
CNPq
Científico e Tecnológico
País:
Brasil
UF:GO
CNPJ:
Título:
Construção e expressão de uma proteína de fusão recombinante, em Escherichia coli, a partir de
antígenos imunodominantes do Mycobacterium tuberculosis
Palavras-chave:
Proteína, fusão, antígeno imunodominante, resposta imune e tuberculose.
Construction and expression of a recombinant fusion protein, in Escherichia coli, from
Título em outra língua:
immunodominant antigens of Mycobacterium tuberculosis
Palavras-chave em outra língua:
Protein, fusion, immunodominant
tuberculosis
Área de concentração:
Ciências Biológicas
Data defesa: (dd/mm/aaaa)
27/02/2014
Programa de Pós-Graduação:
Medicina Tropical e Saúde Pública
Orientador (a):
André Kipnis
E-mail:
[email protected]
Co-orientador (a):*
Ana Paula Junqueira Kipnis
E-mail:
[email protected]
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG
antigen, immune
response e
3. Informações de acesso ao documento:
Concorda com a liberação total do documento [X] SIM
[
] NÃO1
Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o
envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.
O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os
arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização,
receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de
conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.
Data: 27/02/2014
Lázaro Moreira Marques Neto
1
Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste
prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão
disponibilizados durante o período de embargo.
LÁZARO MOREIRA MARQUES NETO
Construção e expressão de uma proteína de fusão
recombinante, em Escherichia coli, a partir de antígenos
imunodominantes do Mycobacterium tuberculosis
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
e Saúde Pública da Universidade Federal de
Goiás para obtenção do Título de Mestre em
Medicina Tropical e Saúde Pública.
Orientador: Dr. André Kipnis
Coorientador: Dr. Ana Paula Junqueira-Kipnis
Goiânia
2014
i
ii
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno (a): Lázaro Moreira Marques Neto
Orientador (a): André Kipnis
Co-orientador (a): Ana Paula Junqueira Kipnis
Membros:
1. André Kipnis
2. Lucimeire Antanelli da Silveira
3. Carla Afonso da Silva Bitencourt Braga
Data: 27/02/2014
iii
Dedicatória
Esse trabalho é dedicado à minha família:
À minha mãe, Marlene Marques Mendanha
À minha irmã, Lídia Carolina Marques Mendanha
À minha irmã, Ana Carolina Marques Mendanha
À minha sobrinha e afilhada, Juliana Mendanha Teixeira
Ao meu sobrinho, Arthur Mendanha Teixeira
À minha sobrinha, Katarina Mendanha de Souza Miranda
Vocês são a razão da minha vida.
Obrigado!
Aos meus amigos:
Caique Coletto Bottosso
Dannilo Borges de Oliveira
Hugo do Carmo Mendes César
Rodrigo Gomes de Andrade
William Borges de Oliveira
Desculpem os sumiços! Foi por um bom motivo!
“Para conseguir a amizade de uma pessoa digna é preciso
desenvolvermos em nós mesmos as qualidades que naquela admiramos.”
Sócrates
“Na vida não há nada a temer, mas a entender.”
(Marie Curie)
iv
AGRADECIMENTOS
À minha família por me amparar nos momentos difíceis, me dar força para
superar as dificuldades, serem meu guia nos caminhos e nas horas incertas e me
suprir em todas as minhas necessidades.
Aos meus orientadores Professores Dr. André Kipnis e Dra. Ana Paula
Junqueira-Kipnis, pela paciência frente aos erros, por sempre exigirem o melhor de
mim, por ser um exemplo de conduta e ética que eu sempre utilizarei como padrão na
minha vida pessoal e profissional e por me mostrarem o caminho da ciência.
Ao colaborador e amigo, Abadio da Costa Júnior por me ensinar e me
acompanhar na realização dos ELISA. Obrigado, esse trabalho é tão meu quanto seu.
À colaboradora e amiga, Monalisa Martins Trentini, a pessoa mais incrível que
eu conheço, mais brava, mais faladeira, mais disposta, mais confiável, mais amiga,
mais companheira. Obrigado por me ensinar a manusear e a trabalhar com
camundongos. Sua ajuda com certeza foi fundamental para a realização desse
trabalho e para a conclusão do meu mestrado.
Ao colaborador e amigo, Fábio Muniz de Oliveira pelas horas de conversa, pela
compreensão, pela amizade e por me ajudar nos experimentos de vacinação,
imunogenicidade e proteção. É um privilégio ter você como amigo. Obrigado!
Aos meus companheiros do Laboratório de Bacteriologia Molecular e
Imunopatologia das doenças infecciosas: Renato Beilner, Danilo Rezende, Rogério
Coutinho, Viviane Lopes, Adeliane da Costa, Bruna Daniella, Bruno Santos, Rafaela
Alves, Jacqueline Melo, Beatriz Fonseca, Luana Nice, Duanne Alves, André Corrêa.
Agradeço de coração todo o apoio, a amizade e contribuições que vocês me deram.
Ao Laboratório de Biologia Molecular ICB-UFG, em especial ao Professor Dr.
Alexandre Melo Bailão, por me receberem tão bem e me ajudarem nos experimentos
de Espectrometria de Massa.
v
Aos Professores Dra. Carla Afonso S. Bitencourt Braga, Dr. Alexandre Melo
Bailão, Dr. André Corrêa Amaral e Dra. Lucimeire Antonelli da Silveira por
participarem da banca de qualificação e de defesa e me ajudarem a construir e
melhorar esse trabalho.
À Professora Dr. Alessandra Marques, por fazer parte da minha formação, por
me ensinar e me fazer começar a amar a microbiologia e por me incentivar à
pesquisa. Obrigado.
A todos os professores do IPTSP, principalmente os professores de bacteriologia
que sempre foram solícitos, educados e muito atenciosos. Muito obrigado.
Agradeço aos funcionários da secretaria geral e da secretaria do curso de pósgraduação: Fernando Koslowski, Valéria, Divina, José Clementino, Kariny e Márcio.
Muito obrigado pela cooperação.
Ao CNPq pelo apoio financeiro ao projeto e a mim, que certamente foi o que nos
ancorou na realização desse trabalho.
vi
SUMÁRIO
1
REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................... 1
1.1
Etiologia e Epidemiologia da Tuberculose ........................................................ 1
1.2
Imunopatologia da Tuberculose ......................................................................... 3
1.3
Profilaxia: Vacinação com Bacilo de Calmette e Guérin (BCG) ....................... 9
1.4
Diagnóstico da Tuberculose ............................................................................. 11
1.5
Tratamento da Tuberculose .............................................................................. 15
1.6
Controle da Tuberculose .................................................................................. 17
1.7
Antígenos utilizados nesse trabalho ................................................................. 20
1.8
Construção de Proteínas de Fusão .................................................................... 26
2
JUSTIFICATIVA ............................................................................................. 30
3
OBJETIVOS ..................................................................................................... 33
3.1
Objetivo Geral .................................................................................................. 33
3.2
Objetivos Específicos ....................................................................................... 33
4
MÉTODOS ....................................................................................................... 34
4.1
Construção dos vetores recombinantes para expressão heteróloga em E. coli. 35
4.1.1 Desenho de oligonucleotídeos iniciadores e análise “in silico” da construção 35
4.1.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ......................................................... 36
4.1.3 Reação de Digestão Simples e Dupla das subunidades gênica. ....................... 37
4.1.4 Sistema de Ligação ........................................................................................... 38
4.1.5 Transformação por eletroporação ..................................................................... 39
4.1.6 Extração de DNA plasmidial por lise alcalina ................................................. 39
4.2
Sequênciamento do plasmídeo pET23a/CDα ................................................... 40
4.3
Expressão de proteína CDα de fusão em E. coli .............................................. 41
4.3.1 Expressão de proteína CDα em larga escala .................................................... 41
4.3.2 Purificação da proteína em condições desnaturantes ....................................... 42
4.3.3 Gel de SDS-PAGE ........................................................................................... 42
4.3.4 Espectrometria de Massa – MALDI-TOF MS ................................................. 43
4.4
Imunização de camundongos com a proteína recombinante CDα ................... 43
4.5
Ensaio Imuno-Enzimático com a Proteína recombinante CDα ........................ 44
4.5.1 Reação de ELISA ............................................................................................. 44
4.5.2 ELISA com soro de camundongos vacinados .................................................. 44
5
RESULTADOS ................................................................................................ 46
vii
5.1
Desenho de oligonucleotídeos iniciadores e análise “in silico” da construção da
fusão gênica Ag85c-MPT51-HspX (CDα) ................................................................ 46
5.2
Construção da sequência gênica da proteína CDα ........................................... 48
5.3
Análise constitucional: Sequênciamento do plasmídeo pET23a/CDα e
Espectrometria de Massa (MALDI-TOF MS) da proteína CDα ............................... 50
5.4
Expressão da CDα em E. coli. .......................................................................... 52
5.5
Padronização do ELISA para CDα ................................................................... 55
5.6
Produção e titulação de anticorpos anti-CDα ................................................... 56
6
DISCUSSÃO .................................................................................................... 57
7
CONCLUSÕES ................................................................................................ 60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 61
ANEXOS ................................................................................................................... 80
Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética ...................................................................... 80
Anexo 2 - Artigo Científico........................................................................................82
viii
Tabelas, Figuras e Anexos
Tabela 1. Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados nesse trabalho e
seus respectivos amplicons esperados. ...................................................................... 46
Figura 1. Mapa da incidência de tuberculose pelo mundo.. ........................................ 3
Figura 2. A contenção do Mycobacterium tuberculosis por um granuloma sólido.. ... 6
Figura 3. Transmissão e disseminação do Mycobacterium tuberculosis a partir do
rompimento de um granuloma caseoso.. ..................................................................... 9
Figura 4. Ação enzimática (a), estrutura (b) e sítios catalíticos (c) das proteínas da
família Ag85.. ............................................................................................................ 23
Figura 5. Estrutura terciária do MPT51 ..................................................................... 24
Figura 6. Representação esquemática da sequência de metodologia e técnicas
utilizadas nesse trabalho ............................................................................................ 35
Figura 7. Sequência final do gene CDα e sequência de nucleotídeos gerados pela
expressão no contexto do plasmídeo pET23a ............................................................ 47
Figura 8. Predição da estrutura terciária da proteína CDα.. ....................................... 47
Figura 9. Etapas da construção da sequência gênica da proteína CDα. ..................... 49
Figura 10. Espectro de Massa Molecular (MALDI-TOF/MS). ................................. 51
Figura 11. Teste de indução da proteína CDα , gel de SDS-PAGE a 12%....... ........ 52
Figura 12. Indução em larga escala, gel de SDS-PAGE a 12% da proteína CDα. .... 53
Figura 13. Purificação da proteína em condições desnaturantes. .............................. 53
Figura 14. Quantificação da proteína CD α. .............................................................. 54
Figura 15. Gel de SDS-PAGE a 12% da dessalinização da proteína CDα. ............... 54
Figura 16. Padronização da quantidade antígeno e diluição do soro para utilização da
proteína CDα, em ensaio de imunoenzimático.. ........................................................ 55
Figura 17. Titulação de anticorpos anti-CDα.. .......................................................... 56
Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética.........................................................................80
Anexo 2. Artigo Científico.........................................................................................82
ix
Símbolos, Siglas e Abreviações
Ag85c - Antígeno 85c
AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (do ingles: Acquired
Immunodeficiency Syndrome)
APC – Células Apresentadora de antígeno (do inglês: Antigen Presenting Cell)
BAAR - Bacilo Álcool-Ácido Resistente
BCG - Bacilo de Calmette-Guérin
BK - Bacilo de Koch
BMDM – Macrófagos Derivados de Medula Óssea (do inglês: Bone Marrow Derived
Macrophage)
BSA – Soro Albumina Bovina (do inglês: Bovine Serum Albumin)
CFP10 – Proteína de Filtrado de Cultura de 10 kDa (do inglês: Culture Filtrate
Protein of 10kDa)
CXCL – Qumiocinas que apresentam motivos C-X-C
DOTS – Terapia Diretamente Observada de Curta Duração (do ingles: Directly
Observed Therapy, short-course)
E – Etambutol
ELISA - Ensaio Imunoenzimático (do inglês: Enzyme Linked Imuno Sorbent Assay)
ESAT - do inglês: Early-Secretory Antigenic Target
Et – Etionamida
FAPEG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Goiás
Gli – Glicina
H- Isoniazida
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana (do ingles: Human Immunodeficiency
Virus)
HspX – Proteína de Choque Térmico X (do ingles: Heat Shock Protein X)
IFN-γ - Interferon Gama
IgG - Imunoglobulina G
IgM - Imunoglobulina M
IGRA – Ensaio de Liberação de Interferon Gama (do inglês: Interferon Gama
Release Assay)
IL - Interleucina
LB Ágar – Ágar Lúria Bertani
x
MGIT – Tubo Indicador de Crescimento de Micobactérias (do inglês: Mycobacterial
Growth Indicator Tube)
MHC - do inglês: Major Histocompatibility Complex
MNT – Micobactérias não causadoras de Tuberculose
MPT51 – Proteína do Mycobacterium tuberculosis (do inglês: Mycobacterium
tuberculosis protein)
MS - Ministério da Saúde
Mtb- Mycobacterium tuberculosis
NO - Óxido Nítrico
OMS – Organização Mundial da Saúde
OPD - Ortophenilenediamina
PBS – Tampão Salina Fosfato (do inglês: Phophate Buffered Saline)
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês: Polymerase Chain Reaction)
PPD – Derivado Proteico Purificado (do inglês: Purified Protein Derivative)
PRR - Receptor de Reconhecimento Padrão (do inglês: Pattern Recognition
Receptor)
PT- Prova Tuberculínica
R – Rifampicina
RD – Regiões de Diferenciação (do ingles: Region of Difference)
SD – Sistema de Digestão
Ser – Serina
SL – Sistema de Ligação
SVS- Secretaria de Vigilância e Saúde
T CD4+ - Linfócitos T auxiliaries (do inglês: Helper T Lymphocytes) (Th)
T CD8+ - Linfócitos T citotóxicos (do inglês: Citotoxic T Lymphocytes) (Tc)
TB – Tuberculose
TCSS – Sistema de Sinalização de Dois Componentes (do inglês: Two Components
Signal Sistem)
TDM – Trealose Dimicolato
TGF – Fator Transformador de Crescimento (do inglês: Transforming Growth
Factor)
Th1 – células T helper 1
Th17 – células T helper 17
TMM – Trealose Monomicolato
xi
TNF-α- Fator de Necrose Tumoral alfa (do inglês: Tumoral Necrosis Factor alfa)
Treg – Células T Reguladoras
WHO – Organização Mundial da Saúde (do inglês: World Health Organization)
Z – Pirazinamida
xii
RESUMO
A tuberculose (TB) é um mal antigo que assola a humanidade há milhares de anos e
ainda hoje é um grave problema de saúde pública, causando adoecimento de mais de
8 milhões e matando mais de 1 milhão de pessoas todo o ano. A vacina utilizada
atualmente, a BCG, foi desenvolvida em 1921 e a partir de 1924 passou a ser
utilizada como método profilático contra a tuberculose, sendo considerada a vacina
mais amplamente utilizada em todo o mundo. Seu potencial protetor é muito
variável, tendo índices de proteção variando de 0 a 80%, mas ainda é utilizada
porque ela protege contra as formas mais graves da doença na infância. Vacinas de
subunidade protéica e proteínas de fusão utilizam da estratégia de poder lidar apenas
com os componentes do microrganismo que melhor estimulam o sistema imune ao
invés de utilizar o microrganismo inteiro. No entanto, o desenvolvimento de
proteínas de fusão não possui regras definidas, pois a aproximação artificial de
peptídeos pertencentes a diferentes proteínas acarretam em novas interações
intramoleculares cujos resultados ainda não podem ser totalmente previstos. Nesse
trabalho propusemos a construção de uma proteína de fusão (CDα) a partir de
subunidades de proteínas conhecidamente antigênicas do Mycobacterium
tuberculosis (Ag85c, MPT51 e HspX). As subunidades foram escolhidas a partir de
seu potencial de induzir uma resposta imune do tipo Th1 e, principalmente, pelo seu
papel na ativação e indução de populações diversas de linfócitos T CD8+. Com base
em análises "in silico" foi possível construir oligonucleotídeos iniciadores que
possibilitaram a amplificação e posterior fusão das sequências gênicas das
subunidades além da inserção de uma sequência hinge de glicina e serina entre cada
subunidade que permitiram melhor estabilidade da proteína. A sequência gênica da
CDα foi inserida em um plasmídeo de expressão e transformada em Escherichia coli
BL21 e a partir disso foi possível induzir sua expressão e purificar a proteína em
larga escala, contudo, não foi possível obter a proteína em sua forma solúvel. A
sequência da proteína foi confirmada pelo sequênciamento do plasmídeo e por
análise da constituição protéica por espectrometria de massa MALDI-TOF. A partir
da proteína purificada foi possível padronizar a utilização da proteína em teste de
imunoensaio demonstrando que a proteína não é antigênica para a resposta imune
humoral de pacientes infectados com o Mtb (TB ativa ou TB latente). Produzimos
anticorpos monoclonais por imunização de camundongos BALB/c gerando títulos de
20.000 para IgG1e IgG2, indicando que a proteína tem potencial imunogênico.
Podemos concluir que, a proteína CDα foi construída sem qualquer erro ou mutação
e isso foi possível devido à aliança de técnicas "in silico" e "in vitro", contudo
estudos precisam ser feitos para obter a proteína em sua forma solúvel e
principalmente para averiguar seu potencial vacinal.
xiii
ABSTRACT
Tuberculosis (TB) is an ancient plague which affects mankind for thousands of years
and remains a serious public health problem, causing illness of over 8 millions and
killing more than 1 million people throughout the year. The currently used vaccine,
BCG, was developed in 1921 and began to be used in 1924 as a prophylactic agent
against tuberculosis, and today is the most widely used vaccine worldwide. The
protective potential of BCG is very variable, with rates of protection ranging from 0
to 80%, but it is still used because it protects against the most serious forms of the
disease in childhood. Consequently the need for a new vaccine strategy is urgently
needed. Subunit protein vaccines and fusion proteins strategy only deal with the
components of the organism that best stimulate the immune system rather than using
the whole organism system. However, the development of fusion proteins has no
defined rules, as approximating artificial peptides from different proteins leads to
new and unpredicted intramolecular interactions. In this study we propose the
construction of a fusion protein (CDα) composed of antigenic subunits from proteins
of Mycobacterium tuberculosis (Ag85c, MPT51 and HspX). The subunits were
chosen due to their potential in inducing a Th1-type immune response and especially
for its role in activation and induction of various populations of CD8+ T
lymphocytes. Based on analyzes in silico we could design primers that allowed the
amplification and subsequent fusion of the subunit gene sequences of, and in
addition, inserting a hinge sequence of glycine and serine between each subunit that
allowed better protein stability. The gene sequence of CDα was inserted into an
expression plasmid and transformed into Escherichia coli BL21 and from this it was
possible to induce its expression and purify the recombinant protein on a large scale,
however, it was not possible to obtain the protein in a soluble form. The protein
sequence was confirmed by sequencing the expression plasmid and analysis of
purified recombinant protein composition by mass spectrometry MALDI-TOF. The
purified protein was used to standardize an immunoassay test to detect human
antibodies, and our data show that the CDα is not antigenic for humoral immune
response of patients infected with Mtb (latent TB or active TB). Monoclonal
antibodies produced by immunization of BALB/c mice generated titers of 1:20,000
against IgG1 and IgG2a, indicating that the protein has immunogenic potential. We
conclude that the CDα protein was constructed without any error or mutation, and
this was possible due to technical alliance in silico and in vitro, however further
studies are needed to purify the protein in soluble form and especially to ascertain
their vaccine potential.
xiv
1 REVISÃO DA LITERATURA
1.1
Etiologia e Epidemiologia da Tuberculose
A tuberculose (TB) é um mal antigo que assola a humanidade há milhares de
anos e vem sendo relatada por toda a história e pré-história humana. Surge em grandes
epidemias e depois diminui o número de doentes e mortes, se comportando como uma
grande epidemia, mas com uma escala de tempo que desafia explicações aceitas de
ciclos epidemiológicos (DANIEL, 2004). Estimativas baseadas na frequência de
mutação do Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da doença, remontam
à origem do bacilo há mais ou menos 15.000 anos atrás, provavelmente na África, pois,
o fóssil humano com traços de tuberculose mais antigo foi encontrado nesse continente
(DANIEL, 2006). No entanto, o agente etiológico dessa doença infectocontagiosa só foi
descoberto por Robert Koch, um bacteriologista alemão, no ano de 1882 e por esse
motivo também é chamado de bacilo de Koch (MAARTENS; WILKINSON, 2007).
A bactéria pertence à classe Schizomycetes, ordem Actinomycetales, família
Mycobacteriaceae e gênero Mycobacterium. É um bacilo reto ou ligeiramente curvo,
imóvel, não esporulado, não encapsulado, que mede de 1 a 10 μm de comprimento por
0,2 a 0,6 μm de largura. Quando corado a quente com fucsina fenicada de Ziehl, retém
os corantes após lavagens com soluções de álcool e ácido (propriedade utilizada na
coloração de Ziehl-Neelsen), sendo a propriedade morfotintorial de álcool-ácido
resistência muito importante para a sua diferenciação e diagnóstico (FORRELLAD et
al., 2012; RODRIGUES, C.; VADWAI, 2012; SAKAMOTO, 2012). Essa característica
morfotintorial está relacionada ao alto teor lipídico de sua parede celular (60% da
constituição total da parede) e à complexa estrutura química da mesma, composta
também de peptidioglicanos, arabnogalactanos, ácidos micólicos além da grande
variedade de lipídios diferentes. Uma vez que a síntese da parede celular das
micobactérias envovelm complexas reações de síntese lipídicas essa alta quantidade de
lipídios da parede celular também é responsável pelo relativo crescimento lento da
bactéria (KOUL et al., 2004; LAWN; ZUMLA, 2011).
Ainda hoje a doença é um grande problema mundial, principalmente em países
emergentes. Estima-se uma incidência de 8.7 milhões de casos, uma prevalência de 12
milhões e a mortalidade em torno de 1,45 milhões durante o ano de 2011 (1,1 milhão de
morte causada apenas por tuberculose e 350 mil mortes causadas por comorbidade entre
1
HIV e tuberculose). Avalia-se também que um terço da população mundial esteja
infectada com o bacilo, encontrando-se em estado de latência, e deste total 5% a 10%
desenvolverão a forma ativa da doença durante sua vida. A grande quantidade de óbitos
causados pela tuberculose faz dessa doença a segunda maior causa de morte por doença
infecciosa do mundo, ficando atrás apenas da AIDS (Acquired Immunodeficiency
Syndrome) que causa em torno de 1,8 milhões de mortes no mundo (WHO, W. H. O.-.
2012).
No Brasil a TB, como demonstrado na Figura 1, também é um problema de
saúde pública, apesar de ter apresentado significativa melhora em seus valores
epidemiológicos nos últimos 20 anos, o país ainda está incluso entre os 22 países que
representam 80% dos casos totais de TB no mundo e teve uma prevalência de 91 mil
casos e uma incidência de 83 mil no ano de 2011 (WHO, W.H.O.-. 2012). A TB está
distribuída de maneira heterogênea no Brasil, sendo que 315 dos 5564 municípios
brasileiros contribuem para 70% dos casos totais de TB no país. O estado de São Paulo
apresenta maior quantidade de casos absolutos e o estado do Rio de Janeiro apresenta
maior coeficiente de incidência. É importante ressaltar que ocorrem por volta de cinco
mil mortes por ano devido a esse agravo no Brasil, uma doença que pode ser prevenida
e é tratável gratuitamente pelo Sistema Único de Saúde (SUS) (MS/SVS 2010).
Recentemente a Organização Mundial de Saúde (OMS) divulgou dados que
indicam que 1,1 milhões de pessoas estão infectadas com Mtb e HIV, estimando-se uma
mortalidade de 350 mil pessoas pela comorbidade entre as doenças associadas aos
microrganismos (WHO, W. H. O.-. 2012). Essa assustadora associação está sendo um
fator determinante nas mudanças epidemiológicas da TB, modificando as características
desta de uma evolução crônica para aguda, podendo levar os pacientes ao óbito em
poucas semanas. Além disso, como supracitado, estimativas indicam que um terço da
população mundial está infectada com o Mtb e avalia-se que o risco de reativação da
doença é de até 10% durante toda a vida do indivíduo, no entanto a chance de reativação
em indivíduos com AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) salta para 5 a 15%
ao ano (KWAN; ERNST, 2011; PAWLOWSKI et al., 2012). Dessa forma, a AIDS
contribui significativamente para o aumento dos riscos de reativação da tuberculose e
aumento da susceptibilidade a uma infecção primária devido à imunossupressão
associada ao desenvolvimento da síndrome (AARON et al., 2004; PAWLOWSKI et al.,
2012).
2
Figura 1. Mapa da incidência de tuberculose pelo mundo. O Brasil se encontra-se entre
os países que contribuem com a maioria do número de casos do mundo, no entanto o
coeficiente de incidência brasileiro é comparável ao de alguns países desenvolvidos.
Adaptado de WHO, 2012.
