Avaliação da participação da citocina IL
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Emília Souza Araújo Avaliação da participação da citocina IL-33 e de mastócitos na resposta imune protetora e na evolução das alterações pulmonares e intestinais induzidas pela infecção por Strongyloides venezuelensis em camundongos Belo Horizonte Instituto de Ciências Biológicas da UFMG 2014 Emília Souza Araújo Avaliação da participação da citocina IL-33 e de mastócitos na resposta imune protetora e na evolução das alterações pulmonares e intestinais induzidas pela infecção por Strongyloides venezuelensis em camundongos Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como pré-requisito para obtenção do grau de Doutor em Parasitologia. Área de Concentração: Imunoparasitologia Orientação: Profª Drª Deborah Negrão-Corrêa Belo Horizonte Instituto de Ciências Biológicas da UFMG 2014 2 LABORATÓRIOS ENVOLVIDOS Imunologia de Helmintos – ICB/UFMG – Profa. Dra. Deborah Ap. Negrão-Corrêa Mecanismos de Infecções Fúngicas –ICB/UFMG – Prof. Dr. Ary Corrêa Junior Genômica de Parasitos – ICB/UFMG – Prof. Dr. Ricardo Toshio Fujiwara Imunofarmacologia – ICB/UFMG – Prof. Dr. Mauro Martins Teixeira APOIO FINANCEIRO Programa de Incentivo a Pesquisa em Parasitologia Básica - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Capes Fundação de Amparo a Pesquisas do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG 3 AGRADECIMENTOS Agradeço em primeiro lugar a Deus por absolutamente tudo. Também a todos meus irmãos de luz que me auxiliam em minha caminhada. Aos meus pais Walter e Zilma. Pelo simples fato de me colocarem neste mundo maravilhoso já têm minha gratidão eterna. Pelo amor incondicional não há como agradecer, apenas retribuo igualmente com todo meu amor. Grata por sempre apoiarem minhas escolhas, meus caminhos, mesmo quando não pareciam fazer sentido. Às minhas queridas irmãs, Aline e Júlia, por todo carinho, apoio, força e auxílio em todas as minhas caminhadas. Têm todo meu amor. À minha orientadora Deborah, uma grande mestra. Por todo o aprendizado destes longos anos, por todo suporte, preocupação, paciência e pela grande dedicação na construção de minha vida profissional. Agradeço profundamente a confiança depositada em mim e reconheço que isto foi fundamental para que eu enxergasse e reconhecesse toda minha capacidade de transformar, superar e realizar. Agradeço também todo o carinho e compreensão sempre. À grande alquimista, Liliane, que vem a um bom tempo transformando “metal” em “ouro”. Agradeço por conduzir toda transformação em meu ser. Realizou um verdadeiro ofício de lapidação e extraiu da pedra bruta um belíssimo diamante. Aos meus grandes amigos de laboratório: Cíntia, Jaílza, Michelle, João, Paula, Vanessa, Vinicius, Izabella, Fernanda, Laura, Adriana, Ana Terezinha (in memorian), Fernando, Núbia, Márcia, Raquel, Flor e todos que tiveram uma passagem ainda que breve. Por todo auxílio e parceria, todo carinho, pela excepcional convivência, por tornarem os trabalhos mais fáceis e divertidos e pelos momentos de descontração únicos. Aos funcionários: Zé Carlos, Selma, Zenir, Sr. Alberto, Bete, Batata, Carlinhos. Por todo auxílio e solicitude sempre, dedicação, carinho e amizade. 4 Aos meus grandes amigos: Maria, Cris, Maria Fernandina, Bel, Neide, Fernanda, Guilherme, Thiago, Tico, Mariana, Ariane, Helena, Diego, Priscila. Por todo carinho, companheirismo, incentivo e prazerosa convivência. À minha tia Nira, por todo apoio, incentivo, conselhos e carinho. À minha tia Zilda (in memorian), por toda ajuda e carinho. À minha avó Terezinha, por auxiliar minha educação desde os tempos de escola até a faculdade. Agradeço imensamente todo incentivo e carinho de sempre. À minha avó Dadinha (in memorian), por todo auxílio, incentivo e carinho sempre. A todos meus familiares, pelo carinho e apoio. À eterna turma 9.8: Laila, Angélica, Alexandre, Pedro, Fernando, Rafaela, Letícia, Lanuze, Luíza. Pelas discussões de corredores, conselhos e incentivos valiosos e pela convivência maravilhosa. Ao Programa de Pós-graduação em Parasitologia da Universidade Federal de Minas Gerais pela oportunidade de desenvolver este trabalho e por todo apoio sempre. Aos órgãos financiadores Capes e Fapemig pela concessão da bolsa e todo apoio financeiro. A todos os outros grandes mestres que tive a abençoada oportunidade de conhecer e que de alguma forma contribuíram para que este meu trabalho fosse concluído com tanto êxito e sucesso. Em especial, aqueles que me auxiliaram de forma que eu concluísse este trabalho de maneira tão suave. Por fim, como não poderia deixar de ser, agradeço a mim mesma, por excepcional esforço, disposição, dedicação, por todo amor e carinho depositado em todas as tarefas e pela eterna confiança de que no fim tudo dá certo. Brilhei! 5 Para mi solo recorrer los caminos que tienen corazon, cualquier camino que tenga corazon. Por ahi yo recorro, y la única prueba que vale es atravesar todo su largo. Y por ahi yo recorro mirando, mirando, sin aliento. (Para mim só existe percorrer os caminhos que tenham coração, qualquer caminho que tenha coração. Ali viajo, e o único desafio que vale é atravessá-lo em toda a sua extensão. E por ali viajo olhando, olhando, arquejante.) - Dom Juan (Carlos Castaneda) 6 RESUMO A resposta inflamatória do tipo-2 induzida pela infecção por espécies de Strongyloides tem sido associada à proteção do hospedeiro. Entretanto, a participação de elementos da resposta inata na indução da resposta protetora ainda não foi estabelecida para estes nematódeos. Desta forma, o presente trabalho experimental teve como objetivo avaliar a participação da ativação da via IL-33/ST2 e de mastócitos no processo inflamatório e nas alterações patofisiológicas induzidas pela infecção experimental por S. venezuelensis. Para tanto, camundongos geneticamente deficientes na produção do receptor de IL-33 (ST2-/-), camundongos com uma mutação no lócus c-kit (SH) e seus respectivos controles foram infectados com 700 L3 S. venezuelensis /camundongo e a avaliação da infecção feita através de contagem de larvas no pulmão, vermes no intestino delgado e ovos liberados nas fezes. O processo inflamatório foi avaliado através da quantificação da concentração de citocinas e da caracterização do infiltrado celular no pulmão e intestino dos animais experimentais, e as alterações fisiológicas pulmonares foram estimadas pela variação na pressão intra-traqueal em resposta a inoculação de metacolina. Os dados mostram que a ausência da ativação da via IL33/ST2 afeta o controle das larvas de S. venezuelensis e a fecundidade dos vermes adultos, sem alterar significativamente o período de eliminação do parasito intestinal. Em comparação com camundongos selvagens, a infecção em ST2-/- não induz aumento da concentração de citocinas, especialmente do tipo 2, e reduz a produção das quimiocinas CXCL1 e CCL11 no homogenato pulmonar durante e após a migração das larvas. Aos 7 dias de infecção também foi verificado redução da concentração da maioria das citocinas no homogenato intestinal dos camundongos ST2-/- em relação aos selvagens. Nos animais ST2-/- a infecção por S. venezuelensis também resultou menor infiltração de eosinófilos e neutrófilos no pulmão e intestino e da mastocitose intestinal, além de retardo na elevação de concentração de IgE sérica, sugerindo atraso no estabelecimento da resposta do tipo-2. Entre os leucócitos recuperados do parênquima pulmonar de camundongos ST2-/- aos 4 dias de infecção foi verificado menor porcentagem de granulócitos e de linfócitos CD4+, sendo que entre os linfócitos CD4+ houve uma tendência a verificar uma menor porcentagem de células positivas para IL-4 que em camundongos não deficientes. Por outro lado, os animais deficientes não infectados apresentam número maior de linfócitos T regulatórios em relação Balb/c não infectados. Apesar das alterações no processo inflamatório pulmonar dos camundongos ST2-/-, a infecção por S. venezuelensis induz hiperreatividade brônquica aos 4 dias da infecção como detectado em camundongos selvagens, mas nos animais ST2-/- esta alteração fisiológica não se manteve até os 7 dias da infecção. A avaliação comparativa da infecção por S. venezuelensis em camundongos selvagens e mutantes no locus c-kit (não diferenciam mastócitos) não detectou diferenças significativas no processo inflamatório pulmonar. No intestino dos animais infectados, a ausência de mastócitos resultou em redução transitória da produção de IL-4 e IL-10, que não afeta significativamente a infiltração de neutrófilos e eosinófilos, mas impede a eliminação do parasito no período normal. Os resultados indicam que a ativação do receptor ST2 participa da indução da resposta imune do tipo-2, reduzindo produção de IgE, eosinófilia e mastocitose induzida pela infecção por S. venezuelensis, afetando o controle precoce do parasito, mas não é essencial para eliminação do mesmo, enquanto mastócitos participam da resposta imune adquirida atuando na resolução da infecção. Palavras chave: IL-33/ST2, mastócitos, Strongyloides venezuelensis, pulmão, intestino. 7 ABSTRACT Evaluation of the IL-33/ST2 and mast cell activation on the protective immune response and on pathophysiologic changes of lung and intestine induced by infection with Strongyloides venezuelensis in mice The role of the innate immune response in the induction of protective mechanism against Strongyloides venezuelensis has not been established yet. Thus, this experimental study aimed to evaluate the role of activation of the IL-33 / ST2 and mast cells in the inflammatory process and the pathophysiologic changes induced by experimental infection with S. venezuelensis. For this purpose, mice genetically deficient in producing the IL-33 receptor (ST2 - / -), mice with a mutation in the c-kit locus (SH) and the respective controls were challenged with 700 L3 S. venezuelensis / mouse and the infection was evaluated by counting the larvae in the lung, the worm in the small intestine and the parasite eggs released in the faeces. The inflammatory process was evaluated by measuring the concentration of cytokines and characterization of the cellular infiltration in lung and gut of the experimental animals, physiological changes in lung were estimated by the variation of intra-tracheal pressure in response to methacholine inoculation. The results indicate that the absence of activation of the IL33 / ST2 affects the control of larvae at the beginning of the infection and the fecundity of adult worms, without significantly altering the period of elimination of the intestinal parasite. In contrast to the wild type mice, the parasite infection in ST2-/- mice did not induce production of different cytokine in lung homogenate after larvae migration. Moreover, ST2-/- mice also showed lower level of CXCL1 in lung during the larvae migration and reduction of CCL11 later in infection. At 7dpi there was also lower concentration of cytokines, especially of type 2, in gut of ST2 -/- infected mice compared to WT infected animals, but the cytokine production in intestine was re-stablished later in infection. The reduction in cytokine and chemokine production observed in ST2-/infected mice was accompanish by delay in IgE stimulation, lower eosinophil infiltration in lung and intestine and significant reduction in intestinal mastocytosis, but it did not alter the goblet cell differentiation induced by the parasite infection. Among leukocytes isolated from the lungs of 4 day-infected ST2-/- mice there was a significant reduction in granulocytes and CD4+ Tcell populations compared to wild-type infected mice. Moreover, the CD4+ Tcell also had lower percentage of IL-4 expression in infected and higher proportion of Treg in uninfected ST2-/- mice. Despite the changes in pulmonary inflammatory process of ST2-/- mice, the infection by S. venezuelensis induces bronchial hyperreactivity, but different from the wild-type mice, in ST2-/- the hyperresponsiveness was no longer detected at 7 days after infection. A comparative evaluation of the infection by S. venezuelensis showed no significant differences in pulmonary inflammation induced by the parasite in mice lacking mast cells comparing with their wild type controls. In the intestine, the absence of mast cells leads to a transient decrease of IL-4 and IL-10, which does not affect significantly the infiltration of neutrophils and eosinophils, but prevents the elimination of the parasite in the normal period. The results suggest that ST2 receptor activation participate in the development of type 2 immune response, reducing the infiltration of eosinophils and mastocytosis typically induced by S. venezuelensis infection that would affect the early control the parasite, but is not essential for the parasite elimination. In contrast, mast cell deficient animal had a strong impact in the resolution of infection. Keywords: IL-33/ST2, mast cells, Strongyloides venezuelensis, lung, gut 8 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - DELINEAMENTO EXPERIMENTAL DOS CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/- .................................... 46 FIGURA 2- DELINEAMENTO EXPERIMENTAL DOS CAMUNDONGOS SHC E SH .............................................. 48 FIGURA 3 - NÚMERO DE LARVAS NO PULMÃO DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/- . ................................... 59 FIGURA 4 - NÚMERO DE VERMES NO INTESTINO DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/- . ................................ 60 FIGURA 5 – NÚMERO DE OVOS ELIMINADO NAS FEZES (A) E FECUNDIDADE DAS FÊMEAS DO PARASITO (B) .......................................................................................................................................................... 62 FIGURA 6 – CONCENTRAÇÃO TOTAL DE IGE NO SORO DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/- ........................ 63 FIGURA 7 – NÍVEIS DE IGG1 E IGM REATIVOS AOS ANTÍGENOS SOLÚVEIS DE L3 DE S. VENEZUELENSIS NO SORO DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2 -/- . ........................................................................................ 65 FIGURA 8 - AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE LEUCÓCITOS TOTAIS RECUPERADOS NO LAVADO BRONCOALVEOLAR DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2 -/- . ............................................................................... 66 FIGURA 9 - NÚMERO DE EOSINÓFILOS, NEUTRÓFILOS, LINFÓCITOS E OUTRAS MONONUCLEARES (MASTÓCITOS E MACRÓFAGOS) NO LAVADO BRONCOALVEOLAR DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/-. .......................................................................................................................................................... 68 FIGURA 10 – FOTO DE CÉLULAS DO LAVADO BRONCOALVEOLAR DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/-...... 69 FIGURA 11 – ATIVIDADE DE PEROXIDASE DE EOSINÓFILOS (EPO) (A) E DE MIELOPEROXIDASE DE NEUTRÓFILOS (MPO) (B) NO HOMOGENATO PULMONAR DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2 -/- . ......... 71 -/- FIGURA 12 – FOTOMICROGRAFIAS DO PULMÃO DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2 CORADOS POR HEMATOXILINA-EOSINA E POR PAS .................................................................................................. 73 FIGURA 13 – CONCENTRAÇÃO DE QUIMIOCINAS CXCL1 E CCL11 NO HOMOGENATO PULMONAR DE -/- CAMUNDONGOS BALB/C E ST2 ........................................................................................................ 75 FIGURA 14 – CONCENTRAÇÃO DE INTERLEUCINAS IL-13, IL-4, IL-5, IL-10, IL-17, TNF-ΑLFA, INF-GAMA NO HOMOGENATO PULMONAR DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2 -/- . .................................................. 77 FIGURA 15 - PERFIL DE LEUCÓCITOS ISOLADOS DE PULMÃO DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/- . ............. 79 FIGURA 16 - PERFIL CELULAR E DE GRANULÓCITOS CD193+ F4/80- ISOLADOS DE PULMÃO DE -/- CAMUNDONGOS BALB/C E ST2 ........................................................................................................ 80 FIGURA 17 - PERFIL CELULAR E DE MACRÓFAGOS F4/80+ ISOLADOS DE PULMÃO DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2 -/- .............................................................................................................................................. 82 FIGURA 18 - PERFIL CELULAR E DE LINFÓCITOS CD3+ OU CD19+ ISOLADOS DE PULMÃO DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/- ................................................................................................................................. 83 FIGURA 19 - PERFIL DE LINFÓCITOS CD4+ ISOLADOS DE PULMÃO DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/-....... 84 FIGURA 20 - PERFIL DE LINFÓCITOS CD4+ CD25+ FOXP3+ ISOLADOS DE PULMÃO DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/-. ................................................................................................................................ 85 FIGURA 21 - PORCENTAGEM DE AUMENTO DA PRESSÃO INTRA-TRAQUEAL DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/- . ............................................................................................................................................... 87 FIGURA 22 – FOTOMICROGRAFIAS DO INTESTINO CORADOS POR HE E PAS DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/-. ................................................................................................................................................ 89 9 FIGURA 23 – ATIVIDADE DE PEROXIDASE DE EOSINÓFILOS (EPO) (A) E DE MIELOPEROXIDASE DE NEUTRÓFILOS (MPO) (B) NO HOMOGENATO INTESTINAL DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2 -/- . ......... 91 FIGURA 24 – FOTOMICROGRAFIAS DO INTESTINO CORADOS POR ALCIAN-BLUE DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2 -/- . ............................................................................................................................................. 93 FIGURA 25 – NÚMERO DE MASTÓCITOS PRESENTES POR VILOSIDADE INTESTINAL DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2-/-. ................................................................................................................................ 94 FIGURA 26 – CONCENTRAÇÃO DE INTERLEUCINAS IL-4, IL-10, IL-13, IL-17, TNF-ALFA E TGF-ΒETA NO -/- HOMOGENATO INTESTINAL DE CAMUNDONGOS BALB/C E ST2 . ....................................................... 96 FIGURA 27 - NÚMERO DE LARVAS NO PULMÃO DE CAMUNDONGOS SHC E SH. .......................................... 97 FIGURA 28 - NÚMERO DE VERMES NO INTESTINO DE CAMUNDONGOS SHC E SH. ....................................... 98 FIGURA 29 – NÚMERO DE OVOS POR GRAMA DE FEZES (OPG) DE CAMUNDONGOS SHC E SH E FECUNDIDADE DAS FÊMEAS DE S. VENEZUELENSIS PRESENTES EM CAMUNDONGOS SHC E SH. ........ 100 FIGURA 30 - AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE LEUCÓCITOS RECUPERADOS NO LAVADO BRONCO-ALVEOLAR DE CAMUNDONGOS SHC E SH. ............................................................................................................. 103 FIGURA 31 – FOTO DE CÉLULAS DO LAVADO BRONCOALVEOLAR DE CAMUNDONGOS SHC E SH. ............. 104 FIGURA 32 – ATIVIDADE DE PEROXIDASE DE EOSINÓFILOS (EPO) (A) E DE MIELOPEROXIDASE DE NEUTRÓFILOS (MPO) (B) NO HOMOGENATO PULMONAR DE CAMUNDONGOS SHC E SH. ................ 106 FIGURA 33 – CONCENTRAÇÃO DE INTERLEUCINAS IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, TNF-ΑLFA E IFN-GAMA NO HOMOGENATO PULMONAR DE CAMUNDONGOS SHC E SH.......................................................... 108 FIGURA 34 - PORCENTAGEM DE AUMENTO DA PRESSÃO INTRA-TRAQUEAL DE CAMUNDONGOS SHC E SH ........................................................................................................................................................ 110 FIGURA 35 – NÍVEIS DE PEROXIDASE DE EOSINÓFILOS (EPO) (A) E MIELOPEROXIDASE DE NEUTRÓFILOS (MPO) (B)NO HOMOGENATO INTESTINAL DE CAMUNDONGOS SHC E SH. ...................................... 112 FIGURA 36 – CONCENTRAÇÃO DE INTERLEUCINAS IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, TNF-ΑLFA E IFN-GAMA NO HOMOGENATO INTESTINAL DE CAMUNDONGOS SHC E SH ......................................................... 114 10 LISTA DE ABREVIATURAS ΔdblGATA - Camundongos deficientes na maturação de eosinófilos µMT-/- - Camundongos deficientes na produção da cadeia pesada µ. Abs - Absorbância Ag – Antigeno AID-/- - Activation-induced cytidine deaminase knockout mice AIDS – Sindrome da imunodeficiência adquirida AHR – Hiperreatividade brônquica AMCase – Acidic mammalian chitinase ANOVA - Análise de variância APC – Células apresentadoras de antígeno ATII – Células epiteliais alveolares do tipo 2 BSA - Bovine Serum Albumin CCL – Quimiocina (C-C motif) ligand CD - Cluster of differentiation CEBIO - Centro de Bioterismo CETEA - Comitê de ética em experimentação animal CS – Cromolyn Sodium CXCL – Quimiocina (C-X-C motif) ligand DMSO - Dimetilsulfóxido DNA - Deoxyribonucleic Acid DPI - Dias após infecção EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid ELISA - Enzyme-linked immuno sorbent assay EP – Erro padrão EPO - Peroxidase de Eosinófilo FACS - Fluorescence Activated Cell Sorter FcR – Receptor de Imunoglobulina FSC – Forward Scatter FITC - Fluorescein isothiocyanate FoxP3 – Forkhead Box P3 GM-CSF - Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor HE – Hematoxilina e eosina HIV – Vírus da imunodeficiência humana HRP - Horseradish peroxidase HTAB - Hexadecyltrimethylammonium Bromide HTLV-1 - Vírus linfotrópico para células T Humanas do tipo 1. ICB - Instituto de Ciências Biológicas IDO – Indoleamina 2,3-dioxigenase IFN-γ - Interferon Gama Ig - Imunoglobulina Ih2 – Innate helper type 2 IL - Interleucina IL4R - Receptor de interleucina 4 IL4Rα - Receptor do tipo alfa de interleucina 4 ILCs2 – Linfócitos inatos do tipo 2 KYN – L-quinurerina 11 L1 - Larva de primeiro estágio L2 – Larva de segundo estágio L3 - Larva de terceiro estágio LBA – Lavado broncoalveolar M3 – receptor muscarínico 3 MAP kinase – Mitogen-activated protein MBP – Proteína básica principal mMCP1 – Mast cell protease 1 MPO – Mieloperoxidase de neutrófilo MPPtype2 – Multipotent progenitors (type2) mRNA – RNA mensageiro NF-κB – Fator nuclear kappa B NH – Natural helper NKT – Natural Killers T OPD - O-Phenylenediamine Dihydrochloride OPG – Ovos por grama de fezes OVA - Ovalbumina PAS – Ácido periódico de Schiff PBS - Phosphate Buffered Saline PE – Phycoeritrin PEEP – Pressão positiva expiratória final PerCP - Peridinin-chlorophyll-protein complex RELM - Resistin-Like Molecule RMCPII – Protease tipo quimiotripsina RPMI - Roswell Park Memorial Institute (Meio de Cultura) SCF - Stem Cell Factor SCID - Severe Combined Immunodeficiency SFB – Soro fetal bovino SH – Camundongos mutantes que não diferenciam mastócitos. Kitw-sh knockout mice SHC – Camundongos selvagens, controles dos camundongos SH SIGRR – Single Ig IL-1R-related molecule SSC – Side Scatter STAT - Signal Transducers and Activators of a Transcription ST2 – receptor da citocina IL-33 ST2L – recpetor ST2 ligado a membrana ST2-/- - Camundongos deficientes para o receptor ST2 sST2 – receptor ST2 solúvel T1/ST2 – Gene que codifica receptor ST2 TGF-β – Tumor Growth Factor Beta Th-1 - Linfócitos T CD4+ auxiliares do tipo 1 Th-2 - Linfócitos T CD4+ auxiliares do tipo 2 TLR - Toll-like receptor TMB - Tetrametilbenzidina TNF-α - Tumor Necrosis Factor Alpha TSLP - Thymic Stromal Lymphopoietin UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais WT - Camundongos Selvagens W/WV - Camundongos que apresentam deficiência na diferenciação de mastócitos YM1 – Quitinase produzida por macrófagos 12 SUMÁRIO 1 - INTRODUÇÃO ............................................................................................ 15 1.1- Ciclo de desenvolvimento de Strongyloides .......................................... 18 1.2- Resposta imune induzida pelo parasito: mecanismos de proteção e patologia ....................................................................................................... 21 1.3 – IL-33 e mastócitos................................................................................ 31 2- JUSTIFICATIVA ........................................................................................... 39 3 - OBJETIVOS ................................................................................................ 40 3.1- Objetivo Geral ........................................................................................ 40 3.2- Objetivos Específicos ............................................................................ 40 4-METODOLOGIA ........................................................................................... 42 4.1- Animais experimentais........................................................................... 42 4.2- Parasito ................................................................................................. 43 4.3- Obtenção das larvas filarioides, infecção e produção de antigeno ........ 43 4.4-Delineamento experimental .................................................................... 45 4.5-Avaliação parasitológica da infecção ...................................................... 49 4.6- Avaliação da pressão intra-traqueal ...................................................... 49 4.7- Composição celular do infiltrado pulmonar ............................................ 50 4.8 - Obtenção de células inflamatórias do parênquima pulmonar e avaliação do perfil celular recuperado .......................................................................... 51 4.9 - Obtenção do homogenato pulmonar e intestinal .................................. 52 4.10 - Avaliação da produção de citocinas e quimiocinas ............................ 53 4.11 - Avaliação indireta da infiltração de Eosinófilos e Neutrófilos .............. 54 4.12- Análise histopatológica ........................................................................ 55 4.13 - Avaliação da produção de Imunoglobulinas ....................................... 56 4.14 – Análise estatística .............................................................................. 58 5 – RESULTADOS ........................................................................................... 59 ANIMAIS ST2-/- E BALB/C ............................................................................ 59 5.1 - Avaliação parasitológica da infecção de animais ST2-/- e Balb/c .......... 59 5.2 - Avaliação imunológica de animais ST2-/- e Balb/c ................................ 63 5.2.1 - Avaliação da resposta humoral ...................................................... 63 13 5.2.2 - Caracterização do infiltrado celular pulmonar ................................ 66 5.2.3 - Análise das alterações histopatológicas pulmonares ..................... 72 5.2.4 - Quantificação de quimiocinas de pulmão ....................................... 74 5.2.5 - Quantificação de citocinas do pulmão............................................ 76 5.2.6 - Citometria de fluxo ......................................................................... 78 5.3 - Avaliação da função pulmonar de animais ST2-/- e Balb/c.................... 86 5.4 - Avaliação das alterações histopatológicas intestinais e infiltração/ativação celular de animais ST2-/- e Balb/c................................... 88 5.5 - Avaliação imunológica no intestino de animais ST2-/- e Balb/c ............. 90 5.5.1 - Avaliação do infiltrado celular intestinal ......................................... 90 5.5.2 – Quantificação de citocinas do intestino ......................................... 95 ANIMAIS SH E SHC ..................................................................................... 97 5.6 - Avaliação parasitológica da infecção de animais SH e SHC ................ 97 5.7 - Avaliação imunológica de animais SH e SHC .................................... 101 5.7.1 - Avaliação do infiltrado celular pulmonar ....................................... 101 5.7.2 - Quantificação de citocinas do pulmão .......................................... 107 5.8 - Avaliação da função pulmonar de animais SH e SHC ........................ 109 5.9 - Avaliação imunológica no intestino de animais SH e SHC ................. 111 5.9.1 - Avaliação do infiltrado celular intestinal ....................................... 111 5.9.2 – Quantificação de citocinas do intestino ....................................... 113 6 - DISCUSSÃO ............................................................................................. 115 7 - CONCLUSÕES ......................................................................................... 