título do resumo

AVALIAÇÃO DE EFEITO IMUNOPATOLÓGICO EM INFECÇÃO
EXPERIMENTAL DE CAMUNDONGOS COM Arthrographis kalrae POR VIA
INTRAPERITONEAL
Bianca Dorana De Oliveira Souza (Bolsista Fundação Araucária/IC), Paula
Leonello Álvares e Silva, Eiko Nakagawa Itano, e-mail: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Centro de Ciências Biológicas/
Departamento de Ciências Patológicas
Área e sub-área do conhecimento: Ciências Biológicas/Imunologia
Aplicada.
Palavras-chave: Cérebro; ELISA; Resposta Imune.
Resumo
Arthrographis kalrae é um fungo dimórfico, descrito como patógeno oportunista
em diferentes manifestações clínicas e causador de síndrome neurológica
complexa em animais infectados. Em trabalhos anteriores foram observados
efeitos imunopatológicos em camundongos infectados com A. kalrae por via
intravenosa. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito imunopatológico
em camundongos infectados com A. kalrae por via intraperitoneal.
Camundongos Swiss foram inoculados intraperitonealmente com A. kalrae
(2,4x107 células) e seus comportamentos avaliados até 15 dias após infecção.
Amostra de tecido histológico cerebral foi analisada por coloração HE e por
imunohistoquímica utilizando anticorpos anti - A. kalrae. Adicionalmente foram
avaliados os níveis de anticorpos séricos em camundongos infectados e
controles sem infecção por ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto utilizando
antígenos solúveis de A. kalrae. Todos os camundongos infectados por via
intraperitoneal (10/10) apresentaram a cabeça pendendo para um lado e
destes 2/10 apresentaram giros. Não foi detectada a presença de fungo ou
resposta inflamatória nos cérebros de camundongos infectados, tanto por HE
como por imunohistoquímica. Os resultados de ELISA demonstraram nível
elevado de anticorpos a antígenos de A. kalrae em camundongos infectados
em relação ao controle sem infecção (p≤0,0007).
Introdução e objetivo
O fungo Arthrographis kalrae foi descrito pela primeira vez em 1971 por Tewari
e Macpherson, isolado de escarro humano e de lesões na pele de animais. É
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um fungo dimórfico que se apresenta na forma filamentosa em temperatura
ambiente (25°C) e na forma leveduriforme a 37°C. Macroscopicamente forma
colônias brancas ou cor de creme, com aspecto aveludado ou com textura
poeirenta a granular. Pode ser isolado do solo e também de águas termais
naturais usadas em recreação no Japão.
No tecido infectado pelo fungo, é predominante sua forma micelial.
Animais infectados coma forma leveduriforme apresentam síndrome
neurológica complexa, com hiperirritabilidade, ataxia, giros e saltos. Tewari e
Macpherson (1968) demonstraram que a taxa de mortalidade foi de 60%
quando a inoculação foi via intravenosa e 10% quando a inoculação foi via
intraperitoneal. Os efeitos produzidos pela inoculação intravenosa foram mais
severos.
O fungo vem sendo descrito como patógeno oportunista em humanos
em diferentes manifestações clínicas como, queratites, eumicetoma,
onicomicoses, sinusites e meningites, porém o mecanismo de infecção ainda
não é conhecido. O estudo dos fatores de virulência de A. kalrae se faz
necessário para compreensão de sua patogenicidade.
Procedimentos metodológicos
Foi utilizado o fungo Arthrographis kalrae, isolado de águas termais naturais
usadas em recreação no Japão. Cedido pela Profa. Dra. Ayako Sano
(Research Center of Pathogenic fungi and microbiol Toxicoses, Chiba
University, Chiba, Japan). O fungo foi mantido a 35°C, cultivado em ágar
Saboraund Dextrose.
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss. Os animais foram
manuseados de acordo com a orientação do Biotério Central/UEL. O projeto foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade
Estadual de Londrina e registrado sob o número 82/09.