1.2
Imunopatologia da Tuberculose
O agente causador da TB normalmente se dissemina pelo ar quando indivíduos
doentes (em fase bacilífera da doença) tossem ou falam e expelem o patógeno através de
gotículas de Flügge, que são aerossóis contendo os bacilos. Essas gotículas ao serem
expostas ao ambiente (vento e calor) diminuem seu volume, tornando-se núcleos de
Wells (com diâmetros de até cinco micrômetros e com um a dois bacilos em suspensão),
que são passíveis de inalação por indivíduos presentes naquele ambiente. Um doente
com tuberculose sem receber tratamento tem capacidade de infectar cerca de dez a doze
pessoas durante um ano (JAMES; WILLIAMS; MARSH, 2000; DYE et al., 2005).
Logo após a inalação, a maioria dos indivíduos infectados (90%) não desenvolvem TB
primária, tornam-se infectados latentes e, conforme supracitado, a probabilidade dessa
infecção transformar-se em doença é de 5 a 10%, sendo que essa evolução está
relacionada com a carga bacilar, com a patogenicidade da cepa infectante e com fatores
imunológicos do indivíduo (DAFFE; ETIENNE, 1999).
Após a infecção, o bacilo é reconhecido nos pulmões, por receptores de
reconhecimento de padrões (do inglês, pattern recognition receptors, PRRs) presentes
3
em células do sistema mononuclear fagocitário (macrófagos, neutrófilos, monócitos e
células dendríticas) que levarão à fagocitose da bactéria e à produção de citocinas próinflamatórias, como a interleucina 1α (IL-1α) e a interleucina 1β (IL-1β) (ERNST,
2012; OTTENHOFF, 2012). Em decorrência do reconhecimento da bactéria e da
subsequente fagocitose, novos macrófagos são recrutados para o sítio da infecção
formando
infiltrados
celulares
e
desenvolvendo
o
granuloma
primário
(RAMAKRISHNAN, 2012). Os macrófagos são recrutados rapidamente para dentro
dessa estrutura em resposta ao gradiente de quimiocinas liberadas pelas células
infectadas ou por células do sistema imune ativadas. As células dendríticas que
estiverem presentes na região da infecção também irão fagocitar a bactéria e migrarão
para os linfonodos, onde ativarão linfócitos T “näive” que por sua vez se diferenciarão
em células T helper 1 (Th1), T helper 17 (Th17), em linfócitos T citotóxicos (T CD8+)
ou em outras populações celulares dependendo do modo de apresentação dos antígenos
pelas APCS e do microambiente em que essas células näive estão. Essas células T
ativadas migrarão para a região da infecção onde poderão liberar citocinas que ativarão
os macrófagos e potencializarão sua capacidade antimicrobiana, cerceando assim o
desenvolvimento da infecção (EHLERS; SCHAIBLE, 2012).
O granuloma evolui à medida que a bactéria ao ser fagocitada pelos macrófagos
evade dos mecanismos da resposta imune e conseguem se multiplicar no interior da
célula, em resposta a essa replicação as células infectadas migram no tecido e formam
os
granulomas
devido
aos
estímulos
inflamatórios
persistentes
(TURNER;
BASARABA; ORME, 2003; VOLKMAN et al., 2004). O granuloma maduro então, se
forma quando fagócitos mononucleares indiferenciados são recrutados em resposta à
infecção por Mtb dispostos em torno das células infectadas, e ativados por citocinas, tais
como IFN-γ, produzida principalmente por células T ativadas. (TUFARIELLO; CHAN;
FLYNN, 2003; RAMAKRISHNAN, 2012). Estudos em larvas de peixe-zebra
(zebrafish larvae) indicam que o granuloma é uma estrutura dinâmica em que as células
do hospedeiro podem fluir para dentro ou para fora (CARVALHO et al., 2011;
OTTENHOFF, 2012). Sua morfologia é caracterizada por um núcleo contendo células
infectadas que é circulado por macrófagos epitelióides que, por conseguinte, são
circundados por camadas de linfócitos T α/β e fibroblastos, além da possível presença
de células multinucleadas gigantes, plasmócitos, neutrófilos e linfócitos T γ/δ
(RHOADES et al., 2005). Essa dinâmica estrutural envolve continuas mortes celulares e
reposição por células recrutadas, assim como remodelação tecidual e vascular constante
4
(EHLERS; SCHAIBLE, 2012). Sendo dependente de um intricado sistema de produção
e interação de quimiocinas e citocinas produzidas por células efetoras do sistema imune
e células teciduais (TURNER; BASARABA; ORME, 2003). O recrutamento celular e a
coesão da estrutura dependem de citocinas pró-inflamatórias (fator de necrose tumoral TNF, IFN-γ e IL-1, dentre outras) e imunoregulatórias (IL-10 e IL-12 dentre outras)
(TURNER; BASARABA; ORME, 2003; RHOADES et al., 2005; RAMAKRISHNAN,
2012).
Como apresentado na figura 2, apesar de o granuloma ter poder de conter o
bacilo, ele não tem efetiva capacidade de eliminá-lo (EHLERS; SCHAIBLE, 2012).
Além disso, essa estrutura tem papel fundamental na patogenia da doença, uma vez que
estudos moleculares recentes indicam que a micobactéria promove recrutamento celular
para o granuloma, o que sugere que sua formação é parte crucial da estratégia de
virulência e patogenia da tuberculose (PAIGE; BISHAI, 2010). Dentro do granuloma a
bactéria se protege de mecanismos antimicrobianos do sistema imune e escapa das
concentrações terapêuticas dos antibióticos promovendo maior resistência aos mesmos.
Portanto, o granuloma não é apenas uma forma de contenção da bactéria, ele também é
uma fonte de danos teciduais e está intrinsecamente correlacionado tanto com a
proteção quanto com a doença (LAWN; ZUMLA, 2011; REECE; KAUFMANN, 2012).
A resposta imune adaptativa ao bacilo é complexa, sendo uma resposta protetora
observada quando há processamento e apresentação de antígenos para as células T que
se diferenciarão em varias populações celulares as quais orquestrarão uma resposta por
mediadores inflamatórios, citocinas e quimiocinas (VAN ALTENA et al., 2011). O
complexo principal de histocompatibilidade (major histocompatibility complex – MHC)
de classe II apresenta antígenos peptídicos derivados da bactéria residente no
fagossoma, o que leva a estimulação das células T CD4+. Como resultado, essa célula T
CD4+, principalmente as células Th1 produzem INF-γ, TNF-α e IL-2, que são
considerados os mediadores mais cruciais na proteção contra a tuberculose (GUPTA et
al., 2012; OTTENHOFF, 2012; O'GARRA et al., 2013).
5
Figura 2. A contenção do Mycobacterium tuberculosis por um granuloma sólido. Essa
estrutura é característica do indivíduo latente, e nela estão presentes células do sistema
imune, do tecido epitelial alveolares (AEC1 e AEC2) e outras como células epiteliais e
fibroblastos. Adaptado de Kaufmann 2013.
As células T CD4+ Th17, produtoras de interleucina 17 (IL-17), também
contribuem na defesa contra o Mtb, principalmente nas fases iniciais da infecção, uma
vez que tem papel na estimulação de neutrófilos (KAUFMANN, 2011). A IL-17 é
também importante no recrutamento de outras células produtoras de INF-γ para o sítio
da infecção, uma vez que a produção dessa citocina aumenta a expressão das
quimiocinas CXCL9, CXCL10 e CXCL11 que recrutarão diversas células do sistema
imune para o sítio da infecção (O'GARRA et al., 2013). Além disso, foi demonstrado
que ao se transferir células Th17 responsivas a peptídeos de Mtb para camundongos
infectados, ocorria inibição parcial do crescimento bacteriano e essa inibição era
independente de células produtoras de INF-γ, sugerindo que essa população celular está
envolvida no controle da bactéria por outros mecanismos ainda não esclarecidos
(GALLEGOS et al., 2011).
As células T reguladoras (Treg) são também células T CD4+, mas envolvidas
principalmente na regulação e tolerância aos próprios antígenos e doenças autoimunes,
bem como supressão da resposta imune durante a infecção. Essas células secretam
citocinas regulatórias (IL-10 e Transforming Growth Factor, TGF-β) que suprimem a
6
resposta imune Th1 e podem impedir que ela se torne uma resposta exacerbada e danosa
ao organismo (VAN ALTENA et al., 2011). Aparentemente elas são recrutadas
inespecificamente para os pulmões durante a TB, no entanto durante o desenvolvimento
da doença o aumento da população de células T reguladoras está diretamente ligado à
severidade da doença estando correlacionado com maior carga bacilar em TB pulmonar
e também com casos de TB miliar, a forma mais grave de infecção por Mtb (SHARMA
et al., 2009; WELSH et al., 2011).
Diversos experimentos em modelo primata não-humano (CHEN et al., 2009),
em modelos bovinos (VILLARREAL-RAMOS et al., 2003; PALMER; WATERS;
THACKER, 2007) e murino (FLYNN et al., 1993; BEHAR et al., 1999) reforçam que
as células T CD8+ contribuem efetivamente nas defesas contra o Mtb. Classicamente
essas células são conhecidas pelo seu efeito citotóxico sobre células infectadas, sendo
que a maioria dessas atividades é feita por mecanismos apoptóticos, e a formação de
vesículas apoptóticas diminui a viabilidade da bactéria (BEHAR, 2013). Além disso, a
célula T CD8+ tem capacidade de matar a bactéria dentro da célula infectada ao liberar
grânulos de granzimas no citoplasma da célula infectada que agirão sobre a bactéria
(BROOKES et al., 2003).
Populações de células T CD8+ (Tc) importantes para o controle da tuberculose
também já foram investigadas. Além das células T citotóxicas clássicas, outras
populações com propriedades efetoras secretando diversas citocinas, como as
populações Tc1 (produtoras de IFN-γ, TNF-α e IL-2) ou Tc17 (produtoras de IL-17),
foram caracterizadas como importantes populações auxiliam na resposta contra o Mtb
(BEHAR, 2013). Rozot et al (2003) demonstraram uma heterogeneidade de expressão
de citocinas em linfócitos T CD8+ em indivíduos latentes, que tem maior população
polifuncional (IFN-γ+, TNF-α+ e IL-2+) enquanto pacientes com TB ativa apresentam
maior quantidade de células T CD8+ produtoras de TNF-α+. Por conseguinte, a
presença de células T CD8+ duplo positivas (IFN-γ+ e IL-2+) é um marcador de
resposta imune protetora contra o Mtb uma vez que ela está reduzida ou ausente em
pacientes com tuberculose ativa (COMMANDEUR et al., 2011). No entanto, o real
papel das populações celulares de células T CD8+ ainda precisa ser esclarecido, apesar
de se saber que no decorrer do desenvolvimento da doença elas são importantes nas
defesas do organismo, não se sabe ainda quando elas atuam e nem qual o papel efetivo
das populações T CD8+ efetoras.
7
Em adição a essa capacidade de retardar o início da resposta imune adaptativa, o
Mtb também consegue manipular e resistir dentro das células infectadas escapando das
defesas do hospedeiro, particularmente dentro dos fagócitos profissionais, mesmo esse
local sendo hostil. Isso se dá principalmente porque o Mtb possui uma gama de
mecanismos de evasão, sendo que os mais importantes são: sua capacidade de inibir a
maturação do fagossomo e sua fusão com o lisossomo; inibir a autofagia e a via de
sequestro alveolar endógeno que tem forte ação antimicrobiana; inibir a apoptose
celular que tem intenso efeito antimicrobiano e induzir a via de morte celular por
necrose; inibir o processamento e a apresentação de antígenos às células T impedindo
seu reconhecimento; inibir a via de sinalização mediada pelo receptor de IFN- que é
uma das vias mais importantes na defesa contra esse microrganismo e que regula vários
mecanismos imunes do hospedeiro; e inibir a formação de reativos de oxigênio e
nitrogênio que tem ação microbicida (OTTENHOFF, 2012).
A tuberculose latente é um período em que não há doença aparente, a bactéria
não está se replicando e tem baixa atividade metabólica, traducional e transcricional. Há
um equilíbrio entre o hospedeiro e o bacilo, sendo que, em resposta à infecção o
indivíduo desenvolverá uma robusta resposta imune que essencialmente impedem a
doença de evoluir para sua forma ativa e a bactéria continuamente se evade da
eliminação. Logo, esse equilíbrio é capaz de prevenir a ativação da doença, na maioria
dos indivíduos latentes, por toda a vida (FLYNN; CHAN, 2001).
Já a doença ativa se desenvolve na medida em que há quebra desse equilíbrio,
com aumento da multiplicação do bacilo e aparecimento de necrose caseosa no centro
do granuloma, decorrente do aumento na morte das células infectadas e do acúmulo de
lipídios, induzido pela própria bactéria, no interior das células infectadas (Figura 3). Há
o eventual rompimento da cápsula fibrosa que cobre o granuloma, seguidamente um
aumento da oxigenação e multiplicação do bacilo permitindo a disseminação da doença
no órgão ou para outros sítios de infecção e a transmissibilidade do bacilo para outros
indivíduos (DAVIS; RAMAKRISHNAN, 2009; GUPTA et al., 2012; SAKAMOTO,
2012).
8
Figura 3. Transmissão e disseminação do Mycobacterium tuberculosis a partir do
rompimento de um granuloma caseoso. Essa forma de granuloma está presente em
casos de tuberculose ativa e está correlacionado com a falha do sistema imune em
conter o bacilo. Adaptado de Kaufmann 2013.
1.3
Profilaxia: Vacinação com Bacilo de Calmette e Guérin (BCG)
A vacina BCG foi desenvolvida, na França, entre os anos de 1908 a 1921, por
Albert Calmette e Camille Guérin, após atenuação por passagens seriadas in vitro de
uma cepa patogênica de Mycobacterium bovis. Foi utilizada pela primeira vez em
crianças francesas, no ano de 1921 e reduziu a mortalidade causada pela doença em
aproximadamente 90%. Hoje em dia, a imunização por BCG é compulsória em regiões
endêmicas, tornando-se uma das vacinas mais utilizadas em todo o mundo. Seu êxito se
deve principalmente a capacidade de prevenir formas graves de TB na infância, como
meningite tuberculosa, assim como sua relativa seguridade em humanos. Além do mais,
é uma vacina barata e pode ser prontamente utilizada em várias partes do mundo,
inclusive nos países mais pobres (VON REYN, 2012).
No entanto, a BCG apresenta uma eficiência variável em proteger contra a forma
mais comum de tuberculose, a tuberculose pulmonar em jovens e adultos. Essa
ineficiência foi demonstrada em diversos estudos, sendo que as taxas mais ineficientes
demonstradas são relativas aos países com maior prevalência da doença (COLDITZ et
9
al., 1995; ANDERSEN, P.; DOHERTY, 2005). Diversos ensaios têm relatado essa
variada eficácia protetora da vacina BCG (entre 0% e 90%,) com altas taxas de proteção
na América do Norte e na Europa e baixa proteção em áreas tropicais (ROWLAND;
MCSHANE, 2011). Em meta-análises, a BCG demonstra uma média de 86% de
eficácia contra a tuberculose miliar e meníngea, uma maior proteção contra mortes por
tuberculose, meningite TB e TB disseminada em comparação com casos de TB total,
mas uma eficácia heterogênea contra a TB pulmonar (RODRIGUES, L. C. et al., 2005).
Além disso, em uma análise quantitativa revelou perda de eficácia em sete dos 10
ensaios avaliados e uma média de 14% de eficácia global depois de 10 anos da
vacinação (ROMANO; HUYGEN, 2012). Não obstante, estudos de longo prazo em
índios americanos e nativos do Alasca demonstraram eficácia de 82% após 20 anos e
52% de eficácia após 50-60 anos, demonstrando que a eficácia protetora da vacina BCG
pode ser durável em certas populações (ARONSON et al., 2004).
Uma provável explicação para a acentuada variação geográfica de proteção da
BCG está na exposição constante a micobactérias não causadoras de tuberculose
(MNT). Black et al, em estudo realizado na Malásia, no ano de 2001, onde há grande
exposição à MNT e baixa eficácia da BCG demonstrou uma relação inversa entre
produção de INF-γ frente à imunização com BCG e a resposta imune a MNT, indicando
uma possível inibição à resposta vacinal devido à sensibilização prévia com MNT
(CAYABYAB; MACOVEI; CAMPOS-NETO, 2012). Existem duas hipóteses que
podem explicar o mecanismo pelo qual as MNT podem inibir a resposta vacinal à BCG:
a resposta às MNT pode estar mascarando a resposta à BCG, pois a vacina não
consegue aumentar (Boost) a resposta imune induzida pelas MNT; ou a resposta imune
às MNT está impedindo, através de reação cruzada, a BCG de se replicar no hospedeiro
e, por conseguinte levando a vacina a ser eliminada antes de induzir uma resposta
protetora (BLACK et al., 2001; ROWLAND; MCSHANE, 2011). A hipótese do
bloqueio corrobora com o trabalho de Brandt et al, de 2002, onde camundongos
sensibilizados com uma mistura de micobactérias não causadoras de tuberculose
bloquearam o efeito protetor da vacinação com BCG, mas não o fizeram quando a
imunização foi feita com uma vacina de subunidade proteica do Mtb. Diferenças nas
respostas imunes à vacina BCG entre o Reino Unido e Malásia também foram vistos em
crianças aonde 100% dos quais responderam ao PPD (do inglês, purified protein
derivative) de Mtb após a vacinação com BCG no Reino Unido, mas só 53%
responderam na Malásia, indicando que o aumento na resposta por IFN-γ se
10
correlacionou com a proteção concedida pelo BCG ou que a imunidade induzida pela
MNT conferiu alguma proteção contra a TB e a vacina BCG não conseguiu melhorá-la
(BLACK et al., 2002).
Outra hipótese para justificar a ineficiência da BCG, é a variação gênica nas
cepas de Mycobacterium bovis utilizadas na vacinação em diferentes partes do mundo,
pois, desde a sua utilização pela primeira vez em 1920, a cepa BCG foi distribuída para
diversas partes do mundo sem uma padronização da maneira como essa vacina deveria
ser cultivada, gerando assim diversas cepas atuais, com capacidades imunogênicas e
protetoras diferentes (BEHR et al., 1999; BRANDT et al., 2002). Aproximadamente
90% de todas as vacinações usam a cepa francesa Pasteur P2 1173, a cepa Danish SSI
133, a cepa Glaxo 1077 ou a cepa Tokio 172. Sendo assim, já foi demonstrado que
diferentes cepas de BCG induzem diferentes respostas imunes em seres humanos e em
modelos animais e as mesmas cepas têm desempenhos diferentes em locais geográficos
diferentes, no entanto a questão-chave continua a ser se estas diferenças in vitro
refletem as diferenças na eficácia protetora contra a tuberculose em humanos (RITZ et
al., 2008).
A variação gênica da população alvo que irá receber determinada vacina, bem
como seu estado nutricional e existência de co-infecção por outros microrganismos (e.g.
HIV) também alteram a capacidade de responder ao estímulo vacinal (DOHERTY;
ANDERSEN, 2005; SKEIKY; SADOFF, 2006). Por conseguinte, por ser uma vacina de
bactéria viva atenuada, constitui certo risco ao ser administrada, em recém-nascidos e
especialmente em imunocomprometidos, podendo causar efeitos colaterais como
adenite ou infecção disseminada (VON REYN, 2012).
1.4
Diagnóstico da Tuberculose
Um dos maiores problemas no controle da tuberculose está na dificuldade e
demora em seu diagnóstico. Os métodos de diagnóstico que são atualmente utilizados,
como a baciloscopia, a cultura microbiológica, a radiografia de tórax, e o teste
intradérmico com o PPD, ou teste tuberculínico, não têm tido o sucesso desejado para
diminuir a incidência da TB de forma significativa.
Na TB pulmonar, a tosse não produtiva é o sintoma mais comum no início da
doença. Com o avanço da doença o escarro do paciente geralmente se apresenta com
bacilos devido ao aumento da inflamação e da necrose do tecido pulmonar. Associado a
11
rapidez e baixo custo do método, a baciloscopia é o método prioritário de diagnóstico e
controle durante o tratamento da TB (TEIXEIRA; ABRAMO; MUNK, 2007). O
principal método de coloração para a pesquisa de bacilos no escarro é a técnica de
Ziehl-Neelsen (ZN), um método barato e específico, que se baseia na coloração a quente
com fucsina fenicada, seguida de uso de um descorante álcool-ácido, fazendo com que
somente as micobactérias mantenham a coloração vermelha, por terem uma parede rica
em ácidos micólicos e, portanto, serem resistentes ao efeito do descorante (motivo de a
bactéria ser classificada como um bacilo álcool-ácido resistente – BAAR) (LAWN,
2013). A baciloscopia, apesar de sua simplicidade e baixo custo, tem como principal
desvantagem sua variável sensibilidade que oscila entre 20 e 50%, isso se dá
principalmente devido à necessidade de uma alta quantidade de bacilos no escarro do
paciente (pelo menos 5.000 ou 10.000 bacilos por mililitro de escarro) (PARSONS et
al., 2011). Como tentativa de melhorar a sensibilidade da técnica de microscopia, outros
métodos de coloração foram pesquisados, como fluorescência com auramina, que apesar
de apresentar um tempo de leitura menor, possui a mesma acurácia da coloração padrão,
exige maior treinamento técnico e tem custo mais elevado (IPUGE; RIEDER;
ENARSON, 1996; NELSON; DEIKE; CARTWRIGHT, 1998; TEIXEIRA; ABRAMO;
MUNK, 2007).
A cultura microbiológica do agente, a partir de amostras de pacientes como
escarro e lavado bronco-alveolar é considerada padrão ouro no diagnóstico da doença e
tem a vantagem de permitir a detecção e o isolamento da micobactéria, a possível
identificação da espécie ou do complexo ao qual a bactéria pertence, e caso seja feito
também um teste de sensibilidade a antimicrobianos permite a determinação da
sensibilidade do microrganismo aos quimioterápicos (FRIEDEN et al., 2003). O meio
sólido Löwenstein-Jensen é o principal meio utilizado para crescimento de
Mycobacterium tuberculosis, é um meio à base de ovo que permite amplo crescimento e
uma leitura quantitativa do mesmo, através da contagem do número de colônias, o que o
torna mais adequado para a monitorização do tratamento, porém apresenta tempo de
crescimento muito longo, sendo necessárias cerca de duas a três semanas para obter um
resultado positivo. Por conseguinte, com o aparecimento de sistemas automáticos e
semiautomáticos de leitura, os meios líquidos como os MGIT (Mycobacterial Growth
Indicator Tube) passaram a ser mais utilizados, pois os aparelhos permitem uma
detecção precoce do crescimento utilizando diferentes métodos (radiométrico,
fluorimétrico ou colorimétrico), propiciando os resultados em um período de 5 a 15 dias
12
(CDC, 2000; CHEGOU et al., 2011). Contudo, todo o processo de crescimento,
identificação e teste de sensibilidade ainda é muito demorado e pode levar até 60 dias
para obter um resultado definitivo, caso seja feito em meio sólido. Em contrapartida os
sistemas automatizados têm provado ser essencial para fortalecer o diagnóstico e o
tratamento da TB em muitos países, no entanto a compra do aparelho e suprimentos, a
manutenção, o treinamento de pessoas e fornecimento de locais adequados para
acomodar com segurança estes instrumentos podem ser extremamente difícil para a
maioria dos laboratórios de saúde pública em países com recursos limitados (PARSONS
et al., 2011).
O diagnóstico clínico é muitas vezes difícil, devido aos sintomas inespecíficos e
frequentemente insidiosos e a apresentação radiológica pode ser muito diversificada.
Apesar disso, o clínico se vale da radiografia do tórax como um método auxiliar
importante no diagnóstico da TB, o qual procura por sinais característicos como a
presença de opacidades radiológicas características, tendo utilidade no diagnóstico da
TB pulmonar primária (opacidade mais homogênea e aumento no volume dos
linfonodos regionais) e TB pulmonar secundária (opacidade heterogênea, presença de
cavidades e nódulo). Outros aspectos observados são cavitações, adenopatia, derrame
pleural, atelectasia (particularmente na criança) e outras possíveis alterações
radiológicas encontradas na TB (CDC, 2000; CHEGOU et al., 2011). Entretanto, o
exame não é específico para detectar pacientes com TB, visto que lesões pulmonares
semelhantes às causadas pela micobactéria podem ocorrer em outras doenças
(HARRIES et al., 1997; TEIXEIRA; ABRAMO; MUNK, 2007). A tomografia
computadorizada do tórax é um método radiológico de alta resolução e mais sensível do
que a radiografia de tórax, mas apresenta alto custo e só está disponível em centros de
referência (MCADAMS; ERASMUS; WINTER, 1995; WANG, Y. H. et al., 2003).
