tcc final darlen dia 15 - Faculdade de Biomedicina

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
DARLEN CARDOSO DE CARVALHO
FARMACOGENÉTICA DO GENE TIOPURINA METILTRANSFERASE
NA RESPOSTA A 6-MERCAPTOPURINA, EM PACIENTES COM
LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA, NA REGIÃO NORTE DO
BRASIL.
BELÉM
2011
DARLEN CARDOSO DE CARVALHO
FARMACOGENÉTICA DO GENE TIOPURINA METILTRANSFERASE
NA RESPOSTA A 6-MERCAPTOPURINA, EM PACIENTES COM
LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA, NA REGIÃO NORTE DO
BRASIL.
Trabalho
de
Conclusão
de
Curso
apresentado à Faculdade de Biomedicina
da Universidade Federal do Pará, como
requisito parcial para obtenção do grau de
Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Ney Pereira Carneiro dos Santos
BELÉM
2011
DARLEN CARDOSO DE CARVALHO
FARMACOGENÉTICA DO GENE TIOPURINA METILTRANSFERASE
NA RESPOSTA A 6-MERCAPTOPURINA, EM PACIENTES COM
LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA, NA REGIÃO NORTE DO
BRASIL.
Trabalho
de
Conclusão
de
Curso
apresentado à Faculdade de Biomedicina
da Universidade Federal do Pará, como
requisito parcial para obtenção do grau de
Bacharel em Biomedicina, aprovado com o
conceito
___________________________.
Belém (PA), 16 de Dezembro de 2011.
Banca Examinadora:
______________________________
Prof. Dr. Ney Pereira Carneiro dos Santos
ICB-UFPA
(orientador)
______________________________
Prof. Dr. Rommel Mario Rodríguez Burbano
(ICB-UFPA)
______________________________
Profª Drª Andrea Kely Campos Ribeiro dos Santos
(ICB-UFPA)
______________________________
Prof. Dr. Jose Ricardo dos Santos Vieira - Suplente
(ICB-UFPA)
i
Enormes mudanças estão ocorrendo em relação à previsão de futuros riscos de
doenças, à otimização da terapia médica e à descoberta de novas abordagens para
o tratamento de doenças. A transformação do atendimento médico é
impressionante. Estamos agora avançando além da realidade atual e já começamos
a imaginar como a medicina poderá ser praticada no futuro, o que certamente nos
promete uma louca aventura.
Francis S. Collins
ii
AGRADECIMENTOS
Ao Meu orientador, Dr. Ney Santos, pelos ensinamentos, oportunidade
de aprendizado e incentivo. Por
ter me orientado na graduação e transmitido
bastante conhecimento para a minha vida acadêmica, e pela incondicional atenção
e apoio neste trabalho.
Ao Laboratório de Genética Humana e Médica (LGHM) da Universidade
Federal do Pará.
Aos amigos do LGHM: Marianne, Débora, Gabriela, Giovana, Natalle,
Rafael, Igor, Pablo, Danilo e Marcos, pela ajuda e amizade.
Aos professores Dr. Sidney Santos e Dra. Ândrea Ribeiro dos Santos pelo
auxílio e aprendizado na elaboração deste estudo.
Agradecimento especial a Alayde pela contribuição fundamental para a
realização deste trabalho.
A Universidade Federal do Pará (UFPA) e Hospital Ophir Loyola pela
contribuição no desenvolvimento deste estudo.
Aos meus pais, pelo amor e incentivo, por sempre confiarem em mim.
A minha família, em especial a minha prima Fernanda pelo incentivo para
que eu completasse essa fase da minha vida.
iii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
1.1. CÂNCER ................................................................................................................. 1
1.1.2. EPIDEMIOLOGIA DO CÂNCER ...................................................................... 2
1.2. CÂNCER INFANTO-JUVENIL .............................................................................. 4
1.2.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS ............................................................................ 4
1.2.2. LEUCEMIAS ........................................................................................................ 5
1.2.3. LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA .......................................................... 8
1.2.4. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA
AGUDA ............................................................................................................................ 9
1.2.5. TRATAMENTO DA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA ...................... 10
1.2.5.1. GLICOCORTICÓIDES ................................................................................. 11
1.2.5.2. ASPARAGINASE .......................................................................................... 12
1.2.5.3. METOTREXATO ........................................................................................... 12
1.2.5.4. 6-MERCAPTOPURINA ................................................................................ 13
1.3. MECANISMO DE AÇÃO DA 6-MERCAPTOPURINA ................................... 13
1.3.1. EFEITOS ADVERSOS AO FÁRMACO 6-MERCAPTOPURINA .............. 16
1.4. LELUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA NO ESTADO DO PARÁ ............. 17
1.5. FARMACOGENÉTICA ........................................................................................ 20
1.5.1. FARMACOGENÉTICA APLICADA AO CÂNCER ...................................... 21
1.5.2. FARMACOGENÉTICA DO 6-MP ................................................................... 23
1.6. GENE TPMT- POLIMORFISMOS GENÉTICOS ............................................ 25
1.7. DOSAGEM RECOMENDADA DE 6-MP ......................................................... 31
1.8. JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 34
1.9. OBJETIVOS .......................................................................................................... 35
1.9.1. OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 35
1.9.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................... 35
2. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 36
2.1. AMOSTRAS ESTUDADAS ................................................................................ 36
2.2. EXTRAÇÃO DE DNA .......................................................................................... 36
2.3. QUANTIFICAÇÃO ............................................................................................... 37
2.4. SELEÇÃO DOS SNP .......................................................................................... 38
iv
2.5. DESENHO DOS INICIADORES ........................................................................ 38
2.6. REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR) .................................... 39
2.7. SEQUENCIAMENTO DIRETO DO DNA ......................................................... 40
2.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................... 40
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 42
3.1. OTIMIZAÇÃO DA PCR E SEQUENCIAMENTO PARA INVESTIGAÇÕES
DOS POLIMORFISMOS NO GENE TPMT ............................................................. 43