131 8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 133 14 1 - INTRODUÇÃO Os nematódeos parasitos gastrintestinais são agentes infecciosos que apresentam alta prevalência na população humana, sendo estimado que mais de 1 bilhão de pessoas no mundo estejam infectadas com uma ou mais espécie destes parasitos (De Silva et al. 2003; Bethony et al. 2006). Estes dados representam uma estimativa da prevalência global obtida a partir de estudos regionais (Chan et al. 1994; Chan 1997; Bundy et al. 2004) e tem permitido avaliar a morbidade de doenças devido a nematódeos intestinais no estudo de Carga Global de Doenças (Murray & Lopez 1996; Mathers et al. 2007; Brooker 2010). Apesar da infecção por nematódeos ser amplamente distribuída na população humana, estes parasitos afetam principalmente a população residente em países em desenvolvimento, localizados em regiões tropicais e subtropicais do globo (Chan 1997; Khan & Collins 2004). A infecção produzida por nematódeos gastrintestinais está associada à mortalidade relativamente baixa, sendo que esta mortalidade ocorre principalmente em crianças gravemente infectadas. Entretanto, a morbidade induzida por nematódeos é bastante expressiva. Estudos epidemiológicos mostram que, além dos danos diretos ao hospedeiro, que incluem deficiência nutricional, anemia e perda de peso (Stephenson et al. 2000), crianças intensamente infectadas podem apresentar retardo de crescimento, afetando também funções cognitivas e reduzindo a capacidade de aprendizado, que pode afetar a produtividade na fase adulta do indivíduo (Cooper & Bundy 1988; Nokes et al. 1992; Guyatt 2000). Entre os nematódeos parasitos humanos tem sido ressaltada a importância da infecção produzida por Strongyloides stercoralis. O gênero Strongyloides pertence ao Filo Nematoda, Classe Secernentea, Ordem Rhabditida e Família Strongyloididae (Adamson 1987). Entretanto, estudos filogenéticos baseados na análise de genes da subunidade do RNA ribossomal de mais de 300 espécies de nematódeos propõem nova classificação do filo Nematoda, sendo o gênero Strongyloides agora incluído dentro da Classe Chromadorea, Ordem Rhabditida, Subordem Tylenchina, Infraordem Panagrolaimomorpha, Superfamília Strongyloidoidea e Família Strongyloididae (Blaxter et al. 1998). Os dados de prevalência da estrongiloidose são ainda muito controversos. De acordo com Siddiqui e Berk (2003), a estrongiloidose atinge de 30 a 100 milhões de pessoas em 70 países, sendo a maioria destes países localizados em regiões tropicais e subtropicais do sudeste da Ásia, na América Latina e África. A infecção por S. 15 stercoralis é considerada a quarta mais importante infecção por nematódeo intestinal, após ancilostomídeos, Ascaris lumbricoides e Trichuris trichiura (Stephenson et al. 2000). A prevalência estimada em humanos residentes em áreas endêmicas é muito variada, normalmente superior a 5%, sendo maior em indivíduos mais jovens (Viney & Lok 2007), embora estudo recente tenha também demonstrado alta prevalência em indivíduos idosos em grupo analisado na cidade de Uberlândia, MG, Brasil (Naves & Costa-Cruz 2013). Em revisão publicada Paula e Costa-Cruz (2011) mostraram um apanhado dos estudos epidemiológicos dessa parasitose no Brasil publicados entre os anos de 1990 e 2009. Ficou demonstrado que nesse período de tempo a média da prevalência, utilizando diferentes métodos diagnósticos, foi de 5.5%, o que caracteriza o país como área endêmica para estrongiloidose. Essa revisão demonstrou que a distribuição dessa helmintíase não é uniforme no território nacional sendo que a prevalência da mesma é de 5.3% no Norte brasileiro, 7.9% no Nordeste, 6.6% no Centro-Oeste, 3.9% no Sudeste e 4.0% na região Sul. Essa variação não ocorre ao comparar as áreas urbanas e rurais, onde as prevalências foram de 5.0% e 4.8% respectivamente (Paula & Costa-Cruz 2011). Esse trabalho de revisão considerou estudos epidemiológicos utilizando tanto amostras fecais, quanto amostras sorológicas. Dessa maneira, os autores ressaltam que a diversidade dos métodos diagnósticos utilizados nos estudos analisados contribui para que o conhecimento sobre a epidemiologia dessa parasitose seja irregular (Paula & Costa-Cruz 2011). A maioria dos especialistas considera que as estimativas de prevalência desta infecção estão muito subestimadas, especialmente devido à dificuldade de diagnostico clínico e laboratorial com boa sensibilidade (Agrawal et al. 2009; Olsen et al. 2009; Krolewiecki et al. 2013; Puthiyakunnon et al. 2014). Mais recentemente, um estudo revisou a literatura dos últimos 20 anos sobre registro das taxas de infecção por S. stercoralis (Schär et al. 2013), demonstrando que a prevalência global da estrongiloidose humana é tão diversa e heterogênea quanto o tipo e número de estudos avaliados. Apesar disso, a informação existente sugere que infecções por S. stercoralis podem afetar entre 10 e 40% da população em muitos países tropicais e subtropicais do globo, sendo que países pobres em recursos e com cenários ecológicos e sócio-econômicos favoráveis a propagação de S. stercoralis, elevadas taxas de infecção de até 60% podem ser encontradas. Em relação aos países desenvolvidos, alguns estudos demonstram que a estrongiloidose é endêmica no sul, leste e região central da Europa (Vadlamudi et al 2006) além de terem sido relatados casos de infecção isolada em partes do sudeste dos Estados Unidos (Genta 1989). 16 Embora não haja um consenso entre os vários estudos de prevalência da infecção por S. stercoralis em humanos, fato importante a respeito da estrongiloidose é que esta é uma parasitose que apresenta dificuldades de controle devido ao difícil diagnóstico e à cronicidade associada ao fenômeno de autoinfecção que ocorre no ciclo de S. stercoralis (Liu & Weller 1993). As infecções crônicas produzidas por S. stercoralis são, em cerca de 50% dos casos, clinicamente assintomáticas ou apresentam sintomatologia pouco específica, porém, em alguns casos, a autoinfecção pode levar a um intenso aumento da carga parasitária com disseminação das larvas infectantes do parasito pelo hospedeiro, sendo que nesses casos a infecção é fatal em até 87% dos pacientes (Siddiqui & Berk 2001; Siddiqui & Berk 2003; Concha et al. 2005). Estima-se que casos de infecção exacerbada ocorra entre 1,5 a 2,5% dos pacientes com estrongiloidose (Milder et al. 1981), observando-se dor abdominal severa, diarréia aquosa, perda de peso, náuseas, vômitos, constipação, prurido anal e algumas vezes sangramento gastrointestinal e obstrução intestinal subaguda (Concha et al. 2005; Vadlamudi et al. 2006). Além disso, observam-se nos pacientes com infecção exacerbada, devido à migração da larva, sintomas pulmonares, tais como tosse, diminuição da taxa de respiração, chiado e infiltrado pulmonar transitório (Concha et al. 2005). Na estrongiloidose disseminada, o envolvimento de outros órgãos como sistema nervoso central pode ser visto (Kothary et al. 1999), com sintomas incluindo dor de cabeça, estado mental alterado e, em casos extremos, coma (Concha et al. 2005). A meningite bacteriana também é freqüente, sendo que a maior parte dessas infecções secundárias resulta da invasão de bactérias da flora intestinal que penetram através do epitélio danificado pelo verme e invadem os tecidos do hospedeiro. A maioria destes pacientes (83%-87%) vai a óbito (Link et al. 1999). Na estrongiloidose humana o processo de autoinfecção pode ser interno, quando larvas rabditóides, ainda na luz intestinal, transformam-se em larvas filarioides que penetram na mucosa intestinal. Também tem sido relatada a possibilidade de autoinfecção externa, quando larvas rabditoides presentes na região perianal do hospedeiro transformam-se em larvas filarioides infectantes e aí penetram, completando o ciclo direto (Grove 1996; Concha et al. 2005; Vadlamudi et al. 2006). Os casos de infecção exacerbada e disseminação do parasito estão geralmente associados a um estado de imunossupressão do hospedeiro, que pode ser decorrente de uso continuado de drogas imunossupressoras, ou por infecções que afetem a resposta imune do hospedeiro, tais como a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) e infecção pelo 17 vírus linfotrópico para células T humanas tipo 1(HTLV-1) (Genta 1989; Grove 1996; Porto et al. 2002; Concha et al. 2005; Vadlamudi et al. 2006). Entretanto, estudos sobre a associação entre AIDS e infecção exacerbada/disseminação do parasito têm sido controversos. Recentemente, um estudo de Siegel e Simon (2012) discutiu dados que mostram que apesar da prevalência de estrongiloidose ser maior em indivíduos HIV positivo em comparação aos HIV negativos, esta propensão aumentada para infecção por S. stercoralis em indivíduos aidéticos não parece ser preditiva para incidência aumentada de hiperinfecção e disseminação. O estudo justifica a baixa associação entre HIV e estrongiloidose disseminada ao fato de que a infecção por HIV resultar primariamente em perda de atividade Th1, sendo que a atividade Th2, que tem sido relacionada com proteção contra nematódeos, é pouco comprometida ou pode até ser acentuado nos indivíduos HIV positivo. De qualquer forma, porém, o controle da estrongiloidose humana está diretamente associado à capacidade do hospedeiro de montar uma resposta imunológica protetora. Devido à alta prevalência e a morbidade associada às infecções por nematódeos, torna-se justificável a realização de estudos que gerem um melhor conhecimento das alterações fisiológicas, patológicas e imunológicas induzidas por estes parasitos em seus hospedeiros, estudos estes que podem servir de subsídio no desenvolvimento de novas estratégias de diagnóstico e controle para estas infecções parasitárias. Muito do conhecimento relativo à interação Nematódeo-Hospedeiro é resultado de estudos realizados em modelos experimentais de infecção por Trichinella spiralis, Nippostrongylus brasiliensis e Trichuris muris (Khan e Collins 2004), Strongyloides ratti (Satou et al. 2001) e S. venezuelensis (Negrão-Corrêa et al 2003) em roedores mantidos em laboratórios, especialmente camundongos pela facilidade de manutenção, manipulação e pela disponibilidade de ferramentas e reagentes que permitem uma análise mais específica. 1.1- Ciclo de desenvolvimento de Strongyloides Em relação ao ciclo de vida, as espécies do gênero Strongyloides apresentam como característica diferenciada dos demais nematódeos parasitos o fenômeno de alternância de gerações de vida livre e vida parasitária. Desta forma, as larvas de 1º estádio (L1) presentes no meio externo podem sofrer quatro mudas formando machos e 18 fêmeas rabditóides de vida livre. Estas fêmeas após serem inseminadas pelos machos podem originar novas gerações de vida livre e/ou larvas infectantes, que precisam penetrar no hospedeiro vertebrado para completar seu desenvolvimento. Na maioria das espécies de Strongyloides como é no caso do S. stercoralis, observa-se somente uma geração de vida livre (Yamada et al. 1991; Viney & Lok 2007). Este tipo de desenvolvimento é conhecido como ciclo de vida livre, heterogônico ou indireto. Alternativamente, o desenvolvimento destes parasitos pode se processar de maneira direta, no qual as larvas L1 que eclodem dos ovos transformam-se em L2 e posteriormente originam as larvas filarióides (L3) que são infectantes ao hospedeiro vertebrado (Grove 1996; Viney & Lok 2007). Os fatores que determinam o desenvolvimento do ciclo de vida direto ou indireto das larvas de Strongyloides ainda não estão completamente esclarecidos. Entretanto fatores genéticos, estado nutricional e imunológico do hospedeiro e as condições ambientais às quais as larvas de vida livre estão expostas influenciam nesta determinação (Arizono 1976; Shiwaku et al 1988; Berezhnaia et al. 1991; Grove 1996; Viney 1996; Viney 1999; Harvey & Viney 2001; Viney & Lok 2007). Utilizando a espécie S. ratti, Viney (1996), verificou que larvas fêmeas se desenvolvem preferencialmente em fêmeas adultas de vida livre quando em temperaturas mais altas que a do hospedeiro que liberou as fezes contaminadas. Também foi relatado que cepas do parasito isoladas de regiões tropicais desenvolvem-se predominantemente pelo ciclo indireto, enquanto que cepas de regiões temperadas tendem ao desenvolvimento direto, principalmente a temperaturas mais baixas (Berezhnaia et al. 1991). Em estudos com S. stercoralis, Shiwaku e colaboradores (1988), verificaram que nem temperatura nem o grau de diluição das fezes alteravam o surgimento de machos de vida livre, mas o aumento destes dois fatores induzia aumento do número de larvas filarióides, indicando que a determinação de machos ocorre no ovo enquanto desenvolvimento em fêmeas de vida livre ou larvas filarióides é determinado de acordo com circunstâncias ambientais. Isto foi corroborado por Harvey e Viney (2001), que demonstraram que todas as formas evolutivas de S. ratti são diplóides e que a determinação sexual é genética. Neste trabalho os autores verificaram que as fêmeas apresentavam seis cromossomos, sendo 2 cromossomos sexuais (2n=6, XX) e machos apresentavam apenas 5 cromossomos, recebendo apenas um dos cromossomos sexuais (2n=5, X0). Na determinação do desenvolvimento das fêmeas de vida livre e parasitas, além de fatores do meio externo, como temperatura e nutrientes, foi demonstrado que as larvas de S. ratti oriundas de fêmeas que parasitam hospedeiro com resposta 19 imunológica já estabelecida originam uma maior proporção de fêmeas de vida livre (Harvey et al. 2000; Viney & Lok 2007). Portanto, é provável que a diferenciação entre fêmeas de vida livre aconteça devido à diferenciação na expressão gênica, que pode ser influenciada pela resposta imune do hospedeiro, disponibilidade de nutrientes e temperatura ambiental, entre outros fatores (Viney 1999). A larva filarióide oriunda do desenvolvimento direto ou indireto é morfologicamente semelhante e geralmente a infecção ocorre quando a larva L3 penetra ativamente através da pele do hospedeiro vertebrado. Em camundongos, a infecção por S. venezuelensis ocorre pela penetração ativa das larvas filarióides (larvas de 3º estádio ou L3) pela pele ou mucosa do hospedeiro, seguido por migração das larvas por tecidos subcutâneos e musculares, onde permanecem até 42 h pós-infecção (Negrão-Corrêa 1990; Takamure 1995). Esta migração ocorre de maneira diferente para larvas de S. stercoralis, já que nesta espécie a migração após a penetração pela pele é feita preferencialmente através de circulação venosa ou linfática até chegarem ao pulmão (Grove 1996; Viney & Lok 2007). No caso das larvas de S. venezuelensis em camundongos, estas chegam ao pulmão, a partir de 36 h pós-infecção e saem do órgão gradualmente passando pela traquéia, esôfago e estômago até atingir o intestino delgado, entre 48h e 96h pós-infecção, se instalando na porção inicial do duodeno. Após o estabelecimento no intestino do hospedeiro, as larvas do parasito completam seu desenvolvimento e amadurecimento sexual, se transformando em fêmeas adultas. Em infecções experimentais de camundongos, as fêmeas do parasito começam a produzir ovos após 5 dias de infecção, sendo que a maior fecundidade foi observada no 7º dia pós-infecção (Negrão-Corrêa 1990; Takamure 1995). Na superfície mucosa os vermes adultos invadem o espaço intercelular das células epiteliais e se movem ativamente entre elas, deixando túneis por onde migraram (Dawkins et al. 1983). Eles não penetram na lâmina própria através da membrana basal, sugerindo que os vermes se movem para dentro e para fora da camada epitelial repetidamente durante o curso da infecção (Dawkins 1989). Substâncias adesivas de natureza glicoprotéica são secretadas oralmente pelo parasito e são estas substâncias que permitem a adesão dos vermes na camada epitelial da mucosa intestinal e a conseqüente invasão da mesma pelo parasito (Maruyama et al. 1997). A infecção por S. stercoralis em humanos pode levar ao processo conhecido como autoinfecção, em que algumas das larvas L1 que eclodem dos ovos eliminados pelas fêmeas partenogenéticas podem se desenvolver em L3 ainda na luz intestinal do homem e penetrar a mucosa intestinal reinfectando o hospedeiro 20 (Grove & Northern 1989). No caso da infecção por S. venezuelensis em camundongos é espontaneamente eliminada pelo hospedeiro, sendo relatada uma redução significativa dos vermes aos 10dpi, e aos 14dpi os camundongos já estão livres da infecção. Em camundongos infectados por S. venezuelensis, diferentemente de humanos expostos ao S. stercoralis, não é observado o fenômeno de autoinfecção e os camundongos previamente expostos adquirem forte resistência à reinfecção, sendo que a maioria das larvas é eliminada ainda durante o processo de migração (Sato & Toma 1990; Fernandes et al. 2008). 1.2- Resposta imune induzida pelo parasito: mecanismos de proteção e patologia A infecção por nematódeos gastrintestinais, como Strongyloides venezuelensis, induz eosinofilia, aumento nos níveis séricos de IgE e IgG1, e mastocitose no hospedeiro (revisto por Urban et al. 1992; Allen & Maizels 1996; Finkelman et al. 1997; Onah & Nawa 2000). Estas alterações são características da resposta imune controlada por linfócitos T auxiliares do tipo 2 (linfócitos Th2), que são linfócitos T que expressam o determinante antigênico CD4 na superfície celular e que secretam, principalmente, as citocinas designadas de interleucina-4 (IL-4), IL-5, IL-9, IL-10 (esta, podendo ser também produzida por células Th1 e T regulatórias) e IL-13 em resposta à estimulação antigênica (Mossman & Coffman 1989; Abbas et al. 1996; revisto por Anthony et al. 2007). A indução da resposta imune do tipo2 tem sido associada com proteção do hospedeiro contra maioria das infecções por nematódeos (Finkelman et al. 1997; Finkelman et al. 2004; Anthony et al. 2007; Patel et al. 2009). Entretanto, evidências experimentais indicam que diferentes mecanismos efetores induzidos pela ativação da resposta do tipo2 podem atuar para o controle de diferentes espécies de nematódeos, sendo possivelmente relacionado ao microambiente do hospedeiro ocupado pelo parasito, sua fonte de alimento e possíveis mecanismos evasivos desenvolvidos por cada espécie (Finkelman et al. 1997; Onah & Nawa 2000; Negrão-Corrêa 2001; Finkelman & Urban 2001; Lawrence 2003; Patel et al. 2009). Por exemplo, no caso da infecção por Trichuris muris, que habita o epitélio do cólon intestinal do hospedeiro, a aceleração da renovação de células epiteliais induzida por IL-4/IL-13 parece ser importante na resposta protetora 21 ao parasito (Cliffe et al. 2005). Por outro lado, a infecção por Heligmosomoides polygyrus (atualmente denominado H .bakeri, segundo Cable e colaboradores (2006)), nematódeo que infecta roedores pela penetração oral da larva L3, que penetra e se desenvolve até a forma adulta na submucosa do intestino delgado e, posteriormente, o verme adulto sobrevive no lúmen intestinal, a proteção foi associada a ativação alternativa de macrófagos e indução de células caliciformes. Nesta infecção, os dados experimentais indicam que citocinas do tipo-2 são essenciais para a diferenciação de macrófagos alternativamente ativados que participam da formação de granulomas e controle das larvas do parasito, enquanto que a produção de IL-13 e a diferenciação de células caliciformes levam a secreção de RELM-β, que impede a movimentação de alimentação dos vermes adultos que são expulsos do hospedeiro (Artis et al. 2004; Anthony et al. 2006). No caso da infecção por Trichinella spiralis, a produção local de IL-4 e IL-13 induz a diferenciação e ativação de mastócitos e aumento da sensibilidade de células epiteliais aos mediadores liberados por estas células, mecanismo que pode atuar no controle dos vermes adultos que vivem no epitélio do intestino delgado (Knight et al. 2002; Knight et al. 2008). No caso específico da infecção por espécies do gênero Strongyloides, a associação da resposta Th2 com proteção tem sido verificada tanto na infecção humana como em modelos experimentais. Na estrongiloidose humana, pacientes co-infectados por HTLV-1, vírus que induz uma alta produção de IFN-γ, apresentam aumento da indução da resposta imune do tipo Th1 e da diferenciação de células T regulatórias (Montes et al. 2009), e redução na produção de IL-4, IL-5, IL-13 e IgE, componentes participantes do mecanismo de defesa contra S. stercoralis (Porto et al., 2001; Porto et al., 2002). A alteração da resposta imune nos pacientes co-infectados coincide com aumento da carga parasitária e disseminação do nematódeo, demonstrando a importância da resposta Th-2 no controle da estrongiloidose humana. A participação da resposta imune do tipo 2 no mecanismo de controle da infecção por nematódeos do gênero Strongyloides foi confirmada por estudos de infecção experimental utilizando S. venezuelensis em camundongos geneticamente deficientes no receptor de IL-4 e no fator de transcrição induzido por esta via (IL-4Rα-/- ou STAT6-/-), sendo que, nestes camundongos, observou-se um retardo no período de eliminação dos vermes quando comparado ao período de eliminação da infecção em camundongos selvagens (Sasaki et al. 2005; Negrão-Corrêa et al. 2006). De maneira semelhante, em animais deficientes na produção da citocina IL-4 observou-se aumento de carga parasitária, retardo na 22 eliminação da infecção além de resposta imune protetora prejudicada em comparação aos animais selvagens. Diferentemente, neste mesmo trabalho, foi visto que a neutralização de IL-13 nestes camundongos não alterou a carga parasitária embora tenha aumentado a fecundidade dos vermes e acarretado em uma menor produção de IgM em camundongos deficientes para IL-4 (Fernandes 2012). Os dados indicam que na infecção por nematódeos do gênero Strongyloides a proteção é dependente de IL-4, mas não de IL-13. A produção de IL-4 e/ou IL-13 e ativação de IL-4R/STAT6 expresso em diferentes células do sistema imune e em outras células teciduais é responsável, entre outros mecanismos, pela multiplicação e diferenciação Th2, diferenciação e ativação de mastócitos e células caliciformes, que irão produzir outras quimiocinas e citocinas, como eotaxina (CCL11) e IL-5, responsáveis pela diferenciação e migração de eosinófilos para o sitio da infecção (Cara et al. 2000). A participação de eosinófilos no mecanismo de controle de infecções produzidas por nematódeos parasitos é controversa (Cara et al. 2000), sendo relatado que redução significativa da produção e ativação de eosinófilos não afeta signicativamente a carga parasitária de algumas espécies de nematódeos parasitos, como Trichinella spiralis (Herdon & Kayes 1992; Hokibara et al. 1997) e Nippostrongylus brasiliensis (Coffman et al. 1989), mas altera o controle de outros como Angiostrongylus cantonensis (Sasaki et al. 1993), Onchocerca volvulus (Lange et al. 1994) e Heligmosomoides polygyrus (revisto por Matthaei et al. 1997). A indução de eosinófilos tem sido positivamente associada com o controle da infecção por espécies Strongyloides, como ficou demonstrado pelo estudo de Rotman e colaboradores (1996) em camundongos infectados experimentalmente por larvas de S. stercoralis. Neste modelo experimental, os autores relataram que eosinófilos foram as principais células efetoras responsáveis pela morte de larvas do parasito transferidas para cavidade peritoneal de camundongos previamente imunizados pelo parasito. Posteriormente, Herbert e colaboradores (2000), utilizando infecção experimental por S. stercoralis em camundongos geneticamente deficientes na produção de IL-5, demonstraram que a redução do número de larvas do parasito durante a infecção primária e secundária foi associada ao aumento de eosinófilos, que não acontece nos animais deficientes. Em contrapartida, camundongos transgênicos para IL-5 foram capazes de eliminar um grande número de larvas de S. venezuelensis durante a migração tecidual e de vermes adultos cirurgicamente transplantados no intestino delgado (El-Malky et al. 2003). Mais recentemente o efeito direto de eosinófilos pode ser avaliado utilizando-se camundongos 23 Δdbl GATA-1, que são camundongos com deficiência genética no sítio de ligação e alta afinidade no promotor de GATA-1, fator de transcrição essencial para diferenciação final de eosinófilos (Yu et al. 2002), Neste modelo experimental, Pereira (2008) demonstrou que a ausência seletiva de eosinófilos durante a infecção por S. venezuelensis resultou em aumento de carga parasitária e retardo na eliminação dos vermes intestinais. A ativação de eosinófilos por citocinas, imunoglobulinas e complemento, leva estas células a secretarem uma variedade de citocinas pró-inflamatórias como IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 e TGFβ. Tais moléculas regulam a permeabilidade vascular, modulam o tráfego celular, a secreção de muco e a contração do músculo liso. Eosinófilos ativados também podem liberar grânulos citotóxicos contendo proteína básica principal (MBP), peroxidase, neurotoxinas, mediadores lipídicos (entre eles os leucotrienos), que causam contração do músculo liso, aumentam a permeabilidade vascular e secreção de muco. A liberação de MBP altera diretamente a contração do músculo liso por desregular receptores muscarínicos e por induzir desgranulação de mastócitos e basófilos (Rothenberg e Hogan 2006). Durante a infecção por S. stercoralis, os eosinófilos podem ainda agir como células apresentadoras de antígenos (APCs) (Padigel et al. 2006). Estas células também podem polarizar a resposta imunológica induzida por células T, através síntese de IDO (indoleamina 2,3-dioxigenase), uma enzima envolvida na conversão de triptofano em KYN, que regula o balanço Th1/Th2, através da indução de apoptose em células Th1. Eosinófilos parecem ainda promover proliferação de células T efetoras ativadas, mas não de células T naive, e no caso de eosinófilos murinos, promovem secreção de IL-4, IL-5 e IL-13 por células T CD4+ (revisto por Behm & Ovington 2000; Rothenberg & Hogan 2006). Além de eosinófilos, a indução da resposta do tipo 2 estimula a ativação de linfócitos B em plasmócitos e a produção de algumas classes e subclasses de anticorpos, como IgG1 e IgE, que tem sido associado ao controle de infecções helmínticas (Abbas et al. 1996; Finkelman et al. 1998). Vários estudos demonstram o aumento da produção de IgM, IgG1 (ou IgG4 em humanos) e IgE durante a infecção do hospedeiro por espécies de Strongyloides (Carvalho et al. 1983; Abraham et al. 1995; Silveira et al. 2002; Fernandes 2008). Entretanto, estudos que diretamente associam linfócitos B com proteção contra infecção por S. venezuelensis foram realizados mais recentemente. El-Malky e colaboradores (2013) mostraram que camundongos deficientes para maturação de linfócitos B apresentam carga parasitária maior que animais selvagens e que são incapazes de eliminar o parasito, embora o número de mastócitos e eosinófilos presentes 24 na mucosa intestinal tenha sido semelhante entre os dois grupos. Além disso, Eschenazi (2013) demonstrou também que camundongos C57µMT-/-, deficientes na produção de IgM, infectados com S. venezuelensis apresentaram atraso na eliminação do parasito tanto na infecção primária quanto na reinfecção. O efeito na carga parasitária observado em camundongos C57µMT-/- infectados foi acompanhado por redução de IgG e IgE e da ativação de eosinófilos e neutrófilos no pulmão e intestino. Apesar do atraso no controle da infecção, os camundongos foram capazes de eliminar a infecção sugerindo que linfócitos B e a produção de IgM participam dos mecanismos de controle da infecção por Strongyloides, mas não são essenciais para eliminação do parasito. Os mecanismos pelos quais linfócitos B contribuem para imunidade contra S. venezuelensis são ainda desconhecidos. A diferenciação de linfócitos em plasmocitos secretores de IgE, induzida durante a infecção por helmintos parasitos, leva a desgranulação e liberação de mediadores solúveis por mastócitos e basófilos, como histamina, heparina, citocinas e proteases (Schwartz 1994). Bem como pode mediar reação de citotoxicidade celular dependente de anticorpos em eosinófilos, que tem sido associada à destruição de larvas de helmintos (Gounni et al. 1994). A produção de IgG1, que também é estimulada por citocinas do tipo 2, pode interagir com uma variedade de receptores do tipo FcγR, expressos em diferentes células do sistema imune, como mastócitos, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos, e desta forma atuar na opsonização e neutralização de antígenos, sensibilização, estimulação e desgranulação das células (Janeway et al. 2007). Além de produção de isotipos de imunoglobulinas associadas à resposta do tipo 2 (IgG1 e IgE), outra imunoglobulina, IgM, também apresenta-se aumentada em infecções por nematódeos, sendo que estudos mostraram que essa imunoglobulina é essencial para expulsão precoce de larvas de nematódeos. IgM é o primeiro anticorpo a reconhecer larvas de parasitos, e pode ser produzido por uma via independente de célula T (Rajan et al. 2005). Como macrófagos expressam receptor Fc para IgM (Shibuya et al. 2000), este anticorpo poderia também ser importante para reconhecimento de nematódeos por macrófagos (revisto por Anthony et al. 2007). Estudos mais recentes mostram que as citocinas