Outra prova clínica disponível para o diagnóstico da TB é a prova tuberculínica
cutânea utilizando PPD ou técnica de Mantoux, é uma outra ferramenta para diagnóstico
clínico que avalia a reação celular desenvolvida após a inoculação intradérmica de um
derivado protéico do Mtb, o PPD. Um resultado positivo é caracterizado pelo
desenvolvimento de uma resposta de hipersensibilidade do tipo tardia para os antígenos
do Mtb, que pode ser decorrente de uma infecção por micobactérias e não propriamente
a presença da tuberculose ou ainda decorrente da vacinação por BCG (YANG; KRUHGARCIA; DOBOS, 2012). A graduação da reação cutânea realizada com régua
milimetrada (deve ser do diâmetro da área de endurecimento palpável) é utilizada para
13
aumentar a especificidade da técnica e classificar o paciente quanto ao tamanho da
reação (TEIXEIRA; ABRAMO; MUNK, 2007; SHINGADIA, 2012). No entanto, ela
deve ser interpretada de forma especial nas pessoas vacinadas com BCG há menos de
dois ou de três anos; doenças que causem imunodepressão como sarcoidose, neoplasias
malignas de cabeça e pescoço, e linfo proliferativas; vacinação com vírus vivo;
gravidez; tratamento com corticoides e imunossupressores; crianças com menos de dois
meses de idade; e pessoas com mais de 65 anos de idade (FINE et al., 1994;
ANDERSEN, P. et al., 2000). Esse teste possui, portanto, importantes limitações para o
seu uso na decisão diagnóstica, em particular nas áreas de elevada prevalência de
infecção pela TB, como no nosso país, onde a taxa de PPD positivo oscila entre 25% e
55% na população geral, e nos locais de significativa taxa de coinfecção TB/HIV, onde
aumenta a probabilidade de resultado falso-negativo (PAI et al., 2004; MINION; PAI,
2010).
Nos anos 80 a técnica de reação em cadeia da polimerase (do inglês, polymerase
chain reaction – PCR) foi o primeiro método molecular a amplificar sequências de ácido
nucleico e a partir disso se tornou uma técnica promissora para melhorar o diagnóstico
da tuberculose. Desde então, significativos avanços para um teste diagnóstico com essas
ferramentas já foram feitos, e métodos moleculares atuais já apresentam várias
vantagens em relação aos testes diagnósticos convencionais. Os resultados são rápidos,
confiáveis e reprodutíveis, e mesmo culturas mistas podem ser analisadas indicando
uma alta especificidade da técnica (BALASINGHAM et al., 2009). Em vários países,
testes como a identificação de micobactérias utilizando hibridização de sondas de DNA
ou sequênciamento e a caracterização de resistência aos antibióticos por marcadores
moleculares já é uma realidade. No entanto, apesar dos avanços os testes moleculares
ainda são um problema na maioria dos países em desenvolvimento apesar de serem as
populações desses locais as que mais sofrem com a doença, visto que a realização
dessas técnicas ainda é muito cara além de demandar recursos humanos bem treinados e
uma infraestrutura que não está presente na maioria dos países (WOODS, 2001). Além
disso, existem recomendações de que se usem os testes moleculares em conjunto com a
cultura do microrganismo, uma vez que essa última ainda é o padrão ouro de
diagnóstico e a partir dela ainda pode ser feito o teste de susceptibilidade a
antimicrobianos e subsequente genotipagem.
Outros testes também vêm sendo desenvolvidos para o diagnóstico da
tuberculose, como o Interferon-gamma Release Assay (IGRA), proposto para o
14
diagnóstico de indivíduos com tuberculose latente e se baseia na mensuração do IFN-γ,
importante componente da resposta imune contra a bactéria, produzido por linfócitos de
pacientes quando estimulados com três antígenos da bactéria: early-secretory antigenic
target-6 (ESAT-6), culture filtrate protein 10 (CFP-10), e o antígeno TB7.7. Em
estudos de meta-análise feita com os testes comerciais disponíveis do tipo IGRA,
demonstrou uma sensibilidade de 78% (95% CI, 73%– 82%) para QuantiFERON-TB
Gold, 70% (95% CI, 63%– 78%) para QFT-GIT, e 90% (95% CI, 86%–93%) para
TSpot (PAI; ZWERLING; MENZIES, 2008; VITTOR; GARLAND; SCHLOSSBERG,
2011). No entanto, a utilização dos IGRAs continua questionável, uma vez que estudos
em pacientes com tuberculose ativa demonstraram alta sensibilidade do teste
(ANDERSEN, P. et al., 2000; RAVN et al., 2005), indicando a incapacidade do teste de
discriminar indivíduos com a doença ativa de indivíduos com tuberculose latente. Essa
incapacidade tem maior efeito sobre populações com alta prevalência da doença, uma
vez que os programas de controle normalmente focam seus recursos limitados em
diagnosticar e tratar rapidamente a doença e não em identificar indivíduos latentes
(WANG, J. Y. et al., 2007; CHEGOU et al., 2011).
1.5
Tratamento da tuberculose
Apesar de ser uma doença grave, a tuberculose é curável em praticamente 100%
dos casos novos, sensíveis aos medicamentos anti-TB, desde que obedecidos os
princípios básicos da terapia medicamentosa e uma adequada adesão do tratamento. A
associação medicamentosa adequada, as doses corretas e o uso por tempo suficiente são
os princípios básicos para o adequado tratamento evitando a persistência bacteriana e o
desenvolvimento de resistência aos fármacos, assegurando, assim, a cura do paciente. O
tratamento dos bacilíferos é prioritário para o controle da tuberculose, uma vez que
permite interromper a cadeia de transmissão.
Para o tratamento da TB, os principais fármacos utilizados são: rifampicina (R),
isoniazida (H), etambutol (E), estreptomicina (S), etionamida (Et) e pirazinamida (Z).
Em 1979, o Brasil preconizou um sistema de tratamento para a TB com 3 drogas
composto pelo Esquema I (dois meses utilizando R, H e Z seguido de 4 meses
utilizando R e H) para os casos novos; Esquema I reforçado (dois meses utilizando
RHZE seguido de 4 meses utilizando RHE) para re-tratamentos; Esquema II (dois
meses utilizando RHZ seguidos de 7 meses utilizando RH) para a forma
15
meningoencefálica; e Esquema III (três meses utilizando SZEEt seguido de 9 meses
utilizando EEt) para os casos de falência de tratamento.
Em 2009, o Programa Nacional de Controle da Tuberculose, juntamente com o
seu Comitê Técnico Assessor reviu o sistema de tratamento da TB no Brasil. Baseado
nos resultados preliminares do II Inquérito Nacional de Resistência aos medicamentos
anti-TB, que mostrou aumento da resistência primária à isoniazida (de 4,4 para 6,0%), o
etambutol foi introduzido como quarto fármaco na fase intensiva de tratamento (dois
primeiros meses) do esquema básico. Outra mudança feita no sistema de tratamento a
tuberculose foi a extinção do Esquema I reforçado e do Esquema III, desta forma os
esquemas de tratamento da TB vigentes no Brasil são: Esquema I (dois meses utilizando
RHZE seguido de 4 meses utilizando RH) para os casos novos e Esquema II (dois
meses utilizando RHZE seguidos de 7 meses utilizando RH) para a forma
meningoencefálica. Os casos que tem falha terapêutica devem ser criteriosamente
avaliados quanto ao histórico do tratamento, adesão a ele e comprovação de resistência
aos medicamentos. Tais casos devem receber o Esquema Padronizado para
Multirresistência ou Esquemas Especiais individualizados, observando as resistências
apresentadas pelo teste de sensibilidade (MS/SVS 2011).
Um dos grandes problemas relacionado a TB é que, com exceção dos
quinolônicos, que não são específicos, não surge uma nova droga potente para tratá-la
há mais de 30 anos, enquanto a multirresistência avança no mundo. Essa resistência a
fármacos surge principalmente devido ao abandono do tratamento pelo paciente, uma
vez que o tratamento é longo (seis meses nos casos de melhor prognóstico) e com o
desaparecimento dos sintomas logo após o início do uso dos medicamentos (terceira
semana de tratamento) os pacientes mal orientados abandonam o tratamento (ARAUJOFILHO et al., 2008a; ARAUJO-FILHO et al., 2008b; DYE; WILLIAMS, 2009). A
tuberculose multidroga resistente (do inglês multi drug-resistant, MDR-TB) é
caracterizada, segundo a OMS (Organização Mundial da Saúde), por resistência à R e à
H com ou sem resistência a outras drogas.
O tratamento dos casos de MDR-TB é mais longo, menos efetivo, mais caro e
causa mais efeitos colaterais. Estima-se que 4% de todos os casos de TB do mundo
sejam casos de MDR-TB e desses, 40% já foram tratados para TB anteriormente
(MAARTENS; WILKINSON, 2007; WHO, W. H. O.-. 2012). Existem também os
casos em que a cepa é extremamente resistente aos fármacos utilizados para o
tratamento e nesse caso ela é chamada de extensivamente resistente à droga (do inglês
16
extensively drug-resistant, XDR-TB) e essa se caracteriza por resistência no mínimo à
rifampicina e isoniazida, uma quinolona e a um agente injetável de segunda linha
(capreomicina, amicacina ou canamicina). Esse nível de resistência torna a doença
praticamente intratável e o índice de mortalidade atinge cerca de 85% dos casos
(SANTOS et al., 2010; WHO, W. H. O.-. 2012).
No Brasil, a partir do ano 2000, têm sido notificados em média, 340 casos de
MDR-TB ao ano, sua incidência é maior nos estados mais populosos, sendo o Rio de
Janeiro, o estado com maior prevalência da doença, também o que apresenta maior
proporção de casos de múltipla resistência (37,4%), seguido por São Paulo, Bahia, Pará
e Ceará, que também apresentam número expressivo de casos de tuberculose. Quanto à
classificação dos casos de MDR-TB, 95,8% apresentam resistência adquirida, ou seja,
aquela detectada nos indivíduos em uso de antimicobacterianos, ou com história prévia
de uso desses medicamentos por mais de 30 dias. A proporção de casos novos de MDRTB entre os casos novos de TB é de 0,4% ao ano e 7,3% dos casos de MDR-TB
notificado apresentam coinfecção com o HIV (WHO, W. H. O., 2008).
Estudos de prevalência da resistência a antimicobacterianos no estado de Goiás
indicaram uma inesperada taxa de resistência (13,6%) em pacientes não tratados,
sugerindo uma resistência primária (Santos et al.2010). Nosso grupo, em trabalho feito
com 24 amostras apresentando resistência ao menos a um medicamento (R ou H),
também caracterizou que as principais bases moleculares de resistência, no estado de
Goiás, se deve a mutações nos genes rpoB, katG e na região promotora do gene inhA.
Ainda, foram descritos pacientes com populações genotípicas e fenotípicas mistas de
Mycobacterium tuberculosis, indicando provavelmente falha terapêutica da doença em
alguma fase do tratamento (ARAUJO-FILHO et al., 2008a; ARAUJO-FILHO et al.,
2008b; SANTOS et al., 2010; ALVES et al., 2011).
1.6
Controle da tuberculose
No ano de 1993, a OMS declarou a tuberculose como uma emergência global e
lançou o programa DOTS (Directly Observed Treatment, short-course), um programa
que se focava principalmente em diagnosticar e tratar eficientemente os pacientes e que
foi expandido com sucesso como a principal estratégia de controle da tuberculose. Entre
os anos de 1995 e 2008, 46 milhões de pessoas foram tratadas através do programa
17
DOTS, 36 milhões com sucesso, os casos fatais diminuíram de 8% para 4% e um total
de seis milhões de mortes foram evitadas (Lawn & Zumla, 2011).
Após uma década de implementação do programa DOTS, um novo programa foi
lançado pela OMS no ano de 2006, o STOP TB Strategy and the Global Plan to Stop
TB, enumerando os novos paradigmas da tuberculose como a disseminação de casos de
resistência a drogas. a interação sinérgica com a pandemia de HIV, a ausência de uma
vacina eficaz, a inexistência de um teste diagnóstico simples, barato e capaz de
distinguir os diversos grupos relacionados à doença e os defasados sistemas de saúde
dos países não desenvolvidos, incapazes de prestar atendimento satisfatório a toda a
população (Lawn & Zumla, 2011). Além disso, o programa STOP TB propôs esforços
para erradicação da tuberculose até o ano de 2050.
Apesar dos substanciais progressos no controle da tuberculose em todo o mundo,
os índices ainda estão caindo lentamente, com a taxa de incidência caindo apenas 1% ao
ano. Razões para essa queda menor do que o desejado pode ser devido aos fatores de
riscos populacionais estarem contrabalanceando com os benefícios do DOTS, e/ou a
demora no diagnóstico pode estar propiciando a não efetiva queda nos índices de
transmissão. As taxas em declínio também podem estar mais associadas aos fatores
sociais relacionados com a doença do que com a real efetividade dos programas de
controle. Portanto, para se cumprir o objetivo de eliminar a tuberculose como um
problema de saúde pública, até o ano de 2050, os índices de incidência precisam cair
aproximadamente 16% ao ano pelos próximos 40 anos (LONNROTH et al., 2009).
Consequentemente, como medidas eficazes para deter a TB estão: o diagnóstico precoce
dos pacientes, o tratamento efetivo contra as formas resistentes de TB e, acima de tudo,
uma vacina mais aperfeiçoada e com capacidade protetora menos variável e mais
duradoura do que a atual vacina utilizada, a BCG.
Avanços no entendimento da imunopatologia da TB possibilitaram a pesquisa de
novas vacinas contra a doença, como o desenvolvimento de bactérias mutantes
atenuadas com maior capacidade protetora do que o BCG, avirulenta e que possam ser
utilizadas como vacinas vivas (KAUFMANN, 2011; OTTENHOFF; KAUFMANN,
2012). Dentre essas vacinas, a MTBVAC (Mycobacterium tuberculosis ∆phoP
∆fadD26), que não possui um gene componente do sistema PhoP-PhoR, um dos 11
“two-component systems” (TSS) presentes no genoma do Mycobacterium tuberculosis
(LEE, J. S. et al., 2008). Além de também não possuir o gene fadD26 que produz uma
enzima semelhante a Acyl-CoA sintetase, que é necessária na síntese do phthiocerol
18
dimycocerosates (DIMs). Essa vacina tem demonstrado, em testes pré-clínicos com
diferentes modelos animais, ser altamente atenuada e ter grande potencial protetor
contra a doença. Quando comparada à BCG, essa vacina demonstrou níveis similares de
proteção, no entanto estimulou uma maior proporção de células CD4+ e CD8+ no baço
de camundongos vacinados com MTBVAC do que a BCG. Além disso, quando essas
células (CD4+ ou CD8+) foram estimuladas com antígenos do Mtb, depois de 45 dias
de vacinação, houve uma maior proporção de células produtoras de INF-γ, sugerindo
que a vacinação com o Mtb mutante resultou em aumento da ativação de células T,
comparado com a vacinação por BCG (MARTIN et al., 2006).
Outra estratégia utilizando vacina viva, são as vacinas de BCG recombinante,
super expressando antígenos das regiões RD-1, perdidos durante sua atenuação (p. ex.
CFP-10 e ESAT-6), ou outros antígenos que possam intensificar o potencial vacinal já
comprovado da vacina em uso (PYM et al., 2003). A BCG tem muitas proteínas em
comum com o Mtb, no entanto, muitas dessas proteínas não são corretamente
reconhecidas pelo sistema imune de humanos ou animais vacinados. Um exemplo disso
é o Antígeno 85B (Ag85b), um antígeno largamente secretado pelo Mycobacterium
tuberculosis e que já demonstrou gerar certa proteção contra TB em camundongos
vacinados com ele (HORWITZ et al., 1995). A BCG também expressa essa proteína,
mas uma baixa resposta imune é observada contra esse antígeno após a imunização. A
vacina rBCG30, é um BCG recombinante que expressa fortemente o Ag85b (cerca de 5
vezes mais do que as cepas de BCG não recombinantes). Essa super expressão de
antígeno demonstrou ter capacidade de potencializar o efeito da BCG, uma vez que
cobaias vacinadas com a rBCG30 e desafiadas após dez semanas, tiveram uma proteção
significativamente melhor do que a vacina atual. Ademais, comparando os
histopatológicos dos animais vacinado com as duas vacinas, os vacinados com a vacina
recombinante tiveram expressivamente menos lesões pulmonares após desafio por
aerossól com Mtb (HORWITZ et al., 2000; HORWITZ, 2005).
O desenvolvimento de vacinas proteicas (constituídas de proteínas imunogênicas
completas de microrganismos), de subunidades (formuladas a partir das principais
subunidades imunogênicas dos antígenos) e de proteínas de fusão (elaboradas através da
junção de epítopos ou subunidade de múltiplos antígenos) vem se aperfeiçoando a partir
do estudo de diversos antígenos imunogênicos da bactéria, demonstrando capacidade de
acarretar um controle parcial do crescimento bacteriano in vivo por ter capacidade de
gerar uma resposta imune do tipo Th-1 contra o Mtb. Essa resposta imune ocorre
19
principalmente na fase inicial da infecção, resultando em um maior recrutamento e
ativação de células T para o sítio de infecção, possibilitando a contenção da infecção e
diminuindo a chance do indivíduo desenvolver a doença (LAMBERT; HAWKRIDGE;
HANEKOM, 2009).
Um exemplo que vem se mostrando eficiente é a vacina Mtb72F/AS02,
desenvolvida como boost, procurando potencializar e recuperar uma resposta já préexistente induzida pela BCG, é uma proteína de fusão composta por duas proteínas que
são expressas apenas pelo Mtb e pela BCG. Os efeitos dessa vacina já foram estudados
em camundongos, cobaias, coelhos e primatas não-humanos e demonstraram serem
protetores e bem tolerados. Por conseguinte, estudos de tolerância e imunogenicidade
em humanos, evidenciaram que ela é capaz de estimular células T CD4+ e induzir a
produção de IL-2, INF-γ e TNFα. A vacina também induziu forte soro conversão após a
segunda imunização em todos os pacientes. Além disso, a vacina demonstrou ser bem
tolerada e induzir poucos efeitos colaterais (VON ESCHEN et al., 2009).
As vacinas em teste clínico têm demonstrado eficiência, apesar destes testes
clínicos terem capacidade limitada de demonstrar a eficiência das vacinas,
principalmente devido aos altos custos e dificuldades relacionadas ao tempo de proteção
vacinal (KAUFMANN, 2013). As pesquisas em vacinas contra o Mtb evoluíram muito
nas ultimas décadas e atualmente existem mais de uma dúzia de vacinas em testes
clínicos. No entanto, vários obstáculos ainda precisam ser superados para se encontrar
uma vacina eficiente contra a TB. Pouco se sabe sobre o sistema imune como um todo,
em especial sobre a natureza das células de memória tão almejadas no desenvolvimento
de vacinas. Não sabemos exatamente quais as características da BCG que a tornam
eficiente em alguns casos e ineficiente em outros ou quais antígenos do Mtb devem ser
utilizados para gerar proteção eficiente e duradoura (ORME, 2013).
1.7
Antígenos utilizados nesse trabalho
Devido à complexidade da resposta imune do hospedeiro contra a tuberculose e
as restrições genéticas impostas pelo complexo principal de histocompatibilidade, é
provável que uma vacina de subunidade eficaz deve compreender epítopos múltiplos, de
várias fases diferentes da doença expressos em situações diversas para assegurar ampla
cobertura de uma população geneticamente heterogênea. Sendo assim, vários antígenos
do Mtb são pesquisados como alternativas para vacinas ou testes diagnósticos.
20
Antígenos esses que podem ser detectados “in vitro” em diversas condições de
crescimento ou são produzidos ou super expressos pela bactéria em fases específicas da
infecção (FORRELLAD et al., 2012; WANG, C. C. et al., 2013).
A parede celular das micobactérias, rica em lipídios, oferece diversos
mecanismos de sobrevivência para a bactéria. Os ácidos micólicos, componentes
lipídicos mais abundantes da parede celular, são ácidos graxos de cadeia longa βhidroxil encontrados na forma de trealose dimicolato (TDM) e trealose monomicolato
(Figura 4) (SCHEICH; PUETTER; SCHADE, 2010). A família de Antígeno 85 (Ag85)
formada pelo Ag85a, Ag85b e Ag85c possuem massa variando de 30 kDa a 32 kDa,
têm função de micoliltransferase, participando da síntese dos ácidos micólicos ao
catalisar a formação dos glicolipídeos mais abundantes da parede celular micobacteriana
(BELISLE et al., 1997) e são codificadas pelos genes fbpA (Rv3804), fbpB (Rv1886c)
e fbpC2 (Rv0129c), respectivamente (KREMER et al., 2002).
Os antígenos do complexo Ag85 estão sendo extensivamente estudados quanto
ao seu papel na patogenia, imunogenicidade, antigenicidade e virulência do Mtb. Essas
proteínas estão presentes na parede celular, mas são predominantemente secretados
pelas micobactérias e têm a capacidade também de se ligar à fibronectina, dessa forma
participando da aderência bacterina nas superfícies e mucosas o que facilita a invasão e
disseminação da bactéria nos tecidos do hospedeiro (ABOU-ZEID et al., 1988;
FORRELLAD et al., 2012; KUO et al., 2012). Além disso, Armitige et al (1999) ao
fazer uma mutação nos loci que codificam o Ag85a e o Ag85b para impedir a correta
produção da enzima, demonstrou que a bactéria deficiente de Ag85a tem menor
capacidade de sobreviver e se multiplicar dentro de macrófagos humanos (THP-1) e de
camundongos (J774A1).
O Ag85c é extremamente importante para a atividade micoliltransferase do
grupo, sendo sozinho responsável por 40% dessa atividade, não podendo ser substituída
pelas outras duas micoliltransferases, como demonstrado em mutantes deficientes do
gene fbpC2. Esse antígeno também tem papel na ligação covalente dos ácidos micólicos
com o arabinogalactano (JACKSON et al., 1999). Ademais, quando a bactéria está
infectando macrófagos ativados, esse gene tem sua transcrição aumentada,
possibilitando que a bactéria aumente a espessura de sua parede celular e se proteja dos
mecanismos bactericidas do hospedeiro.
21
Em adicional ao seu papel na biossíntese da parede celular bacteriana, o Ag85c
demonstrou ser altamente imunodominante, tendo vários epítopos reconhecidos por
células T CD4+ e CD8+ (SILVER; WALLIS; ELLNER, 1995; LEE, B. Y.; HORWITZ,
1999; D'SOUZA et al., 2003). Lim et al. também reportaram uma resposta imune
positiva de células T de pacientes PPD positivos, frente ao Ag85c, no entanto menor
que as respostas aos outros dois antígenos da família (LIM et al., 1999). Isso
provavelmente é reflexo da baixa produção desse antígeno pela bactéria, que pode
influenciar o reconhecimento e a apresentação do antígeno em experimentos “in vivo”
(WIKER; HARBOE, 1992). Além disso, Kumar et al, ao estudar o potencial dos
antígenos Ag85a, Ag85b, Ag85c e CFP-10 como marcador de diagnóstico para Tb em
crianças, compararam reatividade dos anticorpos de diferentes grupos de crianças (com
a doença mas não tratada, com tuberculose em tratamento, com comorbidades e crianças
saudáveis) frente a esses antígenos, demonstrando que o Ag85c é o que apresenta maior
sensibilidade (89,77%) e maior especificidade (92%) (KUMAR et al., 2008).
O papel do Ag85c na célula bacteriana e sua imunogenicidade natural tornam
esse antígeno um alvo atrativo de estudos para o desenvolvimento de uma vacina contra
tuberculose. Com base nisso, Jain et al construíram uma BCG recombinante (rBCG)
super expressando o Ag85c e avaliaram o seu potencial protetor e a resposta imune
humoral desenvolvida em cobaias vacinadas e depois desafiados com Mtb, por via de
aerossol. A rBCG apresentou melhor proteção, comparado ao BCG, ao se verificar a
carga bacilar presente nos pulmões e baço dos animais, além de uma significante
diminuição de lesões em diversos órgãos. Em contraste, a vacina recombinante induziu
níveis menores de IL-12, IFN-γ e TNF-α, um ligeiro declínio no TGF-β e aumento na
quantidade iNOS, em comparação com a BCG, indicando uma resposta imune mais
moderada, no entanto mais eficiente (JAIN et al., 2008). Christy et al, também
construíram uma BCG recombinante mas expressando epítopos capazes de estimular
células T, com objetivo de melhorar a apresentação dos mesmos e potencializar a
resposta imune da vacina, por conseguinte a vacina rBCG:FBP (expressando o peptídeo
que vai do aminoácido 201 ao 215) apresentou significante aumento na proteção contra
o Mtb, se comparado com a BCG (CHRISTY et al., 2012).
O antígeno MPT51 (FbpC1), cuja estrutura terciária está demonstrada na figura 5,
é uma proteína de 27 kDa codificado na região fbpC1 (Rv3803c), também chamado de
Ag85D devido a sua homologia (40%) com o complexo Ag 85 (NAGAI et al., 1991;
RAMBUKKANA et al., 1993). No entanto, não é uma micoliltransferase, o que a
22
classifica como uma nova família α/β hidrolases (WILSON et al., 2004). Sua função
biológica tem relação análoga a também não catalítica acetilcolina esterase que se liga à
fibronectina e a outros carboidratos (RINKE DE WIT et al., 1993; WILSON et al.,
2004).
Figura 4. Ação enzimática (a), estrutura (b) e sítio catalíticos (c) das proteínas da
família Ag85. Adaptado de Backus et al. 2011.
Esse antígeno demonstrou ser um bom marcador para diagnóstico de tuberculose
principalmente em pacientes coinfectados com HIV onde a imunodeficiência favorece
uma rápida disseminação do patógeno, tornando a detecção precoce essencial (SINGH
et al., 2005). Achkar et al. em estudo feito com pacientes tuberculosos da Índia,
demonstrou que um teste utilizando a proteína MPT51 tem 80% de sensibilidade tanto
em pacientes paucibacilares quanto em multibacilares (ACHKAR et al., 2006). Melo et
al.2 reportaram em suas pesquisas, com grupos distintos de pacientes no Brasil, uma
sensibilidade de 76% em um ensaio imuno-enzimático para IgM utilizando o antígeno
MPT51(MELO et al., 2008). Nosso grupo, em trabalhos anteriores também demonstrou
que ao vacinar camundongos BALB/C, com a uma vacina composta da proteína
recombinante MPT51 e adjuvantes (tanto CPG DNA quanto adjuvante incompleto de
Freud) houve uma relativa proteção contra a infecção. Além disso, a proteína estimulou
23
a multiplicação de células T INF-γ+ e diminuiu a inflamação presente nos pulmões dos
camundongos (SILVA et al., 2009).