3.2. FREQUÊNCIA DOS ALELOS DO GENE TPMT NAS POPULAÇÕES
ESTUDADAS ................................................................................................................ 44
3.2.1. FREQUÊNCIA DOS ALELOS DO GENE TPMT NA POPULAÇÃO DE
BELÉM-PA ................................................................................................................... 44
3.2.2. FREQUÊNCIA DOS ALELOS DO GENE TPMT EM PACIENTES COM
LLA ................................................................................................................................. 47
3.3. GENÓTIPOS ENCONTRADOS DO GENE TPMT NAS POPULAÇÃO
ESTUDADAS ................................................................................................................ 51
3.4. DADOS CLÍNICOS DOS PACIENTES COM LLA .......................................... 53
4. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 58
REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 60
v
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Tipos de câncer mais incidentes estimados para os anos de 2010/2011,
exceto câncer de pele não melanoma, na população brasileira. .................................... 3
FIGURA 2. Distribuição percentual da incidência por tipo de câncer infanto-juvenil,
Belém e Ananindeua, 1997 a 2001. .................................................................................... 7
FIGURA 3. Subtipos da LLA de acordo com a classificação da OMS. ......................... 8
FIGURA 4. Mecanismo de metabolização do fármaco 6-MP. ...................................... 15
FIGURA 5. Procedência e números de casos por município de pacientes pediátricos
portadores de LLA no estado do Pará. ............................................................................. 18
FIGURA 6. Frequência de toxicidade em pacientes pediátricos portadores de LLA
provenientes do estado do Pará. ....................................................................................... 19
FIGURA 7. Fármacos aprovados pela FDA referentes a marcadores
farmacogenômicos ................................................................................................................ 22
FIGURA 8. Estrutura química dos fármacos Tiopurinas. ............................................... 24
FIGURA 9. Distribuição populacional da atividade da enzima TPMT. ........................ 27
FIGURA 10. Variantes alélicas predominantes do locus TPMT. .................................. 29
FIGURA 11. Exemplo de eletroferograma de um paciente pediátrico com LLA,
heterozigoto para dois polimorfismos do tipo SNP: 460G>A e 474T>C....................... 43
FIGURA 12. Gráfico comparando a frequência alélica do gene TPMT entre as
populações de pacientes com LLA e a população sadia de Belém-PA. ..................... 50
vi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Frequência das variantes alélicas do TPMT em diferentes grupos
étnicos. ................................................................................................................................... 26
TABELA 2. Alelos da Tiopurina Metiltransferase e fenótipos associados à atividade
da enzima TPMT. ................................................................................................................. 30
TABELA 3. Dosagem recomendada de 6-Mercaptopurina de acordo com o fenótipo
do TPMT. ............................................................................................................................... 32
TABELA 4. Polimorfismos farmacogenéticos selecionados do gene TPMT
associados à resposta terapêutica do 6-MP. ................................................................... 38
TABELA 5. Descrição dos iniciados utilizados na genotipagem dos polimorfismos do
gene TPMT ............................................................................................................................. 39
TABELA 6. Frequência estimada na população de Belém para os seis SNP
investigados e seus haplótipos derivados do gene TPMT. ........................................... 45
TABELA 7. Frequência estimada em pacientes com LLA para os seis SNP
investigados e seus haplótipos derivados do gene TPMT.............................................. 48
TABELA 8. Distribuição dos indivíduos estudados de acordo com o genótipo do
TPMT e sua capacidade de metabolização do 6-MP. .................................................... 52
TABELA 9. Dados clínicos dos 24 pacientes com LLA estratificados de acordo com
genótipo do TPMT ................................................................................................................. 56
vii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS OU SIMBOLOS
6-MeTIMP: 6-metil tioinosina 5’ monofosfato
6-MP: 6-mercaptopurina
6-TGN: 6-tioguanina
6-TU: Ácido tioúrico
ASNS: Asparaginase Sintetase
AZA: Azatioprina
FDA: Food and Drug Administration
GMPS: Guanosina monofosfato sintase
HGPRT: Hipoxantina-guanina fosforibosil transferase
IARC : Agência Internacional para Pesquisa em Câncer
IMPD: Inosina monofosfato desitrogenase
INCA: Instituto Nacional do Câncer
LCR: Liquido Cefalorraquidiano
LLA: Leucemia Linfoblástica Aguda
LLC: Leucemia linfóide Crônica
LMA: Leucemia Mielóide Aguda
LMC: Leucemia Mielóide Crônica
MMP: Metilmercaptopurina
MTX: Metotrexato
NCI/NIH: Instituto Nacional de Câncer (dos Estados Unidos)
OMS: Organização Mundial da Saúde
viii
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
SNP: Polimorfismos de Nucleotídeos Únicos
TGMP: Tioguanina monofosfato
TGN: Nucleotídeos citotóxicos
TIMP: Tiomecaptopurina
TPMT: Tiopurina Metiltransferase
TXMP: Tioxantina monosfosfato
χ2 : Qui-quadrado
XO: Xantina Oxidase
ix
RESUMO
O 6-MP é um dos quimioterápicos mais utilizados em todo mundo no tratamento da
leucemia linfoblástica aguda, que é o tipo de câncer mais comum na infância. A
metabolização desse fármaco ocorre a partir de um processo de S-metilação
catalisada pela enzima TPMT. Polimorfismos genéticos presentes no TPMT
controlam os níveis de atividade dessa enzima nos tecidos humanos. O objetivo do
presente trabalho foi investigar a frequência das variantes alélicas do gene TPMT:
TPMT*1S (474T>C), TPMT*2 (238G>C), TPMT* 3A (460G>A e 719A>G), TPMT*3B
(460G>A), TPMT*3C (719A>G), TPMT*4 (G_1A), TPMT*8 (644G>A) em 24
pacientes com leucemia linfóide aguda, tratados com 6-MP, em um hospital de
referencia em tratamento oncológico do estado do Pará, com a finalidade de
correlacionar esses polimorfismos com os dados clínicos desses pacientes. O grupo
controle do estudo foi constituído de 49 indivíduos representativos da população
investigada de Belém-PA. Os polimorfismos do gene TPMT foram analisados
através da reação em cadeia da polimerase seguido de sequenciamento direto.