do tipo 2 também induzem a diferenciação de macrófagos, definidos como macrófagos alternativamente ativados, tendo sido demonstrada a participação destas células na resposta alérgica e em infecções helmínticas (Gordon 2003). Zhao e colaboradores (2008) demonstraram que a infecção de camundongos por Nippostrongylus brasiliensis leva a aumento da infiltração de macrófagos alternativamente ativados no intestino, sendo que a depleção de macrófagos 25 resultou em bloqueio da hipercontratilidade do músculo liso intestinal e impediu a expulsão dos vermes. Estes macrófagos podem mediar efeitos mais diretos sobre helmintos intestinais, através da produção de proteínas pertencentes à família Fizz, que incluem quitinases e proteínas que têm homologia com quitinases, como Ym1, AMCase, que possuem efeito enzimático e podem danificar a cutícula dos parasitos (Nair et al. 2006). As proteínas produzidas por macrófagos alternativamente ativados também têm papel importante na quimiotaxia de eosinófilos, remodelamento tecidual e produção de fibrose (Zhu et al. 2004). Estes resultados indicam macrófagos alternativamente ativados podem ter papel fundamental na resposta imune protetora contra nematódeos gastrintestinais bem como na imunopatologia associadas a estas infecções; entretanto, não temos relatos da participação de macrófagos alternativamente ativados na infecção por Strongyloides sp.. Finalmente, existem ainda fortes evidências experimentais associando mastocitose intestinal e aumento de células caliciformes com a eliminação de infecções por parasitos do gênero Strongyloides (Nawa et al. 1985; Abe & Nawa 1987; Khan et al. 1993; Ishikawa et al. 1995; Maruyama et al. 2002). A participação de mastócitos no processo de eliminação de Strongyloides ssp foi inicialmente demonstrada em camundongos W/WV, uma linhagem de camundongos que apresentam deficiência na diferenciação de mastócitos causada por mutação do gene c-kit. Os camundongos W/WV eliminam a infecção por S. ratti (Nawa et al. 1985; Abe & Nawa 1987) ou S. venezuelensis (Khan et al. 1993) muito mais lentamente que camundongos não deficientes. Outra evidência experimental foi obtida em camundongos nude (camundongos que possuem um defeito tímico, não desenvolvendo células T), cuja resposta protetora contra S. ratti foi restaurada após tratamento prolongado com IL-3, tratamento este capaz de restaurar a mastocitose intestinal nestes camundongos (Abe & Nawa 1988). Recentemente, foi observada ocorrência de mastocitose intestinal durante a infecção por S. ratti em ratos, sendo que número maior destas células foi detectado em torno de 5 a 7 dias após ter o ocorrido o pico de infecção em diferentes porções do intestino destes animais (Shinotoku et al. 2013). As alterações imunológicas induzidas pela infecção por nematódeos, além de afetar a sobrevivência destes parasitos, também estão associadas aos aspectos da morbidade da infecção por estes parasitos. Muitos estudos têm mostrado que a passagem de nematódeos por diferentes órgãos do hospedeiro induzem a uma resposta inflamatória local e que esta está associada às alterações patofisiológicas (Khan & Collins 2004). Estas 26 alterações são associadas a vários sintomas apresentados por pacientes infectados, como diarréias, perda de peso, tosses e dificuldades respiratórias, e consequentemente tem sido alvo de grande interesse na área da parasitologia (Tomita et al. 2000; Palmer et al. 2002; Zhao et al. 2003; Cliffe et al. 2005). Para um melhor entendimento da relação entre a resposta imunológica e a sintomatologia induzida por infecções por nematódeos tem sido utilizado modelo experimental para estudos das alterações pulmonares e intestinais. Buijs e colaboradores (1995) relataram ocorrência de hiperreatividade da traquéia de camundongos infectados por Toxocara canis, mas que esta alteração varia no decorrer da infecção. Os autores também sugerem que a infiltração por eosinófilos está diretamente relacionada com a indução da alteração funcional. Pinelli e colaboradores (2007) observaram que uma única infecção com 500 ovos infectantes de T. canis resultou em exacerbação da inflamação pulmonar, eosinofilia e hiperreatividade das vias aéreas de camundongos em resposta a sensibilização por ovalbumina (OVA). Em camundongos infectados por N. brasiliensis foi observado acúmulo de eosinófilos e danos extensivos no pulmão do hospedeiro, caracterizados por hemorragia e destruição da parede alveolar, além de forte hiperreatividade em resposta a metacolina. Neste modelo experimental a utilização de camundongos deficientes para IL-5, apesar de reduzir significativamente a infiltração de eosinófilos e os danos pulmonares induzidos por este nematódeo, não alterou a hiperreatividade brônquica induzida pelo parasito (Coyle et al. 1998). Trabalhos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram que a passagem de larvas de S. venezuelensis pelo pulmão de ratos (Silveira et al. 2002) e de camundongos (Pereira 2008) induz uma resposta inflamatória eosinofílica transitória. Em ratos, a inflamação pulmonar apresenta um pico entre 5º e 7º dia pós-infecção por S. venezuelensis, sendo detectado aumento de IgE no lavado broncoalveolar, produção de muco pelas células caliciformes do epitélio das vias brônquicas, espessamento do epitélio brônquico e das camadas musculares e intensa infiltração eosinofílica no parênquima pulmonar e no lavado broncoalveolar dos animais infectados (Silveira et al. 2002). A inflamação pulmonar induzida por S. venezuelensis coincide com um aumento da hiperreatividade brônquica detectada nestes animais em resposta a acetilcolina ou metacolina (Silveira et al. 2002; Pereira 2008; Araújo 2010). As alterações imunológicas bem como as funcionais (hiperreatividade) retornam aos níveis normais no 12º dia pós-infecção e são pouco evidentes no 2º dia pós-infecção, quando as larvas encontram-se no parênquima pulmonar induzindo hemorragia e acentuada produção local de IL-10 (Silveira et al. 27 2002), demonstrando um importante papel desta citocina na regulação do processo inflamatório nos pulmões. Em ratos, a hiperreatividade brônquica induzida por S. venezuelensis foi bloqueada em animais tratados com capsaicina ao nascimento, droga capaz de destruir os nervos sensoriais. O bloqueio da hiperreatividade brônquica neste modelo experimental ocorreu apesar do aumento da inflamação pulmonar e da infiltração de eosinófilos para o local (Ferreira et. al. 2009). Posteriormente, Ferreira e colaboradores (2010), também mostraram que a hiperreatividade brônquica observada durante infecção por S. venezuelensis em ratos é independente de IL-13, apesar desta citocina ser fundamental na diferenciação de células caliciformes, na produção de muco e infiltração eosinofílica no parênquima pulmonar dos animais infectados. Mais recentemente, os dados apresentados por Araújo (2010) ampliaram nosso entendimento dos mecanismos envolvidos na indução de hiperreatividade brônquica por S. venezuelensis através da utilização de camundongos geneticamente deficientes na produção de IL-4 e de eosinófilos, sendo demonstrado que a alteração funcional é dependente da citocina IL-4, mas completamente independente de eosinófilos. Estes dados contrastam com os mecanismos de indução de hiperreatividade brônquica induzida por doenças alérgicas, onde os estudos experimentais demonstram que citocinas do perfil Th2 expressas localmente contribuem para indução de hiperreatividade brônquica, definida como um estreitamento excessivo das vias respiratórias em resposta a uma variedade de estímulos químicos ou físicos que têm pouco ou nenhum efeito em indivíduos saudáveis (Brusasco & Pellegrino 2003). Neste processo, a produção de IL-13 tem papel fundamental na evolução dos sinais clássicos da patologia da asma, incluindo a hiperreatividade brônquica (Shore 2004). IL-13 induz diferenciação de células epiteliais em células caliciformes aumentando a produção de muco, além de promover a produção de proteínas da matriz extracelular e aumento da contratilidade de células musculares lisas das vias aéreas (Wills-Karp 2004). Assim como IL-13, IL-4 também pode modificar funções das células do músculo liso das vias aéreas (Moore et al. 2002; Chiba et al. 2010). As citocinas tipo 2 também ativam eosinófilos e mastócitos, que ampliam a resposta inflamatória local. Evidências obtidas em modelos experimentais e em pacientes têm mostrado uma correlação positiva entre número e/ou nível de mediadores derivados de eosinófilos com a gravidade dos sintomas e perda de função pulmonar observada na asma (revisto por Wills-Karp 1999; Cara et al. 2000; Wills-Karp & Karp 2004). Estes trabalhos indicam a participação de eosinófilos na 28 indução de lesão tecidual, gênese da imunopatologia peri-brônquica (Humbles et al. 2004; Wills-Karp & Karp 2004;) e na indução de hiperreatividade brônquica ( Teixeira et al. 1995; Lee et al. 2004). Entretanto, esta associação não tem sido observada em animais experimentalmente infectados por nematódeos, sugerindo que mecanismo imune importante para o controle da parasitose pode não ser o principal responsável pelas alterações funcionais. No caso do intestino, estudos têm demonstrado o efeito de citocinas do tipo-2 em alterações fisiológicas relatadas durante a infecção por helmintos intestinais, como é caso de Zhao e colaboradores (2003) que demonstraram a atuação direta de IL-4 e/ou IL-13 na musculatura da mucosa intestinal, alterando a contração do músculo e de Cliffe e colaboradores (2005) que mostraram que a produção destas citocinas aumenta a proliferação das células epiteliais intestinais. Nestes trabalhos foi demonstrado que o aumento da contratilidade intestinal induzido por N. brasiliensis e H. polygyrus é promovido por citocinas IL-4 e IL-13, porém, foram detectadas diferenças quantitativas e qualitativas nos efeitos destas citocinas na contratilidade intestinal. Estas diferenças consistem, basicamente, no fato de IL-13 induzir diretamente um aumento da capacidade das células intestinais em resposta aos neurotransmissores colinérgicos, como acetilcolina, e não colinérgicos, por uma via dependente de STAT-6, enquanto IL4 é capaz de agir em células intestinais por vias independentes de STAT-6. Outro estudo, utilizando Trichinella spiralis como modelo experimental, mostrou que tanto IL-13 quanto IL-4 induziu aumento da afinidade de receptores muscarínicos ao carbacol, um agonista da acetilcolina, em células musculares isoladas do intestino dos camundongos infectados (Akiho et al. 2002). Comprovando a atuação destas duas citocinas no músculo intestinal durante infecção por nematódeos, Horsnell e colaboradores (2007), demonstraram que a ausência do receptor IL-4Rα (receptor de ambas citocinas) exclusivamente em células do músculo liso, causa atraso na expulsão de vermes de N. brasiliensis do intestino de camundongos. Este atraso na expulsão foi associado ao um atraso na hiperplasia de células caliciformes, a uma reduzida produção de citocinas Th2 pelos linfonodos mesentéricos e a reduzida expressão de receptores muscarínicos M3 (receptores de acetilcolina) durante a infecção. Khan e colaboradores (2003) mostraram ainda que o aumento de IL-9, induzido pela infecção por Trichuris muris em camundongos, provoca proliferação e diferenciação de mastócitos e também induz hipercontratilidade intestinal. No caso da infecção por S. venezuelensis, o estabelecimento dos vermes na mucosa do intestino delgado de roedores induz uma 29 inflamação eosinofílica local, deformação e destruição de vilosidades intestinais e hiperplasia de células caliciformes culminando com aumento na secreção de muco (Negrão-Corrêa et al. 2004; Ferreira et al. 2007). Em ratos e camundongos experimentalmente infectados as alterações inflamatórias coincidem com aumento de contratilidade intestinal e com a eliminação dos vermes intestinais (Ferreira et al. 2007; Araújo 2010). Nos camundongos, o aumento de contratilidade intestinal durante a infecção por S. venezuelensis mostrou ser independente da produção da citocina IL-4 e de eosinófilos, visto que animais deficientes para estes elementos da resposta imune foram capazes de desenvolver esta alteração fisiológica, sendo necessário, portanto, desvendar os mecanismos geradores de tal alteração (Araújo 2010). Os dados apresentados mostram que a indução da resposta imune adaptativa do tipo 2 atua no controle da infecção por nematódeos intestinais como é o caso da infecção por Strongyloides venezuelensis, bem como participam de mecanismos responsáveis pela indução de algumas alterações fisiopatológicas que geram alguns dos sintomas associados a esta parasitose. Entretanto, poucos estudos têm sido realizados para esclarecer as alterações iniciais responsáveis da resposta do tipo 2 durante a infecção por espécies de Strongyloides. Em outros modelos experimentais, tem sido relatado que citocinas produzidas por células da resposta imune inata, como IL-21, IL33 e IL-25, podem potencializar o desenvolvimento da resposta do tipo 2 (revisto por Anthony et al. 2007). Além destas citocinas, a infecção por nematódeos tem sido caracterizada por uma rápida ativação de neutrófilos, eosinófilos, basófilos, macrófagos teciduais, e os recentemente descritos linfócitos inatos. Estes últimos têm sido divididos em múltiplas subclasses, sendo que estudos experimentais indicam que a subclasse denominada linfócitos inatos do tipo2 (ILCs2) tem importante papel durante infecções helmínticas (revisto por Bonne-Année et al. 2011; Koyasu & Moro 2012). A participação de mastócitos na resposta imune adaptativa envolvida na eliminação de Strongyloides foi apresentado anteriormente; entretanto, estas células também exercem importante papel no início das infecções por vários tipos de patógenos (revisto por Abraham & John 2010). Tem sido demonstrado que mastócitos são um dos principais respondedores da citocina IL-33 (Ho et al. 2007), e portanto a investigação da atuação destes dois elementos faz-se essencial para o entendimento da resposta imune inata como desencadeadora da resposta adaptativa no caso da infecção por espécies de Strongyloides. 30 1.3 – IL-33 e mastócitos A citocina IL-33 foi descrita por Schmitz e colaboradores (2005) como um membro da família IL-1, com estrutura muito semelhante a dois outros membros desta família, IL-18 e IL-1β. IL-33 é produzida por uma variedade de células do estroma e parênquima de órgãos, como, células do músculo liso, fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliais, células da glia, osteoblastos e adipócitos, e por diferentes células do sistema imune, como macrófagos, células dendriticas e mastócitos (revisto por Le et al., 2013). A citocina IL-33 atua em vários tipos celulares, incluindo células de origem hematopoiéticas e células não hematopoiéticas. Estudos recentes mostram que esta citocina é preferencialmente liberada de células durante a necrose e clivadas em formas inativas dentro de células durante apoptose (Luthi et al. 2009). O padrão de liberação da IL-33 é característico de alarminas ou sinais de perigo endógeno (Lamkanifi & Dixit 2009), o que também é reforçado pelas observações de que esta citocina é produzida em maior concentração por células epiteliais e endoteliais que enfrentam ameaças ambientais e são vulneráveis a danos teciduais (Moussion & Girard 2008). Entretanto, existem ainda evidências de produção de IL-33 observados em fibroblastos murinos sem evidência de necrose, sendo verificado nestas células o trafico e liberação da citocina através de vesículas, indicando que possíveis vias de liberação da IL-33 ainda não foram bem elucidadas (Kakkar et al. 2012). Uma vez liberada, IL-33 se liga a células alvo através do receptor ST2 (Xu et al. 1998; Schmitz et al. 2005). Praticamente todos os tipos de células imunes e numerosos tipos de células não imunes respondem a IL-33 via este receptor (Mirchandani et al. 2012). O receptor ST2 pertence à família de receptores IL-1 e foi originalmente identificado há mais de 20 anos como uma “seruminducible secreted protein” em fibroblastos murinos (Klemenz et al. 1989; Tominaga 1989; Tominaga et al. 1991 e 1992; Bergers et al. 1994). O gene ST2 codifica no mínimo três isoformas de proteína, uma forma solúvel (sST2), uma forma ligada a membrana (ST2L) e um ST2 variante (Tago et al. 2001). O mRNA que codifica a forma solúvel é induzido após a estimulação de fibroblastos, enquanto o mRNA que codifica a forma transmembrana é expresso em tecidos hematopoiéticos e pulmão (Tominaga 1989; Klemenz et al. 1989; Yanagisawa et al. 1992 e 1993; Bergers et al. 1994; Rossler et al. 1995). A forma solúvel do ST2 é capaz de sequestrar e neutralizar a IL-33, sendo sua inibição funcional demonstrada tanto in vitro quanto in vivo (Hayakawa et al. 2009). 31 Outro papel inibitório envolvendo a ligação IL-33/ST2 foi demonstrado por Bulek e colaboradores (2009) que verificaram que camundongos deficientes para SIGIRR apresentaram resposta Th2 induzida por IL-33 mais acentuadas quando comparados aos animais selvagens. A molécula SIGIRR é membro da superfamília de receptores L1R/TLR e forma um complexo com o receptor ST2 ligado a IL-33, inibindo a sinalização mediada por esta citocina; ou seja, SIGIRR tem função de regulação negativa na via IL-33/ST2. Por outro lado, Lohning e colaboradores (1998) e Xu e colaboradores (1998) mostraram que o tratamento de camundongos com anticorpo antagonístico de ST2 ou com uma proteína de fusão IgG-ST2, levou a uma acentuada resposta Th1 e teve um efeito inibitório na inflamação alérgica das vias aéreas associada a resposta Th2. A ligação da IL-33 ao receptor ST2 foi verificada por Schmitz e colaboradores (2005), que demonstrou ser este um receptor heterodimérico, consistindo de ST2 e uma proteína acessória IL-1R. Neste trabalho os autores também verificaram que a ligação de IL-33 em células que expressam ST2 resulta em ativação de NF-κB e MAP kinases. A adição de IL-33 purificado a cultivos in vitro de células T naive ou administração in vivo desta citocina resulta em produção de citocinas associadas a Th2. Dentre as células hematopoiéticas responsivas a IL-33 incluem-se linfócitos Th2 (Xu et al., 1998; Kurowska-Stolarska et al. 2008), linfócitos T CD8+ (Bonilla et al. 2012), linfócitos B (Komai-Koma et al. 2011), células NKT (Smithgall et al. 2008) e ILC2s (Moro et al. 2010; Neil et al. 2010; Price et al. 2010) como já citado anteriormente. Estes linfócitos ILCs2 foram recentemente identificados e, inicialmente, foram denominados células “Natural Helper” (NH) (Moro et al. 2010), “Multipotent progenitors (type2)” MPPtype2 (Saenz et al. 2010), nuócitos (Neil et al. 2010) ou “Innate helper type-2” (Ih2) cells(Price et al. 2010). ILCs2 têm sido descritos como responsivos a citocinas derivadas de células epiteliais como TSLP, IL-25 e IL-33 e sobre estes estímulos estas células produzem IL-13 e IL-5, que por fim desencadeiam a polarização da resposta para Th2 (Moro et al. 2010; Neil et al. 2010). Além dessas células, granulócitos, como eosinófilos (Pecaric-Petkovic et al. 2009; Chow et al. 2010), mastócitos (Ho et al., 2007), basófilos (Kondo et al. 2008), e neutrófilos (AlvesFilho et al. 2009 e 2010; Hueber et al. 2011), também respondem a IL-33. IL-33 também atua em células dendríticas (Rank et al. 2009; Besnard et al. 2011) e, em sinergia com IL-13, atua em macrófagos induzindo sua diferenciação em macrófagos alternativamente ativados, M2 (Kurowska-Storlarska et al. 2009). O receptor ST2 também é expresso em células progenitoras hematopoiéticas e sua ativação através de 32 IL-33 induz aumento da mielopoiese na medula óssea e a rápida emigração de células mielóides para periferia (revisto por Le et al. 2013). Por fim, a citocina IL-33 atua de maneira autócrina em células epiteliais e endoteliais, dois tipos de células que produzem grandes quantidades desta citocina. IL-33 induz angiogenese por aumentar proliferaçao e migração de células endoteliais, induzir ligações vasculares além de induzir também secreção de mediadores inflamatórios tanto por estas células quanto por células epiteliais (Choi et al. 2009; Yagami et al. 2010; Fujita et al. 2012). Alguns estudos têm avaliado a ativação da produção de IL-33 e seu receptor ST2 durante infecções por nematódeos, sendo demonstrado que na infecção pelo nematódeo intestinal Trichuris muris a ativação da via IL-33/ST2 é importante indutora da resposta imune adaptativa (Humpheys et al. 2008). A importância da via IL-33/ST2 também foi experimentalmente confirmada durante a infecçao por Trichinela spiralis em camundongos deficientes para o receptor ST2, que apresentaram elevada carga parasitária, resposta Th2 reduzida e ausência de ativação de mastócitos intestinais (Scalfone et al. 2013). Na infecção por Nippostrongylus brasiliensis, camundongos deficientes para IL-33 apresentaram déficit seletivo para IL-13 derivada de ILC2 tanto na infecção primária quanto secundária; entretanto, a resposta Th2 típica foi mais exacerbada nos camundongos deficientes em IL-33 em comparação aos não deficientes, sendo verificada maior produção de IL-4, IgE e proliferação de mastócitos e basófilos. Os níveis reduzidos de IL-13 resultaram em menor expressão de RELM-β e recrutamento de eosinófilos, o que refletiu em maior carga parasitária nos animais deficientes (Hung et al. 2013). Com relação à infecção por S. venezuelensis, estudos recentes (Yasuda et al. 2012) demonstraram que a infecção pelo nematódeo aumenta o número de células epiteliais alveolares do tipo 2 (ATII) que expressam IL-33, e o aumento desta citocina foi associado ao aumento de células NH (Natural helper) no pulmão de camundongos infectados. Foi observado que IL-33 atua nas células NH estimulando a produção de IL-5 e IL-13, o que induz inflamação eosinofílica pulmonar observada durante infecção por S. venezuelensis. Estes estudos sugerem ainda que a infecção por S. venezuelensis induz a eosinofilia pulmonar por meio da quitina presente na cutícula do parasito, visto que a administração intranasal deste componente foi suficiente para induzir aumento de células epiteliais expressando IL-33, aumento da concentração desta citocina no lavado broncoalveolar e eosinofilia pulmonar em animais selvagens, mas estas alterações não foram detectadas em animais IL-33-/- que receberam o 33 mesmo tratamento (Yasuda et al. 2012 e 2014). Entretanto, a importância da ativação da via IL-33/ST2 para o controle do parasito ou da patologia não foi demonstrado. Os mastócitos são células que estão amplamente distribuídas pela mucosa do trato intestinal e respiratório, sendo caracterizadas pela grande quantidade de grânulos citoplasmáticos contendo mediadores pré-formados, como heparina, proteases e histamina, que agem rapidamente aumentando o fluxo sanguíneo local (ocasionando afluxo de leucócitos local) e aumentando a permeabilidade vascular (revisto por De Veer et al. 2007; Abraham & John 2010). Quando ativados de maneira especifica, os mastócitos produzem e secretam citocinas, como IL-4, IL-5 e IL-13 (que perpetuam a resposta Th2), mediadores inflamatórios lipídicos, como prostaglandina D2 e leucotrieno C4, e quimiocinas como CCL11/eotaxina, que são de fundamental importância na indução do processo inflamatório local (Bertaccini et al. 2000; Bradding et al. 2006; De Veer et al. 2007; Abraham & John 2010). Os mediadores inflamatórios também podem atuar em receptores em células do músculo liso alterando a contratilidade do mesmo (Bertaccini et al. 2000). A ativação clássica que resulta na desgranulação de mastócitos envolve a ligação da imunoglobulina (Ig) E ao receptor FcεRI ou de IgG ao FcγRIII; entretanto, a ativação inata (Ig-independente) de mastócitos por nematódeos parasitos ou seus extratos também tem sido observada (Shakoory et al. 2004; De Veer et al 2007). Estudos demonstraram que além de citocinas do tipo 2, as citocinas IL-2 e IL-18, típicas da resposta imune inata, também podem agir sinergicamente na indução da mastocitose intestinal através de uma via independente da ativação IL-4R/STAT6. Paralelamente, a produção de IL-18 ativa células Th2 a produzir IL-3 e IL-9, que são potentes fatores de crescimento para mastócitos, potencializando a mastocitose durante infecção por nematódeos (Sasaki et al. 2005; Yoshimoto & Nakanishi 2006). Um estudo in vitro (Allakhverdi et al. 2007) demonstrou que IL-33 estimula diretamente mastócitos humanos a produzirem várias citocinas proinflamatórias e quimiocinas e também exerce efeito permissivo na resposta destes mastócitos a TSLP (Linfopoietina do Estroma Tímico, um potente ativador de mastócitos). IL-33 também acelerou a maturação de precursores de mastócitos e induziu secreção de citocinas Th2 e quimiocinas atraentes de Th2 por estas células (Allakhverdi et al. 2007). Recentemente, um estudo utilizando mastócitos derivados da medula óssea de camundongos demonstrou que estas células, sob estímulo de antígeno, são capazes de produzir IL-33 endógeno, na presença ou não de IgE e que também respondem a esta citocina, produzindo citocinas como IL-6 e IL-13, aumentando a ativação das cascatas de MAP kinases e NF-κB (Tung et al. 2014). Também em modelo 34 de asma experimental foi verificado que camundongos deficientes para mastócitos apresentaram níveis menores de IL-33 do que animais selvagens demostrando que estas células são importante fonte de IL-33 neste modelo experimental (Fuchs et al. 2012). O efeito da IL-33 sobre a formação dos grânulos parece ser diferente entre espécies, sendo que em camundongos a ligação de IL-33 ao receptor especifico expresso em mastócitos induz a produção de prostaglandinas e leucotrienos (Moulin et al. 2007; Enoksson et al. 2011), enquanto em mastócitos humanos a estimulação destas células pela citocina não leva a produção destes elementos (Allakhverdi et al. 2007). Por fim, um importante efeito mediado por mastócitos induzidos por IL-33 é iniciar uma orquestração de reposta inflamatória com produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF, IL-6), citocinas do tipo-2 (IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF) e quimiocinas (CXCL8, CCL1) que direcionam o recrutamento de células inflamatórias. Com exceção de IL-3 e “stem cell factor” (SCF, um ligante para c-kit), que são necessários para desenvolvimento de mastócitos, pelo menos em camundongos, IL-33 é a única citocina dentre todas que é capaz de provocar secreção de citocinas e quimiocinas em mastócitos cultivados derivados de medula óssea de camundongos, sem afetar sua desgranulação (Allakhverdi et al. 2007; Ho et al. 2007; Iikura et al. 2007; Moulin et al. 2007; Silver et al. 2009). Isso ficou bem demonstrado em um estudo de Hepworth e colaboradores (2012) que avaliaram a infecção por Heligmosomoides bakeri e Trichuris muris em camundongos deficientes para mastócitos ou em camundongos tratados com agente estabilizante de mastócitos (Cromolyn Sodium-CS) que impede a desgranulação destas células. Nestes animais foi verificado redução da produção inicial de IL-25, IL-33 e TSLP, e posteriormente redução da produção de citocinas Th2 e aumento das cargas parasitárias. Estes dados indicam que mastócitos participam da resposta inata a nematódeos, estimulando a resposta Th2 via regulação de IL-25, IL-33 e TSLP. Uma vez que a resposta adaptativa esteja estabelecida uma das hipóteses pela qual a mastocitose intestinal atuaria na eliminação de Strongyloides, bem como de outros nematódeos do intestino sugere que proteoglicanas fortemente sulfatadas presentes nos grânulos de mastócitos e secretadas no intestino dificultam a fixação dos vermes no epitélio da mucosa intestinal e, consequentemente, facilitam a eliminação dos mesmos. Mecanismo semelhante também pode ocorrer com secreção de mucinas sulfatadas produzidas por células caliciformes durante a infecção (Ishikawa et al. 1995; Maruyama & Nawa 1997; Maruyama et al. 2000; Maruyama et al. 2002; Maruyama et al. 2003). A eliminação dos vermes da mucosa intestinal pode ser potencializada pela ação da histamina na contração muscular e 35 na permeabilidade vascular, que podem contribuir para expulsão física dos patógenos do intestino (Janeway 2002). Além destas alterações, a histamina liberada por mastócitos, juntamente com IL-5 e CCL11 podem ativar a diferenciação e migração de eosinófilos para o sitio inflamatório (Shakoory et al. 2004; De Veer et al. 2007), contribuindo para resposta eosinofílica típica de infecções por nematódeos. Estudos em roedores e humanos identificaram numerosos outros mediadores derivados do eixo mastócitos-eosinófilos com a capacidade de regular a função neuronal, incluindo peptídeo intestinal vasoativo, substância P, serotonina, entre outros (revisto por Powel et al. 2010). Além da participação na indução da resposta imune contra algumas espécies de nematódeos parasitos, a ativação da via IL-33/ST2 e de mastócitos também têm sido associadas à ocorrência de inflamação das vias aéreas e evolução de asma (revisto por Brightling et al. 2002; Oboki et al. 2011). Estudos mostram que camundongos