Figura 5. Estrutura terciária do MPT51. Adaptado de WILSON et al. 2004
A proteína HSPX, também chamada de Acr1 ou proteína α-cristalina de 16Kda,
faz parte do DosR-DosT regulon um sistema do tipo TCSS (two components signal
systems) que é ativado frente a estímulos do microambiente em que a bactéria se
encontra, principalmente em condições de estresse, como hipóxia e extresse oxidativo.
O HspX é uma proteína presente em grande quantidade em culturas em fase
estacionária, sendo pouco detectada na fase lag ou exponencial do crescimento
bacteriano (VOSKUIL et al., 2003).
Yuan et al (1998) relataram que um mutante M. tuberculosis:Δacr tem seu ritmo
de crescimento significativamente diminuído, tanto em macrófagos de origem da
medula óssea (do inglês: bone marrow derived macrophage, BMDM) como em células
THP-1 (uma linhagem de células de leucemina monocícita humana). Hu et al. (2006)
demonstraram exatamente o oposto: outro Mtb mutante, Δacr tem aumento do
crescimento ao infectar camundongos da linhagem BALB/c e em cultura in vitro de
BMDM. Consistente com esta última, a superexpressão da proteína HspX acarreta
redução do crescimento do BCG nos pulmões e fígado de camundongos. Sendo assim, a
proteína de 16 kDa α-cristalina regula a multiplicação bacteriana e sua expressão está
diretamente ligada ao microambiente inóspito com hipóxia e extresse oxidativo,
portanto, tendo relação direta com a fase de latência da infecção (SPRATT; BRITTON;
TRICCAS, 2010)
24
Além disso, anticorpos presentes no soro da maioria dos pacientes com
tuberculose ativa reconhecem HspX, no entanto pessoas vacinadas com BCG mas que
não tiveram contato com Mtb, não apresentam resposta contra ela. Kaushik et al,
avaliaram a imunogenicidade do HspX frente ao soro de pacientes com tuberculose
pulmonar, extrapulmonar, e controles não doentes e a utilização da proteína foi capaz de
discriminar completamente indivíduos doentes de não doentes. Geluk et al também
demonstraram que a maioria dos indivíduos expostos ou infectados apresentam maior
resposta de células T contra a HspX do que indivíduos não expostos ou vacinados com
BCG. Rabahi et al. evidenciaram que a resposta de anticorpos ao HspX também é um
bom indicador para novas infecções. Davidow et al caracterizaram uma maior resposta
humoral entre indivíduos com TB latente do que indivíduos com TB ativa (DAVIDOW
et al., 2005; GELUK et al., 2007; RABAHI et al., 2007; KAUSHIK et al., 2012).
Timm et al. (2003) descreveram que antígenos associados com a fase latente da
doença tem grande poder de estimular a produção específica de INF-γ, proliferação de
células T CD4+ e expressão de diversas outras citocinas por células do sistema
mononuclear fagocitário. Em adicional, o HspX é capaz de ativar células T de 80% de
indivíduos contatos de pacientes com tuberculose e 90% de indivíduos que trabalham
em centros de atendimento à doença (VEKEMANS et al., 2004). Portanto, como esse
antígeno está associado com a fase latente da doença e também é produzido, ainda que
minimamente, nas fases logarítmica e exponencial do crescimento bacteriano, o HspX é
um alvo racional de estudos para a possível utilização no desenvolvimento de uma
vacina que estimule uma resposta imune protetora tanto na fase ativa da doença quanto
durante a fase de latência (TAYLOR et al., 2012). Por conseguinte, Li et al. em um
trabalho utilizando imunização de camundongos BALB/c com proteínas de fusão,
fusionaram vários antígenos do Mtb e contruíram a vacina AMH (Ag85b-Mpt64190-180HspX) e evidenciaram que a vacina de subunidade foi capaz de gerar grande quantidade
de IgG2a e IgG1 específicos para HspX, assim como altos níveis de INF-γ estimulados
pelo Ag85b e HspX (Li et al, 2011) .
Em outro trabalho, Niu et al. construíram uma proteína de fusão utilizando os
antígenos Mtb10.4 e HspX objetivando antígenos da fase inicial da doença e antígenos
da fase de dormência, respectivamente, e evidenciaram que a proteína de fusão
construída tinha grande poder imunogênico e protetor se utilizada com adjuvantes. A
proteína de fusão induziu resposta específica com produção de IFN-γ e IL-17, assim
como grande produção de anticorpos IgG2A e IgG1. Além disso, ao utilizar a vacina
25
como boost ela potencializou o efeito protetor da BCG em camundongos (Niu et al,
2011) .
1.8
Construção de proteínas de fusão
O progresso da microbiologia, genética, biotecnologia e biossínteses em geral,
forneceram importantes ferramentas para o desenvolvimento da vacinologia. Desse
ponto de vista, o desenvolvimento de proteínas recombinantes ou de fusão é uma
estratégia que vem demonstrando ser notável, visto que uma proteína de fusão pode ter
vários usos que vão desde a vacinação/prevenção, passando pelo diagnóstico e
chegando ao tratamento de doenças. Além disso, a partir de uma proteína de fusão ou
proteína recombinante, um leque de estratégias vacinais é aberto, de maneira que uma
única proteína poderia ser utilizada em uma estratégia de “prime boost” após a
vacinação por BCG, construir-se uma vacina BCG recombinante que expresse essa
proteína e melhorar o seu potencial vacinal ou utilizar uma proteína recombinante/fusão
como uma vacina protéica em conjunto com adjuvantes (PARIDA; KAUFMANN,
2010; CHENG et al., 2011; KAUFMANN, 2011).
Vacinas de subunidade protéica utilizam da estratégia de poder lidar apenas com
os componentes do microrganismo que melhor estimulam o sistema imune ao invés de
utilizar o microrganismo inteiro. De fato, uma vacina de subunidade ao utilizar
essencialmente antígenos imunodominantes reduz a chance de reações adversas. Uma
vacina de subunidade pode ter diversos epítopos imunodominantes, ou seja, a região
protéica capaz de estimular o sistema imune mais eficientemente, seja ativando células
T ou estimulando células B (PATRONOV; DOYTCHINOVA, 2013). Por conseguinte,
a ampliação do conhecimento acerca do reconhecimento de antígenos pelo sistema
imune contribui para o desenvolvimento racional de vacinas proteicas, de subunidade,
peptídicas ou de fusão. A idéia geral por trás dessas estratégias vacinais está em
identificar epítopos imunodominantes para células B e células T, podendo conjugá-los
ou fusioná-los para potencializar suas capacidades imunogênicas (MELOEN et al.,
2001; DERMIME et al., 2004).
Dado ao elevado grau de complexidade de interação entre o Mtb e seu
hospedeiro, entender o repertório imunogênico do Mtb é extremamente importante para
o desenvolvimento de uma vacina. O genoma de M. tuberculosis H37Rv, codifica cerca
de 4000 genes e tem características únicas, tais como o elevado número de genes que
26
codificam enzimas envolvidas no metabolismo de ácidos graxos (para síntese de parede
celular) ou a família de proteínas PE e PPE, proteínas com funções diversas que podem
estar associadas à variação antigênica do Mtb durante a infecção. Antígenos que são
reconhecidos por células do hospedeiro durante a TB ativa, quando o bacilo está se
replicando, e capazes de induzir resposta via células T CD4+ e T CD8+ são alvos
potenciais para o controle imunológico do patógeno. A latência e a evasão dos
mecanismos imunológicos também devem ser abordados para desenvolver uma vacina
eficaz contra o Mtb (LINDESTAM ARLEHAMN et al., 2013).
Contudo, a capacidade de uma proteína induzir uma resposta imune eficaz é
inferior à de outras estratégias vacinais (e.g. vacinas vivas atenuadas, vacinas de vetor
viral) e a utilização de uma proteína purificada em uma estratégia vacinal está
diretamente ligado à coadministração de adjuvantes e imunoestimuladores (AWATE;
BABIUK; MUTWIRI, 2013; MOYLE; TOTH, 2013; PATRONOV; DOYTCHINOVA,
2013). Por conseguinte, dada a sua pouca quantidade de epítiopos e ao grande
polimorfismo da molécula de HLA, vacinas peptidicas tem capacidade reduzida de
estimular resposta imune em populações muitos distintas e a fusão de subunidades
antigênicas propicia maior abrangência populacional ao se ampliar a gama de antígenos
capazes de se ligar à moléculas de MHC distintas, presentes na molécula vacinal
(ALEXANDER et al., 1998; MOYLE; TOTH, 2013).
O desenvolvimento de proteínas de fusão para serem utilizadas como
diagnóstico (com capacidade antigênica) e/ou vacinas (com capacidade imunogênica)
não possui regras definidas, pois a aproximação artificial de peptídeos pertencentes a
diferentes proteínas acarretam em novas interações intramoleculares cujos resultados
ainda não podem ser totalmente previstos. O desenho de proteínas e a identificação de
sequências podem ser sutis e complexas e não há modelo experimental competente o
suficiente para identificar todas as propriedades funcionais e estruturais de uma proteína
sintética. As interações que conferem estrutura e função à proteína envolvem forças
intermoleculares e um grande número de interações entre aminoácidos. Como suas
estruturas podem ser compostas de dezenas a milhares de aminoácidos, as possíveis
ligações da cadeia principal e das cadeias laterais resultam em um imenso número de
configurações possíveis para uma única sequência (SAMISH et al., 2011). Portanto,
sabe-se que da construção de fusões proteicas surgem novas proteínas com propriedades
imprevisíveis devido a nova sequência de aminoácidos (cada um com sua propriedade
físico-química característica) exercer ações intramoleculares que podem interferir na
27
estabilidade da proteína de fusão produzida (PARR-VASQUEZ; YADA, 2010) ou
acarretar um inesperado dobramento da proteína para gerar os determinantes antigênicos
das proteínas originais esperados (MONASTYRSKAYA et al., 1997; KARPENKO et
al., 2000).
Além disso, a sequência “hinge”, sequência de aminoácidos que separa os
epítopos fusionados na proteína, exerce igual efeito crítico. Essa sequência tem tal
importância que alterações em sua composição ou tamanho resultam em alterações de
estabilidade, de estado oligomérico, resistência proteolítica e solubilidade. Elas são
usualmente baseadas em glicinas (no caso de nossa proteína de fusão já feita uma
sequência de penta-glicina – Gli-Gli-Gli-Gli-Gli) e seu tamanho é calculado com
objetivo de ter uma menor distância entre a região COO- de uma proteina e a região
NH+ de outra proteína. A glicina é geralmente usada em sequências hinge porque a
ausência de um β-carbono permite a cadeia principal de polipeptídeo acesso a ângulos
diedros
que
são
energeticamente
impossibilitados
para
outros
aminoácidos
(ROBINSON; SAUER, 1998; DIPTI; JAIN; NAVIN, 2006).
Atualmente existem algumas vacinas baseadas na estratégia de proteína de fusão
em fases de testes clínicos avançados. A vacina M72F é formada por uma poliproteína
de 72 kDa, produzida ao se fusionar as proteínas Mtb32 e Mtb39, selecionadas a partir
de sua capacidade de estimular a produção IFN-γ por células CD4+ e CD8+ de
indivíduos saudáveis e PPD positivos (SKEIKY; SADOFF, 2006). Essa proteína de
fusão foi primeiramente testada com a utilização de 2 adjuvantes (AS02A e AS01B) e
como vacina de DNA. Essas formulações foram administradas, por via intramuscular,
em camundongos C57BL/6 e em cobaias, e a proteção foi avaliada após subsequente
infecção por aerossol com Mtb. A vacina demonstrou ter poder protetor contra
tuberculose e o adjuvante escolhido para ser utilizado em associação com a vacina foi o
AS02B (SKEIKY; SADOFF, 2006). Posteriormente, a M72F foi administrada em
esquema de “prime boost”, após vacinação com BCG, em cobaias e primatas não
humanos e teve capacidade de aumentar sobrevivência dos animais infectados
(BRANDT et al., 2004; REED et al., 2009). A vacina avançou para fase de teste I em
humanos e demonstrou ser bem tolerada em adultos PPD negativos, bem como induzir
uma multiplicação de células T CD4+ e aumento na produção de IL-2 e IFN-γ antígenoespecífica (VON ESCHEN et al., 2009).
Existem também duas vacinas utilizando o antígeno ESAT-6 em teste, a Hybrid
1 é baseada na fusão da proteína Ag85b com a proteína ESAT-6 e demonstrou em
28
modelo murino, ao ser utilizada com um adjuvante, ter capacidade protetora comparável
ao BCG (WEINRICH OLSEN et al., 2001; DOHERTY et al., 2004). Em esquema de
“prime boost” a vacina Hybrid 1 protegeu as cobaias de infecção com Mtb por via de
aerossol. Já a HyVac, que foi produzida a partir da fusão dos antígenos ESAT-6 e Mtb
10.4, demonstrou ter maior capacidade de proteção do que a formulação de ESAT-6 e
Mtb 10.4. Ao ser testada também como boost a vacina HyVac demonstrou potencial
capacidade de melhorar a proteção da BCG, em cobaias vacinadas e infectadas com Mtb
por via de aerossol.
29
2 JUSTIFICATIVA
O diagnóstico rápido e preciso da TB e o início precoce do tratamento são
fatores de grande importância para reduzir a morbidade, mortalidade e minimizar o
risco de contágio. Contudo, novos métodos de diagnóstico por si só não terão um
impacto real necessário para reduzir, e muito menos eliminar a TB (CHEGOU et al.,
2011; PARSONS et al., 2011). Ferramentas de diagnóstico avançadas e eficientes são
inócuas se não estiverem associadas com prevenção e tratamento também eficiente. Elas
podem e devem ser melhor usadas, fechando a lacunas entre diagnósticos, tratamento,
assistência ao paciente e adesão ao tratamento do mesmo, no entanto os investimentos
em tratamento e acima de tudo em prevenção é o que causará maior impacto na luta
contra a doença (WEYER; CARAI; NUNN, 2011).
Uma das estratégias mais promissoras para desenvolvimento de vacinas é o
estudo de proteínas de fusão, cujo desenvolvimento racional requer o entendimento da
resposta imune contra o microrganismo para o qual se quer desenvolver a vacina e o
conhecimento de quais os componentes microbianos podem estimular uma resposta
imune protetora (MOYLE; TOTH, 2013). Desse ponto de vista, uma vacina de fusão
pode incorporar diversas subunidades com capacidades antigênicas diferentes podendo
induzir uma resposta eficiente e duradoura contra o Mtb. No entanto, o desenvolvimento
de vacinas proteicas contra TB tem sido restringido pelo limitado número de antígenos
conhecidos do Mtb (DERRICK et al., 2013), sendo que a maioria das vacinas proteicas
que estão em estudos clínicos mais avançados utilizam o Ag85b em sua formulação e
apesar de se demonstrar imunogênica isso não tem se correlacionado com a proteção
apresentada pelas vacinas, o que também reflete o déficit de conhecimento do sistema
imune (ORME, 2013).
Nesse trabalho propomos a construção de uma proteína de fusão constituída de
subunidades de três outras antígenos do Mtb. O Ag85c é uma proteína intrinsecamente
ligada à fisiologia bacteriana e a única micolil transferase da família que não pode ter
suas funções substituída pelos outros membros da família. A proteína MPT51 está
relacionada à virulência do bacilo e a sua capacidade de aderir na célula que a bactéria
infectará. A proteína HspX, por sua vez, tem papel fisiológico principalmente
relacionado à fase de latência da bactéria. Dessa forma, ao associarmos antígenos com
diversas funções e relacionados a fases distintas da doença procuramos desenvolver
30
uma proteína com capacidade vacinal de afetar a bactéria em seus diferentes estados. O
mesmo raciocínio foi utilizado na construção da vacina ID93, construída a partir de
antígenos com funções diferentes e que são expressos em fases diferentes da doença
(Rv2608 pertencente a família de proteínas PPE; Rv3619 e Rv3620 pertencentes a
família de proteínas EsX; Rv1813 antígeno da fase de latência) e demonstrou ser uma
vacina capaz de melhorar o tratamento de camundongos infectados com o Mtb,
aumentando a sobrevivência em até 50% mesmo quando o esquema da terapia foi
reduzido para 60 dias (COLER et al., 2013).
As subunidades escolhidas de cada proteína têm capacidades imunogênicas
distintas, mas em especial, a proteína CDα foi desenhada com o objetivo de estimular
resposta imune do tipo Th1, sendo que as subunidades escolhidas apresentam
capacidade de induzir a produção de INF-γ e IL-2 por diversas células do sistema imune
(D'SOUZA et al., 2003; AOSHI et al., 2005; GELUK et al., 2007; AOSHI et al., 2008).
Essas citocinas já estão bem caracterizadas como necessárias no desenvolvimento de
uma resposta imune eficiente contra Mtb ao melhorar a capacidade microbicida dos
macrófagos (INF-γ), ou a atividade dos próprios linfócitos (IL-2) (ERNST, 2012;
O'GARRA et al., 2013). A mesma capacidade já foi relatada por outras vacinas de
proteínas de fusão, como a Mtb72f, que tem capacidade de estimular populações
celulares duradouras produtoras de IL-2, TNF-α, INF-γ e IL-17, sendo essa resposta
correlacionada com seu potencial protetor (DAY et al., 2013).
A proteína CDα foi desenvolvida com objetivo de estimular principalmente
células T CD8+, sendo as subunidades do MPT51 e do HspX capaz de potencializar a
citotoxicidade mediada por célula dos linfócitos T CD8+ além de estimular populações
de células T CD8+ produtoras de citocinas INF-γ e IL-2 (AOSHI et al., 2005; GELUK
et al., 2007; AOSHI et al., 2008). Dessa forma ao escolhermos as subunidades que
compõem a CDα, procuramos induzir populações celular diretamente ligada a resposta
protetora contra o bacilo e explorar pontos negativos da vacina em uso (BCG), que é
uma fraca estimuladora de resposta por células T CD8+ (GRODE et al., 2005). Uma
vacina que também proteja através de resposta por células T CD8+ é uma boa
alternativa para pacientes que são coinfectados por Mtb e HIV, uma vez que o vírus
depleta as células T CD4+ (ORME, 2013).
Outro fator importante na construção de uma proteína de fusão é a sequência que
separa as subunidades da proteína. Essa sequência tem grande influência em sua
estabilidade e na conformação final da proteína. O aminoácido mais comumente
31
utilizado em sequência “hinge” é a glicina, pois a ausência de um β-carbono permite
que a cadeia polipeptídica possa fazer angulações diédricas que não são permitidas por
outros aminoácidos, possibilitando, portanto uma maior flexibilidade de dobra para a
proteína. No entanto, Robinson e Sauer em seu trabalho de 1998, demonstraram que
uma sequência “hinge” muito flexível é prejudicial para a estabilidade da proteína de
fusão. O aminoácido serina também demonstrou ser importante na conformação final da
proteína, tendo relação direta com a estabilidade da proteína quando em tampões com
baixa concentração de sais (ROBINSON; SAUER, 1998).
32
3 OBJETIVOS
3.1
Objetivo Geral
Obter uma proteína de fusão contendo epítopos das proteínas MPT51, Ag85c e
HspX de M. tuberculosis e analisar seu potencial imunogênico.
3.2
Objetivos Específicos
3.2.1 Desenhar oligonucleotídeos específicos para os epítopos de M. tuberculosis a
serem fusionados e clonados em vetor pGEM-T para E. coli;
3.2.2 Amplificar por PCR convencional as regiões correspondentes aos epítopos a
serem usados;
3.2.3 Digerir os insertos correspondentes aos epítopos com as respectivas enzimas de
restrição;
3.2.4 Construir a fusão gênica, CDα, através de sistemas de ligação contendo os
amplicons digeridos;
3.2.5 Amplificar a fusão gênica do produto de ligação e inseri-la no vetor de clonagem
pGEM-T easy;
3.2.6 Transferir a sequência da fusão CDα para o vetor pET23a, para ser expressa em
E. coli;
3.2.7 Analisar a expressão da proteína de fusão recombinante CDα em Escherichia
coli;
3.2.8 Determinar as sequências gênicas e proteicas da CDα ;
3.2.9 Avaliar as propriedades antigênicas e a imunogenicidade humoral da proteína
CDα.
33
4 MÉTODOS
Na figura 6 apresentamos
uma síntese dos métodos e das sequências
metodológicas utilizadas nesse trabalho. Para construção da seqüência gênica e
expressão da proteína utilizamos a bactéria Escherichia coli (cepa XL1-Blue como
vetor de clonagem e cepa BL21 como vetor de expressão). Essa enterobactéria é ainda o
vetor mais utilizado para construção e expressão de proteínas recombinantes, uma vez
que seu genoma é bem caracterizado (CHOU, 2007). Além disso, há o aperfeiçoamento
intenso das ferramentas disponíveis para manipular essa bactéria geneticamente estando
disponíveis diversas linhagens e sistemas de expressão para atender as mais variadas
condições de expressão (ANDERSEN, D. C.; KRUMMEN, 2002; SCHMIDT, 2004).
Aliado à cepa bacteriana BL21, utilizamos o plasmídeo, pGEM-T easy (para
clonagens) e pET23a (para expressão) da proteína CDα, esse último escolhido por ter
uma região promotora do fago T7, um promotor potente e induzível pela presença de
IPTG, e permitiu assim a super-expressão do gene da proteína CDα, além de adicionar à
seqüência proteica uma cauda de poli-histidina que permitiu a posterior purificação da
proteína por cromatografia de afinidade. Esse sistema possibilita maior controle da
expressão evitando expressão basal do gene clonado, apesar de o controle não ser total
uma vez que o vazamento da expressão é um problema de sistemas controlados pelo
operon lac, estando correlacionado com diminuição de nutrientes do meio
(GROSSMAN et al., 1998; SORENSEN; MORTENSEN, 2005a).
34
Figura 6. Representação esquemática da sequência de metodologia e técnicas utilizadas
nesse trabalho.
4.1
4.1.1
Construção dos vetores recombinantes para expressão heteróloga
em E. coli.
Desenho de oligonucleotídeos iniciadores e análise “in silico” da
construção
As informações sobre sequências de genes de interesse foram recuperadas do
banco de dados do GenBank® e a partir da sequência gênica das proteínas Ag85c
(RV0129c, NCBI-GeneID: 886132), MPT51 (RV3803c; NCBI-GeneID:886121), HspX
(RV2031c, NCBI GeneID: 887579) foram desenhados oligonucleotídeos iniciadores
que permitiram a amplificação das regiões correspondentes as subunidades desejadas, a
criação de novos códons de aminoácidos nas extremidades dos epítopos amplificados,
assim como a criação de sítios para enzimas de restrição que permitiram a fusão dos três
fragmentos em fase de leitura correta e posterior clonagem e expressão em vetores para
expressão em E. coli. Além disso, os oligonucleotídeos permitiram a criação de uma
35
sequência “hinge” de cinco aminoácidos intercalados entre cada uma das subunidades.
Em seguida, foi feito uma análise “in silico” das sequências dos oligonucleotídeos e de
seus respectivos amplicons, bem como do resultado de sua fusão e de sua provável
expressão em vetor pET23a (software CLC Main Workbench®).
A predição da estrutura terciária da proteína foi feita através do programa
Phyre2 (Protein Homology/AnalogY Recognition Engine) que faz a predição estrutural
através da comparação da homologia da estrutura de proteína e seus aminoácidos de um
banco de dados (no caso Hpred e HHserch).
4.1.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada em dois momentos
diferentes, para amplificar cada uma das subunidades utilizadas (PCR1) e para
amplificar a sequência gênica das subunidades fusionadas a partir do sistema de ligação
das mesmas (PCR2).
As reações de amplificação PCR1 foram feitas em uma reação de volume final
igual a 50 µL, contendo: 20 ηg DNA genômico de Mycobacterium tuberculosis H37Rv;
1,5 U Taq DNA polimerase (Invitrogen®); Tampão GoTaq (Promega®) 1.5 mM de
MgCl2; 250 µM de cada dNTP; 50 nM de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores
Ag85NH+/Ag85COO- para amplificarem a subunidade do Ag85c, MPT51NH+/MPT51COOpara amplificarem a subunidade do MPT51 e HspXNH+/HspXCOO- para amplificarem a
subunidade do HspX. A reação foi feita em termociclador, seguindo os seguintes
parâmetros: (a) 1 ciclo de 4 minutos a 4ºC; (b) 35 ciclos de 45 segundos a 92ºC, 1
minuto a 58ºC e 1 minuto a 72ºC; (c) 1 ciclo de 10 minutos a 72ºC; (d) 1 ciclo
permanente de 10ºC.