Entre a população de Belém, as frequências dos alelos do gene TPMT foram:
TPMT*1S: 22%, TPMT*3A: 2%, TPMT*3C: 1%, TPMT*8: 5%, TPMT*2: 1%, as dos
pacientes portadores de LLA foram TPMT*1S: 21% e TPMT*3A: 4 %. Dos 49
indivíduos da população de Belém analisados, nove (18,4%) apresentaram
mutações relacionado a atividade intermediária da TPMT, sendo o genótipo mais
frequente TPMT*1/TPMT*8 (10%). Dos 24 pacientes com LLA investigados, dois
(8,3%) apresentaram atividade intermediária da enzima TPMT, cujo genótipo
correspondendo foi TPMT*1/TPMT*3A. Quando foram analisados os dados clínicos
dos pacientes pediátricos com LLA dez (41, 6%) apresentaram reações adversas
decorrentes do tratamento, quatro (18, 7%) apresentaram falência terapêutica. Entre
as reações adversas observadas nos pacientes com LLA as que se mostraram mais
frequentes foram as mucosites (cinco pacientes, 22, 7%) e neutropenias (três
pacientes, 12, 5%). Quando se comparou os grupos (homozigotos para atividade
alta da TPMT e heterozigotos) foi observado um maior número de indivíduos que
obtiveram falecia terapêutica e óbitos no grupo de pacientes homozigotos para a alta
atividade da TPMT, embora essas diferenças não sejam estatisticamente
significativas (p>0,05). O presente trabalho é o primeiro realizado na região Norte do
Brasil a investigar polimorfismos farmacogenéticos do gene TPMT em resposta ao
tratamento de pacientes com LLA. Nossos resultados sugerem uma tendência de
risco associando a falência terapêutica com os homozigotos de elevada
metabolização da 6-MP, contudo o estudo ainda necessita ser comprovado com
aumento do numero amostral dos pacientes e maior acompanhamento dos
mesmos, para a realização de análises mais precisas. As investigações
farmacogenéticas do gene TPMT com resposta ao 6MP podem fornecer subsídios
para implementação de políticas públicas voltadas para exames preditivos que
sejam capazes de melhorar a terapêutica dos pacientes portadores de LLA, evitando
toxicidade e aumentando a eficácia da terapia.
Palavras-chave:
Leucemia
Linfoblástica
Aguda
(LLA);
Polimorfismos
farmacogenéticos; Tiopurina Metiltransferase (TPMT); 6-mercaptopurina (6-MP).
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. CÂNCER
O câncer pode ser entendido como uma patologia complexa do ponto
vista genético. Na maioria dos casos, o câncer surge em função de um processo de
multiplicação celular que ocorre de maneira descontrolada, devido a alterações
moleculares em genes responsáveis por fazer o controle da divisão celular. Sem
regulação clones mutantes de células se dividem excessivamente formando
aglomerados celulares chamados de tumores ou neoplasias, que podem ser
classificadas como benignas ou malignas (Instituto Nacional do Câncer-INCA, 2010).
As neoplasias malignas se diferenciam das benignas basicamente pela capacidade
de invadir tecidos e órgãos e de espalhar-se por outras regiões do corpo, por meio
do sangue ou da linfa, gerando tumores secundários, denominados metástases
(INCA, 2010).
As pesquisas voltadas a oncologia nos últimos anos identificou diversos
genes envolvidos no surgimento do câncer. O mecanismo responsável pela
carcinogênese envolve essencialmente mutações em proto-oncogenes (oncogenes)
e em genes supressores tumorais (Vogelstein & Kinzler, 2004). Os proto-oncogenes
e genes supressores tumorais atuam na regulação da proliferação celular.
Os proto-oncogenes basicamente regulam os eventos que mantém a
progressão ordenada do ciclo celular, divisão celular e diferenciação celular (Louro
et al., 2002). Um proto-oncogene que tem a sua função alterada por mutações é
chamado de oncogene, essas mutações alteram a estrutura do DNA e sítios de
expressão dos produtos de um gene o que ativa o seu potencial oncogênico. Os
genes supressores de tumor atuam mantendo a proliferação celular controlada
restringindo, dessa forma, o crescimento celular. Mutações com perda da função
desses genes aumentam a suscetibilidade ao câncer, pela estimulação do ciclo
celular (Louro et al., 2002).
Os cânceres podem ser classificados de acordo com os tecidos e os tipos
celulares dos quais derivam, podendo ser agrupados em duas grandes categorias:
Carcinoma, quando são derivados de células epiteliais ou de tecidos que recobrem
alguns órgãos, e Sarcoma, quando derivam do tecido conjuntivo ou de células
2
musculares. Os cânceres que não se enquadram em nenhuma dessas categorias
incluem as várias Leucemias, que são derivadas de células hematopoiéticas e os
cânceres do sistema nervoso central (INCA, 2010).