inoculados com IL-33 recombinante desenvolveram hiperplasia de células epiteliais, tanto no pulmão quanto no trato gastrointestinal juntamente com infiltração eosinofílica e de mononucleares na lâmina própria (Humphreys et al. 2008; Neil et al. 2010). Kim e colaboradores (2013) observaram que hiperreatividade brônquica e inflamação das vias aéreas podem se desenvolver ou se intensificar na ausência de células Th2 através de mecanismos imunes inatos, envolvendo IL-33, células NH e células natural killers T (NKT). Diversos mecanismos ativados pela produção de IL-33 podem afetar a gravidade de reações alérgicas, sendo verificado que IL-33 afeta a maturação de células dendriticas, e consequentemente a indução da resposta adquirida, durante a indução de asma experimental induzida por administração de OVA em camundongos (Besnard et al. 2011). A produção de IL-33 também tem um profundo efeito em macrófagos alveolares, induzindo um fenótipo alternativamente ativado que produz quimiocinas importantes durante inflamações alérgicas (Kurowska-Stolarska et al. 2009). Em mastócitos, basófilos e eosinófilos, IL-33 acentua a adesão e sobrevivência das células por promover expressão de CD11b (revisto por Oboki et al. 2011) o que contribui para patogênese das desordens alérgicas. A possibilidade de mastócitos, diferentemente de células T ou eosinófilos, migrarem para a proximidade de músculo liso brônquico em pacientes com asma tem sido associado ao desenvolvimento do fenótipo asmático nestes pacientes (Brightling et al. 2002). Neste sentido, a infiltração e desgranulação de mastócitos na mucosa das vias aéreas de sujeitos com asma apresentam correlação positiva com a produção de muco depositado no lúmen das vias aéreas, sugerindo que mastócitos também têm um papel 36 importante na regulação da secreção das glândulas mucosas (Carrol et al. 2002). No caso do intestino, estudos recentes têm demonstrado o papel de IL-33 nas alterações histopatológica da mucosa intestinal induzidas pela infecção por nematódeos parasitos, incluindo hiperplasia de células epiteliais e caliciformes, com aumento na produção de muco e infiltração eosinofílica (Schmitz et al. 2005; Pastorelli et al. 2013). Entretanto, a importância destes mecanismos dependentes de produção de IL-33 na indução de alterações funcionais e no agravamento da sintomatologia pulmonar ou intestinal induzida pela infecção por nematódeos como S. venezuelensis ainda não foi verificada. Por outro lado, a associação de mastocitose com desenvolvimento de alterações patofisiológicas intestinais observadas durante infecções por nematódeos já foi anteriormente relatado. A infecção por Trichuris muris em camundongos resulta em proliferação e diferenciação de mastócitos induzidas por IL-9 que foi associada ao estabelecimento de hipercontratilidade intestinal (Khan et al. 2003). Além disso, existem evidências de que mastócitos podem regular a atividade muscular através da liberação de mediadores como histamina, triptase ou leucotrienos que causam contração/relaxamento do músculo liso (Bischoff 2009; Shea-Donohue et al. 2010). Traver e colaboradores (2010) observaram que a hipercontratilidade gastrointestinal induzida por tratamento com OVA em ratos é reduzida quando os animais são tratados com Ketotifen, uma droga que previne a desgranulação de mastócitos. Ierna e colaboradores (2008) observaram que as citocinas IL-4 e TNF produzidas por mastócitos são responsáveis por regular a resposta protetora Th2 e inflamação intestinal associada com a expulsão de Trichinella spiralis. Neste estudo, camundongos deficientes para mastócitos (W/Wv) reconstituídos com células da medula óssea de animais deficientes na produção de IL-4 ou de TNFα, assim como aqueles não reconstituídos, tiveram enteropatia menor quando comparados aos animais selvagens ou aos animais W/Wv reconstituídos com medula óssea de animais selvagens. Nestes últimos foram observados atrofia de vilosidades, hiperplasia de criptas, aumento do número de figuras mitóticas e do peso do intestino durante a infecção. Em ratos infectados por Nippostrongylus brasiliensis, observou-se uma associação entre acúmulo de mastócitos na mucosa intestinal e aumento da permeabilidade no órgão. Este acúmulo de mastócitos foi determinado indiretamente através da presença de RMCPII “protease tipo quimiotripsina” presente em mastócitos de mucosas (King & Miller 1983). Em infecção por T. spiralis o aumento da permeabilidade intestinal foi associado à 37 destruição de ocludina mediado por protease 1 de mastócitos murinos (mMCP1) (McDermott et al. 2003). Estes dados indicam que faz-se necessário um entendimento mais completo de como a via IL-33/ST2 e mastócitos afetam e participam da resposta imune protetora e das alterações fisiopatológicas durante infecção por S. venezuelensis. 38 2- JUSTIFICATIVA Com base no que se tem descrito na literatura é possível concluir que a resposta imune induzida pela infecção por nematódeos gastrintestinais pode resultar em alterações patológicas e funcionais no pulmão e no intestino dos animais infectados. Entretanto, os mecanismos imunológicos que desencadeiam as alterações observadas e sua possível participação no controle do parasito ou na patologia associada à infecção ainda não são completamente conhecidos e podem variar em diferentes modelos experimentais. Trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa, nos quais foi investigada a evolução da infecção experimental por S. venezuelensis em camundongos deficientes para receptor de IL-4 (Negrão-Corrêa et al. 2006), na produção de IL-4 (Fernandes 2012), ou na diferenciação de eosinófilos (Pereira 2008) mostraram a importância destes elementos da resposta imune no controle da infecção e na patologia associada. A participação da citocina IL-4 e de eosinófilos nas alterações fisiológicas induzidas pela infecção por S. venezuelensis, foi também avaliada em nosso laboratório por Araújo (2010). Entretanto, a participação de elementos da resposta imune inata na indução desta resposta imunológica adaptativa, bem como no controle do parasito, da patologia e das alterações fisiológicas precisam ser mais bem esclarecidos. Neste trabalho o objetivo é avaliar o papel do receptor ST2 (receptor de IL-33) e de mastócitos no controle da infecção por S. venezuelensis, bem como na indução da resposta imune adaptativa e das alterações funcionais e patológicas. 39 3 - OBJETIVOS 3.1- Objetivo Geral Analisar a importância da ativação via IL-33/ST2 e da presença de mastócitos na indução da resposta imunológica protetora bem como nas alterações patológicas e funcionais decorrentes da infecção por Strongyloides venezuelensis em camundongos. 3.2- Objetivos Específicos (i) Avaliar comparativamente a cinética da infecção por S. venezuelensis em camundongos não deficientes e geneticamente deficientes na expressão do receptor ST2 e mutantes que não diferenciam mastócitos, através da quantificação de: a) larvas recuperadas do pulmão b) vermes adultos recuperados do intestino c) ovos eliminados nas fezes d) fecundidade dos vermes adultos em diferentes períodos da infecção. (ii) Quantificar a produção das citocinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, IFN-γ, TGF-ß e TNF-α quimiocinas CCL11 e CXCL1 no pulmão e intestino de camundongos geneticamente deficientes na expressão do receptor ST-2 e em mutantes que não diferenciam mastócitos e seus respectivos controles ao longo da infecção experimental por S. venezuelensis; (iii) Quantificar a concentração sérica de IgE e avaliar os níveis de IgG1 e IgM parasito reativas no soro de camundongos geneticamente deficientes na expressão do receptor ST-2 e seus respectivos controles ao longo da infecção; (iv) Avaliar as alterações funcionais e histopatológicas induzidas pela infecção por Strongyloides venezuelensis em camundongos geneticamente deficientes na expressão 40 do receptor ST-2 e em mutantes que não diferenciam mastócitos e seus respectivos controles, através de; a) Análise histopatológica do pulmão e intestino b) Análise de alterações na pressão intra-traqueal em resposta a inoculação de metacolina ao longo da infecção (v) Avaliar comparativamente o infiltrado inflamatório no pulmão e intestino de camundongos geneticamente deficientes na expressão do receptor ST-2 e em mutantes que não diferenciam mastócitos e seus respectivos controles durante a infecção por S. venezuelensis, através de: a) quantificação da atividade de enzimas específicas, peroxidase de eosinófilos – EPO e mieloperoxidase – MPO; b) contagem total e diferencial de leucócitos recuperados do lavado broncoalveolar c) análise em citometria de fluxo de células inflamatórias presentes no pulmão. 41 4-METODOLOGIA 4.1- Animais experimentais Foram utilizados camundongos Balb/c não deficientes (WT) provenientes do CEBIO-ICB-UFMG e camundongos Balb/c geneticamente deficientes na produção do receptor de IL-33, ST-2-/-, que foram gentilmente cedidos pelo prof. Dr. João Santana, da Universidade de São Paulo. A deleção do gene que codifica a proteína T1/ST2 e que leva a incapacidade das células produzirem o receptor, foi feito a partir da construção de um vetor de 5.1-kb em que o gene de resistência a neomicina foi inserido dentro do gene T1/ST2, rompendo desta forma o gene deste receptor. O vetor foi então inserido em células embrionárias e aquelas contendo o gene T1/ST2 modificado foram selecionadas e microinjetadas em blastocistos de C57BL/6 para gerar as quimeras. Esses camundongos foram acasalados com camundongos C57BL/6 e o genótipo das células embrionárias foi transmitido ao longo das linhagens. Os mutantes homozigotos para o gene rompido T1/ST2 foram obtidos pelo intercruzamento de heterozigotos (Townsend et al. 2000). Os homozigotos deficientes foram posteriormente acasalados com animais Balb/c e após algumas gerações obteve-se animais mutantes homozigotos (ST2-/-) em background Balb/c. Foram também utilizados camundongos mutantes que não diferenciam mastócitos, Kitwsh (SH) e seus controles não mutantes (SHC) gentilmente cedidos pelo prof. Dr. Marcos Vinicius Melo de Andrade, da Faculdade de Medicina/UFMG. A mutação Kitw-sh (ou “sash”) apareceu espontaneamente em uma ninhada produzida de um cruzamento C3H/HEH x 101/H no MRC Radiobiology Unit at Harwell (H) no Reino Unido (Lyon & Glenister 1982). A fêmea geradora foi identificada por uma faixa branca em sua barriga. A mutação Kitw-sh é uma inversão abrangendo um segmento de 2.8 Mbp próximo ao lócus c-kit que rompe sequencias regulatórias 5’. A mutação Kitw-sh resulta em deficiência embrionária e eventual abolição de mastócitos logo após o nascimento. Há também uma deficiência de melanócitos e de células intersticiais destes camundongos. Desta forma, animais homozigotos apresentam pelagem branca, olhos pretos e manchas escuras em torno das orelhas, enquanto animais heterozigotos apresentam pelagem preta com uma faixa branca na barriga. Esses animais são férteis e não são anêmicos (Lyon & Glenister 1982; Stevens & Loutit 1982; Duttlinger et al. 42 1993). Esta linhagem foi tranferida para vários cientistas, sendo retrocruazada no mínimo 10 vezes com animais C57BL/6 antes de ser doada para The Jackson Laboratory Repository em 2004, onde a colonia de camundongos Kitw-sh foi mantida. Os animais experimentais são mantidos em racks ventiladas apropriadas no biotério do laboratório de esquistossomose do Departamento de Parasitologia, ICB, UFMG e alimentados com ração granulada para camundongo (marca Nuvilab CR1, fabricado por Sogorb Indústria e Comércio Ltda, São Paulo, Brasil) e água potável fornecida ad libitum. Os animais geneticamente deficientes e seus respectivos controles foram utilizados com idade entre 8 ± 1 semana, pesando de 22-25g. Todos os animais utilizados nos experimentos são submetidos ao tratamento oral com 4mg/Kg de Ivermectina (Laboratório Chemites Agro-veterinária, São Paulo, Brasil) por sete dias consecutivos, baseado no descrito por Klement e colaboradores (1996) e com Cestox (MERCK) 75mg/Kg em dose única. No 10 o dia após o final do tratamento, os camundongos foram aleatoriamente separados nos diferentes grupos experimentais e infectados por S. venezuelensis, como detalhado a seguir. Os procedimentos experimentais realizados receberam aprovação prévia da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-UFMG) sob protocolo número 334/2012, que se encontra em anexo. 4.2- Parasito O nematódeo utilizado nos experimentos foi Strongyloides venezuelensis, parasito isolado inicialmente de Rattus norvegicus (Brener e Chaia 1960) e mantido no Departamento de Parasitologia, ICB-UFMG, através de infecções sucessivas em ratos da linhagem Wistar. 4.3- Obtenção das larvas filarioides, infecção e produção de antigeno As lavas filarioides infectantes (L3) de S. venezuelensis utilizadas para infecção de camundongos foram obtidas a partir de coproculturas realizadas com fezes de ratos Wistar infectados, entre 10 e 20 dias de infecção. A coprocultura é feita misturando-se fezes contendo ovos do parasito e vermiculita na proporção 1:2 e, posteriormente, umedecendo-se a mistura com água para promover umidade adequada para o desenvolvimento da larva. Esta coprocultura é mantida na estufa a 28o C, por 48 a 72 horas. As larvas infectantes (L3) são isoladas da coprocultura através da técnica de 43 Baermann-Moraes, filtradas em filtros de papel (Kimwipes EX-L de 12 x12 in./po, 30.4 x 30.4 cm- Kimberly-Clark) como descrito por Barçante e colaboradores (2003) e então lavadas com solução fisiológica (0,85% NaCl). A lavagem é feita retirando-se o sobrenadante da solução contendo as larvas infectantes, depois que estas já tenham decantado e acrescentando solução de NaCl (0,85%) e o processo é repetido por 3-4 vezes. Após a lavagem, as larvas são quantificadas por amostragem e utilizadas para infecção dos camundongos. Para a infecção dos animais, as larvas L3 infectantes foram diluídas em 10 mL de solução fisiológica (0,85% NaCl) e as larvas vivas foram contadas em 3 amostras de 10µL sob microscópio estereoscópio, permitindo uma estimativa do número de larvas presentes na amostra. Após a contagem, aproximadamente 700 larvas infectantes de S. venezuelensis foram inoculadas subcutaneamente, na região abdominal de cada camundongo dos diferentes grupos experimentais, conforme descrito no delineamento experimental. As larvas filarioides também foram descontaminadas e utilizadas para produção de antígeno solúvel de L3. Para a descontaminação (Barçante et al. 20003) as larvas filarióides recuperadas e lavadas em tampão fosfato (PBS-13,7 mM de NaCl, 0,27 mM de KCl, 0,14 mM de KH2SO4 e 0,43 mM de Na2HPO4. 7H2O) foram incubadas por 10 min em solução 0,25% de hipoclorito de sódio, lavadas novamente em PBS, incubadas por 10 min em PBS acrescido de solução de antibióticos, nas concentrações de 4mg/mL de Gentamicina, 1000un/mL de Penicilina e 1000µg/mL de Estreptomicina e finalmente lavadas mais uma última vez em PBS. As larvas descontaminadas foram armazenadas a -20ºC até a preparação do antígeno. Para a obtenção do antígeno solúvel de L3, as larvas descontaminadas foram ressuspendidas em PBS contendo coquetel inibidor de protease (1 tablete em 25mL de PBS; Boehringer Mannheim, Indianápolis, USA). A suspensão de larva foi inicialmente rompida com pérolas de vidro (212-300 mícrons, SIGMA CHEMICAL Co. St. Louis, USA) misturadas em vortex por 15 min e, posteriormente, as larvas processadas foram transferidas para outro tubo e destruídas em sonicador (PGC Scientific, Gaithersburg Md) utilizando-se 3 ciclos de 30 segundos em alta potência com intervalos de 1 minuto. O homogenato foi centrifugado a 4000xg por 1 h. As proteínas solúveis de larvas filariódes foram recuperadas com sobrenadante e a concentração de proteínas foi determinada pelo método de LOWRY e colaboradores (1951) antes de serem distribuídas em aliquotas e estocadas a -20ºC. 44 4.4-Delineamento experimental Camundongos Balb/c selvagens foram aleatoriamente divididos em 2 grupos: controles e infectados. O mesmo ocorreu para camundongos deficientes para o receptor ST2 (ST2-/-). Para avaliar a participação do receptor ST2 na cinética e alterações induzidas pela infecção por S. venezuelensis, trinta (30) camundongos Balb/c fêmeas infectadas, 30 camundongos ST2-/- fêmeas infectadas, 6 Balb/c e 6 ST2-/- fêmeas não infectadas foram inicialmente utilizadas para avaliação parasitológica e imunológica. Aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção 6 animais de cada grupo experimental ou os animais controles foram anestesiados e sangrados através do plexo braquial para obtenção de soro. Os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal solução de ketamina (Dopalen, Sespo Indústria e Comércio Ltda/Divisão Vetbrands Saúde Animal) na dose de 88 mg/Kg e xilazina (Kensol, Laboratórios König S.A.) na dose de 15 mg/Kg de peso do animal. A associação entre anestésicos tem por objetivo diminuir os efeitos colaterais indesejáveis dos compostos aplicados, não somente pelas doses menores de cada um, como também pelo equilíbrio dos efeitos específicos. Após a retirada de sangue, cada animal anestesiado foi eutanaziado por deslocamento de cervical e a traqueia foi canulada para lavagem broncoalveolar. Os pulmões foram retirados, sendo que o lobo direito foi imediatamente congelado para posterior quantificação de citocinas e atividade enzimática: peroxidase de eosinófilos (EPO) e mieloperoxidase (MPO). Nos animais infectados, aos 2dpi, o lobo pulmonar esquerdo foi utilizado para contagem de larvas do parasito. O intestino delgado destes animais também foi cirurgicamente retirado, sendo que a metade anterior (duodeno e jejuno proximal) foi utilizada para recuperação e contagem de vermes e a metade posterior do intestino delgado foi congelada para quantificação de citocinas, EPO e MPO. Aos 7, 10 e 14 dias de infecção a porção final do intestino grosso de cada animal necropsiado foi retirada e as fezes formadas foram coletadas e pesadas para quantificação de ovos do parasito (Fig 1). Para completar a análise imunológica foram utilizados 12 camundongos fêmeas Balb/c e 12 camundongos fêmeas ST2-/-, sendo que metade deles, ou seja, 6 Balb/c e 6 ST2-/-, foram infectados com S. venezuelensis. Os pulmões destes animais foram removidos aos 4dpi para obtenção e marcação de células inflamatórias presentes no órgão sendo desta forma analisados por citometria de fluxo. Os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes para confirmação dos resultados. 45 Infecção com 700L3 de S. venezuelensis 6 Balb/c não infectados 30 ST2-/infectados 30 Balb/c infectados 6 ST2-/- não infectados Eutanásia e necropsia: 2, 4, 7, 10 e 14 dpi Soro Resposta imune humoral Pulmão Lavado broncoalveolar (LBA) Contagem de parasito Intestino Citocinas, EPO e MPO Fezes para contagem de OPG Contagem de leucócitos Figura 1 - Delineamento experimental dos camundongos Balb/c e ST2 -/- 46 Em outro momento, 6 camundongos Balb/c e 6 camundongos ST2-/- não infectados e 18 camundongos Balb/c e 18 ST2-/- fêmeas, infectados aos 2, 4 e 7dpi com S. venezuelensis, foram anestesiados para avaliação da reatividade brônquica a doses crescentes de metacolina. A análise histopatológica foi realizada em um grupo separado de animais composto por 12 camundongos Balb/c e 12 camundongos ST2-/- fêmeas. Quatro camundongos Balb/c e quatro ST2-/- não infectados tiveram seus pulmões e intestinos retirados para preparações histológicas. Os pulmões e intestino delgado dos animais infectados de ambos os grupos experimentais também foram recuperados para analise histopatologia após 4 e 10 dias da infecção, sendo utilizado 4 camundongos Balb/c e 4 ST2-/- em cada ponto da infecção. Para averiguar a participação de mastócitos na cinética e alterações induzidas pela infecção por S. venezuelensis, vinte e cinco (25) camundongos não mutantes, (designados de SHC) fêmeas infectadas, 25 camundongos SH (mutantes com deficiencia em mastócitos) fêmeas infectadas, 5 SHC e 5 SH fêmeas não infectados foram inicialmente utilizados para avaliação parasitológica e imunológica. Aos 2 e 4 dias após infecção 5 animais de cada grupo experimental e seus respectivos controles foram anestesiados conforme descrito anteriormente para avaliação da reatividade brônquica a doses crescentes de metacolina. De maneira semelhante ao anteriormente descrito, os camundongos anestesiados foram eutanaziados e canulados para realização de lavagem broncoalveolar. Os pulmões foram retirados aos 2dpi para contagem de larvas do parasito. Animais não infectados e infectados aos 4, 7, 12 e 21dpi tiveram o pulmão retirado e congelado para quantificação de citocinas, EPO e MPO. O intestino delgado destes animais também foi cirurgicamente retirado, sendo que a metade anterior (duodeno e jejuno proximal) foi utilizada para recuperação e contagem de vermes e a metade posterior do intestino delgado foi congelada para quantificação de citocinas, EPO e MPO. Aos 7, 12 e 21 dias de infecção a porção final do intestino grosso de cada animal necropsiado foi retirado e as fezes coletadas para quantificação de ovos do parasito (Fig 2). 47 Infecção com 700L3 de S. venezuelensis 5 SHC não infectados 25 SHC infectados 25 SH infectados 5 SH não infectados Eutanásia e necropsia: 2, 4, 7, 12 e 21 dpi Pulmão Avaliação da reatividade brônquica Lavado broncoalveolar (LBA) Contagem de parasito Intestino Citocinas, EPO e MPO Fezes para contagem de OPG Contagem de leucócitos Figura 2- Delineamento experimental dos camundongos SHC e SH 48 A metodologia utilizada nas análises parasitológicas, imunológicas, histopatológica e funcional está detalhadamente descrita nos itens seguintes. 4.5-Avaliação parasitológica da infecção A avaliação parasitológica da infecção nos diferentes grupos experimentais foi realizada através da contagem de larvas recuperadas do pulmão, vermes recuperados do intestino e ovos eliminados nas fezes dos camundongos infectados, conforme descrito por Negrão-Corrêa e colaboradores (2004). A contagem de larvas no pulmão foi realizada aos 2 dpi (dias após infecção) através da fragmentação do pulmão seguida por incubação em solução salina (0.85% NaCl) à 37ºC por 4 h em cálices de Baermann e quantificação das larvas recuperadas em microscópio estereoscópio. Para recuperação de vermes de S. venezuelensis, a metade anterior do intestino delgado dos animais infectados foi separada, aberta longitudinalmente, colocada sobre uma tela dentro dos cálices de Baermann contendo solução salina (0,85% NaCl), sendo os cálices incubados em banho-maria por 4-5h a 37oC. Após este período os vermes adultos depositados no fundo dos cálices foram contados em microscópio estereoscópio e os intestinos foram colocados em placas de Petri contendo solução fisiológica para quantificação dos vermes aderidos à mucosa que foram, então, somados ao total. Para contagem de ovos, o reto foi retirado e as fezes formadas presentes na porção final foram coletadas. Estas fezes foram pesadas, homogeneizadas em volume conhecido de solução fisiológica contendo 4% de formol. Posteriormente, 2 amostras de 100µL do material fecal diluído foram examinadas em microscópio para contagem de ovos de S. venezuelensis. A contagem foi expressa em número de ovos por grama de fezes de camundongos (OPG). A fecundidade das fêmeas de S. venezuelensis foi avaliada através da razão do número de ovos por grama de fezes pelo número de fêmeas recuperadas do intestino do mesmo animal. 4.6- Avaliação da pressão intra-traqueal A avaliação de alterações na pressão intra-traqueal no decorrer da infecção por S. venezuelensis foi utilizada como parâmetro indireto para avaliar a hiperreatividade 49 brônquica em animais de todos os grupos, sendo o protocolo baseado naqueles descritos por Silveira e colaboradores (2002) e Ferreira (2007) para avaliar esta alteração em ratos experimentalmente infectados e por Pereira (2008) e Araújo (2010) avaliando em camundongos experimentalmente infectados. Para medição da hiperreatividade brônquica os camundongos foram anestesiados com injeção intraperitoneal solução de ketamina e xilazina, e a traquéia foi canulada usando cateter 20GA 1.88IN (BD Insyte). Um conector das 3 vias foi ligado à cânula traqueostômica, ao ventilador (Havard Apparatus Mouse Ventilator – Model 687) e a um transdutor de pressão diferencial (Differencial Pressure Transducer – Modelo MP100ACE – Biopac Systems). A ventilação mecânica do animal foi feita com 10 mL de ar/Kg do peso corporal a uma freqüência de 150 respirações/minuto com exalação passiva através de uma coluna de água mantida a uma pressão positiva expiratória final (PEEP) de 2-3 cm de água. Os músculos lisos dos camundongos foram paralisados com injeção intraperitoneal de 60µL de brometo de pancurônio (2mg/mL) (PANCURON® - CRISTÁLIA), o que equivale a uma dose de 0,12mg por animal. A variação da pressão intra-traqueal após injeção de doses crescentes (0,3; 0,9; 3; 6; 9; 30µg) de metacolina (acetyl βmethylcholine chloride – SIGMA) através de uma cânula inserida na veia jugular do camundongo foi usada como uma medida indireta da resistência pulmonar. O sinal do transdutor é digitalizado por uma placa digital analógica (System 1000 Power Supply; CWE Incorporated) conectado a um computador para o registro. Os dados foram expressos como porcentagem de aumento na pressão intra-traqueal em comparação à linha basal após cada dose de metacolina. 4.7- Composição celular do infiltrado pulmonar Para avaliação do infiltrado celular no espaço alveolar, cada animal eutanasiado foi submetido ao procedimento de obtenção do lavado broncoalveolar (LBA). Este procedimento consistiu de traqueostomia seguida de inoculação e aspiração de 1 mL de tampão fosfato (PBS) contendo 0,3% de albumina bovina (BSA- Sigma, Germany). A solução foi inoculada e aspirada 3 vezes através de uma cânula inserida na traqueia do animal. A solução contendo as células recuperadas dos alvéolos pulmonares foi transferida para um tubo mantido a 4ºC e todo o procedimento foi repetido por mais 2 vezes, sendo inoculado um total de 3mL por animal. Toda solução recuperada de cada animal foi centrifugada (200 x g, 4ºC por 10 min) e o sobrenadante foi desprezado. O 50 sedimento contendo as células recuperadas dos alvéolos dos animais foi ressuspendido em 100µL de PBS contendo 3% de BSA. O número total de leucócitos recuperados no lavado broncoalveolar de cada animal foi estimado através da contagem das células em câmara de Neubauer, sendo utilizadas amostras de LBA diluídas (1:10) em solução de Turk. Para contagem diferencial de leucócitos, alíquotas de 100 µL de LBA na concentração de 1 x 106 células/mL de PBS-BSA 3% foram utilizadas para confecção de lâminas em Citospyn (Shandon Citospyn III – 450rpm por 3 min) e coradas pela técnica May-Grunwald-Giemsa. Para cada lâmina, 200 células foram examinadas através de microscópio óptico e diferenciadas em eosinófilos, neutrófilos, linfócitos e outros mononucleares (predominantemente macrófagos) através de critérios morfológicos padrões para diferenciação leucocitária. O número de cada tipo celular foi calculado a partir da porcentagem encontrada em relação ao número total de células. 4.8 - Obtenção de células inflamatórias do parênquima pulmonar e avaliação do perfil celular recuperado Camundongos Balb/c selvagens e ST2-/- infectados com 700 L3 de S. venezuelensis aos 4dpi e não infectados foram eutanaziados sob condições estéreis, para retirada dos pulmões e obtenção de leucócitos infiltrados nos mesmos. Os leucócitos isolados foram caracterizados fenotipicamente por citometria de fluxo. Para tanto, os pulmões retirados de cada animal experimental foram estocados em meio RPMI 1640 (Sigma, St. Louis MO, USA) contendo 15 mM de Hepes e 24 mM NaHCO3 e 60 mg/L de gentamicina e digerido pela adição de 100 U/mL de colagenase tipo IV (Sigma) durante 45 minutos a 37ºC em banho-maria. Após este período, a digestão foi interrompida por adição de meio RPMI suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB) e a solução celular resultante foi filtrada em peneira celular com malha de nylon de 70µm (BD Falcon). O material resultante foi coletado em tubo estéril, centrifugado a 550 xg, a 4ºC por 10 min e, após a retirada do sobrenadante, o pellet contendo as células pulmonares foi ressuspendido em meio RPMI contendo 35% de Percoll a temperatura ambiente. Esta suspensão foi homogeneizada, depositada delicadamente em tubo de fundo U contendo tampão PBS com 70% de Percoll e então centrifugada a 1100xg, a 20ºC por 20 minutos para separação de células de interesse. O anel de leucócitos formado na interface da coluna de Percoll foi retirado e tranferido para tubo estéril de fundo em U, onde foi lavado 3 vezes com RPMI suplementado com 5% de SFB e após centrifugação a 260xg, 51 4º por 5 minutos o sobrenadante foi descartado (Queiroz 2011). As células obtidas foram ressuspensas em RPMI suplementado com 5% de SFB, quantificadas e distribuídas em placa de cultura de 96 poços na concentração de 1X106 células/mL e foram cultivadas na presença de 1mg/ml de Brefeldina A e 25 μg/ml antígeno L3 por 4h a 37ºC em estufa de CO2. Após a incubação iniciou-se a marcação da membrana celular com os anticorpos anti-CD4-FITC (clone H129.19) (BD Pharmingen) na concentração de 1:200, anti-CD3-PE (clone 17A2) (BD Pharmingen) na concentração de 1:250, antiCD19-FITC (clone 1D3) (BD Pharmigen) na concentração de 1:25, anti-CD193-Alexa 647 (clone 83103) (BD Pharmigen) na concentração de 1:50, anti-F4/80-PercP (clone BM8) (BD Pharmigen) na concentração de 1:200, anti-CD25-PercP (clone PC61) (BD Pharmingen) na concentração de 1:200. Após a marcação surpeficial foi feita a permeabilização celular com tampão PBS contendo 0.5% de BSA, 2mM de Azida sódica e 0.5% Saponina por 10 min. em temperatura ambiente. Após as células terem sido permeabilizadas foi feita marcação intracelular com 0.5 μl de anticorpo anti-IL-4PE (clone 11B11) (BD Pharmingen) e 0.5 μl de anti-Foxp3-PE (clone MF23) (BD Pharmingen), conforme metodologia previamente descrita, (Lehmann et al. 2002). Três mixes foram feitos utilizando as marcações citadas. No primeiro mix utilizou-se os marcadores anti-CD19- FITC, anti-CD3-PE, anti-F4/80-PerCP e anti-CD193-Alexa. No segundo mix, o objetivo foi avaliar quais tipos celulares estariam produzindo IL-4, sendo para isto utilizados marcadores anti-CD4-FITC, anti-IL-4-PE, anti-F4/80-PerCP e anti CD193-Alexa. No terceiro mix objetivou-se avaliar a porcentagem de linfócitos CD4+ ativados, bem como a porcentagem de linfócitos T regulatórios presentes, utilizando-se para isto os marcadores anti-CD4-FITC, anti-FoxP3-PE e anti-CD25PerCP. Após as marcações, as células foram fixadas em solução de PBS contendo 2% de formaldeído, submetidas à leitura em citômetro de fluxo (BD FACScan™) e posteriormente analisadas com auxilio do programa Flow Jo (V.7.6.3). 