A reação de amplificação PCR2 foi feita em uma reação de volume final igual a
50 µL, contendo: 3 µL do sistema de ligação contendo os amplicons acima digeridos,
1,5 U Taq DNA polimerase (Invitrogen®), Tampão GoTaq (Promega®) 1.5 mM de
MgCl2, 250 µM de cada dNTP e 50nM dos oligonucleotídeos iniciadores (Ag85NH+ e
HspXCOO-). A reação foi feita em termociclador com os seguintes parâmetros: (a) 1 ciclo
de 4 minutos a 4ºC; (b) 35 ciclos de 45 segundos a 92ºC, 1 minuto a 58ºC e 1 minuto a
72ºC; (c) 1 ciclo de 10 minutos a 72ºC; (d) 1 ciclo permanente de 10ºC.
Os produtos da amplificação foram analisados aplicando-se 8µL da reação mais
2 µL de tampão de amostra, assim como um marcador de 100 pb (Invitrogen®), em gel
36
de agarose a 1,5% contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídeo, em tampão 1X TBE (0,89
M de tris base, 0,89 M de ácido bórico e 0,01 M de EDTA), o qual foi submetido a
separação eletroforética em uma tensão de 80 Volts por 60 minutos. O gel então foi
visualizado por incidência de ultravioleta através do Fotodocumentador Gel Doc
System (ByoRad®), documentado e analisado através do programa Quantity One
(ByoRad®).
4.1.3 Reação de digestão simples e dupla das subunidades gênica.
No trabalho foram utilizados digestões em momentos diferentes para formar
extremidades coesivas entre as subunidades ou entre a sequência gênica já fusionada e o
plasmídeo de expressão.
Os amplicons correspondentes as subunidades gênicas de interesse foram
digeridos (Dg1) com as respectivas enzimas de restrição, com exceção da região amino
terminal do Ag85c e da região carboxi terminal do HspX. De maneira que foi feito uma
um digestões simples para a subunidade Ag85c utilizando NheI (10 Unidades/ µg de
DNA) e tampão apropriado para digerir a região carboxi terminal da subunidade gênica.
Digestão dupla para o gene correspondente a subunidade MPT51 com a enzima XbaI e
XhoI (10 Unidades/ µg de DNA) e tampão apropriado. Digestão simples para a
subunidade do HspX utilizando a enzima XhoI (10 Unidades/ µg de DNA) e tampão
apropriado com objetivo de digerir a região amino terminal da subunidade gênica, todas
as digestões foram feitas pelo período de 2 horas em banho-maria a 37ºC. Uma vez feito
a digestão, os produtos foram precipitados para retirar as enzimas de restrição, com
150mM de NaCl e etanol a 65%, incubou-se a -20ºC por 16 horas. Posteriormente
centrifugou-se a 12.000g, por 20 minutos a 4ºC, descartou-se o sobrenadante, lavou-se o
sedimento com etanol a 70% gelado e deixou secar. O produto das digestões foi então
ressuspendido em 20 µL de água tipo I.
O plasmídeo de clonagem, pGEM-T easy, contendo o gene de fusão clonado foi
digerido (Dg2) com as respectivas enzimas de restrição, da região amino terminal do
Ag85c e da região carboxi terminal do HspX. De maneira que foi feito uma digestão
dupla com: 49 µL de DNA plasmidial pGEM-T/CDα, 6 µL de tampão BamHI
(Fermentas®), enzima BamHI (Fermentas®), e enzima NotI (Fermentas®), a digestão
foi incubada pelo período de 2 horas em banho-maria a 37ºC. Uma vez feito a digestão,
os produtos foram separados novamente por eletroforese em gel de agarose, como
37
descrito anteriormente, e os fragmentos liberados da digestão foram eluídos e
purificados em gel de agarose a 1,5% pelo GFX™ PCR DNA e Gel Band Purification
Kit (GE Lifesciences), seguindo as instruções do fabricante. Uma digestão com as
mesmas enzimas e condições acima foi realizada com o plasmídeo pET23a para receber
o gene correspondente a fusão digerida.
4.1.4 Sistema de ligação
Foram realizados três tipos de sistema de ligação no trabalho, um para se ligar as
subunidades da sequência gênica da proteína de fusão (SL1), outro para ligar a
sequência ao plasmídeo de clonagem pGEM-T easy (SL2) e outro para se ligar a
sequência gênica da proteína de fusão ao plasmídeo de expressão pET23a (SL3).
Na reação para construção da sequência gênica da proteína de fusão foi feito um
sistema de ligação (SL1) contendo 1,5 μL de tampão da DNA Ligase, 4,0 µL de cada
inserto digerido, 4,5 U de T4 DNA ligase (Promega®) e água destilada/deionizada para
um volume final de 15 μL. A reação de ligação foi incubada 1 hora em temperatura
ambiente, e logo após por 16 horas a 14ºC.
Na reação para ligação da sequência gênica da proteína de fusão ao plasmídeo de
clonagem foi feito um sistema de ligação (SL2) contendo 1 µL de tampão da DNA
Ligase, 100 ηg do plasmídeo pGEM-T easy (Promega®), 5 µL de produto de PCR2
como inserto, 3 U de T4 DNA ligase (Promega®), e água destilada/deionizada para um
volume final de 10 μL. A reação de ligação foi incubada 1 hora em temperatura, e logo
após por 16 horas a 16ºC.
Na reação para ligação da sequência gênica da proteína de fusão ao plasmídeo de
expressão (SL3) foi feito um sistema de ligação (SL3) contendo 1 µL de tampão da
DNA Ligase, 100 ng do plasmídeo pET23a (Novagen®) previamente digerido com as
enzimas BamHI e NotI, 5 µL do inserto correspondendo a fusão digerida e eluída como
inserto, 3 U de T4 DNA ligase (Promega®), e água destilada/deionizada para um
volume final de 10 μL. A reação de ligação foi incubada 1 hora em temperatura, e logo
após por 16 horas a 16ºC.
38
4.1.5 Transformação por eletroporação
Foram feitas três transformações por eletroporação no trabalho: transformação
T1 dos sistemas de ligação SL2 em XL1-Blue para clonagem dos plasmídeos pGEMT/CDα; transformação T2 dos sistemas de ligação SL3 em XL1-Blue para clonagem
dos plasmídeos pET23a/CDα; transformação T3, do plasmídeo pET23a/CDα em BL21
DE3 (pLysS) para construção do vetor de expressão da proteína CDα.
A transformação T1 e T2 foi feita utilizando 3 µL de SL2/SL3 e 50 µL de
células competentes Escherichia coli XL1 Blue. O plasmídeo foi inserido na célula
através de eletroporação em um aparelho do tipo Electroporator MicroPulser (ByoRad®), no programa Ec2 para bactérias. Essa transformação, foi então acrescida de
meio SOC (extrato de leverdura 0,5%, triptona 2%, NaCl 10mM, KCl 2,5mM, MgCl2
10mM, MgSO4 20mM e glicose 20mM) e incubada por 1 hora a 37ºC sob agitação.
Posteriormente, foi feito um plaqueamento de 50µL de sistema em meio Luria-Bertani
(LB) contendo ampicilina (100 µg/mL) como fator de seleção e incubado por 18 a 24
horas.
A transformação T2 foi feita utilizando 1 µL do plasmídeo recombinante e 50
µL de células competentes E. coli BL21 DE3 (pLysS) e o plasmídeo foi inserido na
célula através de eletroporação em um aparelho do tipo Electroporator Micro Pulser
(Byo-Rad®) no programa Ec2 para bactérias. Essa transformação, foi então acrescida
de meio SOC (extrato de leverdura 0,5%, triptona 2%, NaCl 10mM, KCl 2,5mM,
MgCl2 10mM, MgSO4 20mM e glicose 20mM) e incubada por 1 hora a 37ºC sob
agitação. Posteriormente, foi feito um plaqueamento de 50µL de sistema em meio
Luria-Bertani (LB) contendo ampicilina (100 µg/mL) e cloranfenicol (20 µg/ml) como
fator de seleção e incubado por 18 a 24 horas.
4.1.6 Extração de DNA plasmidial por lise alcalina
Colônias de E. coli transformadas do sistema T1 foram selecionadas e
inoculadas em 5 mL de caldo LB com ampicilina e novamente crescidos por 18 a 24
horas. Por conseguinte, para extração do DNA plasmidial, 2 mL das células foram
coletadas por centrifugação (5000 g por 10 minutos a 10ºC), descartado o sobrenadante
e o sedimento celular foi ressuspendido em 210 µL de solução I (150mM tris HCl,
10mM EDTA pH 8,0) com RNAse (10µg/ml), homogeneizado em vortex e incubado
por 5 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, acrescentou-se 210 µL de solução II
39
(200mM NaOH, 1% SDS), homogeneizou-se e incubou por 5 minutos a temperatura
ambiente. Por fim, acrescentou-se 280 µL de solução III (acetato de sódio 3M, ácido
acético 2M, pH 4,8-5,0), homogeneizou-se por 10 vezes através de inversão e procedeuse com centrifugação (12000g por 10 minutos a 10ºC). Em seguida, transferiu-se o
sobrenadante para outro tubo de ensaio e precipitou-se o plasmídeo utilizando
isopropanol gelado, incubado por 15 minutos e posteriormente centrifugado (12000g
por 15 minutos a 10ºC). Por fim, foi descartado o sobrenadante e o sedimento foi lavado
com 500 µL de etanol 70% gelado e deixado a temperatura ambiente para evaporar o
álcool. O produto final foi então ressuspendido em água tipo I (STUDIER; MOFFATT,
1986).
4.2
Sequênciamento do plasmídeo pET23a/CDα
Reações de sequênciamento foram realizadas utilizando os oligonucleotídeos
Ag85c amino terminal, MPT51 amino terminal, MPT51 carboxi terminal e HspX
carboxi terminal. Cada reação de sequênciamento foi feita utilizando-se 1,0 µL de
oligonucleotídeo iniciador, 3 µL de DNA plasmidial (pET 23a/CDα, extraído por lise
alcalina), 1,0 µL de BigDye, 1.5 µL de Tampão, 3.5 µL de água Tipo I.
A reação foi feita em placa de PCR, e após adição dos reagentes a placa foi
agitada por um minuto a 750 rpm, em homogeneizador de placa. Em seguida, a placa foi
colocada no Termociclador (Labnet Multigene) com a seguinte rotina: (a) 1 ciclo de 1
minuto a 95ºC; (b) 25 ciclos de 20 segundos a 95ºC, 15 segundos a 50ºC e 1 minuto a
60ºC; (c) 1 ciclo por tempo indeterminado de 4ºC. Após término da ciclagem,
adicionou-se 60 µL de isopropranol a 65% (Merck®), homogeneizou-se a placa por 30
segundos a 1000 rpm. Após a homogeneização a placa foi deixada por 20 minutos a
temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Foi então, centrifugada a 2000g por 45 minutos
a 20ºC. Após a centrifugação o sobrenadante foi descartado e a placa foi invertida sobre
papel filtro por 2 minutos. Em seguida para lavagem das amostras, foi adicionado 250
µL de etanol 60% e centrifugadas a 2000g por 10 minutos a 20ºC, posteriormente o
sobrenadante foi descartado e para terminar de retirar o etanol a placa foi centrifugada
invertida sobre um papel filtro a 750 rpm por 1 minuto. Para secagem da amostra a
placa foi submetida a 95º C por 2 minutos no termociclador. Em seguida, após retornar
a temperatura ambiente, foi adicionado 10 µL de formamida e colocado no
termociclador a 95ºC para desnaturação da fita de DNA. A placa foi então retirada do
40
termociclador e colocada imediatamente no gelo por 2 minutos. Em seguida foi
centrifugada a 750 rpm por 1 minuto e por fim submetida a leitura no aparelho (Apllied
Byosistem ABI3130®).
A análise da similaridade entre as sequências nucleotídicas determinadas foi
realizada utilizando-se o algoritmo BLAST do Centro Nacional de Biotecnologia e
Informação (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
4.3
Expressão de proteína CDα de fusão em E. coli
O plasmídeo pET23a/CDα foi transformado em células competentes E. coli
BL21 DE3 (pLysS), utilizando a mesma técnica descrita anteriormente, no entanto a
transformação foi plaqueada em meio LB ágar contendo ampicilina (200 µg/mL e
cloranfenicol (20 µg/ml). Após incubação de 18 a 24 horas colônias transformantes
foram inoculadas em LB caldo contendo Ampicilina (200 µg/mL) e cloranfenicol (20
µg/ml) para crescimento dos pré-inóculos, e também inoculados por 18 a 24 horas.
Posteriormente, 50µL desse pré-inoculo foi inoculado em 5 ml de meio LB caldo
contendo ampicilina (200 µg/mL e cloranfenicol (20 µg/ml) e incubados sob agitação a
37ºC. Assim que o crescimeto bacteriano chegou a O.D (520nm) de 0,6, foi retirado
uma alíquota de 1ml e acrescentado IPTG (Indutor) para concentração final igual a 0,4
mM à cultura que foi novamente incubada por 3 horas a 37ºC sob agitação. Ao final do
período, uma alíquota de 1 ml foi retirada para análise e juntamente com a alíquota
retirada antes da adição do IPTG foram centrifugadas a 5000g por 15 minutos a 4ºC. Foi
descartado o sobrenadante e acrescentado um volume de tampão de amostra para gel de
SDS suficiente para completar o volume para 100µL (CHO et al., 1985).
4.3.1 Expressão de proteína CDα em larga escala
Após o ensaio de expressão da proteína CDα, o clone bacteriano que melhor
expressava a proteína foi escolhido e inoculado em 2 tubos de 5 mL de meio LB
contendo ampicilina (100 µg/mL) e cloranfenicol (20 µg/ml) incubado por 24 horas a
37ºC sob agitação, para obtenção de um pré-inóculo. Após a incubação, o pré-inóculo
foi transferido para 2 frascos com 500 mL de meio LB (20µg/mL de cloranfenicol e
100µg/mL de ampicilina) incubando sob agitação a 37°C. Assim que o crescimento
bacteriano chegou a 0,6 O.D (520nM) foi adicionado 1mL de IPTG a 0,4 mM (indutor)
41
e a cultura foi incubada por mais 4 horas sob agitação a 37ºC. Após este período, a
cultura foi coletada em quatro tubos através de centrifugação a 5.000g por 10 minutos e
o sedimento obtido foi armazenado a -20ºC.
4.3.2 Purificação da proteína em condições desnaturantes
O sedimento bacteriano proveniente do procedimento anterior foi ressuspendido
em 10 ml de tampão de lise desnaturante pH 8.0 (8 M uréia , 20 mM fosfato de sódio,
500 mM NaCl) e incubado a temperatura ambiente (15-25ºC) por 60 minutos,
homogeneizando a cada 15 minutos. Após a incubação, o lisado foi centrifugado em
tubos cônicos a 10.000 g por 45 minutos a temperatura ambiente. O sobrenadante foi
transferido para tubo tipo falcon de 15mL. Uma alíquota de 20 µL foi retirada, acrescida
de tampão de amostra para gel de SDS-PAGE e estocado a -20ºC para posterior análise
em gel de SDS-PAGE. O sobrenadante foi transferido para uma coluna de Ni-NTA
Agarose (Qiagen®), ressuspendido na coluna e incubado por 60 minutos na geladeira.
Em seguida, o lacre da coluna foi aberto e todo o sobrenadante que não se ligou à
coluna foi coletado (filtrado) para posterior análise em SDS-PAGE. A coluna foi lavada
duas vezes com 4 ml de tampão de lavagem (o mesmo tampão de lise, mas o pH foi
tamponado para 6.3), todo o material da lavagem foi coletado para análise em gel de
SDS-PAGE (lavado). Após a lavagem, foi feita a eluição da proteína aderida à coluna
aplicando 1 ml de tampão de eluição (tampão de lise, mas o pH foi tamponado para 4.5)
duas vezes seguidas. Todo o filtrado foi coletado em tubo tipo eppendorf e separado
uma alíquota de 20µL para a análise em gel de SDS-PAGE. Após a purificação, todas as
frações de proteínas foram analisadas em SDS-PAGE.
4.3.3 Gel de SDS-PAGE
A partir de cada etapa da purificação descrita anteriormente, foi retirado uma
alíquota de 10µL às quais foram misturadas com 10µL de tampão de amostra. Em
seguida as amostras foram fervidas por 5 minutos para desnaturação e aplicadas em gel
SDS-PAGE a 12%. O gel foi submetido à eletroforese, a 80 volts e a 100 mA. Após as
amostras entrarem no gel de resolução, a voltagem foi aumentada para 100 volts até o
final da corrida.
42
Para determinar a concentração da proteína recombinante purificada, foi feito
uma diluição seriada de fator 2 (começando em 1/2 e terminando em 1/16) em água
Tipo 1 e o mesmo com albumina sérica bovina (começando em 2µg de proteína e
chegando a 0.25 µg), e essas diluições foram aplicadas em gel SDS-PAGE 12% e
tiveram suas bandas comparadas para se chegar a concentração final da proteína CDα.
4.3.4 Espectrometria de Massa – MALDI-TOF MS
A proteína recombinante purificada foi ressuspendida em 200 µL de NH4HCO3
(bicarbonato de amônia) a 25 mM, após a solução foi adicionada a uma coluna de
ultracentrifugação Amicom (Merck Millipore®) e adotadas as recomendações do
fabricante, para retirada do excesso de sais e obtenção de amostra em maior grau de
pureza e mais concentrada. A seguir foram adicionados 25 µL do detergente RapiGest
SF a 0,2% e a solução foi aquecida a 80 °C por 15 minutos. A amostra foi centrifugada
e 2,5 µL de ditiotreitol a 100mM foram adicionados. Em seguida, incubada a 60°C por
30 minutos e ao final novamente centrifugada. A seguir foram adicionados 2,5 µL de
iodoacetamida a 300 mM e a amostra foi mantida no escuro durante 30 minutos. Junto à
mistura resultante adicionou-se 3 µL de tripsina a 50 ng/µL (Promega®) em tampão
bicarbonato de amônia a 50 mM e incubado a 37 °C por 3 horas. Após a digestão, foram
adicionados 10 µL de ácido trifluoroacético a 5% e a mistura foi agitada por vórtex. As
amostras foram incubadas a 37 °C por 60 minutos e ao final desse período centrifugadas
e concentrada em SpeedVac. Por fim, foi ressuspendida em 10µL de solução contendo
0,01% de ácido trifluoroacético (TFA) e 50% de acetonitrila (ACN).
Para análise, 1µL de amostra foi adicionada a placa, juntamente com 1µL de
matriz (previamente diluída em solução de ácido trifluoroacético (TFA) 0,01%
acetonitrila (ACN) 50%), deixou-se secar a temperatura ambiente e em seguida
analisamos a amostra no sistema MALDI-TOF MS (WATERS®)
4.4
Imunização de camundongos com a proteína recombinante CDα
Após ser realizada a purificação da proteína recombinante CDα, iniciou-se os
experimentos de imunização de camundongos para obtenção de anticorpos anti-CDα.
Um grupo de 4 camundongos BALB/c foram imunizados por via subcutânea por três
vezes, com intervalo de 15 dias. Na primeira imunização a dose vacinal foi de 100 µL
43
contendo 40 µg da proteína purificada e 50 µL de adjuvante completo de Freud, na
segunda e terceira imunizações foi utilizado uma dose vacinal de 100µL com 40µg de
proteína e 50 µL de adjuvante incompleto de Freud. Após 15 dias da terceira
imunização foi coletado o soro dos camundongos, que foi centrifugado a 2500 rpm por
10 minutos e o soro foi aliquotado e armazenado a -20ºC.
4.5
Ensaio Imuno-Enzimático com a Proteína recombinante CDα
4.5.1 Reação de ELISA
A padronização do ELISA foi realizada com duas concentrações de antígenos:
5µg/mL e 10µg/mL. Já as diluições das amostras de soros foram: 1:5, 1:10, 1:20, 1:40.
Foi utilizado pool de soros de pacientes com tuberculose pulmonar ativa (TB+), pool de
soros de indivíduos positivos na prova tuberculínica (PPD+) e pool de soros de
indivíduos negativos na prova tuberculínica (PPD-) para verificar as diluições ideais dos
soros. Foram utilizados três controles para o ensaio imunoenzimático: branco (contendo
todos os componentes do ensaio, exceto bloqueio e anticorpo), controle do conjugado
(contendo todos os reagentes do ensaio, exceto o anticorpo primário) e controle do
bloqueio (contendo todos os reagentes do ensaio, exceto o antígeno). Os anticorpos
utilizados foram: anti-IgG- anticorpo monoclonal de coelho, anti-IgG humana
conjugado com peroxidade (IgG-HRP, Sothern Biotechnology®), diluídos 1:10.000.
4.5.2 ELISA com soro de camundongos vacinados
Inicialmente uma placa com 96 poços foram sensibilizadas com 50μL por poço
de proteína CDα a 10 μg/ml em tampão carbonato-bicarbonato (15 mM Na2CO3, 35mM
NaHCO3, pH 9,6). As placas foram incubadas por 18 horas a 4°C. O volume foi
desprezado por inversão das placas e em seguida adicionado 100μL de tampão de
bloqueio (tampão carbonato-bicarbonato e 0.5% gelatina) e incubado por 2 horas a
37°C. O conteúdo da placa foi então desprezado por inversão e adicionado 100 µL de
PBS por poço para lavar. Em seguida, os soros dos camundongos foram diluídos em
tampão de diluição (PBS com 0.05% de gelatina) numa concentração de 1:1.000,
1:10.000, 1:20.000, 1:40.000 e adicionados 50 µL dessas diluições à placa. Foi feita
uma incubação por 2 horas a 37°C e em seguida lavado seis vezes com tampão de
44
lavagem (PBS 0,05% Tween 20). O anticorpo secundário, anti-IgG1 e anti-IgG2a foi
diluído em tampão de diluição numa concentração de 1:5.000. Foi utilizado o anticorpo
anti-IgG 1 de camundongo (Southern Biotechnology®) e anti-IgG 2a de camundongo
(Southern Biotechnology), ambos biotinilados. A incubação foi feita por 1 hora a 37ºC e
em seguida lavado seis vezes com tampão de lavagem. Posteriormente foi adicionado
50 µL de avidina peroxidase diluída 1:10.000 e incubado por 1 hora a 37ºC, sendo
posteriormente lavado seis vezes com tampão de lavagem. Por fim, a revelação foi feita
com 50 µL de tampão citrato-fosfato
(0,05 M Na3C6H5O7.2H2O; 0,05M
Na2H2PO4.H2O) contendo 1mg/ml de OPD (o-Phenylenediamine) e 4μL de H2O2 20
volumes. A reação foi finalizada com H2SO4 1:20 e a leitura feita a 520 nm leitora de
ELISA.
45
5 RESULTADOS
5.1
Desenho de oligonucleotídeos iniciadores e análise “in silico” da
construção da fusão gênica Ag85c-MPT51-HspX (CDα)
Os softwares utilizados permitiram a simulação de todos os experimentos de
clonagem e construção da fusão gênica realizada, propiciando avaliar, confirmar e
redefinir estratégias de construções de vetores. Além disso, permitiram o desenho
correto de oligonucleotídeos iniciadores capazes de amplificar as subunidades gênicas
desejadas e ainda possibilitaram a inserção de sítios de enzimas de restrição (Tabela I e
Figura 6) que possibilitaram a fusão das subunidades, bem como a adição da sequência
hinge de glicina e serina (Tabela I e Figura 6) que separa as subunidades da fusão. A
predição da estrutura terciária da proteína também possibilitou a avaliação dos epítopos
e determinantes antigênicos expostos (Figura 8).
Tabela 1. Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados nesse trabalho e
seus respectivos amplicons esperados.
Antígenos
Sequência 5’- 3’dos oligonucleotídeos iniciadores *
Ag85c
acggggatccgacacctacgcggccgacggtg
Ag85cNH+
gcatgtgctcaacggcgcgacaggcagcggcagcggcgctagcatg
Ag85cCOO
Amplicon Ag85c acggggatccgacacctacgcggccgacggtggacgcaacggggtgttt
aacttcccgcccaacggaacacactcgtggccctactggaacgagcagc
(169 pb)
tggtcgccatgaaggccgatatccagcatgtgctcaacggcgcgacagg
cagcggcagcggcgctagcatg
MPT51
MPT51NH+
MPT51COOAmplicon MPT51
(213 pb)
HspX
HspXNH+
HspXCOOAmplicon HspX
(170 pb)
gcttctagagccccatacgagaacc
ggcgggcaaggggatttcgggcagcggcagcggcctcgagatc
gcttctagagccccatacgagaacctgatggtgccgtcgccctcgatgg
gccgggacatcccggtggccttcctagccggtgggccgcacgcggtgta
tctgctggacgccttcaacgccggcccggatgtcagtaactgggtcacc
gcgggtaacgcgatgaacacgttggcgggcaaggggatttcgggcagcg
gcagcggcctcgagatc
gctctcgaggtccgcgatggtcagctgacc
ggccacctacgacaagggcgcggccgcatg
gctctcgaggtccgcgatggtcagctgaccatcaaggccgagcgcaccg
agcagaaggacttcgacggtcgctcggaattcgcgtacggttccttcgt
tcgcacggtgtcgctgccggtaggtgctgacgaggacgacattaaggcc
acctacgacaagggcgcggccgc
* Nucleotídeos em negrito correspondem a sequências palindrômicas alvo de enzimas
de restrição. Nucleotídeos em itálico correspondem a sequência hinge que separa as
subunidades da proteína de fusão. Nucleotídeos sublinhados correspondem a regiões
dos oligonucleotídeos iniciadores homólogas aos genes alvos.