1.1.2. EPIDEMIOLOGIA DO CÂNCER
O câncer, em todas as suas formas, é uma patologia que afeta
mundialmente a saúde das populações. O Relatório da Agência Internacional para
Pesquisa em Câncer- IARC (2008) estimou que o impacto global do câncer dobrou
nos últimos 30 anos. Estimou-se que, no ano de 2008, ocorreriam cerca de 12,4
milhões de casos novos de câncer e 7,6 milhões de óbitos por câncer no mundo.
Destes, os mais incidentes foram o câncer de pulmão (1,52 milhões), mama (1,29
milhões) e cólon e reto (1,15 milhões). Sendo o câncer de pulmão a principal causa
de morte (1,31 milhões), seguido pelo câncer de estômago (780 mil óbitos) e pelo
câncer de fígado (699 mil óbitos). Para América Latina, estimou-se em 2008 cerca
de um milhão de casos novos de câncer e 589 mil óbitos. Em homens, o mais
comum foi o câncer de próstata, seguido por pulmão, estômago, cólon e reto. Nas
mulheres, o mais frequente foi o câncer de mama, seguido do colo do útero, cólon e
reto, estômago e pulmão (World Cancer Report 2008).
O crescimento populacional, acompanhado com seu envelhecimento, terá
impactos significativos para a incidência de câncer no mundo. A IARC/OMS estimou
em 2008, que metade dos casos novos e aproximadamente dois terços dos óbitos
por câncer ocorrerão em países de baixo e médio desenvolvimento. A Organização
Mundial da Saúde (OMS) prevê que em 2030 ocorrerão 27 milhões de casos novos
de câncer com 17 milhões de mortes ao ano e 75 milhões de pessoas vivas com
câncer no prazo de cinco anos de diagnóstico (World Cancer Report 2008).
No Brasil é estimado que no ano de 2011 ocorram 489.270 novos casos
de câncer. Os tipos mais incidentes são: câncer de pele não melanoma, com 114 mil
novos casos, seguido de cânceres de próstata (52 mil) e de pulmão (28 mil) em
homens e os cânceres de mama (49 mil) e do colo do útero (18 mil) em mulheres
(INCA, 2010). É estimado que ocorram 9.580 casos de leucemias no Brasil, sendo
3
5.240 entre homem e 4.340 entre as mulheres (INCA, 2010). A Figura 1 mostra os
tipos de câncer mais incidentes para o ano de 2010 e 2011 na População Brasileira.
No estado do Pará é estimada a ocorrência de 7.720 novos casos de
neoplasias e apresentando a mesma tendência do restante da população brasileira,
também apresenta o câncer de pele não melanoma como o mais prevalente (2.010
novos casos), seguido do câncer de colo do útero (790); do câncer de próstata (700)
e câncer gástrico (650). É estimado que ocorram 260 novos casos de leucemias no
estado do Pará, 140 em homens e 120 em mulheres (INCA, 2010).
O Instituto Nacional do Câncer estima que em 2011, em Belém, capital
paraense, ocorram aproximadamente 3.710 novos casos de câncer, dos quais
apresentam-se em ordem de prevalência: o câncer de pele não melanoma (890
casos); câncer de mama (400); câncer de colo do útero (330); câncer de próstata
(330) e câncer gástrico (310). A incidência estimada para as leucemias em Belém é
100 novos casos, sendo 50 em homens e 50 em mulheres (INCA, 2010).
Figura 1. Tipos de câncer mais incidentes estimados para os anos de 2010/2011, exceto câncer de
pele não melanoma, na população Brasileira. Fonte: Instituto Nacional do Câncer, Estimativa
2010/2011: incidência de câncer no Brasil. Rio de Janeiro, 98p. 2009.
4
1.2. CÂNCER INFANTO-JUVENIL
1.2.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
O Câncer infanto-juvenil deve ser estudado separadamente do câncer do
adulto por apresentar diferenças nos locais primários, origens histológicas e
comportamentos clínicos. Do ponto de vista clínico, os tumores pediátricos
apresentam menores períodos de latência, em geral crescem rapidamente e são
mais invasivos; porém respondem melhor ao tratamento e são considerados de bom
prognóstico (INCA, 2010).
O Câncer infanto-juvenil é considerado raro quando comparado com as
neoplasias que afetam os adultos e correspondem entre 1% a 3% de todos os
tumores malignos na maioria das populações (INCA, 2010). Entre os cânceres
pediátricos estima-se, para o Brasil no ano de 2011, a ocorrência de cerca de 9.386
casos novos de neoplasias em crianças e adolescentes até os 18 anos (INCA,
2010). Este dado é preocupante uma vez que o Brasil possui uma população
essencialmente jovem, cerca de 38% da população brasileira está abaixo dos 19
anos de idade (INCA. 2010). Dos cânceres infantis, a leucemia é o tipo mais
frequente na maioria das populações, correspondendo entre 25% e 35% de todos os
tipos, com exceção da Nigéria, onde esse percentual é de 45%. Dentre todas as
leucemias, a Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é a de maior ocorrência em
crianças entre 0 a 14 anos de idade (INCA, 2010). Nos países desenvolvidos os
Linfomas correspondem ao terceiro tipo de câncer mais comum. Nos países em
desenvolvimento os linfomas correspondem ao segundo lugar, atrás apenas das
leucemias. Os tumores do sistema nervoso central correspondem à cerca 8% a 15%
das neoplasias pediátricas. Os tumores renais representam de 5% a 10% dos
cânceres
infantis.