Cultura leveduriforme de A. kalrae, cinco dias após repique, foi coletada
em PBS 0,15M pH 7.2 estéril e filtrada e a contagem celular realizada em
câmara de Newbauer. Dez camundongos pesando em média 32g foram
sedados com éter etílico e inoculados com solução de 100µL contendo 2,4x107
leveduras por via intraperitoneal. Dois camundongos foram sacrificados com
nove dias (por apresentarem alterações comportamentais com giros) e oito
com 15 dias de infecção.
Amostras de CFA foram obtidas de acordo com Camargo et al, 1991. Os
anticorpos policlonais anti - CFA de A. kalrae foram obtidos por imunização de
coelho com CFA.
Para avaliação histopatológica o cérebro foi removido dos animais
infectados ou não e fixados em solução de paraformadeído 4%. Após fixação
por 24 horas foram submetidos a procedimentos rotineiros para inclusão em
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parafina e cortes de 5µm de espessura (semi-seriados), que foram corados
pela Hematoxilina-Eosina (HE) para as análises estruturais e de resposta
inflamatória. Algumas secções de 5µm foram fixadas em lâminas de
microscopia por meio de poli L lisina, bloqueadas e incubadas com IgG de
coelho anti - CFA de A. kalrae, seguida de conjugado peroxidase anti - IgG de
coelho e DAB para evidenciação das células fúngicas ou antígenos de A.
kalrae no tecido. As lâminas foram analisadas em microscópio óptico.
Amostras de soros dos camundongos foram analisadas em triplicata por
meio de ELISA indireto utilizando placas de ELISA sensibilizadas com CFA de
A. kalrae (25µg/ml). Após o bloqueio, foram adicionadas 100µL/poço das
amostras de soro diluídas 1:10 e incubadas por 2 horas a 37°C. Após lavagem,
foi adicionado conjugado anti - IgG de camundongo (Sigma A8924) diluído
1:4000 e a revelação foi feita pela adição de substrato cromógeno ortofenilenediamina (OPD), seguida de leitura em Multiskana 492nm.
Foi utilizado teste T para comparação utilizando o software Graphpad
Prism 6.01 (Graphpad Software, San Diego, California, USA), considerando
significativo p-valor ≤ 0.05.
Resultados e discussão
Tewari e Macpherson (1968) e Nagashima (2014) demonstraram que
camundongos infectados com A. kalrae por via endovenosa apresentam
síndrome neurológica complexa, com hiperirritabilidade, ataxia, giros e saltos.
No presente trabalho, os camundongos foram infectados por via intraperitoneal
e todos os camundongos (10/10) apresentaram cabeça pendendo para um lado
e 2/10 camundongos infectados apresentaram também giros (a figura 1 mostra
um dos camundongos com a cabeça inclinada). Como o fungo A. kalrae
apresenta tropismo para o cérebro, a inoculação por via intravenosa deve
permitir a chegada rápida dos mesmos no cérebro, sendo o seu efeito mais
severo que o da via intraperitoneal.
Embora tenha ocorrido alteração comportamental, de forma inesperada,
não foi possível detectar a presença do fungo ou de antígenos no cérebro por
coloração HE e nem por imunohistoquímica. São necessários estudos
adicionais, utilizando carga fúngica maior e em diversos períodos de infecção.
O nível elevado de anticorpos a antígenos de A. kalrae em
camundongos infectados em relação ao controle sem infecção (p=0,0007),
como demonstrado no gráfico 1, sugere que houve infecção. Pode também ter
ocorrido infecção em outros órgãos não investigados no presente trabalho.
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Figura 1 – Camundongo infectado com A.
kalrae com inclinação de cabeça
Fonte: o próprio autor
Gráfico 1 – Níveis séricos de IgG
anti – CFA de A. kalrae. ***p≤0,001
Fonte: o próprio autor
Conclusão
Concluímos que a infecção de camundongos com A. kalrae por via
intraperitoneal induz alteração comportamental e aumento no nível sérico de
anticorpos específicos. Se esta alteração ocorre mesmo na ausência de fungo
no cérebro, requer estudos adicionais.
Referências
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