46
catatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatccgacacctacgcggcc
H M A S M T G G Q Q M G R G S D T Y A A
gacggtggacgcaacggggtgtttaacttcccgcccaacggaacacactcgtggccctac
D G G R N G V F N F P P N G T H S W P Y
tggaacgagcagctggtcgccatgaaggccgatatccagcatgtgctcaacggcgcgaca
W N E Q L V A M K A D I Q H V L N G A T
ggcagcggcagcggcgctagagccccatacgagaacctgatggtgccgtcgccctcgatg
G S G S G A R A P Y E N L M V P S P S M
ggccgggacatcccggtggccttcctagccggtgggccgcacgcggtgtatctgctggac
G R D I P V A F L A G G P H A V Y L L D
gccttcaacgccggcccggatgtcagtaactgggtcaccgcgggtaacgcgatgaacacg
A F N A G P D V S N W V T A G N A M N T
ttggcgggcaaggggatttcgggcagcggcagcggcctcgaggtccgcgatggtcagctg
L A G K G I S G S G S G L E V R D G Q L
accatcaaggccgagcgcaccgagcagaaggacttcgacggtcgctcggaattcgcgtac
T I K A E R T E Q K D F D G R S E F A Y
ggttccttcgttcgcacggtgtcgctgccggtaggtgctgacgaggacgacattaaggcc
G S F V R T V S L P V G A D E D D I K A
acctacgacaagggcgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactga
T Y D K G A A A L E H H H H H H *
Figura 7. Sequência final do gene CDα e sequência de nucleotídeos gerados pela
expressão no contexto do plasmídeo pET23a. Nucleotídeos em negrito são as regiões
correspondentes as sequências resultantes da digestão pelas enzimas de restrição.
Nucleotídeos em itálico correspondem à sequência hinge que separa as subunidades da
proteína de fusão.
Figura 8. Predição da estrutura terciária da proteína CDα. A predição foi feita através
do programa Phyre2, que utiliza o modelamento por homologia.
47
5.2
Construção da sequência gênica da proteína CDα
A reação de PCR (PCR1) resultou na amplificação das sequências gênicas
esperadas de cada subunidade: Ag85C do nucleotídeo 168 ao 33; MPT51 do
nucleotídeo 936 ao 757; HspX do nucleotídeo 208 ao 361. As amplificações dos genes
Ag85c e do MPT51 resultaram, também, na criação de cinco códons para os
aminoácidos Gli/Ser/Gli/Ser/Gli nas extremidades correspondentes às porções
carboxiterminal (COO-) do Ag85c e da subunidade MPT51, correspondente a sequência
hinge. Além disso, os oligonucleotídeos iniciadores permitiram a criação de sítios para
enzimas de restrição que possibilitaram a posterior digestão e criação de extremidades
coesivas que foram utilizadas em uma reação de ligação dos produtos gênicos
amplificados. Por fim, para possibilitar a expressão heteróloga em fase correta
nucleotídeos extras foram inseridos na sequência, pelos oligonucleotídeos iniciadores.
Dessa forma,
os amplicons esperados foram de 169 pares de base para o Ag85c, 213 para
MPT51 e 170 pares de base para a subunidade do HspX (Figura 9A).
Após evidenciação do inserto, foi feito uma digestão dos produtos de PCR com
as enzimas de restrição específicas (Dg1), que tornaram as extremidades das
subunidades coesivas. Um sistema de ligação (SL1) foi montado com cada amplicon
previamente digerido (Ag85c-NheI; XbaI-MPT51-XhoI; XhoI-HspX). Após a reação de
ligação, os oligonucleotídeos iniciadores Ag85NH+ e HspXCOO- forma utilizados em uma
reação de polimerase em cadeia (PCR2) no intuito de amplificar a sequência completa
da proteína de fusão, resultando em um amplicom de 528 pares de base (Figura 9B).
O produto de PCR correspondente à sequência gênica da proteína CDα foi
inserido em um sistema de ligação (SL2) para inserção do mesmo em um plasmídeo de
clonagem (pGEM-T). Esse sistema de ligação foi transformado por eletroporação em
um vetor de clonagem (E. coli XL1-Blue), para que fosse possível pudéssemos
selecionar o plasmídeo recombinante. Clones recombinantes da transformação tiveram
seu plasmídeo extraído, por lise alcalina, e digerido com endonucleases específicas
(BamHI-Ag85c; HspX-NotI), evidenciando, por fim, uma banda de 517 pares de base
correspondente à sequência da proteína CDα e outra banda de 3000 pares de base
correspondente ao plasmídeo pGEM-T (Figura 9C).
O DNA da sequência gênica foi então eluído do gel e utilizado em um sistema
de ligação com o plasmídeo pET23a (SL3). Os sítios da enzima de restrição BamHI na
porção aminoterminal (NH+) do gene Ag85c e sítios para a enzima de restrição NotI na
48
porção COO- do gene HspX auxiliaram na clonagem em fase no vetor de expressão
pET23a, de forma que o plasmídeo também foi digerido com as mesmas enzimas. Esse
sistema de ligação foi transformado por eletroporação em XL1-Blue para seleção do
plasmídeo com o inserto. Para a confirmação de que os plasmídeos extraídos continham
a sequência gênica da CDα, o mesmo foi extraído por lise alcalina e digerido com
enzimas BamHI e NotI para evidenciação do inserto e confirmação da construção final
pET23a/CDα (Figura 9D)
A
B
C
D
Figura 9. Etapas da construção da sequência gênica da proteína CDα. A, Amplificação
das subunidades gênicas que deram origem à proteína de fusão CDα, correspondentes a
uma subunidade de 169pb do Ag85c, 213pb do MPT51 e 170 pb do HspX. B,
Amplificação da fusão gênica da proteína CDα com amplicom de 528pb. C, Digestão e
separação da sequência gênica da proteína CDα (517pb) do plasmídeo de clonagem
pGEM-T easy (3000pb). D, Digestão e confirmação da inserção do gene da proteína
CDα (517pb) no plasmídeo de expressão pET23a (3665pb). O marcador utilizado foi de
100 pares de base.
49
5.3
Análise constitucional: Sequênciamento do plasmídeo pET23a/CDα e
Espectrometria de Massa (MALDI-TOF MS) da proteína CDα
Para confirmar a correta constituição da proteína de fusão, primeiro sequenciou-
se o plasmídeo pET23a contendo a sequência gênica da proteína CDα, o resultado do
sequênciamento foi alinhado com a construção “in silico” da proteína com objetivo de
avaliar toda a sequência da proteína de fusão, além de verificar as regiões
correspondentes as ligações entre as subunidades e as regiões das sequência hinge.
Também foi possível verificar se a sequência estava em fase correta para ser expressa
no vetor pET23a, para uma transcrição e tradução sem erros. A análise da homologia
entre as sequência nucleotídicas, realizada por meio do BLAST indicou que a
ssequência nucleotídica da proteína estava na correta ORF (do inglês, open reading
frame) e que não haviam mutações.
Por conseguinte, após a purificação da proteína,foi realizada uma espectrometria
de massa através de ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF),
após digestão tríptica da proteína e a análise da espectrometria, foi possível confirmar a
constituição da proteína com cobertura de 68,37% dos aminoácidos, com cobertura total
das regiões das sequência hinge e ligações das subunidades (Figura 10).
50
51
Figura 10. Espectro de Massa Molecular (MALDI-TOF/MS). Os picos marcados com asterísco representam peptídios da proteína CDα obtidos
por sua digestão tríptica
5.4
Expressão da CDα em E. coli.
Utilizando a cepa de E. coli BL21 foi possível verificar bandas compatíveis com
a superexpressão da proteína CDα, proteína com peso molecular estimado em 20 kDa).
Dessa forma através de uma indução inicial em pequena escala foi possível escolher a
colônia que melhor expressava a proteína para se fazer a indução e purificação em larga
escala, correspondente as faixas 13 (sem indutor) e 14 (com indutor) conforme a Figura
11.
Foram realizadas duas induções de 500 L de cultura bacteriana contendo a
colônia que melhor expressou a proteína CDα, com a finalidade de purificá-la.
Posteriormente, as bactérias foram lisadas com tampão contendo uréia, para solubilizar
a proteína de interesse, sendo que o produto da indução foi verificado através de um gel
de SDS (Figura 12). A purificação foi feita por meio de uma coluna de afinidade
contendo níquel. Os eluatos obtidos continham a proteína recombinante, o que foi
observado em gel de SDS-PAGE. A partir de 125 mL de cultura bacteriana, foi possível
purificar boa parte da proteína recombinante produzida na indução. No entanto grande
quantidade de proteína foi perdida no processo de purificação, por não se aderir a
coluna e permanecer no filtrado ou sair com as lavagens (Figura 13). A quantificação de
proteína indicou uma concentração de 3,2 mg/mL, tendo um rendimento final em torno
de 25 mg de proteína CDα com 1 litro de indução (Figura 14).
Figura 11. Teste de indução da proteína CDα , gel de SDS-PAGE a 12%. Sete colônias
foram escolhida a partir da transformação do plasmídeo pET23a/CDα. O teste de
indução foi feito na presença (faixas ímpares) e na ausência (faixas pares) de IPTG e a
colônia com melhor expressão na presença do indutor foi escolhida para a indução em
larga escala (colônia 7, faixas 13 e 14). Controle negativo da indução, bactéria sem
plasmídeo (faixa 15 e 16). Marcador de peso molecular na faixa M.
52
Figura 12. Indução em larga escala, gel de SDS-PAGE a 12% da proteína CDα. A
colônia 7 foi inoculada em 2 frascos de 500 mL, e a adição de IPTG induziu grande
quantidade de expressão de proteína CDα (Frasco 1, faixa 1 sem IPTG e faixa 2 com
IPTG; Frasco2, faixa 3 sem IPTG e faixa 4 com IPTG). A faixa M corresponde ao
marcador de peso molecular.
Figura 13. Purificação da proteína em condições desnaturantes. A faixa 1 corresponde à
quantidade de proteína total do lisado. A faixa 2 e 3 correspondem ao filtrado que não
aderiu à coluna de níquel. A faixa 4 e 5 correspondem à proteína perdida através da
lavagem da coluna. A faixa 6 e 7 correspondem ao purificado final da proteína. A faixa
M corresponde ao marcador de peso molecular.
53
Figura 14. Quantificação da proteína CD α. A proteína purificada foi quantificada
através de diluição seriada (1/2 faixa 1, 1/4 faixa 2, 1/8 faixa 3, 1/16 faixa 4 e 1/32 faixa
5) e comparada com uma diluição seriada de albumina sérica bovina (2 µg de BSA na
faixa 6, 1 µg de BSA na faixa 7, 0,5 µg de BSA na faixa 8 e 0,25 µg de BSA na faixa
9). A faixa 4 da proteína CDα equivale à faixa 6 do BSA, que indica uma concentração
de 3,2 mg/mL de CDα. A faixa M corresponde ao marcador de peso molecular.
Por fim, parte da proteína purificada teve o tampão de eluição contendo 8M de
uréia trocado por tampão HEPES para análises posteriores. As frações obtidas dessa
dessanilização foram fracionadas em SDS-PAGE para ser verificado em qual delas está
presente a proteína CDα. Após a dessanilização foi verificada uma perda de até 90%
comparada ao rendimento inicial (Figura 15).
Figura 15. Gel de SDS-PAGE a 12% da dessalinização da proteína CDα. O tampão
uréia em que a proteína foi purificada foi substituído por diálise pelo tampão HEPES, o
que causou grande quantidade de precipitação da proteína (CDα insolúvel) e um
rendimento final em torno 10% de proteína solúvel. A faixa M corresponde ao marcador
de peso molecular.
54
5.5
Padronização do ELISA para CDα
Na figura 16 está apresentado os resultados da padronização do ELISA para
detecção de anticorpos séricos anti a proteína recombinante CDα. De acordo com o
gráfico, a proteína CDα é pouco antigênica mesmo nas concentrações mais altas de
antígenos e anticorpos, tendo leitura de O.D inferiores a 0,600 mesmo com pool de
indivíduos com tuberculose (TB+) frente a sensibilização de 10 µg/mL. Quanto a
padronização das diluições do soro, como pode ser observado nos resultados, a diluição
do soro a 1/5 foi a única que permitiu melhor distinção entre os grupos. Quanto à
concentração do antígeno a ser usado na placa, entre 1 µg/mL (Figura 16C), 5 µg/mL
(Figura 16B), e 10 µg/mL (Figura 16A), as concentrações de 5 µg/ml e 10 µg/ml
permitiram distinguir os grupos pesquisados, no entanto, quando utilizada a
concentração de 10 µg/mL houve melhor distinção entre os grupos TB+ dos grupos
PPD+ e PPD-. Por fim, em qualquer das diluições de soro e concentração de antígeno
não houve diferença entre os grupos PPD+ e PPD-.
Figura 16. Padronização da quantidade antígeno e diluição do soro para utilização da
proteína CDα, em ensaio de imunoenzimático. A, ensaio realizado com concentração de
10 µg/mL de antígeno e soro de pacientes TB+, PPD+ e PPD- diluído 1/5, 1/10, 1/20 e
1/40. B, Padronização com a concentração de antígeno de 5 µg/mL. C, Padronização
com a concentração de antígeno 1 µg/mL de antígeno.
55
5.6
Produção e titulação de anticorpos anti-CDα
A produção de anticorpos policlonais foi feita por imunização de camundongos
BALB/c por via subcutânea com três doses de proteína CDα. Após as 3 doses das
vacinas, os animais imunizados apresentaram quantidades significativas de anticorpos,
confirmando a imunogenicidade humoral em camundongos com uma titulação de soro
de 20.000 para a proteína CDα. (figura 17).
2 .0
Ig G 2 a
Ig G 1
O .D .
1 .5
1 .0
0 .5
0 .0
1 /1 0 0 0
1 /1 0 0 0 0
1 /2 0 0 0 0
1 /4 0 0 0 0
Figura 17. Titulação de anticorpos anti-CDα. A proteína CDα foi detectada até
diluições de 1/20.000 tanto de IgG1 quanto de IgG2a.
56
6 DISCUSSÃO
Em nosso trabalho, utilizamos para a construção da proteína CDα uma sequência
hinge composta por 5 aminoácidos glicinas e serina alternados (Gly-Ser-Gly-Ser-Gly).
Dessa maneira objetivamos obter uma sequência com maior estabilidade para a proteína
de fusão e que não permitisse que uma subunidade se dobre sobre a outra. Dipti e et al,
em seu trabalho de 2006, utilizaram essa mesma sequência “hinge” para construção de
uma proteína de fusão para diagnóstico de hepatite C, obtendo uma proteína final com
sensibilidade de 100% e especificidade de 99,8% para todos os genótipos conhecidos de
HCV (vírus da hepatite C humana), indicando que a sequência possibilitou o
dobramento da proteína mas impedindo que um determinante antigênico se dobrasse
sobre o outro. No entanto, nós não analisamos a estabilidade da proteína, a análise
dessas características são importantes desde o ponto de vista da produção da proteína de
fusão até na sua conformação final uma vez que sua estabilidade não foi analisada em
condições fisiológicas nem em diferentes concentrações de sais e em diferentes pH,
podendo ter variações conformacionais sob diferentes condições.
A superexpressão da proteína CDα, a partir do promotor do fago T7 foi por
outro lado, um fator determinante na formação de corpos de inclusão e um obstáculo na
obtenção da proteína CDα de forma solúvel. Apesar de termos conseguido quantidades
consideráveis de proteína (3,2 mg/mL), isso se deu apenas quando a purificamos sobre
condições desnaturante, sendo que a renaturação da proteína através da dessalinização
do tampão em que ela se encontrava provocou grande quantidade de precipitação. Isso
provavelmente ocorreu devido a regiões hidrofóbicas da proteína CDα estarem expostas
antes da conformação final da proteína estar completa, permitindo a agregação dessas
proteínas e posterior deposição (CARRIO; VILLAVERDE, 2002; SORENSEN;
MORTENSEN, 2005b).
Outro fator associado à precipitação da proteína e à dificuldade de obtê-la em
sua forma solúvel está em sua composição de aminoácidos, uma vez que existem
regiões de aminoácidos que em proteínas normais (que não são de fusão) estariam
escondidas dentro da forma terciária da proteína mas quando estão expostos permitem a
interação entre as proteína e consequente agregação (CARRIO; VILLAVERDE, 2001),
e dessa por esse motivo provavelmente não conseguimos realizar a renaturação eficiente
da proteína CDα por desalinização, tendo perdas consideráveis de aproximadamente
57
90% de proteína insolúvel. Por fim, ainda existem várias opções de protocolo para se
renaturar uma proteína ou para obtê-la diretamente em sua forma solúvel. A produção
de proteína solúvel exige tempo, uma vez que se baseia em tentativa e erro, pois ao se
desenhar uma proteína de fusão, não temos como precisar as interações intra e
intermoleculares entre os aminoácidos e os protocolos de expressão e purificação
precisam ser adaptados para cada proteína. Dessa forma, em experimentos futuros,
procuraremos maneiras diferentes de produzir a proteína CDα em sua forma solúvel,
induzindo a proteína em condições variáveis de temperatura e IPTG, diminuindo a
formação de corpúsculos de inclusão e facilitando a produção da proteína em sua forma
terciária.
Os Linfócitos B são responsáveis pela imunidade humoral, ou seja, pelo
reconhecimento do antígeno e produção de anticorpos capazes de interagir com o
antígeno. Esses anticorpos são produzidos frente à exposição ao antígeno e reconhecem
partes específicas da molécula antigênica e não ela toda. Nesse contexto surge o
conceito de determinante antigênico conformacionais, ou seja, regiões da molécula
antigênica reconhecida por anticorpos, mas que apenas estão presentes se a molécula
antigênica tiver sua conformação terciária preservada (KRINGELUM et al., 2013).
Por conseguinte, ao construirmos a proteína CDα utilizamos vacinologia reversa
e não levamos em consideração a conservação dos determinantes antigênicos
estruturais, apenas os constitucionais da proteína CDα o que se refletiu na incapacidade
da proteína interagir eficientemente com anticorpos de pacientes com tuberculose ativa
(TB+) ou com tuberculose latente (PPD+), desse ponto de vista, a proteína de fusão
recombinante não se prestou para ser utilizada em testes diagnósticos. Gowthaman et al
(2011) em seu trabalho com o peptídeo 91 a 110 da proteína HspX também não
encontraram anticorpos específicos contra esse epítopo em pacientes TB+ ou PPD+, no
entanto nenhum outro trabalho avaliou as subunidades do Ag85c e do MPT51,
utilizadas por nós, quanto ao seu potencial antigênico frente ao soro de pacientes TB+,
PPD+ ou PPD-. Anticorpos específicos contra micobactérias, ao não interagirem com a
proteína CDα indicam potencial vacinal ainda maior, uma vez que a resposta imune
contra essas micobactérias é uma das hipóteses para a ineficiência da BCG, e essa
resposta não afetará indivíduos vacinados com a CDα (CAYABYAB; MACOVEI;
CAMPOS-NETO, 2012). Além disso, o fato da proteína não ser antigênica faz com que
a resposta imune contra tuberculose não a neutralize ou destrua antes dela induzir uma
resposta imune, abrindo caminho para que ela seja usada em outras estratégias vacinais,
58
como por exemplo, uma vacina para auxiliar (melhorar ou acelerar) o tratamento contra
o Mtb (ORME, 2013).
A proteína de fusão recombinante apresentou caráter imunogênico quando
utilizada em camundongos para obtenção de anticorpos, apresentando altos níveis de
anticorpos específicos o que demonstra que apesar de ela não ser capaz de interagir com
a resposta imune humoral gerada pela infecção com Mtb, ela apresenta outros
determinantes antigênicos estruturais, capaz de interagir com o sistema imune e gerar
resposta imune humoral eficientemente. No entanto, mais estudos precisam ser feitos
para avaliar se os determinantes antigênicos constitucionais e estruturais gerados pela
junção das subunidades são capazes de induzirem resposta imune humoral, e se esta
resposta é capaz de neutralizar o Mtb assim como se uma resposta imune celular robusta
pode ser gerada uma vez que ela é a mais importante no combate ao bacilo e motivo
pelo qual a proteína CDα foi construída.
59
7 CONCLUSÕES
A utilização de técnicas de predição e estudo prospectivo "in silico" possibilita a
antecipação de problemas e o ajuste de estratégias utilizadas na pesquisa. Com base em
estudos da literatura e análises computacionais construímos uma proteína de fusão a
partir de subunidades de antígenos imunodominantes do Mycobacterium tuberculosis
com finalidade de desenvolver uma proteína com potencial imunogênico, de resposta
imunológica do tipo Th1 e principal ativação de células T CD8+ de diversos subtipos.
Essa proteína teve sua sequência gênica construida a partir das subunidades
gênicas amplifica de cada proteína, e os oligonucleotídeos iniciadores desenhados
permitiram a criação de sítios de enzimas de restrição para tornar uma subunidade
coesiva a outra. Além disso, os oligonucleotídeos iniciadores também permitiram a
inserção de uma sequência hinge composta de 5 aminoácidos glicina e serina alternados
entre cada subunidade possibilitando uma maior estabilidade à estrutura final da
proteína.
A proteína foi produzida a partir de expressão heteróloga em E. coli BL21 e não
apresentou erros ou mutações constitucionais, no entanto não foi possível obtê-la em
sua forma solúvel e experimentos posteriores precisam ser realizados para tal.
A CDα apresentou capacidade reduzida de interagir com anticorpos de
indivíduos com tuberculose ativa ou latente, sendo pouco antigênica. Ademais,
camundongos imunizados foram capazes de produzir anticorpos tanto do tipo IgG1 e
IgG2a contra a proteína, indicando um potencial imunogênico.
Por fim, estudos utilizando modelos animais e adjuvantes menos potentes que o
adjuvante de Freud, serão feitos para verificar a real capacidade imunogênica e
protetora da proteína CDα contra o Mycobacterium tuberculosis. A imunogenicidade
será avaliada, por citometria de fluxo, quanto a sua capacidade induzir resposta imune
celular por céluas T CD4+ e T CD8+ e a proteção será avalidada quanto à capaciade de
diminuir a patogenia da infecção causada pelo bacilo e a carga bacilar nos órgãos de
camundongos infectados.
60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AARON, L.; SAADOUN, D.; CALATRONI, I.; LAUNAY, O.; MEMAIN, N.;
VINCENT, V.; MARCHAL, G.; DUPONT, B.; BOUCHAUD, O.; VALEYRE, D.;
LORTHOLARY, O. Tuberculosis in HIV-infected patients: a comprehensive review.
Clin Microbiol Infect, v. 10, n. 5, p. 388-398, 2004.
ABOU-ZEID, C.; RATLIFF, T. L.; WIKER, H. G.; HARBOE, M.; BENNEDSEN, J.;
ROOK, G. A. Characterization of fibronectin-binding antigens released by
Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG. Infect Immun, v. 56, n.
12, p. 3046-3051, 1988.
ACHKAR, J. M.; DONG, Y.; HOLZMAN, R. S.; BELISLE, J.; KOURBETI, I. S.;
SHERPA, T.; CONDOS, R.; ROM, W. N.; LAAL, S. Mycobacterium tuberculosis
malate synthase- and MPT51-based serodiagnostic assay as an adjunct to rapid
identification of pulmonary tuberculosis. Clin Vaccine Immunol, v. 13, n. 11, p. 12911293, 2006.
ALEXANDER, J.; FIKES, J.; HOFFMAN, S.; FRANKE, E.; SACCI, J.; APPELLA,
E.; CHISARI, F. V.; GUIDOTTI, L. G.; CHESNUT, R. W.; LIVINGSTON, B.;
SETTE, A. The optimization of helper T lymphocyte (HTL) function in vaccine
development. Immunol Res, v. 18, n. 2, p. 79-92, 1998.
ALVES, S. L.; METZKER, F. S.; ARAUJO-FILHO, J. A.; JUNQUEIRA-KIPNIS, A.
P.; KIPNIS, A. Clinical data and molecular analysis of Mycobacterium tuberculosis
isolates from drug-resistant tuberculosis patients in Goias, Brazil. Mem Inst Oswaldo
Cruz, v. 106, n. 6, p. 655-661, 2011.
ANDERSEN, D. C.; KRUMMEN, L. Recombinant protein expression for therapeutic
applications. Curr Opin Biotechnol, v. 13, n. 2, p. 117-123, 2002.
ANDERSEN, P.; MUNK, M. E.; POLLOCK, J. M.; DOHERTY, T. M. Specific
immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet, v. 356, n. 9235, p. 1099-1104, 2000.
ANDERSEN, P.; DOHERTY, T. M. The success and failure of BCG - implications for
a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews Microbiology, v. 3, n. 8, p. 656-662,
2005.
AOSHI, T.; SUZUKI, M.; UCHIJIMA, M.; NAGATA, T.; KOIDE, Y. Expression
mapping using a retroviral vector for CD8+ T cell epitopes: definition of a
Mycobacterium tuberculosis peptide presented by H2-Dd. J Immunol Methods, v. 298,
n. 1-2, p. 21-34, 2005.
61
AOSHI, T.; NAGATA, T.; SUZUKI, M.; UCHIJIMA, M.; HASHIMOTO, D.; RAFIEI,
A.; SUDA, T.; CHIDA, K.; KOIDE, Y. Identification of an HLA-A*0201-restricted Tcell epitope on the MPT51 protein, a major secreted protein derived from
Mycobacterium tuberculosis, by MPT51 overlapping peptide screening. Infect Immun,
v. 76, n. 4, p. 1565-1571, 2008.