Os
tumores
ósseos
possuem
maior
prevalência
entre
adolescentes, sendo os mais frequentes o tumor de Ewing e o osteossarcoma. Os
sarcomas correspondem a 4% a 8%, enquanto que as neoplasias de células
germinativas correspondem de 2% a 4% de todos os tumores da infância. A
ocorrência de carcinoma em crianças e adolescentes é rara, correspondendo a
cerca de 2% dos casos (INCA, 2010).
5
No Brasil as leucemias são responsáveis pelas maiores taxas de
mortalidades em crianças e adolescentes acometidas por neoplasias (INCA, 2011).
As taxas de mortalidade por câncer no Brasil em crianças e adolescentes com idade
de 1 a 19 anos correspondeu a 8% de todos os óbitos em 2005, colocando-se assim
como a segunda causa de morte nesta faixa etária, ficando atrás somente de mortes
por causas extremas como acidentes e violências. É importante ressaltar que a
mortalidade por câncer não deve incluir somente os óbitos relacionados ao próprio
câncer, mas também relacionados ao tratamento (Welch & Black, 2002). A
toxicidade a quimioterapia durante o tratamento do câncer é atribuída ao óbito
precoce mais do que a progressão da doença em si. Os óbitos relacionados à sepse
em pacientes com neutropenia, durante o tratamento, consistem na causa mais
frequente de mortalidade. Seguidas de toxicidade neurológica, cardíaca e renal
(Brown, 1993; Ray-Coquard, 2001).
Muitas vezes determinar a causa do óbito de um paciente com câncer é
um processo complexo, mas é indispensável incluir os óbitos relacionados ao
tratamento para melhor determinar o progresso de combate ao câncer prevendo
medidas voltadas a melhoria do tratamento oncológico (Welch & Black, 2002).
1.2.2. LEUCEMIAS
Leucemia é uma patologia de origem na maioria das vezes não
conhecida, ela é o resultado de anormalidades que ocorrem em uma célula
progenitora do sistema hematopoiético. Essas anormalidades modificam o programa
de diferenciação celular determinando uma vantagem proliferativa do clone
leucêmico sobre as demais células normais da medula óssea culminando, portanto,
no acúmulo dessas células anormais na medula e impedindo a formação de células
sanguíneas normais (Sachs, 1996; INCA, 2010).
As neoplasias originadas da medula óssea são do ponto de vista
histórico, denominadas leucemias e podem ser classificadas de acordo com o tipo
de glóbulos brancos afetado, nesse quesito são classificadas em dois grandes
grupos; linfóide, quando afetam células da linhagem linfocitária, sendo chamadas de
6
leucemia linfóide, linfocítica ou linfoblástica; ou mielóide quando afetam as células
de origem mielóide podendo ser denominadas de leucemia mielóide ou
mieloblástica. Em relação aos diferentes estágios de maturação das células afetadas
(linfóide ou mielóide) as leucemias podem ser classificadas em crônicas e agudas.
Na forma crônica ocorrem proliferação e acúmulo gradativo de células neoplásicas
na medula óssea, que se apresentam em um estágio tardio de maturação. Na forma
aguda a linhagem celular afetada é oriunda de células imaturas, levando a um
bloqueio de maturação e a uma proliferação descontrolada dessas células
neoplásicas (Rowley, 2000; Zago et al., 2005; INCA 2010). Dessa forma,
combinando as duas categorias podem ser classificados quatro tipos mais comuns
de leucemias; a. Leucemia Linfóide Aguda (LLA); b. Leucemia Linfóide Crônica
(LLC); c. Leucemia Mielóide Aguda (LMA); d. Leucemia Mielóide Crônica (LMC)
(INCA, 2010).
No contexto mundial, as leucemias correspondem a cerca de 30% dos
cânceres em pediatria, constituindo as neoplasias mais comuns em menores de 15
anos na maioria das populações, sendo a leucemia linfóide aguda a mais frequente,
representando cerca de 80% de câncer na infância (Smith & Reis, 2002). A leucemia
mielóide aguda é mais frequente em adultos e representa apenas 4% dos
diagnósticos em cânceres pediátricos (Mullighan, 2009; Wayne et al., 2010). A
ocorrência de leucemia mielóide crônica na infância é rara, correspondendo a cerca
de 1% dos cânceres em crianças de 1 a 4 anos (Wayne et al., 2010).
No Brasil as leucemias são o tipo de tumor mais frequente em crianças e
adolescentes, com percentual médio de 29%, sendo a região Norte do país a que
apresenta maiores percentuais para esse tipo de neoplasia, acima de 39%. A Figura
2 mostra a distribuição percentual da incidência dos diferentes tipos de câncer
infanto-juvenil na população de Belém e Ananindeua no período de 1997 a 2001
(INCA, 2008).
7
Figura 2. Distribuição percentual da incidência por tipo de câncer infanto-juvenil, Belém e
Ananindeua, 1997 a 2001. Fonte: Instituto Nacional de Câncer (Brasil). Coordenação de Prevenção
e Vigilância de Câncer. Câncer da Criança e adolescente no Brasil: Dados dos registros de base
populacional e de mortalidade/Instituto Nacional de Câncer- Rio de Janeiro: INCA, 2008.200p.
Estudos demonstram que fatores socioeconômicos, étnicos/genético e
nutricionais podem possuir papel fundamental no prognóstico de crianças com
leucemias (Greaves et al., 1993; Greaves et al., 1994; Pulsoni et al., 1998; Douer et
al., 1996). Dados internacionais compararam as frequências relativas dos diferentes
subtipos de leucemia estratificando segundo idade, sexo, etnia e condição social,
demonstrando que esses fatores variaram em crianças leucêmicas que vivem em
diferentes partes do mundo (Greaves et al ., 1993; Linet et al ., 1999). Esses dados
parecem sugerir que o risco de desenvolvimento dos diferentes subtipos de
leucemia está relacionado com a interação de diferentes ambientes e/ou fatores de
risco.