4.9 - Obtenção do homogenato pulmonar e intestinal O homogenato pulmonar e intestinal foi obtido pela maceração de 100 mg de tecido obtido de cada animal experimental nos experimentos parasitológicos, em um homogenizador de tecidos (Power General 125; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) na presença de 1 mL de PBS contendo 0,05% de Tween 20, 0.5% de albumina de soro bovino e inibidores de proteases (0.1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila; 0.1mM de 52 cloreto benzetônico; 10 mM de EDTA e 20 Ul de aprotinina). O homogenato resultante foi centrifugado (10000 x g a 4°C por 10 min.), o sobrenadante recolhido e estocado a 70ºC para a posterior dosagem de citocinas. O sedimento obtido foi submetido à lise de hemácias pela adição de solução hipotônica (1.5 mL de solução de NaCI a 0.2 %) e a osmolaridade foi reestabelecida pela adição de 1.5 mL de solução 1.6 % de cloreto de sódio contendo 5 % de glicose, após 30 s. Após nova homogeneização, o material foi dividido em duas amostras e utilizado para ensaios enzimáticos de EPO e MPO, descritos mais adiante. 4.10 - Avaliação da produção de citocinas e quimiocinas O nível das citocinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, IFN-γ, TGF-β e TNF-α e das quimiocinas CCL11 e CXCL1 presentes no homogenato intestinal e pulmonar foi quantificado utilizando-se Kits para ELISA murino (R & D Systems, Minneapolis, MN, EUA) segundo instruções do fabricante com modificações. Microplacas de 96 poços “Half Area” (High Bind) (Greiner Bio-one) foram sensibilizadas com anticorpo de captura anti-citocina de interesse. Bloqueou-se a placa com tampão PBS contendo 1% de BSA. As amostras foram diluídas em Reagente Diluente (tampão PBS contendo 1% de BSA) na proporção 1:1, e adicionadas às placas. Para detecção da citocina/quimiocina aderida à placa foi adicionado anticorpo de detecção conjugado à biotina na diluição recomendada e, após 2 h de incubação, a reação foi revelada pela adição de estreptoavidina conjugada à peroxidase (Streptoavidin – R&D systems Minneapolis, MN, Lot. AEM374111) diluída em Reagente Diluente na concentração de 1:200, seguida pela adição de solução substrato (R&D SYSTEMS® Lote 262660) e a detecção da cor foi realizada a 450 nm. As concentrações conhecidas de proteínas recombinantes foram utilizadas para gerar uma curva padrão para a conversão de leituras de densidade óptica das amostras para pg/ml. O nível da citocina IFN-γ presente no homogenato intestinal e pulmonar foi quantificado conforme descrito acima, entretanto a solução de bloqueio utilizada foi tampão de PBS contendo 1% de BSA e 0,05% de NaN3 e o Reagente Diluente utilizado foi solução Tris-buffered saline (20mM de Trizma base e 150mM de NaCl) contendo 0,1% de BSA e 0,05% de Tween20. De maneira semelhante, a concentração de TGF-β presente no homogenato intestinal e pulmonar também foi quantificado conforme descrito acima, entretanto a solução de bloqueio utilizada foi tampão de PBS contendo 53 5% de Tween20 e 0,05% de NaN3 e o Reagente Diluente utilizado foi tampão PBS contendo 1,4% de soro fetal bovino e 0,05% de Tween20, conforme instruções do fabricante. . 4.11 - Avaliação indireta da infiltração de Eosinófilos e Neutrófilos A infiltração de eosinófilos e neutrófilos nos parênquimas pulmonar e intestinal foi indiretamente medida através da atividade das enzimas Peroxidase de Eosinófilo (EPO), e Mieloperoxidase (MPO), respectivamente relacionadas a ativação de Eosinófilos e Neutrófilos. O ensaio enzimático foi realizado em amostras de sedimento obtidas de tecido homogeneizado, conforme descrito anteriormente. Uma parte foi utilizada para o ensaio de EPO, realizado conforme descrito por Strath et al. (1985) e modificado por Silveira et al. (2002), e a outra parte do homogenato tecidual foi processada para o ensaio de MPO conforme padronizado por Bailey et al. (1988) e detalhado por Barcelos et al. (2005). Para o ensaio de EPO, após a lise de hemácias o homogenato foi novamente centrifugado (3000 x g à 4°C por 10 min.), o sobrenadante descartado e foi realizada a lise de membranas através da ressuspensão do sedimento em PBS contendo 0.5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB), pH 7.4, seguida de nova homogeneização. O homogenato foi submetido a três ciclos de congelamento e descongelamento em nitrogênio líquido para disrupção das vesículas que contêm a enzima. Após esse procedimento, o material foi novamente centrifugado (3000 x g à 4°C por 10 min) e o sobrenadante utilizado para realização do ensaio enzimático em placas de 96 poços (Plate Flat Bottom – SARSTEDT, Inc. USA), aos quais foram adicionados 75 L de cada amostra diluída em PBS contendo 0,5% HTAB na proporção de 1:1, ou somente 75 L de PBS contendo 0.5% HTAB (branco), juntamente com 75 L de substrato (1.5 mM o-fenilenodiamina (OPD) em tampão tris-HCL 0.075 mM, pH 8 suplementado com 6.6 mM de H2O2). Após o desenvolvimento da cor, a reação foi interrompida pela adição de solução 4N de H2SO4 e a intensidade da cor estimada através da leitura da absorbância em leitor de micro-placas (Status-Labsystems Multiskan RC, Helsinki, Finland) a 492 nm. Para o ensaio de MPO, após a lise das hemácias o homogenato foi novamente centrifugado (3000 x g à 4ºC por 10 min), o sobrenadante descartado, o sedimento 54 ressuspenso em um primeiro tampão de extração (0,1 M NaCl, 0,02 M Na3PO4, 0,015 M NaEDTA pH 4,7), seguido de nova homogeneização e centrifugação (3000 x g à 4ºC por 10 min). O sobrenadante novamente foi descartado e o sedimento ressuspenso em um segundo tampão de extração (0,05 M de Na3PO4, pH 5,4 contendo 0,5% de HTAB). Em seguida, a disrupção das vesículas enzimáticas foi realizada através de três ciclos de congelamento e descongelamento em nitrogênio líquido seguido de centrifugação da amostra (3000 x c à 4ºC por 15 min.). Para o ensaio, 25 μL do sobrenadante diluídos no segundo tampão de extração na proporção 1:1, ou somente 25 μL do segundo tampão de extração (branco) foram acrescentados à placas de 96 poços (Plate Flat Bottom – SARSTEDT, Inc. USA) contendo 25 μL de substrato (3,3’- 5,5’ – tetramethylbenzine – TMB diluído em dimetilsulfóxido – DMSO na concentração final de 1,6 mM). Após incubação à 37 ºC por 5 min. foram adicionados 100 μL do segundo tampão de extração contendo 0,5mM de de H2O2 seguida de nova incubação à 37 ºC por 5 min. A reação foi interrompida pela adição de H2SO4 1M e quantificada através da absorbância em leitor de microplacas (Status-Labsystems Multiskan RC, Helsinki, Finland) a 450 nm. 4.12- Análise histopatológica Os pulmões e intestino de camundongos não infectados e infectados aos 4dpi (pulmão) e 10 dpi (intestino) de cada linhagem (Balb/c e ST2-/-) foram recolhidos para avaliação histopatológica. Para fixação do pulmão, foi injetado, via traquéia, 0,5 mL de tampão fosfato contendo 10 % de formalina (solução fixadora) em 4 pulmões de cada grupo. Em outros 4 pulmões de cada grupo, foi injetado, via traqueia, 0,5mL de solução fixadora de Carnoy (Álcool absoluto, clorofórmio e acido acético, sendo a proporção de 6:3:1, respectivamente). Após a inoculação, a traquéia foi amarrada com linha, a cavidade torácica do animal foi aberta e os pulmões foram retirados e colocados nas respectivas soluções fixadoras. O intestino delgado foi dividido em duas partes de tamanhos iguais (cerca de 4 cm cada), sendo a primeira porção utilizada para fixação com tampão fosfato contendo 10 % de formalina e a segunda porção utilizada para fixação com solução de Carnoy. As amostras de intestino foram abertas longitudinalmente sobre um papel filtro e delicadamente lavadas em solução salina 0,85%, pH 7,2 para retirada das fezes. Após a limpeza, as porções de intestino foram acrescidas de solução fixadora (solução de formalina ou Carnoy) e após adquirirem uma consistência mais rígida foram enroladas em um palito de madeira e amarradas com 55 uma linha formando um rolo. As porções de intestino foram então submersas nas soluções fixadoras correspondentes. O tecido fixado em formalina permaneceu na solução fixadora por 24 h e, posteriormente, foi lavado por 3-4 h em água corrente e então colocado em álcool 70%. Posteriormente, todo material foi desidratado em séries crescentes de álcool (70º GL a absoluto), clarificado em xilol e embebido em parafina. O material fixado em Carnoy permaneceu em solução fixadora por 3h e os tecidos foram transferidos para solução de Álcool absoluto e Xilol, na proporção de 1 parte de álcool para 1 parte de Xilol, e posteriormente foram clarificados em xilol e montados em parafina. A seguir foram realizados cortes de 4µm de espessura, sendo os pulmões fixados em formol e a primeira porção do intestino também fixada em formol corados com hematoxilina-eosina para observação de infiltrado inflamatório, lesões e alterações provocadas pela infecção ou PAS (ácido periódico de Schiff) para observação de células caliciformes e produção de muco. Para verificar a presença de mastócitos em animais selvagens e deficientes no receptor ST2 foram realizados cortes de 4µm de espessura de pulmões fixados em Carnoy bem como da segunda porção de intestino também fixada em Carnoy e posteriormente estes cortes foram corados por Alcian-Blue (pH 0.3) e safranina (Abe & Nawa 1987; Enerbäck 1966). Estes cortes foram utilizados para contagem de mastócitos presentes no intestino. Foi feita contagem de mastócitos presentes em cada vilosidade, sendo analisada cerca de 40 vilosidades intestinais por animal e um total de 4 animais por grupo experimental. 4.13 - Avaliação da produção de Imunoglobulinas Os soros dos animais experimentais foram utilizados nos ensaios de ELISA, para avaliar o perfil de imunoglobulinas produzido frente infecção por S. venezuelensis. Para medir a concentração de IgE total no soro dos animais infectados aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias pós infecção por S. venezuelensis e dos animais não infectados, foi utilizado um kit comercialmente disponível (Bethyl Laboratories Inc, Montgomery, TX, Lot. E90-115). De acordo com as instruções do fabricante, placas de 96 poços (Nunc Maxisorp, Nagle Nunc International, Rochester, NY, USA) foram sensibilizadas com anticorpo purificado anti-IgE de camundongo. Entre cada etapa de incubação as placas foram lavadas 5 vezes com tampão Tris-NaCl (Tris 50 mM, NaCl 0,14M). Após bloqueio da placa com tampão Tris-NaCl acrescido de 1% de albumina bovina (BSASigma), amostras de soro obtidas dos animais experimentais e diluídas 1:200 (tampão 56 Tris-NaCl contendo 0,1% BSA) ou amostras com concentrações conhecidas de IgE purificada para curva padrão foram aplicadas à placa e incubadas por 1 h a temperatura ambiente. Após a aplicação das amostras e da curva padrão foi adicionado à placa o anticorpo de detecção (anti-IgE de camundongos, obtida de cabra, conjugada a HRP) e em seguida foi feita a aplicação do substrato (tampão citrato a 0,05mM, pH 5, contendo 4mM de OPD e 0,05mM de peróxido de hidrogênio). A reação foi interrompida com 2N H2SO4 e a leitura realizada em leitor de micro-placas (Status-Labsystems Multiskan RC, Helsinki, Finland) no comprimento de onda de 492 nm. A concentração de IgE nas amostras foi calculada pela interpolação do resultado da leitura de absorbância das amostras na curva padrão, sendo a sensibilidade do teste de 3,9 ng/mL. A presença de IgG1 e IgM reativas à antígeno solúvel de larvas filarióides de S. venezuelensis também foi estimada nos soros coletados dos animais experimentais. Foram utilizadas placas de 96 poços (Costar) de alta afinidade (High Bind) sensibilizadas com 100 L antígeno solúvel de L3 (10 g/mL) diluído em tampão 0,1M de Carbonato-Bicarbonato (0,05 M Na2CO3, 0,5 M NaHCO3 - pH 9,6). Após a sensibilização da placa e entre cada etapa de incubação as placas foram lavadas 5 vezes com tampão fosfato (PBS) contendo 0,5 % de Tween 20. Posteriormente foi feito o bloqueio das placas com tampão fosfato contendo 1% de BSA por 1 h a temperatura ambiente seguido da aplicação das amostras de soro diluídas em PBS contendo Tween 20 (0,5%) acrescido de 0,1% BSA. Para detecção de IgG1 as amostras de soro foram diluídas na proporção de 1:200 e para detecção de IgM as amostras foram diluídas na proporção 1:100. Após a aplicação do soro, adicionou-se o anticorpo de detecção antiIgG1 (Goat anti Mouse IgG1 affinity purified, Bethyl, Lot. A90-205B-1) ou anti-IgM (Goat anti-Mouse IgM (μ-chain-specific) - Peroxidase, Sigma. Lot.125K6055) diluídos em PBS na proporção 1:5000 para IgM e na proporção de 1:40000 para IgG1. A reação de IgG1 foi detectada pela adição de estreptoavidina (Calbiochem U.S. and Canada Lot. B37509) conjugada à peroxidase (1:2000). A revelação da cor foi feita pela adição de substrato (4mM OPD, contendo peróxido de hidrogênio em 0,05 m Tampão Citrato pH 5). A reação foi interrompida após 30 min. com 2N H2SO4 e a leitura realizada em leitor de micro-placas (Status-Labsystems Multiskan RC, Helsinki, Finland) a 492 nm. 57 4.14 – Análise estatística Os dados foram registrados como média ± erro padrão (EP) quando apresentaram distribuição normal, sendo desta forma analisados usando teste t student, quando se compara duas variáveis ou análise de variância ANOVA, teste utilizado quando se tem mais de duas variáveis seguido do teste Neuman-Keuls, que compara grupos de dados dois a dois. Em caso de distribuição não paramétrica foram registrados valores de medianas e aplicado o teste Mann-Whitney. O intervalo de confiança foi fixado em 95% e as diferenças foram consideradas significativas para p<0.05. 58 5 – RESULTADOS ANIMAIS ST2-/- E BALB/C 5.1 - Avaliação parasitológica da infecção de animais ST2-/- e Balb/c Em todos os camundongos Balb/c e ST2-/- infectados com 700 L3 de S. venezuelensis foram recuperadas larvas nos pulmões aos 2 dias de infecção (Fig 3). Em todos os experimentos realizados, o número médio de larvas recuperadas de pulmão de camundongos deficientes para ST2 foi maior que em controles selvagens (100,6 33 larvas no pulmão de camundongos Balb/c e 153,4 35 larvas no pulmão de ST2-/-), entretanto, esta diferença não foi considerada estatisticamente significativa. Nº larvas no pulmão 200 Balb/c ST2-/- 150 100 50 0 2 dias após infecção -/- Figura 3 - Número de larvas no pulmão de camundongos Balb/c e ST2 aos 2 dias após a infecção com 700L3 de S. venezuelensis. Teste estatístico: t-student. N=8 animais por grupo. 59 Em todos os camundongos Balb/c e ST2-/- infectados com 700 L3 de S. venezuelensis foram recuperados vermes no intestino aos 4, 7 e 10 dias da infecção (Fig 4). No quarto dia de infecção foi detectado número estatisticamente maior de vermes no intestino de animais ST2-/- em relação aos animais Balb/c, sendo quantificados no primeiro grupo 228,5 21 enquanto nos animais selvagens foram quantificados 157,6 13 vermes no intestino. No 7º dia pós-infecção o número de vermes recuperados do intestino dos dois grupos experimentais foram semelhantes, sendo recuperados 185 20,4 vermes no intestino de camundongos Balb/c e uma média de 178,3 20 vermes no intestino de camundongos ST2-/-. Aos 10 dias de infecção foram detectados poucos vermes no intestino dos camundongos infectados de ambos os grupos experimentais e a partir do 12º dia de infecção não foram detectados vermes no intestino de nenhum dos camundongos infectados, demonstrando que não houve diferenças estatísticas no Nº de vermes no intestino período de eliminação da infecção experimental nos animais Balb/c e ST2-/-. 300 * 200 100 0 ND 4 7 10 12 ND 14 Dias após infecção -/- Figura 4 - Número de vermes no intestino de camundongos Balb/c e ST2 aos 4,7,10, 12 e 14 dias após a infecção com 700L3 de S. venezuelensis. *(p<0,05) diferença -/significativa entre animais Balb/c e ST2 no mesmo período da infecção. Teste estatístico: t-student. ND = vermes não detectados no intestino. N=10 animais por grupo. 60 Em todos os camundongos ST2-/- e Balb/c infectados com 700 L3 de S. venezuelensis foi detectada presença de ovos nas fezes entre 7 e 10 dias da infecção (Fig 5A). No 70 dia da infecção foi quantificada uma média de 58.660 9508 ovos/g de fezes recolhidas em camundongos Balb/c (amplitude de 13.425 a 105.952 ovos/g de fezes) e 112.500 16040 ovos/g de fezes recolhidas em camundongos ST2-/- (amplitude de 18.529 a 175.362 ovos/g de fezes), sendo estas diferenças consideradas estatisticamente significativas. Aos 10 dias de infecção, houve acentuada diminuição do número de ovos, sendo detectados 10.640 1661 ovos/ g de fezes de camundongos Balb/c (amplitude de 2.112 a 16.818 ovos/g de fezes) e 22.230 3749 ovos/g de fezes de ST2-/(amplitude de 2.045 a 41.250 ovos/g de fezes), e mais uma vez estas diferenças foram consideradas estaticamente significativas, indicando que em camundongos ST2-/infectados por S. venezuelensis ocorre maior eliminação de ovos do parasito. Aos 14 dias de infecção não foram encontrados ovos nas fezes de nenhuma das linhagens de camundongos. Conforme demonstrado na figura 5B, verificou-se valor estatisticamente maior na fecundidade dos vermes recuperados de camundongos ST2-/- em relação aos vermes recuperados de camundongos Balb/c aos 7dpi 61 A 150000 Balb/c ST2-/- Ovos/g fezes ** 100000 50000 * 0 7 10 Dias após infecção ND ND 14 Fecundidade dos vermes OPG/n° de vermes B 800 * Balb/c ST2-/- 600 400 200 0 7dias após infecção Figura 5 – Número de ovos eliminado nas fezes (A) e fecundidade das fêmeas do parasito (B) durante a infecção com 700L3 de Strongyloides venezuelensis. *(p<0.05) e -/**(p<0.01) diferença significativa entre camundongos Balb/c e ST2 no mesmo período da infecção. ND = ovos não detectados nas fezes. Teste estatístico: t-student. N=10 animais por grupo. 62 5.2 - Avaliação imunológica de animais ST2-/- e Balb/c 5.2.1 - Avaliação da resposta humoral Para avaliação da resposta humoral foi estimado a concentração de IgE total e os níveis IgG1 e IgM reativos a antígenos de L3 de S. venezuelensis em amostras de soro dos camundongos não infectados e infectados dos dois grupos experimentais em diferentes dias de infecção. Foi verificado que a concentração de IgE total apresentou aumento estatístico a partir dos 7dpi em animais Balb/c em relação aos seus controles não infectados, ao passo que em animais ST2-/- este aumento estatístico só ocorre a partir dos 10dpi quando comparados aos seus controles não infectados. Comparando-se a concentração de IgE entre os dois grupos experimentais foi verificado que os níveis desta imunoglobulina se mostram estatisticamente inferiores em animais deficientes para ST2 em relação aos animais selvagens Balb/c aos 7 e 10dpi, alcançando níveis semelhantes aos de Balb/c somente aos 14dpi (Fig 6). IgE total 20000 Balb/c 15000 # ** * ### # ng/mL ST2-/- # ## 10000 5000 0 0 2 4 7 10 Dias após infecção 14 -/- Figura 6 – Concentração total de IgE no soro de camundongos Balb/c e ST2 não infectados e aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção com 700L3 de S. venezuelensis. #(p<0,05), ##(p<0,01), ###(p<0,001) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. *(p<0,05), **(p<0,01) diferença significativa -/entre animais Balb/c e ST2 no mesmo período da infecção. Teste estatístico ANOVA, seguido do teste Newman-Keuls. N= 6 animais por grupo. 63 Camundongos Balb/c e ST2-/- infectados por S. venezuelensis apresentam aumento progressivo dos níveis séricos de anticorpos IgG1 e IgM reativas a antígenos solúveis de larva L3 de S. venezuelensis, atingindo os maiores valores aos 14 dias da infecção (Fig 7). No caso de IgG1, foi verificado aumento estatístico dos níveis em animais Balb/c a partir dos 7dpi em relação aos não infectados, enquanto em animais ST2-/- elevação significativa só foi verificada a partir dos 14dpi, o que mostra que estes animais deficientes apresentam atraso na produção desta imunoglobulina, semelhante ao observado para IgE total. Entretanto, não foram verificadas diferenças estatísticas na produção de IgG1 parasito-reativa entre camundongos Balb/c e ST2-/- nos diferentes pontos de infecção avaliados (figura 7A). Por outro lado, a infecção induz um aumento precoce de IgM reativa a antígenos de L3 em camundongos ST2-/- e os níveis de IgM parasito reativa nestes animais são estatisticamente superiores aos níveis detectados em camundongos Balb/c aos 10 e 14dpi (figura 7B). 64 A IgG1 0.3 ### ### Balb/c Abs 492nm ST2-/0.2 # ## ## # 0.1 0.0 0 2 B 4 7 10 Dias após infecção 14 IgM 2.0 *** Abs 492nm ### 1.5 Balb/c ST2-/- ** # 1.0 0.5 0.0 0 2 4 7 10 Dias após infecção 14 Figura 7 – Níveis de IgG1 e IgM reativos aos antígenos solúveis de L3 de S. -/venezuelensis no soro de camundongos Balb/c e ST2 não infectados e aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção com 700L3 de S. venezuelensis. #(p<0,05), ##(p<0,01), ###(p<0,001) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma -/linhagem. **(p<0,01), ***(p<0,001) diferença significativa entre animais Balb/c e ST2 no mesmo período da infecção. Teste estatístico ANOVA, seguido de teste Newman-Keuls. N= 6 animais por grupo. 65 5.2.2 - Caracterização do infiltrado celular pulmonar Para avaliação do infiltrado celular pulmonar em resposta à passagem das larvas do parasito foi realizada contagem de células recuperadas através de lavado broncoalveolar (LBA) e da quantificação de níveis de EPO como medida indireta da presença de eosinófilos e de MPO como medida indireta da presença de neutrófilos no homogenato de tecido pulmonar. Conforme demonstrado na figura 8, a passagem das larvas pelo pulmão do hospedeiro aos 2 dias pós-infecção resultou em aumento estatístico no número de leucócitos recuperados no lavado broncoalveolar (LBA) dos camundongos Balb/c e ST2-/- em relação ao número de células recuperadas em lavados de animais não infectados. Após a passagem das larvas pelo pulmão, o número de leucócitos do LBA aumenta novamente aos 7 dias da infecção em camudongoss selvagens, não sendo verificado aumento Nº de leucócitos X 104/mL estatístico de células nos ST2-/- neste mesmo período da infecção. 150 Balb/c ## ## 100 ST2-/# 50 0 0 2 4 7 10 Dias após infecção 14 Figura 8 - Avaliação do número de leucócitos totais recuperados no lavado bronco-/alveolar (LBA) de camundongos Balb/c e ST2 não infectados e aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção com 700L3 de S. venezuelensis. #(p<0,05) diferença estatisticamente significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 66 A grande maioria dos leucócitos recuperados do lavado broncoalveolar dos camundongos são células mononucleares, especialmente macrófagos não havendo diferença significativa no número destas células entre animais Balb/c e ST2-/-. Os eosinófilos e neutrófilos encontrados no lavado broncoalveolar representaram uma pequena parcela do número total de células recolhidas, entretanto, houve uma variação na porcentagem e no número total de cada uma destas células entre animais Balb/c e ST2-/- aos 4dpi. Animais Balb/c apresentaram número estatisticamente maior de eosinófilos aos 4dpi em relação aos animais ST2-/-. Entretanto, animais ST2-/apresentaram um número mais elevado de neutrófilos recuperados aos 4dpi em relação aos animais Balb/c, embora estes valores não tenham sido considerados estatisticamente significativos (Fig 9). A figura 10 ilustra esta composição celular presente no lavado broncoalveolar de animais Balb/c e ST2-/- não infectados (Fig 10a e 10b) e infectados aos 2dpi (Fig 10c e 10d), 4dpi (Fig 10e e 10f) e 7dpi (Fig 10g e 10h). 67 0.5 * 0.0 nº de linfócitos X 10 4/mL 0 5 10 Dias após infecção Balb/c ST2-/- 4 2 0 0 5 10 Dias após infecção 6 15 Balb/c ST2-/- 4 2 0 0 15 8 6 nº de neutrófilos X 10 4/mL 1.0 nº de mononucleares X 10 4/mL (macrófagos e mastócitos) nº de eosinófilos X 10 4/mL Balb/c ST2-/- 1.5 5 10 Dias após infecção 15 Balb/c ST2-/- 100 50 0 0 5 10 Dias após infecção 15 Figura 9 - Número de eosinófilos, neutrófilos, linfócitos e outras mononucleares (mastócitos e macrófagos) no lavado broncoalveolar (LBA) de camundongos Balb/c e -/ST2 não infectados e infectados aos 2, 4, 7, 10 e 14dpi com 700L3 de S. venezuelensis. -/*(p<0,05) diferença significativa entre animais Balb/c e ST2 no mesmo período da infecção. Teste estatístico: t-student. N=6 animais por grupo. 68 Figura 10 – Foto de células do lavado broncoalveolar de camundongos não infectados -/-/Balb/c (a) e ST2 (b) e Balb/c infectados aos 2dpi (c), 4dpi (e) e 7dpi (g) e ST2 infectados aos 2dpi (d), 4dpi (f) e 7dpi (h). Os asteriscos pretos sinalizam eosinófilos e os asteriscos vermelhos sinalizam neutrófilos presentes no lavado. As células não sinalizadas correspondem a mononucleares. Foto panorâmica no aumento de 40X e de eosinófilos e neutrófilos isolados no aumento de 100X. 69 A quantificação da atividade de peroxidase de eosinófilos (EPO) no homogenato pulmonar foi utilizada como uma medida indireta da quantidade de eosinófilos presentes neste órgão (Fig 11A). A passagem das larvas pelo pulmão induz um ligeiro aumento dos níveis de EPO nos pulmões de animais Balb/c após 2 e 4dpi quando comparados aos controles não infectados. Os níveis de EPO são reduzidos significativamente aos 7 e 10dpi, período em que os vermes já estão instalados no intestino delgado e voltam a apresentar uma elevação significativa no pulmão dos animais aos 14dpi, período em que estes já se encontram livres da infecção. Interessantemente, observamos que os níveis de EPO não apresentam elevação significativa no pulmão de animais ST2-/- em nenhum período da infecção, mostrando que a presença do receptor ST2 é importante para que ocorra infiltração eosinofílica pulmonar durante a infecção por S. venezuelensis. De maneira semelhante, foi verificado aumento estatisticamente significativo dos níveis de MPO, usado como medida indireta da infiltração de neutrófilo, no parênquima pulmonar de camundongos Balb/c após 2 e 4dpi e aos 14dpi, o que não foi detectado no pulmão de camundongos ST2-/- durante a infecção (Fig 11B). 70 A ** EPO [Abs 492nm] 0.4 ## Balb/c ST2-/- 0.3 * 0.2 # 0.1 ## # # 0.0 0 2 4 7 10 Dias após infecção 14 B ** 0.4 ## Balb/c ST2-/- MPO [Abs 450nm] ## 0.3 # ** 0.2 0.1 0.0 0 2 4 7 10 Dias após infecção 14 Figura 11 – Atividade de peroxidase de eosinófilos (EPO) (A) e de mieloperoxidase de -/neutrófilos (MPO) (B) no homogenato pulmonar de camundongos Balb/c e ST2 não infectados e aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção com 700L3 de S. venezuelensis. -/***(p<0,001) e *(P<0,05) diferença significativa entre animais Balb/c e ST2 no mesmo período da infecção. ###(p<0,001) e #(p<0,05) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 71 5.2.3 - Análise das alterações histopatológicas pulmonares As alterações histopatológicas realizadas no pulmão de camundongos Balb/c e ST2-/aos 4 dias após infecção por S. venezuelensis, são mostradas na Figura 12. Conforme esperado, o parênquima pulmonar dos animais não infectados mostra espaços alveolares livres, sem infiltração celular, com brônquios, bronquíolos e vasos intactos e sem a presença de células caliciformes ou muco no epitélio brônquico, tanto em animais Balb/c (Fig 12a-12b), quanto em animais ST2-/- (Fig 12c-12d) . Aos 4 dias pós-infecção, o tecido pulmonar dos animais Balb/c mostra áreas de inflamação onde é possível visualizar congestão de vasos sanguíneos e intenso infiltrado celular composto de células mononucleares e polimornucleares, como eosinófilos, sinalizadas por setas (Fig 12e). Nos animais ST2-/- (Fig 12g), também se observa infiltração de células inflamatórias sendo estas compostas basicamente de mononucleares, melhor visualizadas no aumento maior. Interessantemente, nestes animais deficientes observase intensa hemorragia, constatada pelo grande número de hemácias extravasadas no parênquima pulmonar, sendo que o mesmo não é observado em animais Balb/c. Em ambos os grupos, o processo inflamatório resulta em desestruturação da arquitetura alveolar, em várias regiões do parênquima. Nos tecidos corados por PAS, observa-se discreta diferenciação de células caliciformes no epitélio brônquico de animais infectados, tanto em camundongos Balb/c (Fig 12f), quanto em camundongos ST2-/(Fig 12h), sem diferenças visíveis entre os dois grupos. A coloração por Alcian Blue não revelou a presença de mastócitos no tecido pulmonar no período avaliado. 