ARAUJO-FILHO, J. A.; VASCONCELOS-JR, A. C.; SOUSA, E. M.; SILVEIRA, C.;
RIBEIRO, E.; KIPNIS, A.; JUNQUEIRA-KIPNIS, A. P. Extensively drug-resistant
tuberculosis: a case report and literature review. Braz J Infect Dis, v. 12, n. 5, p. 447452, 2008a.
ARAUJO-FILHO, J. A.; VASCONCELOS JR, A. C.; SOUSA, E. M.; SILVEIRA, C.;
SOUSA, P. T.; SEVERO, K. A.; VIEIRA, L. F.; KIPNIS, A.; JUNQUEIRA-KIPNIS,
A. P. Multidrug-resistant tuberculosis: case reports study in a central state of Brazil.
Braz J Infect Dis, v. 12, n. 1, p. 94-98, 2008b.
ARMITIGE, L. Y.; JAGANNATH, C.; WANGER, A. R.; NORRIS, S. J. Disruption of
the genes encoding antigen 85A and antigen 85B of Mycobacterium tuberculosis
H37Rv: effect on growth in culture and in macrophages. Infect Immun, v. 68, n. 2, p.
767-778, 2000.
ARONSON, N. E.; SANTOSHAM, M.; COMSTOCK, G. W.; HOWARD, R. S.;
MOULTON, L. H.; RHOADES, E. R.; HARRISON, L. H. Long-term efficacy of BCG
vaccine in American Indians and Alaska Natives: A 60-year follow-up study. JAMA, v.
291, n. 17, p. 2086-2091, 2004.
AWATE, S.; BABIUK, L. A.; MUTWIRI, G. Mechanisms of action of adjuvants.
Front Immunol, v. 4, n., p. 114, 2013.
BACKUS, K. M.; BOSHOFF, H. I.; BARRY, C. S.; BOUTUREIRA, O.; PATEL, M.
K.; D'HOOGE, F.; LEE, S. S.; VIA, L. E.; TAHLAN, K.; BARRY, C. E., 3RD;
DAVIS, B. G. Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium
tuberculosis. Nat Chem Biol, v. 7, n. 4, p. 228-235, 2011.
BALASINGHAM, S. V.; DAVIDSEN, T.; SZPINDA, I.; FRYE, S. A.; TONJUM, T.
Molecular diagnostics in tuberculosis: basis and implications for therapy. Mol Diagn
Ther, v. 13, n. 3, p. 137-151, 2009.
BEHAR, S. M.; DASCHER, C. C.; GRUSBY, M. J.; WANG, C. R.; BRENNER, M. B.
Susceptibility of mice deficient in CD1D or TAP1 to infection with Mycobacterium
tuberculosis. J Exp Med, v. 189, n. 12, p. 1973-1980, 1999.
62
BEHAR, S. M. Antigen-specific CD8(+) T cells and protective immunity to
tuberculosis. Adv Exp Med Biol, v. 783, n., p. 141-163, 2013.
BEHR, M. A.; WILSON, M. A.; GILL, W. P.; SALAMON, H.; SCHOOLNIK, G. K.;
RANE, S.; SMALL, P. M. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome
DNA microarray. Science, v. 284, n. 5419, p. 1520-1523, 1999.
BELISLE, J. T.; VISSA, V. D.; SIEVERT, T.; TAKAYAMA, K.; BRENNAN, P. J.;
BESRA, G. S. Role of the major antigen of Mycobacterium tuberculosis in cell wall
biogenesis. Science, v. 276, n. 5317, p. 1420-1422, 1997.
BLACK, G. F.; DOCKRELL, H. M.; CRAMPIN, A. C.; FLOYD, S.; WEIR, R. E.;
BLISS, L.; SICHALI, L.; MWAUNGULU, L.; KANYONGOLOKA, H.; NGWIRA,
B.; WARNDORFF, D. K.; FINE, P. E. Patterns and implications of naturally acquired
immune responses to environmental and tuberculous mycobacterial antigens in northern
Malawi. J Infect Dis, v. 184, n. 3, p. 322-329, 2001.
BLACK, G. F.; WEIR, R. E.; FLOYD, S.; BLISS, L.; WARNDORFF, D. K.;
CRAMPIN, A. C.; NGWIRA, B.; SICHALI, L.; NAZARETH, B.; BLACKWELL, J.
M.; BRANSON, K.; CHAGULUKA, S. D.; DONOVAN, L.; JARMAN, E.; KING, E.;
FINE, P. E.; DOCKRELL, H. M. BCG-induced increase in interferon-gamma response
to mycobacterial antigens and efficacy of BCG vaccination in Malawi and the UK: two
randomised controlled studies. Lancet, v. 359, n. 9315, p. 1393-1401, 2002.
BRANDT, L.; FEINO CUNHA, J.; WEINREICH OLSEN, A.; CHILIMA, B.;
HIRSCH, P.; APPELBERG, R.; ANDERSEN, P. Failure of the Mycobacterium bovis
BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of
BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infect Immun, v. 70, n. 2,
p. 672-678, 2002.
BRANDT, L.; SKEIKY, Y. A.; ALDERSON, M. R.; LOBET, Y.; DALEMANS, W.;
TURNER, O. C.; BASARABA, R. J.; IZZO, A. A.; LASCO, T. M.; CHAPMAN, P. L.;
REED, S. G.; ORME, I. M. The protective effect of the Mycobacterium bovis BCG
vaccine is increased by coadministration with the Mycobacterium tuberculosis 72kilodalton fusion polyprotein Mtb72F in M. tuberculosis-infected guinea pigs. Infect
Immun, v. 72, n. 11, p. 6622-6632, 2004.
BROOKES, R. H.; PATHAN, A. A.; MCSHANE, H.; HENSMANN, M.; PRICE, D.
A.; HILL, A. V. CD8+ T cell-mediated suppression of intracellular Mycobacterium
tuberculosis growth in activated human macrophages. Eur J Immunol, v. 33, n. 12, p.
3293-3302, 2003.
63
CARRIO, M. M.; VILLAVERDE, A. Protein aggregation as bacterial inclusion bodies
is reversible. FEBS Lett, v. 489, n. 1, p. 29-33, 2001.
CARRIO, M. M.; VILLAVERDE, A. Construction and deconstruction of bacterial
inclusion bodies. J Biotechnol, v. 96, n. 1, p. 3-12, 2002.
CARVALHO, R.; DE SONNEVILLE, J.; STOCKHAMMER, O. W.; SAVAGE, N. D.;
VENEMAN, W. J.; OTTENHOFF, T. H.; DIRKS, R. P.; MEIJER, A. H.; SPAINK, H.
P. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One, v. 6, n. 2, p.
e16779, 2011.
CAYABYAB, M. J.; MACOVEI, L.; CAMPOS-NETO, A. Current and novel
approaches to vaccine development against tuberculosis. Front Cell Infect Microbiol,
v. 2, n., p. 154, 2012.
CDC. Diagnostic Standards and Classification of Tuberculosis in Adults and Children.
This official statement of the American Thoracic Society and the Centers for Disease
Control and Prevention was adopted by the ATS Board of Directors, July 1999. This
statement was endorsed by the Council of the Infectious Disease Society of America,
September 1999. Am J Respir Crit Care Med, v. 161, n. 4 Pt 1, p. 1376-1395, 2000.
CHEGOU, N. N.; HOEK, K. G.; KRIEL, M.; WARREN, R. M.; VICTOR, T. C.;
WALZL, G. Tuberculosis assays: past, present and future. Expert Rev Anti Infect
Ther, v. 9, n. 4, p. 457-469, 2011.
CHEN, C. Y.; HUANG, D.; WANG, R. C.; SHEN, L.; ZENG, G.; YAO, S.; SHEN, Y.;
HALLIDAY, L.; FORTMAN, J.; MCALLISTER, M.; ESTEP, J.; HUNT, R.;
VASCONCELOS, D.; DU, G.; PORCELLI, S. A.; LARSEN, M. H.; JACOBS, W. R.,
JR.; HAYNES, B. F.; LETVIN, N. L.; CHEN, Z. W. A critical role for CD8 T cells in a
nonhuman primate model of tuberculosis. PLoS Pathog, v. 5, n. 4, p. e1000392, 2009.
CHENG, Z.; ZHAO, J. W.; SUN, Z. Q.; SONG, Y. Z.; SUN, Q. W.; ZHANG, X. Y.;
ZHANG, X. L.; WANG, H. H.; GUO, X. K.; LIU, Y. F.; ZHANG, S. L. Evaluation of a
novel fusion protein antigen for rapid serodiagnosis of tuberculosis. J Clin Lab Anal,
v. 25, n. 5, p. 344-349, 2011.
CHO, S. A.; SCHARPF, S.; FRANKO, M.; VERMEULEN, C. W. Effect of Iso-PropylThio-Beta-D-Galactoside Concentration on the Level of Lac-Operon Induction in
Steady-State
Escherichia-Coli.
Biochemical
and
Biophysical
Research
Communications, v. 128, n. 3, p. 1268-1273, 1985.
64
CHOU, C. P. Engineering cell physiology to enhance recombinant protein production in
Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol, v. 76, n. 3, p. 521-532, 2007.
CHRISTY, A. J.; DHARMAN, K.; DHANDAPAANI, G.; PALANIYANDI, K.;
GUPTA, U. D.; GUPTA, P.; IGNACIMUTHU, S.; NARAYANAN, S. Epitope based
recombinant BCG vaccine elicits specific Th1 polarized immune responses in BALB/c
mice. Vaccine, v. 30, n. 7, p. 1364-1370, 2012.
COLDITZ, G. A.; BERKEY, C. S.; MOSTELLER, F.; BREWER, T. F.; WILSON, M.
E.; BURDICK, E.; FINEBERG, H. V. The efficacy of bacillus Calmette-Guerin
vaccination of newborns and infants in the prevention of tuberculosis: meta-analyses of
the published literature. Pediatrics, v. 96, n. 1 Pt 1, p. 29-35, 1995.
COLER, R. N.; BERTHOLET, S.; PINE, S. O.; ORR, M. T.; REESE, V.; WINDISH,
H. P.; DAVIS, C.; KAHN, M.; BALDWIN, S. L.; REED, S. G. Therapeutic
immunization against Mycobacterium tuberculosis is an effective adjunct to antibiotic
treatment. J Infect Dis, v. 207, n. 8, p. 1242-1252, 2013.
COMMANDEUR, S.; LIN, M. Y.; VAN MEIJGAARDEN, K. E.; FRIGGEN, A. H.;
FRANKEN, K. L.; DRIJFHOUT, J. W.; KORSVOLD, G. E.; OFTUNG, F.; GELUK,
A.; OTTENHOFF, T. H. Double- and monofunctional CD4(+) and CD8(+) T-cell
responses to Mycobacterium tuberculosis DosR antigens and peptides in long-term
latently infected individuals. Eur J Immunol, v. 41, n. 10, p. 2925-2936, 2011.
D'SOUZA, S.; ROSSEELS, V.; ROMANO, M.; TANGHE, A.; DENIS, O.; JURION,
F.; CASTIGLIONE, N.; VANONCKELEN, A.; PALFLIET, K.; HUYGEN, K.
Mapping of murine Th1 helper T-Cell epitopes of mycolyl transferases Ag85A, Ag85B,
and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun, v. 71, n. 1, p. 483-493,
2003.
DAFFE, M.; ETIENNE, G. The capsule of Mycobacterium tuberculosis and its
implications for pathogenicity. Tuber Lung Dis, v. 79, n. 3, p. 153-169, 1999.
DANIEL, T. M. The impact of tuberculosis on civilization. Infect Dis Clin North Am,
v. 18, n. 1, p. 157-165, 2004.
DANIEL, T. M. The history of tuberculosis. Respir Med, v. 100, n. 11, p. 1862-1870,
2006.
DAVIDOW, A.; KANAUJIA, G. V.; SHI, L.; KAVIAR, J.; GUO, X.; SUNG, N.;
KAPLAN, G.; MENZIES, D.; GENNARO, M. L. Antibody profiles characteristic of
65
Mycobacterium tuberculosis infection state. Infect Immun, v. 73, n. 10, p. 6846-6851,
2005.
DAVIS, J. M.; RAMAKRISHNAN, L. The role of the granuloma in expansion and
dissemination of early tuberculous infection. Cell, v. 136, n. 1, p. 37-49, 2009.
DAY, C. L.; TAMERIS, M.; MANSOOR, N.; VAN ROOYEN, M.; DE KOCK, M.;
GELDENHUYS, H.; ERASMUS, M.; MAKHETHE, L.; HUGHES, E. J.;
GELDERBLOEM, S.; BOLLAERTS, A.; BOURGUIGNON, P.; COHEN, J.;
DEMOITIE, M. A.; METTENS, P.; MORIS, P.; SADOFF, J. C.; HAWKRIDGE, A.;
HUSSEY, G. D.; MAHOMED, H.; OFORI-ANYINAM, O.; HANEKOM, W. A.
Induction and Regulation of T Cell Immunity by the Novel TB Vaccine M72/AS01 in
South African Adults. Am J Respir Crit Care Med, v., n., p., 2013.
DE SOUSA, E. M.; DA COSTA, A. C.; TRENTINI, M. M.; DE ARAUJO FILHO, J.
A.; KIPNIS, A.; JUNQUEIRA-KIPNIS, A. P. Immunogenicity of a fusion protein
containing immunodominant epitopes of Ag85C, MPT51, and HspX from
Mycobacterium tuberculosis in mice and active TB infection. PLoS One, v. 7, n. 10, p.
e47781, 2012.
DERMIME, S.; GILHAM, D. E.; SHAW, D. M.; DAVIDSON, E. J.; MEZIANE EL,
K.; ARMSTRONG, A.; HAWKINS, R. E.; STERN, P. L. Vaccine and antibodydirected T cell tumour immunotherapy. Biochim Biophys Acta, v. 1704, n. 1, p. 11-35,
2004.
DERRICK, S. C.; YABE, I. M.; YANG, A.; KOLIBAB, K.; HOLLINGSWORTH, B.;
KURTZ, S. L.; MORRIS, S. Immunogenicity and protective efficacy of novel
Mycobacterium tuberculosis antigens. Vaccine, v., n., p., 2013.
DIPTI, C. A.; JAIN, S. K.; NAVIN, K. A novel recombinant multiepitope protein as a
hepatitis C diagnostic intermediate of high sensitivity and specificity. Protein Expr
Purif, v. 47, n. 1, p. 319-328, 2006.
DOHERTY, T. M.; OLSEN, A. W.; WEISCHENFELDT, J.; HUYGEN, K.; D'SOUZA,
S.; KONDRATIEVA, T. K.; YEREMEEV, V. V.; APT, A. S.; RAUPACH, B.;
GRODE, L.; KAUFMANN, S.; ANDERSEN, P. Comparative analysis of different
vaccine constructs expressing defined antigens from Mycobacterium tuberculosis. J
Infect Dis, v. 190, n. 12, p. 2146-2153, 2004.
DOHERTY, T. M.; ANDERSEN, P. Vaccines for tuberculosis: novel concepts and
recent progress. Clin Microbiol Rev, v. 18, n. 4, p. 687-702, 2005.
66
DYE, C.; WATT, C. J.; BLEED, D. M.; HOSSEINI, S. M.; RAVIGLIONE, M. C.
Evolution of tuberculosis control and prospects for reducing tuberculosis incidence,
prevalence, and deaths globally. JAMA, v. 293, n. 22, p. 2767-2775, 2005.
DYE, C.; WILLIAMS, B. G. Slow elimination of multidrug-resistant tuberculosis. Sci
Transl Med, v. 1, n. 3, p. 3ra8, 2009.
EHLERS, S.; SCHAIBLE, U. E. The granuloma in tuberculosis: dynamics of a hostpathogen collusion. Front Immunol, v. 3, n., p. 411, 2012.
ERNST, J. D. The immunological life cycle of tuberculosis. Nat Rev Immunol, v. 12,
n. 8, p. 581-591, 2012.
FINE, P. E.; STERNE, J. A.; PONNIGHAUS, J. M.; REES, R. J. Delayed-type
hypersensitivity, mycobacterial vaccines and protective immunity. Lancet, v. 344, n.
8932, p. 1245-1249, 1994.
FLYNN, J. L.; GOLDSTEIN, M. M.; TRIEBOLD, K. J.; BLOOM, B. R. Major
histocompatibility complex class I-restricted T cells are necessary for protection against
M. tuberculosis in mice. Infect Agents Dis, v. 2, n. 4, p. 259-262, 1993.
FLYNN, J. L.; CHAN, J. Tuberculosis: latency and reactivation. Infect Immun, v. 69,
n. 7, p. 4195-4201, 2001.
FORRELLAD, M. A.; KLEPP, L. I.; GIOFFRE, A.; SABIO, Y. G. J.; MORBIDONI,
H. R.; SANTANGELO, M. D.; CATALDI, A. A.; BIGI, F. Virulence factors of the
Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence, v. 4, n. 1, p., 2012.
FRIEDEN, T. R.; STERLING, T. R.; MUNSIFF, S. S.; WATT, C. J.; DYE, C.
Tuberculosis. Lancet, v. 362, n. 9387, p. 887-899, 2003.
GALLEGOS, A. M.; VAN HEIJST, J. W.; SAMSTEIN, M.; SU, X.; PAMER, E. G.;
GLICKMAN, M. S. A gamma interferon independent mechanism of CD4 T cell
mediated control of M. tuberculosis infection in vivo. PLoS Pathog, v. 7, n. 5, p.
e1002052, 2011.
GELUK, A.; LIN, M. Y.; VAN MEIJGAARDEN, K. E.; LEYTEN, E. M.; FRANKEN,
K. L.; OTTENHOFF, T. H.; KLEIN, M. R. T-cell recognition of the HspX protein of
Mycobacterium tuberculosis correlates with latent M. tuberculosis infection but not with
M. bovis BCG vaccination. Infect Immun, v. 75, n. 6, p. 2914-2921, 2007.
67
GOWTHAMAN, U.; SINGH, V.; ZENG, W.; JAIN, S.; SIDDIQUI, K. F.;
CHODISETTI, S. B.; GURRAM, R. K.; PARIHAR, P.; GUPTA, P.; GUPTA, U. D.;
JACKSON, D. C.; AGREWALA, J. N. Promiscuous peptide of 16 kDa antigen linked
to Pam2Cys protects against Mycobacterium tuberculosis by evoking enduring memory
T-cell response. J Infect Dis, v. 204, n. 9, p. 1328-1338, 2011.
GRODE, L.; SEILER, P.; BAUMANN, S.; HESS, J.; BRINKMANN, V.; NASSER
EDDINE, A.; MANN, P.; GOOSMANN, C.; BANDERMANN, S.; SMITH, D.;
BANCROFT, G. J.; REYRAT, J. M.; VAN SOOLINGEN, D.; RAUPACH, B.;
KAUFMANN, S. H. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant
Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. J Clin
Invest, v. 115, n. 9, p. 2472-2479, 2005.
GROSSMAN, T. H.; KAWASAKI, E. S.; PUNREDDY, S. R.; OSBURNE, M. S.
Spontaneous cAMP-dependent derepression of gene expression in stationary phase
plays a role in recombinant expression instability. Gene, v. 209, n. 1-2, p. 95-103, 1998.
GUPTA, A.; KAUL, A.; TSOLAKI, A. G.; KISHORE, U.; BHAKTA, S.
Mycobacterium tuberculosis: immune evasion, latency and reactivation.
Immunobiology, v. 217, n. 3, p. 363-374, 2012.
HARRIES, A. D.; KAMENYA, A.; SUBRAMANYAM, V. R.; MAHER, D.; SQUIRE,
S. B.; WIRIMA, J. J.; NYANGULU, D. S.; NUNN, P. Screening pulmonary
tuberculosis suspects in Malawi: testing different strategies. Trans R Soc Trop Med
Hyg, v. 91, n. 4, p. 416-419, 1997.
HORWITZ, M. A.; LEE, B. W.; DILLON, B. J.; HARTH, G. Protective immunity
against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of
Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 92, n. 5, p. 1530-1534,
1995.
HORWITZ, M. A.; HARTH, G.; DILLON, B. J.; MASLESA-GALIC, S. Recombinant
bacillus calmette-guerin (BCG) vaccines expressing the Mycobacterium tuberculosis
30-kDa major secretory protein induce greater protective immunity against tuberculosis
than conventional BCG vaccines in a highly susceptible animal model. Proc Natl Acad
Sci U S A, v. 97, n. 25, p. 13853-13858, 2000.
HORWITZ, M. A. Recombinant BCG expressing Mycobacterium tuberculosis major
extracellular proteins. Microbes Infect, v. 7, n. 5-6, p. 947-954, 2005.
68
HU, Y.; MOVAHEDZADEH, F.; STOKER, N. G.; COATES, A. R. Deletion of the
Mycobacterium tuberculosis alpha-crystallin-like hspX gene causes increased bacterial
growth in vivo. Infect Immun, v. 74, n. 2, p. 861-868, 2006.
IPUGE, Y. A.; RIEDER, H. L.; ENARSON, D. A. The yield of acid-fast bacilli from
serial smears in routine microscopy laboratories in rural Tanzania. Trans R Soc Trop
Med Hyg, v. 90, n. 3, p. 258-261, 1996.
JACKSON, M.; RAYNAUD, C.; LANEELLE, M. A.; GUILHOT, C.; LAURENTWINTER, C.; ENSERGUEIX, D.; GICQUEL, B.; DAFFE, M. Inactivation of the
antigen 85C gene profoundly affects the mycolate content and alters the permeability of
the Mycobacterium tuberculosis cell envelope. Mol Microbiol, v. 31, n. 5, p. 15731587, 1999.
JAIN, R.; DEY, B.; DHAR, N.; RAO, V.; SINGH, R.; GUPTA, U. D.; KATOCH, V.
M.; RAMANATHAN, V. D.; TYAGI, A. K. Enhanced and enduring protection against
tuberculosis by recombinant BCG-Ag85C and its association with modulation of
cytokine profile in lung. PLoS One, v. 3, n. 12, p. e3869, 2008.
JAMES, B. W.; WILLIAMS, A.; MARSH, P. D. The physiology and pathogenicity of
Mycobacterium tuberculosis grown under controlled conditions in a defined medium. J
Appl Microbiol, v. 88, n. 4, p. 669-677, 2000.
KARPENKO, L. I.; IVANISENKO, V. A.; PIKA, I. A.; CHIKAEV, N. A.;
EROSHKIN, A. M.; VEREMEIKO, T. A.; ILYICHEV, A. A. Insertion of foreign
epitopes in HBcAg: how to make the chimeric particle assemble. Amino Acids, v. 18,
n. 4, p. 329-337, 2000.
KAUFMANN, S. H. Fact and fiction in tuberculosis vaccine research: 10 years later.
Lancet Infect Dis, v. 11, n. 8, p. 633-640, 2011.
KAUFMANN, S. H. Tuberculosis vaccines: Time to think about the next generation.
Semin Immunol, v., n., p., 2013.
KAUSHIK, A.; SINGH, U. B.; PORWAL, C.; VENUGOPAL, S. J.; MOHAN, A.;
KRISHNAN, A.; GOYAL, V.; BANAVALIKER, J. N. Diagnostic potential of 16 kDa
(HspX, alpha-crystalline) antigen for serodiagnosis of tuberculosis. Indian J Med Res,
v. 135, n. 5, p. 771-777, 2012.
69
KOUL, A.; HERGET, T.; KLEBL, B.; ULLRICH, A. Interplay between mycobacteria
and host signalling pathways. Nature Reviews Microbiology, v. 2, n. 3, p. 189-202,
2004.
KREMER, L.; MAUGHAN, W. N.; WILSON, R. A.; DOVER, L. G.; BESRA, G. S.
The M. tuberculosis antigen 85 complex and mycolyltransferase activity. Lett Appl
Microbiol, v. 34, n. 4, p. 233-237, 2002.
KRINGELUM, J. V.; NIELSEN, M.; PADKJAER, S. B.; LUND, O. Structural analysis
of B-cell epitopes in antibody:protein complexes. Mol Immunol, v. 53, n. 1-2, p. 24-34,
2013.
KUMAR, G.; DAGUR, P. K.; SINGH, M.; YADAV, V. S.; DAYAL, R.; SINGH, H.
B.; KATOCH, V. M.; SENGUPTA, U.; JOSHI, B. Diagnostic potential of Ag85C in
comparison to various secretory antigens for childhood tuberculosis. Scand J
Immunol, v. 68, n. 2, p. 177-183, 2008.
KUO, C. J.; BELL, H.; HSIEH, C. L.; PTAK, C. P.; CHANG, Y. F. Novel
mycobacteria antigen 85 complex binding motif on fibronectin. J Biol Chem, v. 287, n.
3, p. 1892-1902, 2012.
KWAN, C. K.; ERNST, J. D. HIV and tuberculosis: a deadly human syndemic. Clin
Microbiol Rev, v. 24, n. 2, p. 351-376, 2011.
LAMBERT, P. H.; HAWKRIDGE, T.; HANEKOM, W. A. New vaccines against
tuberculosis. Clin Chest Med, v. 30, n. 4, p. 811-826, x, 2009.
LAWN, S. D.; ZUMLA, A. I. Tuberculosis. Lancet, v. 378, n. 9785, p. 57-72, 2011.