Outros fatores também podem predispor o aparecimento de neoplasias
linfóide em criança, como infecções virais e algumas síndromes genéticas como a
de Down e Klinefelter (Miller, 1969; Horsman et al., 1987; Shaw et al., 1992; Zipursky
et al., 1997; Vassey et al., 1999; Lange, 2000). Além disso, outras anormalidades do
sistema hematopoiético, como as neutropenias congênitas, e agentes químicos
como benzeno, radiação ionizante e certos tipos de alimentos podem contribuir para
a etiologia da leucemia (Serverson et al., 1993; Shu et al., 1996; Ross et al ., 1997;
8
Ross, 1998; Finkelstein, 2000; Mohan et al., 2000; Snyder, 2000; Konogorov et al.,
2000; Ross, 2000).
1.2.3. LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA
A leucemia linfoblástica aguda é o tipo de leucemia mais frequente em
crianças e compreende apenas 20% das leucemias agudas em adultos (Appelbaum,
1999; Zago et al., 2005) é mais frequente em crianças na faixa etária de 2 a 5 anos,
sendo mais incidente no sexo masculino e em crianças brancas. A classificação da
LLA
pela
a
OMS
baseia-se
em
critérios
morfológicos,
imunofenotípicos,
citogenéticos e biologia molecular, que inclui leucemia linfoblástica aguda de
percussores T ou B (Figura 3) ou neoplasias precursoras de células B maduras do
subgrupo leucemia/linfoma de Burkitt (cujos blastos tem origem de células B do
centro germinativo) (OMS, 2001). Em 80% dos casos a expansão clonal das células
leucêmicas na LLA decorre de linhagem de linfócitos B e em 20% decorrem da
linhagem dos linfócitos T (Pui et al., 2004; Cheok et al., 2006; Onciu, 2009). Subtipos
imunofenotípicos de linfoblastos de células B exibem uma variedade de
anormalidades genéticas. Várias vias moleculares estão envolvidas na patogênese.
Figura 3. Subtipos da LLA de acordo com a Classificação da OMS. A Leucemia linfoblástica
percussor B. Esfregaço de medula óssea. Vários linfoblastos com uma relação núcleo citoplasma alta
e variável e com condensação de cromatina. B Leucemia linfoblástica percussor T. Esfregaço de
sangue.Os linfoblastos variam de tamanho em células grandes e pequenas com uma alta relação
núcleo citoplasma. Fonte: JAFFE, E.S.; HARRIS, N.L.; STEIN, H. & VARDIMAN, J.W. World Health
Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic
and Lymphoid Tissues. Lyon: IARC Pres., 2001.352p.
9
As
alterações
genéticas,
mas
comuns
incluem
hiperdiploidia
e
translocações (BCR-ABL, E2A-PBX1, TCR). Entre as células T de pacientes com
leucemia linfoblástica aguda, a metade apresenta cariótipo normal enquanto que as
translocações recorrentes são vistas em um terço dos pacientes (Jabbour et al.,
2005).
A leucemia linfóide aguda é uma doença que se caracteriza pelo acúmulo
de linfoblastos em numerosos órgão e tecidos, notadamente na medula óssea e
sangue periférico. Devido à vantagem proliferativa das células leucêmicas sobre as
células normais na medula óssea, a função do sistema hematopoiético fica
prejudicada o que resulta em anemia, trombocitopenia e diminuição da imunidade
celular. A infiltração pelas células leucêmicas para outros órgãos determina o
aumento
do
fígado
(hepatomegalia),
baço
(esplenomegalia)
e
linfonodos
(linfadenomegalias). Outros órgãos como timo, rim, pele, gônadas e sistema nervoso
podem também ser comprometidos (Zago et al., 2005).
As manifestações clínicas das leucemias agudas são muito variadas.
Nas crianças é comum o aparecimento de hemorragia como equimoses, petéquias
ou sangramento gengival. Também são notadas diminuição do apetite e da
atividade, dores articulares e febre (Simone et al., 1975).
1.2.4. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA
O diagnóstico definitivo da leucemia tem base no exame da medula
óssea, considera-se o diagnóstico de leucemia quando em torno de 20% a 30% das
células nucleadas da medula óssea consiste de blastos (Bennett et al., 1976).
O
hemograma
está
na
maioria
dos
casos
alterados,
anemia,
trombocitopenia e presença de blasto são alterações frequentes encontrados na
leucemia, em 20% dos indivíduos com leucemia linfoblástica aguda não é possível
evidenciar a presença de blastos (Gajjar et al., 1995). Para determinar a
classificação dos subtipos de Leucemia são realizados exames citogenético
(cariótipo) e imunofenotípico. Os exames radiográficos comumente mostram
alterações que são sugestivas de leucemia (Gallagher et al., 1996). Também são
10
feitos exames do liquido cefalorraquidiano (LCR) para atestar infiltração das células
leucêmicas no sistema nervoso central (Zago et al., 2005).
1.2.5. TRATAMENTO DA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA
Até meados dos anos 1980 as leucemias eram a causa mais comum de
mortes em crianças acometidas com câncer em todo mundo (Miller &
Mackay,
1984). A regressão da mortalidade começou com o progresso terapêutico na década
de 40, quando foi demonstrada a ação dos agentes quimioterápicos contra os
blastos leucêmicos (INCA, 2010). A sobrevida livre de leucemia por mais de cinco
anos é condicionado como critério de cura nessa doença, atualmente a leucemia
linfoblástica aguda é curada em cerca de 80% nas crianças submetidas a regimes
quimioterápicos (Pui et al., 2000; Pui & Evans, 2006).