72 Figura 12 – Fotomicrografias do pulmão de camundongos corados por hematoxilina-/eosina (a,c e,g) e por PAS (b,d,f,h). Camundongos não infectados Balb/c (a-b) e ST2 (c-/d); camundongos Balb/c infectados aos 4dpi (e-f); camundongos ST2 infectados aos 4dpi (g-h). As barras de escalas nas fotografias a, c, e,g correspondem a 50µm do tecido. As barras de escala nas fotografias b,d,f,h correspondem a 25µm do tecido. Nas imagens ampliadas as barras de escala correspondem a 10µm do tecido. As setas sinalizam a presença de eosinófilos. A coloração rosa intensa em d e f representa muco em células caliciformes do epitélio brônquico de camundongos infectados. 73 5.2.4 - Quantificação de quimiocinas de pulmão A concentração das quimiocinas CCL11 e CXCL1 no homogenato pulmonar de camundongos Balb/c e ST2-/- foi quantificada em animais não infectados e animais infectados aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção por S. venezuelensis (Fig 13). Os dados mostram que os níveis de CCL11 (Fig 13A), quimiocina envolvida no recrutamento de eosinófilos, aumentam estatisticamente a partir do 2º dia de infecção em animais Balb/c, enquanto em animais deficientes este aumento só ocorre a partir do 7º dpi. Aos 10 e 14dpi os níveis CCL11 no homogenato pulmonar de animais deficientes apresentam-se menores em relação aos de animais selvagens. A concentração de CXCL1 (Fig 13B), quimiocina envolvida no recrutamento de neutrófilos, no homogenato pulmonar também aumenta durante a infecção por S. venezuelensis já a partir dos 2dpi em animais Balb/c, enquanto nos animais ST2-/- este aumento ocorre aos 4dpi. Foi verificado ainda que os níveis de CXCL1 em animais ST2-/- aos 2dpi são estatisticamente menores em relação aos de animais não deficientes. A partir dos 4dpi não se observa mais diferenças estatísticas entre animais deficientes e selvagens. 74 CCL11 A 1500 pg/100mg Balb/c ## 1000 ## # ## * 500 ## ST2-/- ** ## * ## 0 0 2 4 7 10 Dias após infecção CXCL1 B 800 ## 600 pg/100mg 14 Balb/c ## 400 # ** ST2-/- ## ## # ## ## 200 0 0 2 4 7 10 Dias após infecção 14 Figura 13 – Concentração de quimiocinas CCL11 (A) e CXCL1 (B) no homogenato -/pulmonar de camundongos Balb/c e ST2 não infectados e infectados com 700L3 de S. venezuelensis, aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção. *(p<0,05), **(p<0,01) diferença -/significativa entre animais Balb/c e ST2 no mesmo período da infecção. ##(p<0,01) e #(p<0,05) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 75 5.2.5 - Quantificação de citocinas do pulmão Os níveis de citocinas (IL-4; IL-5; IL-10; IL-13; IL-17; TNF-α e IFN-γ) no homogenato pulmonar de camundongos Balb/c e ST2-/- foram quantificados em animais não infectados e animais infectados aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção por S. venezuelensis (Fig 14). Os dados mostram que os níveis de citocinas do perfil Th2 (IL-4 e IL-5) e da citocina pró-inflamatória IL-17 elevam-se no homogenato pulmonar de camundongos Balb/c entre 7 e 10 dpi quando comparados aos seus controles não infectados. Embora não tenha sido observado aumento estatisticamente significativo de IL-13, IL-10 e TNF-α nestes animais, também foram detectados elevação no nível destas citocinas neste mesmo período de infecção. Entretanto, o interessante a se observar é que em animais ST2-/- o nível destas citocinas permanece semelhante ao nível de seus controles não infectados, não havendo elevação das mesmas em nenhum período da infecção avaliado. Observa-se que a concentração de citocinas no homogenato pulmonar de animais ST2-/- foi menor do que em animais Balb/c ao longo da infecção, sendo que, em alguns pontos, principalmente entre 7 e 10dpi, esta diferença se mostra estatisticamente significativa. A citocina IFN-γ, de perfil Th1, apresentou queda ao longo da infecção tanto em animais Balb/c quanto em animais ST2-/-, o que pode ser explicado pela polarização da resposta para o perfil Th2, característico da resposta imune à infecção por S. venezuelensis. 76 IL-5 IL-4 2000 400 ** Balb/c ST2-/- ## pg/100mg pg/100mg 1000 0 0 4 7 10 Dias após infecção 500 2 4 7 10 Dias após infecção 4 7 10 Dias após infecção 300 ** 0 14 0 2 Balb/c ST2-/- * # 2000 pg/100mg # 200 100 * 5000 2500 Balb/c ST2-/- ** 10000 IL-17 400 14 IL-13 Balb/c ST2-/- ** 0 2 15000 Balb/c ST2-/- 1000 0 14 pg/100mg pg/100mg 2 IL-10 1500 pg/100mg * 200 100 500 0 *** ### 300 1500 0 Balb/c ST2-/- 4 7 10 Dias após infecção 14 TNF- *** * * 1500 1000 500 0 0 2 4 7 10 Dias após infecção 14 0 0 2 4 7 10 Dias após infecção 14 IFN- 800 Balb/c ST2-/- pg/100mg 600 400 200 0 ND 0 2 ND ND 4 7 10 Dias após infecção 14 Figura 14 – Concentração de interleucinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, TNF-α, INF-γ no -/homogenato pulmonar de camundongos Balb/c e ST2 não infectados e infectados com 700L3 de S. venezuelensis, aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção. *(p<0,05), **(p<0,01), -/***(p<0,001) diferença significativa entre animais Balb/c e ST2 no mesmo período da infecção. #(p<0,05), ##(p<0,01), ###(p<0,001) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 77 5.2.6 - Citometria de fluxo Os experimentos de citometria de fluxo avaliaram diferentes marcações celulares em leucócitos recuperados do pulmão de animais Balb/c e ST2-/- não infectados e aos 4dpi. Primeiramente, foi analisada a composição celular através do tamanho e granulosidade dos leucócitos (Fig 15). Os resultados mostraram que, embora não se tenha verificado diferença estatisticamente significativa, animais deficientes apresentaram menor porcentagem de granulócitos em relação aos animais selvagens aos 4dpi (Fig 15B1). Com relação aos outros tipos celulares, macrófagos (Fig 15B2) e linfócitos (Fig 15B3), não houve diferenças significativas entre animais não infectados e infectados, bem como não houve também diferenças entre animais Balb/c e ST2-/-. A população de granulócitos foi analisada pela expressão do antígeno F4/80 e de CD193, que corresponde ao receptor CCR3, um receptor de CCL11 presente em eosinófilos, mastócitos, basófilos, linfócitos Th2 e plaquetas (Charo et al. 2006) (Fig 16). Os resultados mostraram que não houve diferenças na porcentagem de granulócitos CD193+ F4/80- (Fig 16B1) entre os grupos infectados e não infectados ou deficientes e selvagens. Dentro da população de granulócitos CD193+ F4/80- foi analisada a porcentagem de células que produzem IL-4, não sendo detectada diferença na porcentagem desta subpopulação de granulócitos que produzem IL-4 entre animais não infectados e infectados, bem como entre os grupos Balb/c e ST2-/- (Fig 16B2). 78 B2 Balb/c ST2-/- 10 % de Macrófagos % de Granulócitos 15 10 5 0 B3 Balb/c ST2-/- 60 8 % de Linfócitos B1 6 4 2 0 0 4 Dias após infecção Balb/c ST2-/- 40 20 0 0 4 Dias após infecção 0 4 Dias após infecção -/- Figura 15 – Perfil de leucócitos isolados de pulmão de camundongos Balb/c e ST2 não infectados e infectados aos 4 dias após infecção por S. venezuelensis. Células estimuladas com antígeno de L3 de S. venezuelensis in vitro. Figura representativa das três populações de leucócitos (granulócitos, macrófagos e linfócitos) identificadas por citometria de fluxo baseado em tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) (A). Porcentagem -/de granulócitos (B1), macrófagos (B2) e linfócitos (B3) de animais Balb/c e ST2 não infectados e aos 4dpi. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 79 80 B2 Balb/c ST2-/- % de Granulócitos CD193+ F480- produzindo IL-4 % de Granulócitos CD193+ F4/80- B1 60 40 20 0 0 4 Balb/c ST2-/- 15 10 5 0 0 Dias após infecção 4 Dias após infecção + - Figura 16 - Perfil celular e de granulócitos CD193 F4/80 isolados de pulmão de -/camundongos Balb/c e ST2 não infectados e infectados aos 4 dias após infecção por S. venezuelensis. Células estimuladas com antígeno de L3 de S. venezuelensis in vitro.Figura representativa de granulócitos identificados por tamanho (FSC) e + + granulosidade (SSC) F4/80 negativos CD193 (FL4 ) (A). Porcentagem de granulócitos + + + -/CD193 F4/80 (B1) e de granulócitos CD193 F4/80 IL-4 (B2) de animais Balb/c e ST2 não infectados e aos 4 dias após infecção com 700L3 de S. venezuelensis. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 80 Analisando-se a população de macrófagos (Fig 17), verificamos que a infecção levou a um aumento da porcentagem de macrófagos F4/80+ em ambos os grupos experimentais, porém sem diferenças entre animais Balb/c e ST2-/- (Fig 17B1). Por outro lado, a infecção não resultou em aumento da porcentagem de macrófagos F4/80+ que produzem IL-4 (F4/80+ IL-4+), não havendo diferenças significativas também entre animais Balb/c e ST2-/- (Fig 17B2). A análise de linfócitos não revelou diferenças nas porcentagens de linfócitos CD3 + (Fig 18B1) ou linfócitos CD19+ (Fig 18B2) entre animais não infectados e infectados ou entre os grupos selvagens e deficientes. Com relação aos linfócitos marcados por CD4 (Fig 19) observamos que animais ST2-/- infectados apresentaram porcentagens menores destes linfócitos do que animais Balb/c infectados (Fig 19B1). Também observamos uma menor porcentagem de linfócitos CD4+ pulmonares produzindo IL-4 em camundongos ST2-/- infectados, mas sem diferença estatística entre os grupos (Fig 19B2). A expressão de molécula de ativação de linfócitos (CD25+) revelou que a infecção não levou a um aumento da porcentagem de linfócitos CD4+ ativados (linfócitos CD4+ CD25+) no período avaliado, bem como não foi observada diferença estatistica na porcentagem de linfócitos CD4+ CD25+ entre animais selvagens e deficientes (Fig 20B1). Interessantemente, animais ST2-/- não infectados apresentam porcentagem maior de linfócitos CD4+ CD25+ FoxP3+, que caracterizam linfócitos T reg, sendo que estas células tendem a reduzir significativamente devido a infecção nestes animais (Fig 20B2). 81 B2 Balb/c ST2-/## 60 40 20 0 0 10 % de Macrófagos F4/80 + produzindo IL-4 % de Macrófagos F4/80 + B1 80 Balb/c ST2-/- 8 6 4 2 0 4 0 Dias após infecção 4 Dias após infecção + Figura 17 - Perfil celular e de macrófagos F4/80 isolados de pulmão de camundongos -/Balb/c e ST2 não infectados e infectados aos 4 dias após infecção por S. venezuelensis. Células estimuladas com antígeno de L3 de S. venezuelensis in vitro. Figura representativa de macrófagos identificados por tamanho (FSC) e granulosidade + + + (SSC) F4/80 produtores de IL-4 (FL2 ) (A). Porcentagem de macrófagos F4/80 (B1) e de + + -/macrófagos F4/80 IL-4 (B2) de animais Balb/c e ST2 não infectados e aos 4dpi. ##(p<0,01) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 82 B2 B1 20 % de Linfócitos CD19+ % de Linfócitos CD3+ 80 Balb/c ST2-/- 60 40 20 0 0 Balb/c ST2-/- 15 10 5 0 4 0 4 Dias após infecção Dias após infecção + + Figura 18 - Perfil celular e de linfócitos CD3 ou CD19 isolados de pulmão de -/camundongos Balb/c e ST2 não infectados e infectados aos 4 dias após infecção por S. venezuelensis. Células estimuladas com antígeno de L3 de S. venezuelensis in vitro. Figura representativa de linfócitos identificados por tamanho (FSC) e granulosidade + + + + (SSC) CD3 ou CD19 (A). Porcentagem de linfócitos CD3 (B1) e linfócitos CD19 (B2) de -/animais Balb/c e ST2 não infectados e aos 4dpi. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 83 B2 B1 Balb/c ST2-/- * 40 20 0 10 % de Linfócitos T CD4+ produzindo IL-4 % de Linfócitos CD4+ 60 Balb/c ST2-/- 8 6 4 2 0 0 4 Dias após infecção + 0 4 Dias após infecção -/- Figura 19 - Perfil de linfócitos CD4 isolados de pulmão de camundongos Balb/c e ST2 não infectados e infectados aos 4 dias após infecção por S. venezuelensis. Células estimuladas com antígeno de L3 de S. venezuelensis in vitro. Figura representativa de + + + linfócitos CD4 produtores de IL-4 (FL2 ) (A). Porcentagem de linfócitos CD4 (B1) e + + -/linfócitos CD4 IL-4 (B2) de animais Balb/c e ST2 não infectados e aos 4dpi. *(p<0,05) -/diferença significativa entre animais Balb/c e ST2 no mesmo período de infecção. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 84 B2 Balb/c ST2-/- 5 4 3 2 1 0 40 % de Linfócitos T CD4 + CD25+ Foxp3+ % de Linfócitos CD4 + CD25+ B1 30 10 4 0 4 Dias após infecção Dias após infecção + ## 20 0 0 Balb/c ST2-/- ** + + Figura 20 - Perfil de linfócitos CD4 CD25 FoxP3 isolados de pulmão de camundongos -/Balb/c e ST2 não infectados e infectados aos 4 dias após infecção por S. venezuelensis. Células estimuladas com antígeno de L3 de S. venezuelensis in vitro. + + + + + + Figura representativa de linfócitos CD4 (FL1 ) CD25 (FL3 ) FoxP3 (FL2 ) (A). + + + + + Porcentagem de linfócitos CD4 CD25 (B1) e linfócitos CD4 CD25 FoxP3 (B2) de -/animais Balb/c e ST2 não infectados e aos 4dpi. **(p<0,01) diferença significativa entre -/animais Balb/c e ST2 no mesmo período de infecção. ##(p<0,01) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 85 5.3 - Avaliação da função pulmonar de animais ST2-/- e Balb/c A infecção por S. venezuelensis em camundongos Balb/c resultou em aumento significativo da variação da pressão intra-traqueal em resposta a doses crescentes de metacolina entre 4 e 7 dias de infecção (Fig 21), confirmando dados anteriores. Aumento significativo da variação da pressão intra-traqueal em resposta a doses crescentes de metacolina também foi detectado em camundongos aos ST2-/- aos 4 dias de infecção. O interessante a ser observado é que não houve diferença significativa da variação na pressão intra-traqueal em resposta a inoculação de metacolina entre animais ST2-/- e seus controles Balb/c, mostrando que mesmo na ausência deste receptor, os animais são capazes de desenvolver hiperreatividade brônquica. Entretanto, aos 7dpi os animais Balb/c permanecem hiperreativos enquanto animais ST2-/- não mais apresentam esta alteração, o que mostra que a ausência do receptor impede que os animais consigam manter a hiperreatividade brônquica por mais tempo. 86 60 % de aumento da pressão intra-traqueal % de aumento da pressão intra-traqueal 80 Balb/c não infectado ST2-/- não infectado Balb/c 2dpi ST2-/- 2dpi 40 20 0 0.1 0.3 1 3.2 10 31.6 100 100 80 Balb/c não infectado ST2-/- não infectado 60 Balb/c 4dpi ST2-/- 4dpi 40 20 0 0.1 % de aumento da pressão intra-traqueal 80 Balb/c não infectado ST2-/- não infectado 60 Balb/c 7dpi ST2-/- 7dpi # 40 20 0 0.1 0.3 1 3.2 10 31.6 Doses de Metacolina ( g) 0.3 1 3.2 10 31.6 100 Doses de Metacolina ( g) 100 % aumento na pressão intra-traqueal Dose de 30µg de metacolina Doses de Metacolina ( g) 100 # ## 100 80 # ## Balb/c # ST2-/- 60 40 20 0 0 2 4 7 Dias após infecção Figura 21 - Porcentagem de aumento da pressão intra-traqueal provocada pela administração intravenosa de doses crescentes em animais não infectados e aos 2, 4 e -/7dpi e da dose de 30µg de metacolina/camundongo em camundongos Balb/c e ST2 infectados com 700L3 de S. venezuelensis. # (p<0.05) e ## (p<0,01) diferença significativa entre animais infectados e não infectados da mesma linhagem em resposta à dose de 30µg/camundongo de metacolina. Teste estatístico: t-student. N= 8 animais por grupo. 87 5.4 - Avaliação das alterações histopatológicas intestinais e infiltração/ativação celular de animais ST2-/- e Balb/c A chegada do parasito ao intestino delgado do hospedeiro se dá a partir de 3-4dpi, sendo o pico de parasitemia observado aos 7dpi e o período de eliminação aos 10dpi, como observado na contagem dos vermes (Fig 4). Entretanto, as alterações no órgão decorrentes da infecção e da resposta imune induzida são mais intensas no período de eliminação dos vermes. As principais alterações histopatológicas induzidas pela infecção por S. venezuelensis na mucosa do intestino delgado dos camundongos infectados estão ilustradas na figura 22. Na figura 22a e 22b pode-se observar o aspecto das vilosidades do intestino delgado de camundongos não infectados Balb/c e ST2-/-, respectivamente. Aos 10 dias após infecção observa-se deformação e achatamento das vilosidades intestinais, acompanhada de intenso infiltrado inflamatório no tecido da base das vilosidades e na lâmina própria tanto em animais Balb/c (Fig 22c), quanto em animais ST2-/- (Fig 22d). Como este é um período em que o parasito ainda está sendo eliminado, é possível verificar a presença de vermes no tecido (Fig 22c). Pela coloração de PAS é possível verificar grande proliferação de células caliciformes e produção de muco, não sendo observadas grandes diferenças entre animais Balb/c (Fig 22e) e ST2-/- (Fig 22f) neste período de infecção. 88 Figura 22 – Fotomicrografias do intestino corados por HE (a,b,c,d) e PAS (e,f) de -/-/camundongos Balb/c (a) e ST2 (b) não infectados; camundongos Balb/c (c-e) e ST2 (df) infectados aos 10dpi. As barras de escalas nas fotografias a, b, c, d correspondem a 50 µm do tecido. As barras de escalas nas fotografias e,f correspondem a 100µm do tecido. Os asteriscos marrons sinalizam a presença de vermes no tecido. 89 5.5 - Avaliação imunológica no intestino de animais ST2-/- e Balb/c 5.5.1 - Avaliação do infiltrado celular intestinal Para avaliação do infiltrado celular intestinal em resposta à infecção por S. venezuelensis foi realizada a quantificação da atividade de EPO como medida indireta do recrutamento/ativação de eosinófilos e de MPO como medida indireta de neutrófilos no homogenato de tecido intestinal. De acordo com a figura 23A podemos observar aumento estatisticamente significativo da atividade de EPO no intestino de animais Balb/c e ST2-/- aos 2dpi. Estes níveis apresentam queda nos dias subsequentes, mas a partir dos 10dpi tendem a se elevar em animais Balb/c alcançando níveis estatisticamente superiores em relação aos controles não infectados aos 14dpi. Em animais ST2-/- não se observa elevação dos níveis de EPO aos 10dpi, sendo estes níveis estatisticamente inferiores em relação aos Balb/c neste período. De acordo com a figura 23B, observamos um aumento estatisticamente significativo dos níveis de MPO no intestino de animais Balb/c e ST2-/- aos 2dpi em relação aos não infectados. Os níveis de MPO são reduzidos aos 4 e 7dpi e voltam a apresentar uma elevação significativa no intestino dos animais Balb/c e ST2 -/- a partir dos 10dpi. Ainda assim, animais ST2-/- apresentam níveis inferiores se comparados aos níveis de Balb/c, sendo esta diferença estatisticamente significativa aos 14dpi. 90 A 1.0 Balb/c ## EPO [Abs 492nm] 0.8 ST2-/## # * 0.6 0.4 0.2 0.0 0 2 4 7 10 Dias após infecção 14 B 0.5 * # # MPO [Abs 450nm] 0.4 ## Balb/c ST2-/- # 0.3 ## # 0.2 0.1 0.0 0 2 4 7 10 Dias após infecção 14 Figura 23 – Atividade de peroxidase de eosinófilos (EPO) (A) e de mieloperoxidase de -/neutrófilos (MPO) (B) no homogenato intestinal de camundongos Balb/c e ST2 não infectados e aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção com 700L3 de S. venezuelensis. #(p<0,05), ##(p<0,01) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. *(p<0,05) diferença significativa entre animais Balb/c e -/ST2 no mesmo período de infecção. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 91 A estimativa de infiltração/ativação de mastócitos na mucosa do intestino delgado dos animais de ambos os grupos experimentais foi realizada através de análise histopatológica do tecido corado por Alcian Blue (pH 0.3). Conforme observado na figura 24, na mucosa do intestino delgado de animais não infectados praticamente não se observa mastócitos corados, apenas um pouco do muco absorve a colaração azulada (Fig 24a e 24b). Aos 10 dias da infecção por S. venezuelensis é possível verificar um grande número de mastócitos na mucosa intestinal dos camundongos Balb/c, caracterizadas pela coloração dos grânulos em azul. Nestes animais também foi possível verificar que o muco de algumas células caliciformes também foram coradas (Fig 24c e 24e). Em contraste, a presença de mastócitos na mucosa intestinal de camundongos ST2-/- infectados foi bastante reduzida (Fig 24d e 24f). Para quantificar esta diferença, foi realizada a contagem dos mastócitos por vilosidade intestinal sendo demonstrado que camundongos, de ambas as linhagens, infectados aos 10dpi apresentam aumento no número destas células em relação aos animais não infectados. O interessante a se observar, no entanto, é que o aumento de mastócitos na mucosa intestinal de animais ST2-/- é significativamente menor do que aquele observado em animais Balb/c. (Fig 25) 92 Figura 24 – Fotomicrografias de mastócitos do intestino corados por Alcian-Blue de -/-/camundongos Balb/c (a) e ST2 (b) não infectados; camundongos Balb/c (c-e) e ST2 (df) infectados aos 10dpi. As barras de escalas nas fotografias a, b c, d correspondem a 50µm do tecido. As barras de escala nas fotografias e, f correspondem a 25µm do tecido. Os asteriscos marrons sinalizam a presença de vermes no tecido. 93 Mastócitos/vilosidade intestinal *** 6 Balb/c ### ST2-/4 2 ### 0 0 10 Dias após infecção Figura 25 – Número de mastócitos presentes por vilosidade intestinal de camundongos -/Balb/c e ST2 não infectados e aos 10 dias após infecção com 700L3 de S. venezuelensis. ###(p<0,001) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. ***(p<0,001) diferença significativa entre animais -/Balb/c e ST2 no mesmo período de infecção. Teste estatístico: t-student. N= 4 animais por grupo. 94 5.5.2 – Quantificação de citocinas do intestino Os níveis das citocinas IL-4; IL-10; IL-13; IL-17; TNF-α e TGF-β no homogenato intestinal de camundongos Balb/c e ST2-/- foram quantificados em animais não infectados e animais infectados aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção por S. venezuelensis. Conforme demonstrado na figura 26, a infecção por S. venezuelensis induz aumento das citocinas do perfil Th2 (IL-4 e IL-13), citocina regulatória IL-10 e citocinas pró-inflamatórias (IL-17 e TNF-α) em animais Balb/c entre 7 e 10dpi, sendo que o mesmo não é observado em animais ST2-/-. Aos 7 dias de infecção, a concentração de citocinas em camundongos ST2-/- foi estatiscamente inferior em relação aos camundongos Balb/c. 95 IL-4 2500 pg/100mg 2000 pg/100mg IL-10 1500 Balb/c ST2-/- 1500 1000 *** Balb/c ST2-/- 1000 500 500 0 0 2 4 7 10 Dias após infecção 0 14 0 2 4 7 10 Dias após infecção IL-13 8000 IL-17 400 Balb/c ST2-/- *** Balb/c ST2-/- 300 pg/100mg pg/100mg 6000 4000 2000 0 200 100 0 2 4 7 10 Dias após infecção 0 14 0 2 4 7 10 Dias após infecção TNF- 800 Balb/c ST2-/- 200 pg/100mg pg/100mg Balb/c ST2-/- ** 400 200 ** 150 100 50 0 2 14 TGF- 250 600 0 14 4 7 10 Dias após infecção 14 0 ### 0 2 4 7 10 Dias após infecção 14 Figura 26 – Concentração de interleucinas IL-4, IL-10, IL-13, IL-17, TNF-α e TGF-β no -/homogenato intestinal de camundongos Balb/c e ST2 não infectados e infectados com 700L3 de S. venezuelensis, aos 2, 4, 7, 10 e 14 dias após infecção. **(p<0,01), ***(p<0,001) -/diferença significativa entre animais Balb/c e ST2 no mesmo período da infecção. Teste estatístico: t-student. N= 6 animais por grupo. 96 ANIMAIS SH E SHC 5.6 - Avaliação parasitológica da infecção de animais SH e SHC Em todos os camundongos SHC e SH infectados com 700 L3 de S. venezuelensis foram recuperadas larvas nos pulmões aos 2 dias de infecção (Fig 27). Em camundongos SHC foi recuperado valor de mediana de 55 larvas no pulmão, enquanto em camundongos SH (mutantes que não diferenciam mastócitos) foi recuperado valor de mediana de 170 larvas no pulmão. Embora tenha sido observado número maior na média de larvas recuperadas de pulmão de camundongos mutantes para mastócitos em relação aos seus controles selvagens, esta diferença não foi estatisticamente significativa. Nº larvas no pulmão 250 SHC SH 200 150 100 50 0 2dpi Figura 27 - Número de larvas no pulmão de camundongos SHC e SH aos 2 dias após a infecção com 700L3 de S. venezuelensis. Teste estatístico: Mann-Whitney. N=5 animais por grupo. 97 Em todos os camundongos SHC e SH infectados com 700 L3 de S. venezuelensis foi detectada presença de vermes no intestino aos 4, 7 e 12 dias da infecção (Fig 28). No 40 e 70 dia da infecção não foi detectada diferença estatística no número de vermes entre animais SHC e SH, sugerindo que a ausência de mastócitos não afeta a migração e o estabelecimento dos vermes no intestino. No 4º dpi foi quantificada uma mediana de 119 vermes no intestino de animais SHC e 135 vermes no intestino de animais SH. No 7º dpi foi quantificada uma mediana de 231 vermes no intestino de animais SHC e de 207 vermes no intestino de animais SH. Entretanto, em animais mutantes para mastócitos (SH), o número de vermes recuperados do intestino delgado aos 12dpi foi estatisticamente maior que nos animais selvagens, sendo quantificada uma mediana de 274 vermes no intestino em camundongos SH e 49 vermes nos camundongos SHC. Aos 21dpi não foram detectados mais vermes no intestino de camundongos selvagens (SHC), ao passo que camundongos mutantes (SH) apresentaram-se ainda infectados, com uma mediana de 41 vermes, mostrando que na ausência de mastócitos os camundongos não são capazes de eliminar a infecção experimental por S. venezuelensis Nº de vermes no intestino no período normal. 400 SHC SH * 300 200 100 0 ND 4 7 12 21 Dias após infecção Figura 28 - Número de vermes no intestino de camundongos SHC e SH aos 4,7,12 e 21 dias após a infecção com 700L3 de S. venezuelensis. * (p<0.05) diferença significativa entre animais SHC e SH no mesmo período da infecção. Teste estatístico: Mann-Whitney. ND = vermes não detectados no intestino. N=5 animais por grupo. 98 Em todos os camundongos SHC e SH infectados com 700 L3 de S. venezuelensis foi detectada presença de ovos nas fezes entre 7 e 12 dias da infecção (Fig 29A). No 70 dia da infecção foi quantificada uma mediana de 35.560 (amplitude de 7.000 a 142.100) ovos/g de fezes recolhidas em camundongos SHC e 184.140 (amplitude de 37.800 a 271.710) ovos/g de fezes recolhidas em camundongos SH, sendo este número estatisticamente maior que o número de ovos encontrados nas fezes dos animais selvagens. Aos 12 dias de infecção foi encontrada uma mediana de 19.289 (amplitude de 7.442 a 75.714) ovos/ g de fezes de aimais SHC, enquanto em animais mutantes observou-se uma ligeira redução no número de ovos, sendo nestes quantificada uma mediana de 126.944 (amplitude de 40.212 a 220.000) ovos/g de fezes. Ainda assim, o número de ovos/g de fezes de animais SH foi estatisticamente superior em relação ao de animais selvagens. Aos 21 dias de infecção não foram encontrados ovos nas fezes de animais SHC selvagens, ao passo que em camundongos SH ainda foi detectada uma mediana de 27.288 (amplitude de 976 a 55.495) ovos/g de fezes. Conforme demonstrado na figura 29B, verificou-se uma tendência de maior fecundidade dos vermes recuperados de camundongos SH em relação aos vermes recuperados de camundongos SHC aos 7dpi, embora esta diferença não tenha sido considerada estatisticamente significativa. 99 A 250000 SHC SH * Ovos/g fezes 200000 * 150000 100000 50000 ND 0 7 12 21 Dias após infecção B Fecundidade dos vermes OPG/nº de vermes 1500 SHC SH 1000 500 0 7dpi Figura 29 – Número de ovos por grama de fezes (OPG) de camundongos SHC e SH aos 7,12 e 21 dias após a infecção com 700L3 de Strongyloides venezuelensis (A). Fecundidade (OPG/ nº de vermes) das fêmeas de S. venezuelensis presentes em camundongos SHC e SH aos 7dpi (B). *(p<0.05) diferença significativa entre camundongos SHC e SH no mesmo período da infecção. Teste estatístico: MannWhitney. ND = ovos não detectados nas fezes. N=5 animais por grupo. 