LAWN, S. D. Diagnosis of pulmonary tuberculosis. Curr Opin Pulm Med, v. 19, n. 3,
p. 280-288, 2013.
LEE, B. Y.; HORWITZ, M. A. T-cell epitope mapping of the three most abundant
extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis in outbred guinea pigs. Infect
Immun, v. 67, n. 5, p. 2665-2670, 1999.
LEE, J. S.; KRAUSE, R.; SCHREIBER, J.; MOLLENKOPF, H. J.; KOWALL, J.;
STEIN, R.; JEON, B. Y.; KWAK, J. Y.; SONG, M. K.; PATRON, J. P.; JORG, S.;
ROH, K.; CHO, S. N.; KAUFMANN, S. H. Mutation in the transcriptional regulator
70
PhoP contributes to avirulence of Mycobacterium tuberculosis H37Ra strain. Cell Host
Microbe, v. 3, n. 2, p. 97-103, 2008.
LI, Q.; YU, H.; ZHANG, Y.; WANG, B.; JIANG, W.; DA, Z.; XIAN, Q.; WANG, Y.;
LIU, X.; ZHU, B. Immunogenicity and protective efficacy of a fusion protein vaccine
consisting of antigen Ag85B and HspX against Mycobacterium tuberculosis infection in
mice. Scand J Immunol, v. 73, n. 6, p. 568-576, 2011.
LIM, J. H.; PARK, J. K.; JO, E. K.; SONG, C. H.; MIN, D.; SONG, Y. J.; KIM, H. J.
Purification and immunoreactivity of three components from the 30/32-kilodalton
antigen 85 complex in Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun, v. 67, n. 11, p.
6187-6190, 1999.
LINDESTAM ARLEHAMN, C. S.; GERASIMOVA, A.; MELE, F.; HENDERSON,
R.; SWANN, J.; GREENBAUM, J. A.; KIM, Y.; SIDNEY, J.; JAMES, E. A.;
TAPLITZ, R.; MCKINNEY, D. M.; KWOK, W. W.; GREY, H.; SALLUSTO, F.;
PETERS, B.; SETTE, A. Memory T cells in latent Mycobacterium tuberculosis
infection are directed against three antigenic islands and largely contained in a
CXCR3+CCR6+ Th1 subset. PLoS Pathog, v. 9, n. 1, p. e1003130, 2013.
LONNROTH, K.; JARAMILLO, E.; WILLIAMS, B. G.; DYE, C.; RAVIGLIONE, M.
Drivers of tuberculosis epidemics: the role of risk factors and social determinants. Soc
Sci Med, v. 68, n. 12, p. 2240-2246, 2009.
MAARTENS, G.; WILKINSON, R. J. Tuberculosis. Lancet, v. 370, n. 9604, p. 20302043, 2007.
MARTIN, C.; WILLIAMS, A.; HERNANDEZ-PANDO, R.; CARDONA, P. J.;
GORMLEY, E.; BORDAT, Y.; SOTO, C. Y.; CLARK, S. O.; HATCH, G. J.;
AGUILAR, D.; AUSINA, V.; GICQUEL, B. The live Mycobacterium tuberculosis
phoP mutant strain is more attenuated than BCG and confers protective immunity
against tuberculosis in mice and guinea pigs. Vaccine, v. 24, n. 17, p. 3408-3419, 2006.
MCADAMS, H. P.; ERASMUS, J.; WINTER, J. A. Radiologic manifestations of
pulmonary tuberculosis. Radiol Clin North Am, v. 33, n. 4, p. 655-678, 1995.
MELO, C. C. A.; VASCONCELOS, A. C., JR.; KIPNIS, A.; ANDRADE, A. L.;
JUNQUEIRA-KIPNIS, A. P. Humoral immune responses of tuberculosis patients in
Brazil indicate recognition of Mycobacterium tuberculosis MPT-51 and GlcB. Clin
Vaccine Immunol, v. 15, n. 3, p. 579-581, 2008.
71
MELOEN, R. H.; LANGEVELD, J. P.; SCHAAPER, W. M.; SLOOTSTRA, J. W.
Synthetic peptide vaccines: unexpected fulfillment of discarded hope? Biologicals, v.
29, n. 3-4, p. 233-236, 2001.
MINION, J.; PAI, M. Evidence-based diagnosis of tuberculosis: resources for the
medical microbiologist. Indian J Med Microbiol, v. 28, n. 1, p. 2-4, 2010.
MONASTYRSKAYA, K.; STAEUBER, N.; SUTTON, G.; ROY, P. Effects of domainswitching and site-directed mutagenesis on the properties and functions of the VP7
proteins of two orbiviruses. Virology, v. 237, n. 2, p. 217-227, 1997.
MOYLE, P. M.; TOTH, I. Modern subunit vaccines: development, components, and
research opportunities. ChemMedChem, v. 8, n. 3, p. 360-376, 2013.
MS/SVS. Ministério da Saúde/Secretaria de Vigilância Sanitária. MANUAL DE
RECOMENDAÇÕES PARA CONTROLE DA TUBERCULOSE NO BRASIL.
Brasília, 2011. Disponível em:
<http://www.cve.saude.sp.gov.br/htm/TB/mat_tec/manuais/MS11_Manual_Recom.pdf
> Acessado em: 24 mar. 2014.
NAGAI, S.; WIKER, H. G.; HARBOE, M.; KINOMOTO, M. Isolation and partial
characterization of major protein antigens in the culture fluid of Mycobacterium
tuberculosis. Infect Immun, v. 59, n. 1, p. 372-382, 1991.
NELSON, S. M.; DEIKE, M. A.; CARTWRIGHT, C. P. Value of examining multiple
sputum specimens in the diagnosis of pulmonary tuberculosis. J Clin Microbiol, v. 36,
n. 2, p. 467-469, 1998.
NIU, H.; HU, L.; LI, Q.; DA, Z.; WANG, B.; TANG, K.; XIN, Q.; YU, H.; ZHANG,
Y.; WANG, Y.; MA, X.; ZHU, B. Construction and evaluation of a multistage
Mycobacterium tuberculosis subunit vaccine candidate Mtb10.4-HspX. Vaccine, v. 29,
n. 51, p. 9451-9458, 2011.
O'GARRA, A.; REDFORD, P. S.; MCNAB, F. W.; BLOOM, C. I.; WILKINSON, R.
J.; BERRY, M. P. The immune response in tuberculosis. Annu Rev Immunol, v. 31, n.,
p. 475-527, 2013.
ORME, I. M. Vaccine development for tuberculosis: current progress. Drugs, v. 73, n.
10, p. 1015-1024, 2013.
72
OTTENHOFF, T. H. The knowns and unknowns of the immunopathogenesis of
tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, v. 16, n. 11, p. 1424-1432, 2012.
OTTENHOFF, T. H.; KAUFMANN, S. H. Vaccines against tuberculosis: where are we
and where do we need to go? PLoS Pathog, v. 8, n. 5, p. e1002607, 2012.
PAI, M.; MCCULLOCH, M.; ENANORIA, W.; COLFORD, J. M., JR. Systematic
reviews of diagnostic test evaluations: What's behind the scenes? ACP J Club, v. 141,
n. 1, p. A11-13, 2004.
PAI, M.; ZWERLING, A.; MENZIES, D. Systematic review: T-cell-based assays for
the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Ann Intern Med, v. 149, n. 3,
p. 177-184, 2008.
PAIGE, C.; BISHAI, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous
granuloma from the microbe's point of view. Cell Microbiol, v. 12, n. 3, p. 301-309,
2010.
PALMER, M. V.; WATERS, W. R.; THACKER, T. C. Lesion development and
immunohistochemical changes in granulomas from cattle experimentally infected with
Mycobacterium bovis. Vet Pathol, v. 44, n. 6, p. 863-874, 2007.
PARIDA, S. K.; KAUFMANN, S. H. Novel tuberculosis vaccines on the horizon. Curr
Opin Immunol, v. 22, n. 3, p. 374-384, 2010.
PARR-VASQUEZ, C. L.; YADA, R. Y. Functional chimera of porcine pepsin
prosegment and Plasmodium falciparum plasmepsin II. Protein Eng Des Sel, v. 23, n.
1, p. 19-26, 2010.
PARSONS, L. M.; SOMOSKOVI, A.; GUTIERREZ, C.; LEE, E.; PARAMASIVAN,
C. N.; ABIMIKU, A.; SPECTOR, S.; ROSCIGNO, G.; NKENGASONG, J. Laboratory
diagnosis of tuberculosis in resource-poor countries: challenges and opportunities. Clin
Microbiol Rev, v. 24, n. 2, p. 314-350, 2011.
PATRONOV, A.; DOYTCHINOVA, I. T-cell epitope
immunoinformatics. Open Biol, v. 3, n. 1, p. 120139, 2013.
vaccine
design
by
PAWLOWSKI, A.; JANSSON, M.; SKOLD, M.; ROTTENBERG, M. E.;
KALLENIUS, G. Tuberculosis and HIV co-infection. PLoS Pathog, v. 8, n. 2, p.
e1002464, 2012.
73
PYM, A. S.; BRODIN, P.; MAJLESSI, L.; BROSCH, R.; DEMANGEL, C.;
WILLIAMS, A.; GRIFFITHS, K. E.; MARCHAL, G.; LECLERC, C.; COLE, S. T.
Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis.
Nat Med, v. 9, n. 5, p. 533-539, 2003.
RABAHI, M. F.; JUNQUEIRA-KIPNIS, A. P.; DOS REIS, M. C.; OELEMANN, W.;
CONDE, M. B. Humoral response to HspX and GlcB to previous and recent infection
by Mycobacterium tuberculosis. BMC Infect Dis, v. 7, n., p. 148, 2007.
RAMAKRISHNAN, L. Revisiting the role of the granuloma in tuberculosis. Nat Rev
Immunol, v. 12, n. 5, p. 352-366, 2012.
RAMBUKKANA, A.; DAS, P. K.; KOLK, A. H.; BURGGRAAF, J. D.; KUIJPER, S.;
HARBOE, M. Identification of a novel 27-kDa protein from Mycobacterium
tuberculosis culture fluid by a monoclonal antibody specific for the Mycobacterium
tuberculosis complex. Scand J Immunol, v. 37, n. 4, p. 471-478, 1993.
RAVN, P.; MUNK, M. E.; ANDERSEN, A. B.; LUNDGREN, B.; LUNDGREN, J. D.;
NIELSEN, L. N.; KOK-JENSEN, A.; ANDERSEN, P.; WELDINGH, K. Prospective
evaluation of a whole-blood test using Mycobacterium tuberculosis-specific antigens
ESAT-6 and CFP-10 for diagnosis of active tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol, v.
12, n. 4, p. 491-496, 2005.
REECE, S. T.; KAUFMANN, S. H. Floating between the poles of pathology and
protection: can we pin down the granuloma in tuberculosis? Curr Opin Microbiol, v.
15, n. 1, p. 63-70, 2012.
REED, S. G.; COLER, R. N.; DALEMANS, W.; TAN, E. V.; DELA CRUZ, E. C.;
BASARABA, R. J.; ORME, I. M.; SKEIKY, Y. A.; ALDERSON, M. R.; COWGILL,
K. D.; PRIEELS, J. P.; ABALOS, R. M.; DUBOIS, M. C.; COHEN, J.; METTENS, P.;
LOBET, Y. Defined tuberculosis vaccine, Mtb72F/AS02A, evidence of protection in
cynomolgus monkeys. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 106, n. 7, p. 2301-2306, 2009.
RHOADES, E. R.; GEISEL, R. E.; BUTCHER, B. A.; MCDONOUGH, S.; RUSSELL,
D. G. Cell wall lipids from Mycobacterium bovis BCG are inflammatory when
inoculated within a gel matrix: characterization of a new model of the granulomatous
response to mycobacterial components. Tuberculosis (Edinb), v. 85, n. 3, p. 159-176,
2005.
RINKE DE WIT, T. F.; BEKELIE, S.; OSLAND, A.; WIELES, B.; JANSON, A. A.;
THOLE, J. E. The Mycobacterium leprae antigen 85 complex gene family:
74
identification of the genes for the 85A, 85C, and related MPT51 proteins. Infect
Immun, v. 61, n. 9, p. 3642-3647, 1993.
RITZ, N.; HANEKOM, W. A.; ROBINS-BROWNE, R.; BRITTON, W. J.; CURTIS,
N. Influence of BCG vaccine strain on the immune response and protection against
tuberculosis. FEMS Microbiol Rev, v. 32, n. 5, p. 821-841, 2008.
ROBINSON, C. R.; SAUER, R. T. Optimizing the stability of single-chain proteins by
linker length and composition mutagenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 95, n. 11, p.
5929-5934, 1998.
RODRIGUES, C.; VADWAI, V. Tuberculosis: laboratory diagnosis. Clin Lab Med, v.
32, n. 2, p. 111-127, 2012.
RODRIGUES, L. C.; PEREIRA, S. M.; CUNHA, S. S.; GENSER, B.; ICHIHARA, M.
Y.; DE BRITO, S. C.; HIJJAR, M. A.; DOURADO, I.; CRUZ, A. A.; SANT'ANNA,
C.; BIERRENBACH, A. L.; BARRETO, M. L. Effect of BCG revaccination on
incidence of tuberculosis in school-aged children in Brazil: the BCG-REVAC clusterrandomised trial. Lancet, v. 366, n. 9493, p. 1290-1295, 2005.
ROMANO, M.; HUYGEN, K. An update on vaccines for tuberculosis - there is more to
it than just waning of BCG efficacy with time. Expert Opin Biol Ther, v. 12, n. 12, p.
1601-1610, 2012.
ROWLAND, R.; MCSHANE, H. Tuberculosis vaccines in clinical trials. Expert Rev
Vaccines, v. 10, n. 5, p. 645-658, 2011.
ROZOT, V.; VIGANO, S.; MAZZA-STALDER, J.; IDRIZI, E.; DAY, C. L.;
PERREAU, M.; LAZOR-BLANCHET, C.; PETRUCCIOLI, E.; HANEKOM, W.;
GOLETTI, D.; BART, P. A.; NICOD, L.; PANTALEO, G.; HARARI, A.
Mycobacterium tuberculosis-specific CD8(+) T cells are functionally and
phenotypically different between latent infection and active disease. Eur J Immunol, v.
43, n. 6, p. 1568-1577, 2013.
SAKAMOTO, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Vet Pathol,
v. 49, n. 3, p. 423-439, 2012.
SAMISH, I.; MACDERMAID, C. M.; PEREZ-AGUILAR, J. M.; SAVEN, J. G.
Theoretical and computational protein design. Annu Rev Phys Chem, v. 62, n., p. 129149, 2011.
75
SANTOS, L. C.; BOUSQUET HDE, M.; PEREIRA, A. M.; JUNQUEIRA-KIPNIS, A.
P.; KIPNIS, A. A high prevalence of resistance in new tuberculosis cases of midwestern
Brazil. Infect Genet Evol, v. 10, n. 7, p. 1052-1057, 2010.
SCHEICH, C.; PUETTER, V.; SCHADE, M. Novel Small Molecule Inhibitors of MDR
Mycobacterium tuberculosis by NMR Fragment Screening of Antigen 85C. J Med
Chem, v., n., p., 2010.
SCHMIDT, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry.
Appl Microbiol Biotechnol, v. 65, n. 4, p. 363-372, 2004.
SHARMA, P. K.; SAHA, P. K.; SINGH, A.; SHARMA, S. K.; GHOSH, B.; MITRA,
D. K. FoxP3+ regulatory T cells suppress effector T-cell function at pathologic site in
miliary tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med, v. 179, n. 11, p. 1061-1070, 2009.
SHINGADIA, D. The diagnosis of tuberculosis. Pediatr Infect Dis J, v. 31, n. 3, p.
302-305, 2012.
SILVA, B. D.; DA SILVA, E. B.; DO NASCIMENTO, I. P.; DOS REIS, M. C.;
KIPNIS, A.; JUNQUEIRA-KIPNIS, A. P. MPT-51/CpG DNA vaccine protects mice
against Mycobacterium tuberculosis. Vaccine, v. 27, n. 33, p. 4402-4407, 2009.
SILVER, R. F.; WALLIS, R. S.; ELLNER, J. J. Mapping of T cell epitopes of the 30kDa alpha antigen of Mycobacterium bovis strain bacillus Calmette-Guerin in purified
protein derivative (PPD)-positive individuals. J Immunol, v. 154, n. 9, p. 4665-4674,
1995.
SINGH, K. K.; DONG, Y.; BELISLE, J. T.; HARDER, J.; ARORA, V. K.; LAAL, S.
Antigens of Mycobacterium tuberculosis recognized by antibodies during incipient,
subclinical tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol, v. 12, n. 2, p. 354-358, 2005.
SKEIKY, Y. A.; SADOFF, J. C. Advances in tuberculosis vaccine strategies. Nature
Reviews Microbiology, v. 4, n. 6, p. 469-476, 2006.
SORENSEN, H. P.; MORTENSEN, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant
protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol, v. 115, n. 2, p. 113-128, 2005a.
SORENSEN, H. P.; MORTENSEN, K. K. Soluble expression of recombinant proteins
in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact, v. 4, n. 1, p. 1, 2005b.
76
SPRATT, J. M.; BRITTON, W. J.; TRICCAS, J. A. In vivo persistence and protective
efficacy of the bacille Calmette Guerin vaccine overexpressing the HspX latency
antigen. Bioeng Bugs, v. 1, n. 1, p. 61-65, 2010.
STUDIER, F. W.; MOFFATT, B. A. Use of Bacteriophage-T7 Rna-Polymerase to
Direct Selective High-Level Expression of Cloned Genes. J Mol Biol, v. 189, n. 1, p.
113-130, 1986.
TAYLOR, J. L.; WIECZOREK, A.; KEYSER, A. R.; GROVER, A.; FLINKSTROM,
R.; KARLS, R. K.; BIELEFELDT-OHMANN, H.; DOBOS, K. M.; IZZO, A. A. HspXmediated protection against tuberculosis depends on its chaperoning of a mycobacterial
molecule. Immunol Cell Biol, v. 90, n. 10, p. 945-954, 2012.
TEIXEIRA, H. C.; ABRAMO, C.; MUNK, M. E. Immunological diagnosis of
tuberculosis: problems and strategies for success. J Bras Pneumol, v. 33, n. 3, p. 323334, 2007.
TIMM, J.; POST, F. A.; BEKKER, L. G.; WALTHER, G. B.; WAINWRIGHT, H. C.;
MANGANELLI, R.; CHAN, W. T.; TSENOVA, L.; GOLD, B.; SMITH, I.; KAPLAN,
G.; MCKINNEY, J. D. Differential expression of iron-, carbon-, and oxygen-responsive
mycobacterial genes in the lungs of chronically infected mice and tuberculosis patients.
Proc Natl Acad Sci U S A, v. 100, n. 24, p. 14321-14326, 2003.
TUFARIELLO, J. M.; CHAN, J.; FLYNN, J. L. Latent tuberculosis: mechanisms of
host and bacillus that contribute to persistent infection. Lancet Infect Dis, v. 3, n. 9, p.
578-590, 2003.
TURNER, O. C.; BASARABA, R. J.; ORME, I. M. Immunopathogenesis of pulmonary
granulomas in the guinea pig after infection with Mycobacterium tuberculosis. Infect
Immun, v. 71, n. 2, p. 864-871, 2003.
VAN ALTENA, R.; DUGGIRALA, S.; GROSCHEL, M. I.; VAN DER WERF, T. S.
Immunology in tuberculosis: challenges in monitoring of disease activity and
identifying correlates of protection. Curr Pharm Des, v. 17, n. 27, p. 2853-2862, 2011.
VEKEMANS, J.; OTA, M. O.; SILLAH, J.; FIELDING, K.; ALDERSON, M. R.;
SKEIKY, Y. A.; DALEMANS, W.; MCADAM, K. P.; LIENHARDT, C.;
MARCHANT, A. Immune responses to mycobacterial antigens in the Gambian
population: implications for vaccines and immunodiagnostic test design. Infect Immun,
v. 72, n. 1, p. 381-388, 2004.
77
VILLARREAL-RAMOS, B.; MCAULAY, M.; CHANCE, V.; MARTIN, M.;
MORGAN, J.; HOWARD, C. J. Investigation of the role of CD8+ T cells in bovine
tuberculosis in vivo. Infect Immun, v. 71, n. 8, p. 4297-4303, 2003.
VITTOR, A. Y.; GARLAND, J. M.; SCHLOSSBERG, D. Improving the diagnosis of
tuberculosis: From QuantiFERON to new techniques to diagnose tuberculosis
infections. Curr HIV/AIDS Rep, v. 8, n. 3, p. 153-163, 2011.
VOLKMAN, H. E.; CLAY, H.; BEERY, D.; CHANG, J. C.; SHERMAN, D. R.;
RAMAKRISHNAN, L. Tuberculous granuloma formation is enhanced by a
mycobacterium virulence determinant. PLoS Biol, v. 2, n. 11, p. e367, 2004.
VON ESCHEN, K.; MORRISON, R.; BRAUN, M.; OFORI-ANYINAM, O.; DE
KOCK, E.; PAVITHRAN, P.; KOUTSOUKOS, M.; MORIS, P.; CAIN, D.; DUBOIS,
M. C.; COHEN, J.; BALLOU, W. R. The candidate tuberculosis vaccine
Mtb72F/AS02A: Tolerability and immunogenicity in humans. Hum Vaccin, v. 5, n. 7,
p. 475-482, 2009.
VON REYN, C. F. New studies of BCG: implications for tuberculosis vaccines. Lancet
Infect Dis, v. 12, n. 4, p. 259-260, 2012.
VOSKUIL, M. I.; SCHNAPPINGER, D.; VISCONTI, K. C.; HARRELL, M. I.;
DOLGANOV, G. M.; SHERMAN, D. R.; SCHOOLNIK, G. K. Inhibition of respiration
by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med,
v. 198, n. 5, p. 705-713, 2003.
WANG, C. C.; ZHU, B.; FAN, X.; GICQUEL, B.; ZHANG, Y. Systems Approach to
Tuberculosis Vaccine Development. Respirology, v., n., p., 2013.
WANG, J. Y.; CHOU, C. H.; LEE, L. N.; HSU, H. L.; JAN, I. S.; HSUEH, P. R.;
YANG, P. C.; LUH, K. T. Diagnosis of tuberculosis by an enzyme-linked immunospot
assay for interferon-gamma. Emerg Infect Dis, v. 13, n. 4, p. 553-558, 2007.
WANG, Y. H.; LIN, A. S.; LAI, Y. F.; CHAO, T. Y.; LIU, J. W.; KO, S. F. The high
value of high-resolution computed tomography in predicting the activity of pulmonary
tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, v. 7, n. 6, p. 563-568, 2003.
WEINRICH OLSEN, A.; VAN PINXTEREN, L. A.; MENG OKKELS, L.; BIRK
RASMUSSEN, P.; ANDERSEN, P. Protection of mice with a tuberculosis subunit
vaccine based on a fusion protein of antigen 85b and esat-6. Infect Immun, v. 69, n. 5,
p. 2773-2778, 2001.
78
WELSH, K. J.; RISIN, S. A.; ACTOR, J. K.; HUNTER, R. L. Immunopathology of
postprimary tuberculosis: increased T-regulatory cells and DEC-205-positive foamy
macrophages in cavitary lesions. Clin Dev Immunol, v. 2011, n., p. 307631, 2011.
WEYER, K.; CARAI, S.; NUNN, P. Viewpoint TB diagnostics: what does the world
really need? J Infect Dis, v. 204 Suppl 4, n., p. S1196-1202, 2011.
WHO, World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2012.
Geneva, 2012. Disponível em:
<http://who.int/tb/publications/global_report/gtbr12_main.pdf>. Acessado em: 24 mar.
2014.
WHO, World Health Organization. Anti-tuberculosis drug resistance in the world
Report Nº 4. . Geneva: World Health Organization WHO/HTM/TB/2008.2394, 2008.
WIKER, H. G.; HARBOE, M. The antigen 85 complex: a major secretion product of
Mycobacterium tuberculosis. Microbiol Rev, v. 56, n. 4, p. 648-661, 1992.
WILSON, R. A.; MAUGHAN, W. N.; KREMER, L.; BESRA, G. S.; FUTTERER, K.
The structure of Mycobacterium tuberculosis MPT51 (FbpC1) defines a new family of
non-catalytic alpha/beta hydrolases. J Mol Biol, v. 335, n. 2, p. 519-530, 2004.
WOODS, G. L. Molecular techniques in mycobacterial detection. Arch Pathol Lab
Med, v. 125, n. 1, p. 122-126, 2001.
YANG, H.; KRUH-GARCIA, N. A.; DOBOS, K. M. Purified protein derivatives of
tuberculin--past, present, and future. FEMS Immunol Med Microbiol, v. 66, n. 3, p.
273-280, 2012.
YUAN, Y.; CRANE, D. D.; SIMPSON, R. M.; ZHU, Y. Q.; HICKEY, M. J.;
SHERMAN, D. R.; BARRY, C. E., 3RD. The 16-kDa alpha-crystallin (Acr) protein of
Mycobacterium tuberculosis is required for growth in macrophages. Proc Natl Acad
Sci U S A, v. 95, n. 16, p. 9578-9583, 1998.
79
ANEXOS
Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética
80
81
Anexo 2 – Artigo Científico
82