O objetivo no tratamento das leucemias é extinguir as células leucêmicas
para que a medula óssea possa ter o seu funcionamento normalizado (INCA, 2010;
Pui & Evans, 2006).
A base terapêutica da leucemia linfoblástica aguda foi estabelecida por
Pinkel (1971) e consiste na combinação de diferentes quimioterápicos. Esse autor
determinou a administração de diferentes fármacos durante três fases de terapia; a
indução, consolidação e manutenção em um período 2,5 a 3 anos de tratamento. Os
nomes dessas fases variam dependendo do tipo de leucemia (linfóide ou mielóide),
na LLA as fases são denominadas indução, consolidação, reindução, manutenção e
tratamento dirigido ao sistema nervoso central (INCA, 2010).
A primeira etapa, indução, tem a finalidade de diminuir as células
leucêmicas ao ponto de permitir o retorno do funcionamento normal da medula
óssea e consequente melhoria do estado do paciente, o tratamento consiste na
utilização de pelo menos três quimioterápicos: Glicocorticóide (Prednisona e/ou
dexametasona) o antimitótico vincristina e L-asparaginase e em caso de leucemias
de alto risco, é administrada uma quarta medicação geralmente antraciclina. A
remissão completa das células leucêmicas é conseguida entre um e dois meses
11
após o início do tratamento. Isso ocorre quando os exames de sangue e da medula
óssea (remissão morfológica) e o exame físico (remissão clínica) não demonstram
mais anormalidades (INCA, 2010). As fases seguintes (consolidação, reindução,
manutenção e tratamento dirigido ao sistema nervoso central) possuem a finalidade
de eliminar definitivamente as células leucêmicas malignas da medula óssea (Pui &
Evans, 2006).
Na consolidação são administrados fármacos antimetabólitos, geralmente
metotrexato (MTX) e 6-mercaptopurina (6-MP). Nas primeiras semanas após a
remissão ser obtida, o tratamento da indução é repetido duas vezes em um intervalo
de oito semanas o que é chamado de reindução (repetição dos medicamentos
usados na fase de indução) (INCA, 2010).
O tratamento da manutenção varia de acordo com a severidade da LLA,
em pacientas com alto risco o tratamento é mais intensivo, e em pacientes com
baixo risco são administrados semanalmente metotrexato e diariamente 6mercaptopurina. O tratamento direcionado ao sistema nervoso tem a finalidade de
evitar recidivas de células leucêmicas no sistema nervoso central, e é feito através
de radioterapia ou quimioterapia intensiva (Zago et al., 2005).
Apesar das altas taxas de sobrevida decorrentes do progresso terapêutico
para a LLA nos últimos anos, cerca de 30% das crianças não respondem ao
tratamento
quimioterápico
convencional,
apresentando
sérias
complicações
toxicológicas (Lange et al., 2002; Hutchinson et al., 2003). Outros estudos ainda
serão necessários para melhor compreensão da resposta farmacológica no
tratamento da LLA.
1.2.5.1. GLICOCORTICÓIDES
No tratamento da LLA os glicocorticóides (prednisona e dexametasona)
são administrados no início do tratamento (Indução). O principal mecanismo de ação
dos glicocorticóides é induzir a apoptose das células blásticas, portanto apresentam
12
um papel fundamental no tratamento da LLA, os pacientes que não respondem a
quimioterapia apresentam pior prognóstico de sobrevida (Pizzo et al., 2011).
Os principais efeitos adversos associados ao uso de Glicocorticóides
(prednisona e dexametasona) são: obesidade centrípeta, imunossupressão,
miopatia, oesteonecrose, ulcera péptica, pancreatite, desordens psiquiátricas,
cataratas, hipertensão, déficit de crescimento, diabetes e amenorréia (Pui et al.,
2006; Pizzo et al., 2011).
1.2.5.2. ASPARAGINASE
Asparaginase sintetase (ASNS) é uma enzima que realiza a hidrólise da
asparaginase em ácido aspártico um dos fármacos utilizados na terapia para LLA
(Pui & Evans, 2006). A quimioterapia com acido aspártico parte do principio que
células tumorais não são capazes de converter asparagina por apresentarem baixas
expressão do gene ASNS em contraste com celulas normais . Desta forma forma a
terapia com asparagina em pacientes com LLA força apopitose celular direcionada
as células tumorais. Logo niveis elevados de expressão do gene ASNS em células
tumorais podem contribuir para um mecanismo de resistência a terapia (Cheok et al.,
2009).
As principais manifestações clínicas associadas ao uso da asparaginase
são em decorrência de reações alérgicas ao seu substrato, também são observadas
Coagulopatias, diabetes, encefalopatia grave, trombose de seio cavernoso e
pancreatite hemorrágica (Pui et al., 2006; Pizzo et al., 2011).
1.2.5.3. METOTREXATO
O metotrexato é amplamente utilizado no tratamento da LLA na infância.
O MTX é um inibidor competitivo do ácido fólico, componente essencial na síntese
de purinas e pirimidinas (Jonsson & Kamen, 1991; Cheok et al., 2009).
13
A reação adversa do metotrexato geralmente está relacionada com a
concentração da droga e período de exposição.