100 5.7 - Avaliação imunológica de animais SH e SHC 5.7.1 - Avaliação do infiltrado celular pulmonar Para avaliação do infiltrado celular pulmonar em resposta à passagem das larvas do parasito foi realizada contagem de células recuperadas através de lavado broncoalveolar (LBA) e da quantificação de níveis de EPO como medida indireta da presença de eosinófilos e de MPO como medida indireta da presença de neutrófilos no homogenato de tecido pulmonar. Vale salientar que os animais utilizados nesta parte de avaliação da participação de mastócitos na infecção e resposta imune, bem como alterações por ela induzida, pertencem à linhagem C57BL/6 e, portanto, apresentam uma resposta inflamatória diferente daquela observada em animais da linhagem Balb/c, conforme já descrito na literatura (Gueders et al. 2009) e observado anteriormente em trabalhos do nosso grupo (dados não publicados). Conforme demonstrado na figura 30A, observa-se um ligeiro aumento no número de leucócitos recuperados do lavado bronco-alveolar de camundongos SHC e SH aos 2dpi em comparação aos animais não infectados, embora este aumento não seja estatisticamente significativo. Aos 4 dias observa-se queda no número de leucócitos recuperados, não havendo diferença em relação aos animais não infectados. A infiltração de células no lavado broncoalveolar dos animais mutantes para mastócitos foi semelhante ao obervado nos animais selvagens, não sendo verificada diferença estatística no número de células recuperadas entre animais SHC e SH em nenhum ponto da infecção. A grande maioria dos leucócitos recuperados do lavado broncoalveolar dos camundongos aos 2dpi (Fig 30B) e 4dpi (Fig 30C) correspondeu a células mononucleares (monócitos e linfócitos), não havendo diferença significativa no número destas células entre animais SHC e SH. Os eosinófilos e neutrófilos encontrados no lavado broncoalveolar representaram uma pequena parcela do número total de células recolhidas. Apesar disto, foi possível detectar número estatisticamente maior de neutrófilos recuperados de animais SH em relação aos animais SHC aos 2dpi (Fig 30B). 101 A figura 31 ilustra esta composição celular presente no lavado broncoalveolar aos 2dpi (Fig 31a e 31b) e 4dpi (Fig 31c e 31d) em animais SHC e SH. 102 Nº de leucócitos totais X 10 4/mL A 80 SHC SH 60 40 20 0 0 2 4 Dias após infecção Nº de eosinófilos, neutrófilos e mononucleares X 10 4/mL B 60 SHC SH 40 20 * 0 Eosinófilos Nº de eosinófilos, neutrófilos e mononucleares X 10 4/mL C Neutrófilos Mononucleares 2dpi 30 SHC SH 20 10 0 Eosinófilos Neutrófilos Mononucleares 4dpi Figura 30 - Avaliação do número de leucócitos totais (A) recuperados no lavado broncoalveolar (LBA) de camundongos SHC e SH não infectados e aos 2 e 4 dias após infecção com 700L3 de S. venezuelensis e de eosinófilos, neutrófilos e mononucleares recuperados do LBA aos 2dpi (B) e 4dpi (C). *(p<0.05) diferença significativa entre camundongos SHC e SH no mesmo período da infecção. Teste estatístico: MannWhitney. N= 5 animais por grupo. 103 Figura 31 – Foto de células do lavado broncoalveolar de camundongos SHC infectados aos 2dpi (a) e 4dpi (c) e SH infectados aos 2dpi (b) e 4dpi (d). Os asteriscos vermelhos sinalizam neutrófilos presentes no lavado. As células não sinalizadas correspondem a mononucleares. Foto panorâmica no aumento de 40X e de neutrófilos isolados no aumento de 100X. 104 A quantificação da atividade de peroxidase de eosinófilos (EPO) no homogenato pulmonar dos camundongos SHC e SH no decorrer da infecção por S. venezuelensis demonstrou que não ocorre aumento significativo da atividade de EPO durante a passagem das larvas pelo pulmão dos animais de ambos os grupos experimentais. Também foi possível verificar um aumento estatisticamente significativo dos níveis de EPO nos pulmões de animais infectados somente após 12 dpi (Fig 32A). É importante salientar que a atividade de Peroxidase de Eosinófilo quantificada no parênquima pulmonar dos animais não foi estatisticamente diferente entre os camundongos SHC e SH em nenhum período examinado, sugerindo que mastócitos não participam da ativação de eosinófilos. Semelhante ao observado nos níveis de EPO, foi verificado que a atividade de MPO no pulmão dos animais infectados apresenta aumento estatisticamente significativo somente após 21 dpi, tanto em animais SHC e SH (Fig 32B). Em todos os outros pontos da infecção os níveis de MPO do pulmão permaneceram baixos, semelhantes aos controles não infectados, apresentando tendência de elevação somente aos 12dpi. Diferença nos níveis de MPO pulmonar entre animais SHC e SH foi observada aos 4dpi, sendo que animais SH apresentaram níveis mais elevados em relação aos SHC, embora não tenha sido verificado aumento significativo neste período em relação aos animais não infectados. 105 A 2.0 EPO [Abs 492nm] ## 1.5 SHC SH ### 1.0 ### 0.5 0.0 0 4 7 12 21 Dias após infecção B 6 ## MPO [Abs 450nm] ## SHC SH 4 2 * 0 0 4 7 12 21 Dias após infecção Figura 32 – Atividade de peroxidase de eosinófilos (EPO) (A) e de mieloperoxidase de neutrófilos (MPO) (B) no homogenato pulmonar de camundongos SHC e SH não infectados e aos 4, 7, 12 e 21 dias após infecção com 700L3 de S. venezuelensis. ###(p<0,001) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. *(p<0,05) diferença significativa entre animais SHC e SH no mesmo período da infecção. Teste estatístico: Mann-Whitney. N= 5 animais por grupo. 106 5.7.2 - Quantificação de citocinas do pulmão Os níveis das citocinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, TNF-α e IFN-γ no homogenato pulmonar de camundongos SHC e SH foram quantificados em animais não infectados e animais infectados aos 4, 7, 12 e 21 dias após infecção por S. venezuelensis. Conforme demonstrado na figura 33, podemos observar que os níveis das citocinas IL-4, IL-5, IL10, IL-13, IL-17 e TNF-α de ambos os grupos selvagens e mutantes não apresentaram elevação estatística ao longo da infecção, quando comparados aos níveis dos animais não infectados. Interessantemente, foi verificada uma concentração estatisticamente menor de IL-4 pulmonar nos camundongos SH em comparação aos SHC, tanto em camundongos não infectados como após 4 dias de infecção. Aos 21 dias de infecção foi verificada redução da concentração de IL-13, IL-5, IL-10 e IL-17, especialmente em animais selvagens. A citocina de perfil Th1, INF-γ, apresenta elevação aos 4dpi em animais mutantes, enquanto em animais selvagens os níveis permanecem normais. Entretanto, em ambos os grupos os níveis caem aos 7dpi e voltam a níveis semelhantes aos de controles não infectados a partir do 12dpi. 107 IL-4 IL-5 SHC SH 1500 SHC SH 500 ** * pg/100mg pg/100mg 400 1000 ## # # 500 300 * 200 # 100 0 0 0 4 7 12 21 0 4 Dias após infecção IL-10 21 SHC SH 1000 800 pg/100mg 1500 pg/100mg 12 IL-13 SHC SH 2000 7 Dias após infecção 1000 600 400 ## ## 500 # 200 0 0 4 7 12 0 21 0 4 Dias após infecção IL-17 12 21 TNF- SHC SH 3000 7 Dias após infecção SHC SH 800 * pg/100mg pg/100mg 600 2000 # 1000 400 200 0 0 4 7 12 0 21 0 4 Dias após infecção 7 12 21 Dias após infecção IFN- SHC SH 400 pg/100mg 300 ## 200 100 # 0 0 4 7 12 21 Dias após infecção Figura 33 – Concentração de interleucinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, TNF-α e IFN-γ no homogenato pulmonar de camundongos SHC e SH não infectados e infectados com 700L3 de S. venezuelensis, aos 4, 7, 12 e 21 dias após infecção. *(p<0,05), **(p<0,01) diferença significativa entre animais SHC e SH no mesmo período da infecção. #(p<0,05), ##(p<0,01) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. Teste estatístico: Mann-Whitney. N= 5 animais por grupo. 108 5.8 - Avaliação da função pulmonar de animais SH e SHC Como verificado anteriormente, a infecção por S. venezuelensis não induz uma significante variação da pressão intra-traqueal em resposta a inoculação de doses crescentes de metacolina em camundongos com ‘background’ genético de C57BL/6 e este resultado foi confirmado nos animais selvagens (SHC), indicando ausência de hiperreatividade brônquica nestes camundongos. Resultado semelhante foi obtido nos camundongos SH (mutantes para mastócitos), que também não apresentaram alteração na resposta pulmonar a inoculação de metacolina no decorrer da infecção (Fig 34). Entretanto, é importante salientar que a resposta à inoculação de metacolina foi sempre mais intensa nos camundongos mutantes para mastócitos, sendo que a variação na pressão intra-traqueal foi estatisticamente maior em camundongos SH em relação aos SHC após 4 dias da infecção, sugerindo que mastócitos possa ter um possível efeito modulador nesta alteração. 109 B 50 % de aumento da pressão intra-traqueal % de aumento da pressão intra-traqueal A SHC 0dpi SH 0dpi 40 30 SHC 2dpi SH 2dpi * 20 10 0 0.1 0.3 1 3.2 10 31.6 100 50 40 SHC 0dpi SH 0dpi 30 SHC 4dpi SH 4dpi 20 10 0 0.1 0.3 Doses de Metacolina ( g) % de aumento da pressão intra-traqueal Dose de 30g de Metacolina ** 1 3.2 10 31.6 100 Doses de Metacolina ( g) C 50 ** 40 SHC SH * 30 20 10 0 0 2 4 Dias após infecção Figura 34 - Porcentagem de aumento da pressão intra-traqueal provocada pela administração intravenosa de doses crescentes aos 0, 2 (A) e 4dpi (B) e da dose de 30µg de metacolina/camundongo (C) em camundongos SHC e SH infectados com 700L3 de S. venezuelensis. * (p<0,05), ** (p<0.01) diferença significativa entre animais SHC e SH no mesmo período da infecção em resposta à dose de 30µg/camundongo de metacolina. Teste estatístico: Mann-Whitney. N= 5 animais por grupo. 110 5.9 - Avaliação imunológica no intestino de animais SH e SHC 5.9.1 - Avaliação do infiltrado celular intestinal Para avaliação do infiltrado celular intestinal em resposta à infecção por S. venezuelensis foi realizada a quantificação de níveis de EPO como medida indireta da presença de eosinófilos e de MPO como medida indireta da presença de neutrófilos no homogenato de tecido intestinal. De acordo com a figura 35A podemos observar aumento estatisticamente significativo dos níveis de EPO no intestino de animais SHC e SH somente aos 21dpi quando comparados aos controles não infectados, período em que animais selvagens já se encontram livres da infecção e animais mutantes embora ainda estejam infectados apresentam carga parasitária já bem reduzida. Em todos os outros pontos da infecção os níveis de EPO do intestino permaneceram baixos em ambos os grupos semelhantes aos controles não infectados. Apesar disso, verificamos níveis de EPO estatisticamente maiores em animais selvagens aos 4dpi em relação aos animais mutantes, sendo que aos 7dpi esta diferença se inverte, tendo animais SH níveis estatisticamente maiores em relação aos SHC neste período. Padrão semelhante de resposta à infecção foi verificado para a atividade de mieloperoxidase no homogenato intestinal dos animais, sendo verificado aumento estatístico nos níveis somente aos 21dpi em ambos os grupos (Fig 35B) 111 A 1.0 # EPO [Abs 492nm] 0.8 ## 0.6 SHC SH # * 0.4 ** 0.2 0.0 0 4 7 12 21 Dias após infecção B MPO [Abs 450nm] 2.0 # 1.5 SHC SH # 1.0 0.5 0.0 0 4 7 12 21 Dias após infecção Figura 35 – Níveis de peroxidase de eosinófilos (EPO) (A) e mieloperoxidase de neutrófilos (MPO) (B)no homogenato intestinal de camundongos SHC e SH não infectados e aos 4, 7, 12 e 21 dias após infecção com 700L3 de S. venezuelensis. ##(p<0,01) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. Teste estatístico: Mann-Whitney. N= 5 animais por grupo. 112 5.9.2 – Quantificação de citocinas do intestino Os níveis das citocinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17 e TNF-α no homogenato intestinal de camundongos SHC e SH foram quantificados em animais não infectados e animais infectados aos 4, 7, 12 e 21 dias após infecção por S. venezuelensis. Conforme demonstrado na figura 36, podemos observar que os níveis das citocinas IL-4 e IL-13, que caracterizam a resposta do tipo 2, apresentaram elevação estatística em relação aos animais selvagens não infectados a partir dos 12 dpi, enquanto em animais mutantes esta elevação só foi ocorrer aos 21 dpi. A mesma tendência de elevação foi observada nos níveis de IL-5 de animais selvagens, embora não tenha sido estatística. É importante salientar que a concentração de IL-10 no homogenato intestinal de camundongos mutantes que não diferenciam mastócitos (SH) foi inferior ao detectado nos animais selvagens em praticamente todos os pontos da infecção, com exceção do 4º dpi. A concentração da citocina pró-inflamatória IL-17 também apresenta aumento estatístico aos 12dpi em animais selvagens enquanto em animais SH os níveis permanecem baixos semelhantes aos de animais não infectados ao longo de toda infecção. Os níveis de TNF-α não apresentam elevações significativas em relação aos não infectados em nenhum dos dois grupos. A concentração de INF-γ no homogenato intestinal não alterou significativamente durante a infecção por S. venezuelensis, mas foram sempre menores nos animais SH. 113 IL-4 IL-5 250 ## SHC SH SHC SH 200 2000 pg/100mg pg/100mg 3000 ## ## 1000 150 100 50 0 0 4 7 12 0 21 0 4 Dias após infecção IL-10 SHC SH * ** *# ## # 4 7 # * ## # 300 200 12 0 21 0 Dias após infecção 4 7 12 21 Dias após infecção IL-17 1500 21 100 0 0 SHC SH 400 1000 500 12 IL-13 500 pg/100mg pg/100mg 1500 7 Dias após infecção TNF- 3000 SHC SH SHC SH pg/100mg pg/100mg * 1000 500 0 0 4 7 12 2000 1000 0 21 0 Dias após infecção 4 7 12 21 Dias após infecção IFN- pg/100mg 150 SHC SH 100 50 0 0 4 7 12 21 Dias após infecção Figura 36 – Concentração de interleucinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, TNF-α e IFN-γ no homogenato intestinal de camundongos SHC e SH não infectados e infectados com 700L3 de S. venezuelensis, aos 4, 7, 12 e 21 dias após infecção. *(p<0,05), **(p<0,01) diferença significativa entre animais SHC e SH no mesmo período da infecção. #(p<0,05), ##(p<0,01) diferença significativa entre animais infectados e animais não infectados da mesma linhagem. Teste estatístico: Mann-Whitney. N= 5 animais por grupo. 114 6 - DISCUSSÃO Este estudo mostrou que a via IL-33/ST2 é importante para o controle precoce do nematódeo Strongyloides venezuelensis, visto que animais deficientes para o receptor ST2 apresentam carga parasitária maior aos 4dpi, período em o parasito está se instalando no intestino delgado do hospedeiro. Esta maior carga parasitária em relação aos seus controles selvagens pode ser um reflexo do número maior de larvas recuperadas no pulmão aos 2dpi, sugerindo a importância de mecanismos imunes inato no controle da infecção durante o período de migração sistêmica e instalação das larvas no intestino. Associado ao aumento do número de larvas recuperado no início da infecção em camundongos ST2-/-, estes animais também apresentaram alterações no processo inflamatório pulmonar, sendo observada menor concentração de citocinas/quimiocinas de perfil Th2 e pró-inflamatório no homogenato pulmonar e redução da infiltração/ativação de eosinófilos e neutrófilos durante a infecção pelo nematódeo. A participação da via de ativação IL-33/ST2 no processo inflamatório pulmonar frente à infecção por S. venezuelensis também foi demonstrada por Yasuda e colaboradores (2012). Utilizando-se camundongos deficientes na produção de IL-33, os autores verificaram redução na produção de IL-5 e IL-13, e consequentemente menor infiltração eosinofílica no pulmão. Neste estudo, Yasuda e colaboradores (2012) não avaliaram o efeito da ausência de IL-33 na carga parasitária. A participação de IL-33 no desenvolvimento da inflamação pulmonar tem sido mais bem caracterizada no contexto da asma. Ikutani e colaboradores (2012) mostraram que a administração intranasal de IL-33 e IL-25 induziram um fenótipo asmático e acúmulo de linfócitos inatos do tipo 2 (ILC2) nos pulmões e lavado broncoalveolar dos animais experimentais. Kondo e colaboradores (2008) também demonstraram que a administração intranasal de IL-33 induziu eosinofilia pulmonar severa e hiperplasia de células caliciformes nos pulmões dos animais experimentais. A produção de IL-33 também tem um profundo efeito em macrófagos alveolares, induzindo um fenótipo alternativamente ativado que produz quimiocinas importantes durante inflamações alérgicas (KurowskaStolarska et al. 2009). No presente estudo, a análise do infiltrado inflamatório pulmonar revelou diferenças no numero de eosinófilos do lavado broncoalveolar e a atividade de peroxidase de eosinófilo no homogenato pulmonar dos animais deficientes infectados, que foi estatisticamente 115 menor que os animais selvagens aos 4dpi. Estudos realizados em modelos de imunização por OVA demonstraram que fibroblastos pulmonares estimulados por IL-33 in vitro produzem CCL11 (Kurokawa et al. 2011). A quantificação de CCL11 no homogenato pulmonar dos animais ST2-/- e selvagens durante a infecção por S. venezuelensis demonstrou que os níveis desta quimiocina não aumentou em relação aos não infectados até 7 dpi, sendo menor nos animais ST2-/- após 10 dias. Desta maneira, a produção reduzida de CCL11 nos animais deficientes pode estar associada a menor atividade de EPO pulmonar no final da infecção pelo nematódeo. Entretanto, a produção de CCL11 não justifica a diferença na infiltração de eosinófilos detectada precocemente durante a migração das larvas de S. venezuelensis pelo pulmão dos camundongos. Os dados apresentados por Yasuda e colaboradores (2012) demonstram que a eosinofilia pulmonar reduzida observada em camundongos IL-33-/- infectados por S. venezuelensis foi associado à menor ativação de linfócitos inatos e liberação de IL-5 e IL-13 por estas células logo no início da infecção. Resultados semelhantes foram observados por Monticelli e colaboradores (2011), sendo que a depleção de ILCs2 resultou em redução de IL-5 e isto também foi associado a menor eosinofilia detectada no lavado broncoalveolar de camundongos infectados pelo vírus Influenza. Em eosinófilos, bem como em mastócitos e basófilos, IL-33 acentua a adesão por promover expressão de CD11b e sobrevivência destas células no sitio inflamatório durante reações alérgicas (revisto por Oboki et al. 2011). Nossos dados também mostram níveis reduzidos de IL-5 e IL-13 no homogenato pulmonar dos camundongos ST2-/- infectados e isto pode estar associada a menor infiltração de eosinófilos detectada no início da infecção. Além de eosinófilos, os camundongos ST2-/- infectados por S. venezuelensis apresentaram redução da atividade de MPO no pulmão que foi associado a menor concentração de CXCL1, sugerindo a participação desta quimiocina na infiltração de neutrófilos no pulmão dos camundongos infectados por S. venezuelensis. Hueber e colaboradores (2011) observaram que a inoculação de IL-33 na cavidade intraperitoneal de camundongos resultou em recrutamento de neutrófilos, sendo este efeito mediado, em parte, pela aumentada produção de CXCL1 no lavado da cavidade. De maneira semelhante, Alves-Filho et al. (2010) também demonstraram associação entre a produção de IL-33 e o recrutamento de neutrófilos para cavidade intraperitoneal de camundongos em modelo de sepsis. As análises histológicas confirmaram a presença de eosinófilos no infiltrado inflamatório do parênquima pulmonar de camundongos Balb/c, enquanto em animais ST2-/- este 116 infiltrado consistiu basicamente de mononucleares. Entretanto, em camundongos ST2-/- a infecção por S. venezuelensis resultou em extensas áreas de hemorragia pulmonar, sendo visualizado grande extravasamento de hemácias em meio ao infiltrado inflamatório, o que não foi detectado em animais selvagens. Esta hemorragia mais exacerbada nos animais deficientes nos permite sugerir que a via de ativação IL-33/ST2 é importante para manutenção da integridade e reparo tecidual do pulmão, o que também já havia sido demonstrado em animais deficientes para IL-33 infectados por N. brasiliensis (Hung et al. 2013) e em camundongos que sofreram depleção de ILCs2 e foram infectados pelo vírus Influenza (Monticelli et al. 2011). No período examinado, 4 dias após a infecção, a histopatologia revelou uma discreta presença de células caliciformes no epitélio brônquico dos animais infectados, mas sem diferenças entre camundongos selvagens e deficientes, o que sugere que a ausência do receptor ST2 não afetou a indução de produção de muco no pulmão. A diferenciação de células caliciformes também foi observada no intestino delgado dos animais infectados Balb/c e ST2-/- após 10 dias da infecção por S. venezuelensis. Estes resultados contrastam com estudos que demonstram a associação da produção de IL-33 com hiperplasia de células caliciformes (Schmitz et al. 2005; Humphreys et al. 2008; Kondo et al. 2008; Pastorelli et al. 2013). A analise do perfil de leucócitos isolados a partir da digestão do parênquima pulmonar dos animais experimentais indicam que a porcentagem de granulócitos, avaliado a partir do padrão de tamanho e granulosidade, foi menor em animais ST2-/- infectados comparado aos Balb/c infectados, o que corrobora nossos resultados que mostram menor infiltração eosinofílica e neutrofílica no pulmão de animais deficientes. Entretanto, a porcentagem de granulócitos pulmonares que expressam F4/80-CD193+ foi semelhante nos animais ST2-/- e Balb/c. Estes dados contrariam nossa expectativa, já que eosinófilos é uma das células que expressam CD193 e nossos dados revelaram uma menor atividade enzimática de EPO e ausência de eosinófilos na histopatologia. Segundo Charo e Ransohoff (2006), eosinófilo, mastócitos, basófilos, linfócitos Th2 e plaquetas expressam CD193, que é o receptor de CCL11, CCL13, CCL7, CCL5, CCL8 (CCR3). Entretanto, trabalho recente (Tundup et al. 2014) mostra que uma parcela dos granulócitos, incluindo os eosinófilos, expressa também o marcador F4/80. Em nossas analises, entretanto, somente foram considerados granulócitos F4/80 negativos e CD193 positivos o que nos permite sugerir que esta pequena diferença na porcentagem de granulocitos totais entre animais selvagens e deficientes possa estar refletida justamente nestes granulócitos que não foram considerados em nossa analises. Desta forma, futuras análises da população de 117 granulócitos isolados do pulmão de camundongos ST2-/- infectados serão necessárias. Com relação aos macrófagos pulmonares, analisados por tamanho e granulosidade característicos e pela expressão de F4/80 e não expressão de CCR3, não detectamos diferenças significativas na porcentagem destas células ou na expressão de IL-4 por esta população de células entre animais selvagens e deficientes, embora tenha havido aumento devido à infecção em ambos os grupos. Condizente com isto, também não detectamos diferenças no número de macrófagos no lavado broncoalveolar de animais Balb/c e ST2-/aos 4 dias após a infecção por S. venezuelensis. Estes dados diferem de dados da literatura que mostram que animais deficientes para ST2 apresentam número menor de macrófagos no lavado broncoalveolar em relação aos selvagens na asma experimental induzida por imunizações com OVA (Besnard et al. 2011). Em nosso modelo experimental também não pudemos confirmar o papel do receptor ST2 na indução de macrófagos alternativamente ativados nas vias aéreas que foi verificado anteriormente por KurowskaStolarska et al. (2009) em camundongos que receberam inoculação nasal de IL-33. Entretanto, é importante salientar que nossas análises foram realizadas após 4 dias de infecção e os dados obtidos com imunização com OVA ou inoculação de IL-33 foram analisados mais tardiamente. Assim, acreditamos que o papel da ativação de IL-33/ST2 na diferenciação de macrófagos alternativamente ativados e na remodelação do pulmão durante a infecção por S. venezuelensis precisa ser mais bem explorado. Com relação às porcentagens de linfócitos totais, separados por tamanho e granulosidade, bem como linfócitos T (CD3+) ou linfócitos B (CD19+) não detectamos aumento decorrente da infecção e nem diferenças entre animais deficientes e selvagens. Entretanto, a porcentagem de linfócitos CD4+ foi menor em animais ST2-/- que em Balb/c, embora não tenham ocorrido alterações significativas decorrentes da infecção. Estes dados corroboram dados da literatura que mostram a participação da via IL-33/ST2 na indução de células Th2, seja por atuação direta (Xu et al. 1998; Kurowska-Stolarska et al. 2008) seja através de ILCs2 que estimulados pela via IL-33/ST2 produzem IL-13 e IL-5, que por fim desencadeiam a polarização da resposta para Th2 (Moro et al. 2010; Neil et al. 2010). A polarização da resposta Th2 é característica da resposta imune adquirida que ocorre em fase mais tardia da infecção, como mostram trabalhos anteriores (NegrãoCorrêa et al. 2006). No presente estudo também verificamos que, após 4 dias de infecção, linfócitos T CD4+ isolados do pulmão não apresentaram expressão aumentada de CD25, marca característica de ativação, e o aumento significativo de citocinas do perfil Th2 no homogenato pulmonar só foi detectado aos 7 dias da infecção. Entretanto, 118 nossos dados indicam que a ativação da via IL-33/ST2 pode participar da proliferação de linfócitos CD4+ pulmonares na fase inicial da infecção por S. venezuelensis e que estas células podem ser importante fonte de IL-4. Resultados semelhantes foram apresentados por Hung et al. (2013) que demonstraram a presença de linfócitos CD4+ produzindo IL-4 no pulmão de camundongos já a partir dos 3 dias da infecção por N. brasiliensis. Outro dado relevante a se considerar é a porcentagem significativamente maior de linfócitos regulatórios (linfócitos CD4+ CD25+ FoxP3+) no pulmão de animais ST2-/ não infectados em relação aos camundongos Balb/c não infectados, que reduzem durante a infecção pelo parasito. Contrariando nossos dados, vários trabalhos anteriores demonstraram o papel da via IL-33/ST2 na indução de células T regulatórias (Turnquist et al. 2011; Duan et al. 2012; Wasserman et al. 2012). Em um destes trabalhos foi visto que administração de IL-33 em camundongos levou a um aumento de linfócitos CD4+ FoxP3+ no baço dos animais (Turnquist et al. 2011). Em outro estudo, foi visto que a administração da IL-33 em camundongos com colite induzida experimentalmente levou a uma melhora nos sintomas da doença e isto foi associado ao aumento de células T regulatórias e dependente das mesmas já que a depleção destas células anulou este efeito da IL-33 (Duan et al. 2012). Conforme demonstrado anteriormente, a infecção por S. venezuelensis induz hiperreatividade brônquica e esta alteração funcional pulmonar ocorre precocemente e de forma transitória, sendo associada à inflamação pulmonar (Silveira et al. 2002; Ferreira et al. 2007). Kim e colaboradores (2013) observaram que hiper-reatividade brônquica induzida por antígenos glicolipídicos e o processo inflamatório das vias aéreas pode ser induzido por mecanismos imunes inatos, envolvendo IL-33, células NH (natural helper) e células NKT (natural killers T), sem a necessidade da participação da resposta Th2. No modelo de infecção por S. venezuelensis foi verificado que a ausência da ativação da via IL-33/ST2 modifica o processo inflamatório pulmonar; entretanto, a via IL-33/ST2 não foi fundamental para ocorrência de hiperreatividade brônquica induzida pelo parasito, visto que animais ST2-/- apresentaram esta alteração pulmonar aos 4dpi de maneira semelhante ao detectado nos camundongos Balb/c não deficientes no mesmo período. É importante salientar que as principais alterações pulmonares detectadas em camundongos ST2-/-, como menor produção de IL-13 e de infiltração eosinofílica e neutrofílica, não são determinantes na indução da resposta funcional no modelo de infecção por S. venezuelensis. Especificamente, Ferreira et al. (2010), demonstraram que a neutralização da produção de IL-13 durante a migração sistêmica de S. venezuelensis em ratos não 119 alterou a indução de hiperreatividade brônquica nestes animais. Mais recentemente, nossos dados demonstraram que animais deficientes na produção de IL-4 não apresentam variação de pressão intratraqueal no decorrer da infecção por S. venezuelensis, mas esta resposta funcional ocorre de maneira semelhante nos camundongos deficientes na diferenciação de eosinófilos (Araújo et al. manuscrito submetido para publicação). Apesar da ausência de ativação IL-33/ST2 não modificar a indução de hiperreatividade brônquica aos 4 dias da infecção por S. venezuelensis, é interessante observar que animais deficientes em ST2 não permaneceram hiperreativos aos 7dpi, ao contrário do que se observou em animais selvagens. Coincidente com isto estes animais também não apresentaram o aumento na produção de IL-4 que foi detectado nos camundongos Balb/c neste período da infecção. Estes resultados demonstram mais uma vez a importância da produção local de IL-4 na ocorrência de hiperreatividade brônquica induzida pela infecção, conforme anteriormente demonstrado em camundongos deficientes na produção desta citocina (Araújo et al. submetido para publicação). Além disto, nossos dados indicam que a produção local de IL-4 reponsável pela indução da hiper-reatividade brônquica é independente da ativação de IL-33/ST2, entretanto esta via de ativação é de fundamental importância na manutenção da alteração funcional pulmonar nos próximos dias. Dados da literatura demonstraram que a produção de IL-33 estimula a infiltração e acumulação de linfócitos ILC2 no pulmão (Yasuda et al. 2012), sendo que estas células podem ser fonte de IL-4 no inicio da infecção por nematódeos (Hung et al. 2013), podendo, portanto, ser responsáveis pela manutenção da resposta pulmonar por tempo mais prolongado. Após o estabelecimento de S. venezuelensis no intestino delgado dos camundongos, foi verificado aumento inicial do número de vermes e aumento de fecundidade nos camundongos ST2-/-, mas a infecção foi eliminada de maneira semelhante nos animais deficientes e não deficientes. Conforme discutido anteriormente, mecanismos da resposta inata mediados pela ativação da via IL-33/ST2, como ativação de eosinófilos e neutrófilos, que atuam nas larvas do parasito durante a migração sistêmica e estabelecimento no intestino são os possíveis responsáveis pelo aumento de carga parasitária no inicio da infecção por S. venezuelensis. Efeito da ativação da via IL-33/ST2 na fecundidade dos vermes também foram demonstrados no estudo de Yasuda e colaboradores (2014), que verificaram que as fêmeas de S. venezuelensis reduziram significativamente a eliminação de ovos nas fezes de camundongos não deficientes após 120 8dpi, enquanto animais IL-33-/- só foram capazes de reduzir a deposição de ovos do parasito após o tratamento com IL-33. Entretanto, Fernandes (2012) verificou que a administração de IL-33 exógena em camundongos infectados por S. venezuelensis não interferiu na fecundidade dos vermes. Os dados apresentados no presente estudo indicam que a ativação da via IL33/ST2 participa da indução da resposta Th2 e regulatória induzida pela infecção por S. venezuelensis no intestino de camundongos. Neste modelo experimental foi possível verificar uma redução significativa da concentração de citocinas IL-13, IL-10, TGF- β, e TNF-α aos 7 dias de infecção, sugerindo um grande consumo das mesmas, pois em alguns casos os níveis ficam abaixo dos detectados em camundongos não infectados. Posteriormente, foi detectado elevação da concentração destas citocinas se igualando aos níveis detectados em animais Balb/c. Esta redução na concentração de citocinas no pico da ativação da resposta imune intestinal resultou em atraso na produção de IgE, redução da infiltração de eosinófilos e da mastocitose intestinais. Entretanto, a ativação da via IL33/ST2 não se mostrou essencial para a eliminação deste nematódeo, visto que camundongos deficientes para o receptor ST2 foram capazes de eliminar a infecção por S. venezuelensis no mesmo período que animais Balb/c selvagens. Estes dados em conjunto mostram que apesar da resposta imune intestinal ser parcialmente e transitoriamente prejudicada na ausência da via IL-33/ST2, mecanismos compensatórios suprem a ausência da via IL-33/ST2 neste modelo, o que também já foi demonstrado em outros estudos utilizando animais deficientes para o receptor T1/ST2 (Hoshino et al. 1999; Senn et al. 2000). Outros estudos também mostraram a participação da via IL-33/ST2 no desenvolvimento da resposta imune Th-2, sendo que em alguns casos as alterações afetam também o controle de algumas espécies de nematódeos. Em camundongos infectados pelo nematódeo Trichuris muris foi demonstrado que a inoculação de IL-33 recombinante reduziu a produção de IFN-γ por células do linfonodo mesentérico de linhagens de camundongos susceptíveis ao parasito, resultando em polarização da resposta do tipo-2 e na eliminação precoce da infecção (Humphreys et al. 2008). Assim como na infecção por S. venezuelensis, camundongos deficientes no receptor ST2 também mostraram uma redução na ativação de citocinas do perfil Th2, especialmente IL-5 e IL-13, e na ativação de mastócitos durante a infecção por Trichinela spiralis (Scalfone et al. 2013). Os animais ST2-/- também tiveram maior número de larvas de T. spiralis encistadas na musculatura que os animais não deficientes, mas a ausência de ativação da via IL121 33/ST2 não afetou a eliminação dos vermes intestinais (Scalfone et al. 2013). Em contraste, camundongos deficientes na produção de IL-33 não tiveram diferenças significativas na estimulação da produção de IL-4 e de outros elementos da resposta Th2, como produção de IgE e mastocitose durante a infecção experimental por Nippostrongylus brasiliensis (Hung et al. 2013). Apesar do pequeno efeito da indução da resposta do tipo 2, os camundongos IL-33-/- infectados por N. brasiliensis apresentaram redução da produção de IL-13, que afeta a expressão de RELMβ e infiltração de eosinófilos, e resultou em elevação da carga parasitária neste modelo experimental (Hung et al. 2013). A variação da importância da ativação IL-33/ST2 para as diferentes espécies de nematódeos intestinais possivelmente reflete os diferentes mecanismos efetores envolvidos na eliminação destes vermes (Patel et al. 2009). No caso da infecção por S. venezuelensis, dados anteriores mostram que a produção de IL4, mas não de IL-13, é essencial para eliminação do parasito (Fernandes 2012), justificando a eliminação dos vermes em camundongos ST2-/-. Entre os mecanismos efetores associados à eliminação de S. venezuelensis que foram afetados pela ausência da ativação da via IL-33/ST2 podemos salientar a resposta humoral, eosinofilia e mastocitose. Vários estudos demonstram o aumento da produção de IgE, bem como IgM e IgG1 (ou IgG4 em humanos) durante a infecção do hospedeiro por espécies de Strongyloides (Carvalho et al. 1983 Abraham et al. 1995; Silveira et al. 2002; Fernandes 2008). A participação da produção de anticorpos, especialmente IgM e IgG1, no mecanismo de eliminação de S. venezuelensis foi sugerido após verificação de atraso na eliminação destes nematódeos em camundongos C57µMT-/-, deficientes na produção de IgM (Eschenazi 2013) e em camundongos AID-/-, que são camundongos incapazes de realizar troca de classes de imunoglobulina (Matsumoto et al. 2013). No presente trabalho, foi verificado que a produção de IgG1 foi semelhante entre animais deficientes e selvagens, enquanto a produção de IgE foi menor em animais ST2-/- em relação aos Balb/c até os 10dpi. Entretanto, os níveis desta imunoglobulina nos camundongos deficientes se elevaram e alcançaram níveis semelhantes aos de animais selvagens até os 14dpi, mostrando que a ausência de ST2 afetou apenas transitoriamente a resposta humoral. Interessantemente, os níveis de IgM em animais ST2-/- permaneceram maiores em relação aos de animais selvagens ao longo de toda a infecção, contrastando com estudos que mostram que a via IL-33/ST2 estimula a produção desta imunoglobulina (Komai-Koma et al. 2011). Perfil semelhante é observado em animais AID-/- que por 122 serem incapazes de realizar troca de classes de imunoglobulinas, produzem naturalmente mais IgM do que animais WT (Matsumoto et al. 2013; Muramatsu et al. 2000). A partir disso poderíamos sugerir uma deficiência parcial e transitória na troca de classes de imunoglobulinas dos nossos animais ST2-/- ou ainda poderíamos sugerir um papel modulatório da via IL-33/ST2 na produção da IgM durante infecção por S. venezuelensis. Este papel modulatório poderia estar sendo exercido através da molécula SIGIRR, que forma um complexo com o receptor ST2, sob estímulo de IL-33 e regula negativamente a via de sinalização IL-33/ST2 (Bulek et al. 2009). Desta forma poderíamos sugerir que este papel modulatório pode ter sido prejudicado pela ausência do ST2 nos linfócitos B, de maneira que estes animais produzam maiores níveis de IgM. O estabelecimento da resposta humoral no final da infecção nos animais ST2-/- pode ter contribuído para o estabelecimento da resposta imune intestinal auxiliando na eliminação dos vermes no período esperado. As análises histológicas demonstraram que não houve diferenças significativas no aspecto geral das vilosidades intestinais entre animais Balb/c e ST2-/- infectados aos 10dpi. Ambos os animais apresentaram as deformações características da infecção, juntamente com diferenciação de células caliciformes e infiltração de células inflamatórias. No entanto, isso contrasta com estudos que demonstram o papel de elementos da resposta imune inata, como nuócitos, NH (natural helpers), ILCs, induzidas por IL-33 na montagem de uma resposta imune efetiva contra helmintos, sendo esta resposta caracterizada por mudanças histopatológicas na mucosa intestinal, incluindo hiperplasia de células epiteliais e caliciformes, com aumento na produção de muco e infiltração eosinofílica, deformação e achatamento das criptas (Schmitz et al. 2005; Humphreys et al. 2008; Pastorelli et al. 2013). Estudos mostram que camundongos normais em que se injetou IL-33 recombinante desenvolveram hiperplasia de células epiteliais, tanto no pulmão quanto no trato gastrointestinal juntamente com infiltração eosinofílica e de mononucleares na lâmina própria (Humphreys et al. 2008; Neil et al. 2010). Embora, o efeito da IL-33 por si só na mucosa intestinal não deva ser descartado, o que se tem bem documentado, são os efeitos de citocinas Th2, como IL-13, que é superexpressa sob estimulação/administração de IL-33 (Schmitz et al. 2005) em alterações fisiológicas durante a infecção por helmintos intestinais (Akiho et al. 2002; Zhao et al. 2003; Cliffe et al. 2005; Horsnell et al. 2007). Outro elemento importante desta resposta imune intestinal é a mastocitose, que é associada com a eliminação de infecções por parasitos do gênero Strongyloides (Nawa et 123 al. 1985; Abe e Nawa 1987; Khan et al. 1993; Ishikawa et al. 1995; Maruyama et al. 2002). Mastócitos são considerados um dos mais importantes respondedores da citocina IL-33, dando início a uma orquestração de reposta inflamatória com produção de citocinas pró-inflamatórias, Th2 e quimiocinas que direcionam o recrutamento de células inflamatórias (Allakhverdi et al. 2007; Ho et al. 2007; Iikura et al. 2007; Moulin et al. 2007; Silver et al. 2009; Tung et al. 2014). A participação da via IL-33/ST2 na ativação de mastocitose durante a infecção nematódeos intestinais foi anteriormente demonstrada em camundongos deficientes para o receptor ST2 e infectados por Trichinella spiralis. Neste modelo experimental foi verificado que animais ST2-/- tiveram redução significativa dos níveis séricos de mMCP1, indicando redução da ativação de mastócitos intestinais, e resposta Th2 reduzida (Scalfone et al. 2013). De maneira semelhante, nossos dados mostram redução significativa de mastócitos no intestino de animais deficientes ST2-/- infectados por S. venezuelensis quando comparados aos animais infectados não deficientes, que não afetou significativamente a eliminação dos vermes adultos, mas reduziu a fecundidade dos mesmos. É possível que a presença de mastócitos, mesmo que em número menor, aliado a indução de outras alterações intestinais, como acúmulo de células caliciformes e de infiltrado inflamatório, assim como o rápido restabelecimento de níveis de citocinas intestinais e da resposta humoral foram suficientes para que ocorresse a expulsão de S. venezuelensis do intestino de camundongos deficientes na produção do receptor ST2 de forma equivalente ao observado em animais não deficientes da mesma linhagem. Alternativamente, uma das principais citocinas afetadas pela ausência da via IL-33/ST2 é a IL-13, como já demonstrado em trabalhos anteriores (Yasuda et al. 2012; Hung et al. 2013; Scalfone et al. 2013) bem como visto neste estudo. Nestes trabalhos os autores discutem a importância da IL-13 como desencadeadora inicial da resposta Th2, e desta forma importante para o controle do parasito. Entretanto, trabalhos anteriores do nosso grupo já demonstraram que a neutralização da IL-13 não afeta a eliminação do S. venezuelensis (Fernandes 2012). Isto poderia justificar porque a ausência do receptor ST2, embora tenha afetado o estabelecimento da resposta Th2 durante a infecção por S. venezuelensis em camundongos, não prejudicou a expulsão do parasito. Resultados diferentes foram observados em nossos experimentos com animais mutantes, que não diferenciam mastócitos, em que foi constatado que a presença de mastócitos é fundamental para expulsão dos vermes no período normal, ao passo que 124 não parecem ter importância significativa no controle precoce do parasito. Nossos dados mostraram que camundongos mutantes SH, cujo background é C57BL/6, tendem a ter um número maior de larvas no pulmão aos 2dpi, quando comparados aos animais selvagens, semelhante ao observado em animais ST2-/-, mas diferente destes, em animais SH esta tendência não se reflete no número de larvas recuperadas no intestino aos 4dpi. Diferente de animais Balb/c e ST2-/-, o que se observou tanto em animais deficientes SH quanto em animais selvagens SHC, foi que estes não desenvolveram processo inflamatório ou alterações pulmonares decorrentes da infecção. Nos parâmetros avaliados por meio da contagem de leucócitos no lavado broncoalveolar, medição de EPO e MPO, citocinas no pulmão e de pressão intra-traqueal não foram verificadas alterações significativas no período inicial da infecção em nenhum dos dois grupos. Isto pode ser explicado como sendo uma característica de camundongos da linhagem C57BL/6, como é o caso dos camundongos SH e SHC. Diferenças entre as linhagens Balb/c e C57BL/6 quanto ao processo inflamatório pulmonar foram anteriormente demonstradas em modelo de asma induzida por ovalbumina por Gueders e colaboradores (2009). Os autores verificaram que a asma induzida em animais Balb/c resultou em uma forte produção de citocinas Th2 no pulmão, infiltração de mastócitos no tecido e níveis maiores de hiperreatividade brônquica em resposta a metacolina do que em animais C57BL/6. Por outro lado, em animais C57BL/6, o protocolo de asma experimental resultou em resposta reduzida a metacolina, embora tenha se verificado uma forte infiltração de eosinófilos e neutrófilos e níveis mais alto de CCL11 e CCL5 no lavado broncoalveolar. Nos nossos experimentos, a infiltração de eosinófilos e neutrófilos, avaliados indiretamente pela atividade de EPO e MPO no homogenato pulmonar, não alterou significativamente em relação aos animais não infectados durante o período inicial da infecção. A passagem das larvas do parasito pelos pulmões dos camundongos aos 2 dpi resultou em elevação da contagem de leucócitos no lavado broncoalveolar de todos os animais examinados, provavelmente devido ao extravasamento de células do sangue em decorrência da lesão tecidual provocada pela passagem das larvas neste período e não propriamente pelo recrutamento de células inflamatórias. Coincidente com esta hipótese, não foi verificado aumento significativo de células no lavado bronquoalveolar dos camundongos C57BL/6, tanto SH como SHC, aos 4 dias de infecção, bem como não detectamos aumento de citocinas no homogenato pulmonar neste período. Ainda que não tenhamos verificado elevação de citocinas no pulmão induzida pela infecção, um dado interessante a se observar é que animais SH 125 apresentam naturalmente níveis menores de IL-4 em relação aos animais selvagens SHC, o que nos permite sugerir que mastócitos podem ser importante fonte desta citocina. Estudos já demonstraram que os mastócitos produzem e secretam citocinas, como IL-4, IL-5 e IL-13 (que perpetuam a resposta Th2), além de outros mediadores que são de fundamental importância na indução do processo inflamatório local (Bertaccini et al. 2000; Bradding et al. 2006; De Veer et al. 2007; Abraham & John 2010). Além da ativação clássica que envolve a ligação da imunoglobulina (Ig) E ao receptor FcεRI ou de IgG ao FcγRIII em mastócitos, a ativação inata (Ig-independente) destas células por nematódeos parasitos ou seus extratos também já foi observada (Shakoory et al. 2004; revisto por De Veer et al. 2007). Ambas IL-18 e IL-33, elementos da resposta inata, são também associadas a ativação de mastócitos, (Sasaki et al. 2005; Yoshimoto & Nakanishi 2006; Allakhverdi et al. 2007). Um importante efeito mediado por mastócitos induzidos por IL-33 é iniciar uma orquestração de resposta inflamatória com produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF, IL-6), citocinas do tipo-2 (IL-5, IL-10, IL-13, GMCSF) e quimiocinas (CXCL8, CCL1) que direcionam o recrutamento de células inflamatórias (Allakhverdi et al. 2007; Ho et al. 2007; Iikura et al. 2007; Moulin et al. 2007; Silver et al. 2009). Estudos indicam que mastócitos participam da resposta inata a nematódeos, como Heligmosomoides bakeri e Trichuris muris, estimulando a resposta Th2 via regulação de IL-25, IL-33 e TSLP (Hepworth et al. 2012). É importante ressaltar que embora não tenhamos verificado diferenças entre animais mutantes e selvagens, não podemos descartar a hipótese da participação de mastócitos na indução da resposta imune pulmonar frente à infecção por S. venezuelensis, já que o modelo de camundongo utilizado em nossos experimentos (background C57BL/6) por não desenvolver inflamação pulmonar, não foi ideal para verificar isto. De maneira semelhante, os resultados de hiperreatividade brônquica no nosso estudo vieram corroborar dados anteriores do nosso grupo, que já haviam verificado a ausência desta alteração pulmonar, avaliada pela medição de pressão intra-traqueal, em decorrencia da infecção por S. venezuelensis em animais da linhagem C57BL/6 (Araújo et al. submetido para publicação). Ainda assim, foi verificado que animais SH apresentam níveis de hiperreatividade brônquica em resposta a metacolina naturalmente maiores do que os níveis de animais selvagens. Isso nos permite sugerir um papel modulatório de mastócitos nesta alteração funcional. Resultados semelhantes já haviam sido observados em trabalho anterior utilizando esta mesma linhagem de camundongos (Fuchs et al. 2012). Utilizando modelo de asma experimental induzida pela administração intranasal 126 de OVA, os autores verificaram que animais deficientes para mastócitos apresentaram maiores níveis de AHR em resposta a metacolina do que animais selvagens. Além disso, também constataram que o efeito modulador de mastócitos sobre a AHR foi mediado pela liberação de prostanoides, como prostaglandinas. De maneira semelhante, Torres e colaboradores (2013) também verificaram que prostaglandina E2 é capaz de reduzir a hiperreatividade brônquica em resposta a metacolina em camundongos submetidos a modelo experimental de alergia pulmonar. Desta forma, podemos sugerir que mecanismo semelhante possa participar da modulação da resposta pulmonar à inoculação de metacolina observada nos camundongos SHC em comparação aos SH durante a infecção por S. venezuelensis. Esta hipótese precisa ser avaliada em camundongos da linhagen Balb/c, onde a resposta funcional pulmonar pode ser mensurada. Ainda assim nossos dados, juntamente com os dos trabalhos acima citados contrastam com grande parte dos dados da literatura a respeito da associação de mastócitos com as alterações pulmonares. Existem evidências de que mastócitos podem regular função atividade muscular através da liberação de mediadores como histamina, triptase ou leucotrienos que causam contração/relaxamento do músculo liso (Bischoff 2009; Shea-Donohue et al. 2010). A liberação destes mediadores inflamatórios pelos mastócitos pode afetar a função pulmonar do individuo, causando broncoconstrição. Além disso, a possibilidade de mastócitos, diferentemente de outras células, migrarem para a proximidade de músculo liso brônquico em pacientes com asma tem sido associado ao desenvolvimento do fenótipo asmático nestes pacientes (Brightling et al. 2002). Também, estudos já verificaram a associação de contratilidade da musculatura lisa intestinal decorrente da infecção por nematódeos com a presença de mastócitos (Khan et al. 2003). No intestino a ausência de mastócitos teve impacto mais significativo durante a infecção por S. venezuelensis. Nossos dados mostraram que enquanto animais SHC selvagens apresentaram queda na carga parasitológica aos 12dpi e aos 21dpi já estavam livres da infecção, enquanto que os animais mutantes SH ainda se apresentavam intensamente infectados aos 12dpi e até os 21dpi não tinham sido capazes de expulsar o parasito. Além disso, a eliminação de ovos nas fezes foi maior em animais SH aos 7dpi, sendo que neste período a fecundidade das fêmeas tende a ser ligeiramente maior nestes animais em relação aos SHC. Isso demonstra que mastócitos têm papel fundamental no controle da carga parasitária intestinal e na expulsão dos vermes no período normal. Na literatura são vários os relatos associando mastocitose intestinal com a eliminação de 127 infecções por parasitos do gênero Strongyloides (Nawa et al. 1985; Abe & Nawa 1987; Khan et al. 1993; Ishikawa et al. 1995). Utilizando também camundongos deficientes para mastócitos (W/Wv), Nawa e colaboradores (1985) e Abe e Nawa (1987) demonstraram primeiramente a participação de mastócitos no processo de eliminação de Strongyloides ratti sendo que os animais deficientes eliminam a infecção muito mais lentamente que camundongos selvagens. Posteriormente, também foi demonstrado que camundongos W/Wv apresentam deficiência na eliminação da infecção por S. venezuelensis (Khan et al. 1993). Outra evidência experimental foi obtida em camundongos nude (que possuem um defeito tímico, não desenvolvendo células T), cuja resposta protetora contra S. ratti foi restaurada após tratamento prolongado com IL-3, tratamento este capaz de restaurar a mastocitose intestinal nestes camundongos (Abe & Nawa 1988). Posteriormente foi observada ocorrência de mastocitose intestinal durante a infecção por S. ratti em ratos, sendo que número maior destas células foi detectado logo após o pico de parasitemia, sugerindo, portanto, a participação dos mastócitos na expulsão do parasito (Shinotoku et al. 2013). Mais recentemente, Matsumoto e colaboradores (2013) expandiram os estudos sobre a participação de mastócitos na expulsão de vermes de S. venezuelensis do intestino de camundongos. Neste estudo, os autores verificaram que a transferência de soro contendo IgG e IgE parasito-específico para camundongos WT infectados levou a rápida eliminação do parasito. O mesmo não foi observado em camundongos deficientes em mastócitos, mostrando, portanto, a importância da participação destas células, via receptores FcγRIII e FcεRI, na resposta imune adquirida frente à infecção por S. venezuelensis. Nossos dados mostraram ainda que os mastócitos tiveram papel importante no estabelecimento do processo inflamatório intestinal. Apesar de não terem sido detectadas diferenças nos níveis de EPO e MPO entre animais SH e SHC no período de eliminação dos vermes, a concentração da maioria das citocinas mensuradas no intestino dos animais infectados foi reduzida nos camundongos SH, que não diferenciam mastócitos. O atraso na expulsão dos vermes pode, portanto, ser devido a não atuação dos mastócitos como célula efetora no combate ao parasito, juntamente com a deficiência na produção das citocinas inflamatórias, de forma que a ausência destas células pode também ter prejudicado o recrutamento e produção de outros elementos imunes e elementos não imunes importantes para controle da infecção. Os trabalhos mostram que mastócitos são células que estão amplamente distribuídas pela mucosa tanto do trato intestinal quanto do respiratório, sendo estas células caracterizadas 128 pela grande quantidade de grânulos citoplasmáticos contendo mediadores pré-formados, como heparina, proteases e histamina, que podem atuar rapidamente aumentando o fluxo sanguíneo local (ocasionando afluxo de leucócitos local) e aumentando a permeabilidade vascular (revisto por De Veer et al. 2007; Abraham & John 2010). Sob ativação os mastócitos produzem e secretam uma variedade de citocinas, como TNF, IL-6, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 (Bertaccini et al. 2000; Ho et al., 2007; Iikura et al. 2007; Moulin et al. 2007; Silver et al. 2009), o que poderia explicar o menor nível de citocinas no intestino de nossos camundongos deficientes. Além disso, estas células produzem e secretam mediadores inflamatórios lipídicos, como prostaglandina D2 e leucotrieno C4, e quimiocinas como CCL11(eotaxina), que são de fundamental importância na indução do processo inflamatório local (Bertaccini et al. 2000). No nosso caso, vimos que o recrutamento de eosinófilos e neutrófilos no intestino não foi prejudicado pela ausência de mastócitos, mas ainda assim a presença desses dois tipos celulares não foi suficiente para expulsão do parasito. Como já citado anteriormente, os mediadores inflamatórios também podem atuar em receptores em células do músculo liso alterando a contratilidade intestinal (Bertaccini et al. 2000; Bischoff 2009; Shea-Donohue et al. 2010). Este mecanismo pode auxiliar no processo de expulsão dos vermes embora ele não seja fundamental para que isto ocorra, como já ficou demonstrado em trabalhos anteriores do nosso grupo em que foi visto que camundongos deficientes para IL-4 mesmo desenvolvendo hipercontratilidade intestinal, semelhante a animais selvagens, não foram capazes de eliminar os vermes de S. venezuelensis no período normal (Araújo 2010). Em ratos infectados por Nippostrongylus brasiliensis, observou-se uma associação entre acúmulo de mastócitos na mucosa intestinal e aumento da permeabilidade no órgão (King & Miller 1983), o que poderia ser um dos mecanismos pelos quais esta célula atuaria na expulsão de vermes. Também, uma das hipóteses pela qual a mastocitose intestinal atuaria na eliminação de Strongyloides do intestino seria através de proteoglicanas fortemente sulfatadas presentes nos grânulos de mastócitos e que uma vez secretadas no intestino dificultam a fixação dos vermes no epitélio da mucosa intestinal e, consequentemente, facilitam a eliminação dos mesmos. (Maruyama et al. 2002). Por fim, outra hipótese sobre a atuação de mastócitos na expulsão do parasito seria através da indução de hiperplasia de células caliciformes e produção de muco, uma vez que a associação da presença destas células e seus produtos com estas alterações já foi demonstrada anteriormente (Carrol et al. 2002; Okumura et al. 2005). A participação das citocinas IL-13 e IL-4 na indução de hiperplasia de células caliciformes 129 durante infecção helmíntica também já foi demonstrada (Urban et al. 1998). Desta forma, o atraso da produção destas citocinas observada nos animais SH pode também ter prejudicado esta alteração intestinal. Como podemos ver são vários os mecanismos pelos quais os matócitos poderiam estar atuando na expulsão dos vermes. O que nosso trabalho mostra é que esta célula não tem atuação importante como elemento inato no controle de S. venezuelensis, mas é fundamental como elemento da resposta imune adquirida, embora o mecanismo exato de como estes mastócitos estariam atuando não esteja completamente esclarecido. 130 7 - CONCLUSÕES Com relação aos experimentos realizados com animais geneticamente deficientes na produção do receptor da citocina IL-33 (ST2) e seus controles selvagens (Balb/c), concluímos que: o receptor ST2 é importante no controle precoce dos vermes, bem como na fecundidade dos mesmos; sua ausência não interfere na resolução da infecção; a via IL-33/ST2 é importante para desenvolvimento da resposta imune pulmonar, afetando a produção de citocinas e recrutamento de eosinófilos, neutrófilos e linfócitos CD4+ e T reg; . a ausência da via IL-33/ST2 interfere no reparo tecidual do pulmão; a ausência da via IL-33/ST2 não interfere na indução de hiperreatividade brônquica; a ausência da via IL-33/ ST2 também afeta transitoriamente a resposta do tipo 2, visto que animais deficientes apresentam atraso na produção de IgE e níveis menores de citocinas no intestino aos 7dpi; a via IL-33/ST2 é importante para o recrutamento e proliferação de mastócitos no intestino decorrentes da infecção. Com relação aos experimentos realizados em animais mutantes que não diferenciam mastócitos (SH) e seus controles selvagens (SHC), concluímos que: mastócitos parecem não ter papel fundamental na resposta imune inata induzida pela infecção por Strongyloides venezuelensis. Mas estudos utilizando outra 131 linhagem de camundongos se fazem necessários para se verificar o papel destas células no processo inflamatório pulmonar; mastócitos têm papel fundamental na resposta imune adquirida atuando como célula efetora no controle e resolução da infecção intestinal; nos animais C57BL/6, tanto selvagens quanto mutantes, não ocorre hiperreatividade brônquica decorrente da infecção, mas mastócitos parecem ter papel modulatório na pressão intra-traqueal em resposta a metacolina. Nossos resultados mostraram, portanto, que os elementos imunes IL-33/ST2 e mastócitos parecem ter atuação principal em momentos diferentes da infecção, o primeiro atuando como elemento da resposta imune inata e o segundo como elemento da resposta imune adquirida. 132 8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abbas AK, Murphy KM, Sher A 1996. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature 383: 787-793. Abe T, Nawa Y 1988. Worm expulsion and mucosal mast cell response induced by repetitive IL-3 administration in Strongyloides ratti-infected nude mice. Immunology 63: 181-185. Abe T, Nawa Y 1987. Reconstitution of mucosal mast cells in W/Wv mice by adoptive transfer of bone marrow-derived cultured mast cells and its effects on the protective capacity to Strongyloides ratti infection. Parasite Immunology 9: 31-38. Abraham SN, John, ALSt 2010. Mast cells-orchestrated immunity to pathogens. Nature Reviews 10: 440-452. 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