Seu principal efeito é
mielossupressão e mucosite gastrointestinal que ocorre 5 a 14 dias após a
administração do fármaco. A nefrotoxicidade pode ocorrer direta ou indiretamente
em nível de túbulos renais e prejudicar a excreção do MTX promovendo a piora de
outros efeitos adversos. A toxicidade hepática é observada através do aumento
transitório de transaminases, hiperbilirrubinemia e em casos raros é observado
fibrose hepática em pacientes que utilizam baixas doses de MTX por longos
períodos. Alterações dermatológicas como dermatite, reação alérgica podem ser
notadas assim como pneumonites e osteopatia incluindo dor óssea, osteoporose
com relatos de risco de fratura. Neurotoxicidade com altas doses de MTX pode
desencadear convulsões, encefalopatia aguda ou crônica (Pui et al., 2006; Pizzo et
al., 2011).
1.2.5.4. 6-MERCAPTOPURINA
A 6-mercaptopurina é um dos principais medicamentos utilizados durante
o tratamento da LLA, consisti em um antimetabólito que faz parte das Tiopurinas,
fármacos utilizados em uma variedade de condições clínicas (Sahasranaman et al.,
2008). O 6-MP é amplamente estudado na literatura, com vários polimorfismos
relacionados ao gene Tiopurina Metiltransferase (TPMT) (Boson et al., 2003; Reis et
al., 2003; Stanulla et al., 2005; Zhou, 2006; Kapoor et al., 2009; Relling et al., 2010).
Mutações nesse gene podem alterar a resposta terapêutica do paciente ao 6-MP,
resultando em sérios efeitos adversos, podendo ser fatal em muitos casos (Relling et
al.,1999).
1.3. MECANISMO DE AÇÃO DA 6-MERCAPTOPURINA
A 6- mercaptopurina é análoga das purinas e atuam como antagonista
das purinas endógenas que são componentes essências do DNA, RNA e de
algumas coenzimas. O 6-MP é um análogo da adenina, uma das bases necessárias
14
para a biossíntese do ácido nucléico. Portanto age como antimetabólito e interfere
na síntese dos ácidos nucléicos de células em proliferação (Swann et al., 1996;
Inamochi et al., 1999; Rang et al., 2001).
Como a maioria das bases púricas a 6- mercaptopurina requerer passar
por um processo de bioativação para ter os seus compostos citotóxicos ativos
(Sandborn et al., 1999; Chabner et al., 2001). A conversão da 6-MP em nucleotídeos
análogos da tioguanina é um processo gradativo e requer a participação de algumas
enzimas (Figura 4).
O 6-MP sofre ativação metabólica, especialmente no fígado e no
intestino, e após administração oral as transformações químicas sofridas pela droga
ocorre por uma via com três passos competitivos. O primeiro metabolismo é
realizado pela enzima Xantina Oxidase (XO) que converte a 6-MP em ácido tioúrico
(6-TU) um composto inativo, que pode ser observado na urina e no plasma após a
administração da mercaptopurina (Hamilton & Elion, 1954; Elion et al., 1963).
O início da ativação é feito pela enzima Hipoxantina-guanina fosforibosil
transferase (HGPRT) resultando em nucleotídeos citotóxicos (TGN) como o 6tioguanina (6-TGN) responsável pela atividade imunossupressora (Paterson & Tidd,
1974; Lennard & Singleton, 1992).
A terceira via metabólica da 6-MP é realizado pela enzima TPMT
formando compostos inativos chamados metilmercaptopurina (MMP) (Chalmers et
al., 1969; Tay et al., 1969; Elion, 1989; Krynetski &
Evans, 1999). Uma via
alternativa para a citotoxicidade é feita pela enzima TPMT por meio da reação de
metilação da tiomecaptopurina (TIMP) que leva a formação dos 6-TGN. A formação
da 6-metil tioinosina 5’ monofosfato (6-MeTIMP) a partir da TIMP é um processo
importante uma vez que este composto é um potente inibidor da síntese de novas
purinas impedindo, portanto, o ciclo celular (Chalmers et al., 1969; Tay et al., 1969;
Elion, 1989; Krynetski & Evans, 1999).
15
Figura 4. Mecanismo de metabolização do fármaco 6-MP. 1, 2 e 3 evidenciam os passos da via
metabólica da 6-MP. IMPD (Inosina monofosfato desitrogenase), TXMP (tioxantina monosfosfato),
GMPS (Guanosina monofosfato sintase) e TGMP (Tioguanina monofosfato). Fonte: SILVA, M. R.
Polimorfismo do gene da Tiopurina Metiltransferase (TPMT) em uma população de crianças e
adolescentes com Leucemia Linfocítica Aguda (LLA). Dissertação de Mestrado. Belo Horizonte.
Universidade Federal de Minas Gerais, 2007, 124p.
O principal mecanismo de ação do fármaco 6-MP é a incorporação dos
metabólitos 6-TGN ao DNA e RNA, esses compostos são incorporados ao DNA pelo
pareamento incorreto com a timina, essa incorporação anormal é reconhecida pelo
sistema de reparo das células resultando na parada do ciclo celular das células em
proliferação (Swann et al., 1996; Giverhaug et al., 1999).
A deficiência no gene TPMT leva a um acumulo excessivo de
nucleotídeos tioguanina- TGNs nos tecidos hematopoiéticos, levando a uma grave
toxicidade que pode ser observada em pacientes tratados com esse fármaco (Evans
et al., 1991; Relling et al., 1999; Zhou, 2006).
16
1.3.1. EFEITOS ADVERSOS AO FÁRMACO 6-MERCAPTOPURINA
É ampla a descrição na literatura especializada de diferentes efeitos
adversos associados à administração da 6-MP (Lennard et al., 1997; Present et al.,
1989; Kirschner, 1998; Dervieux et al., 1999; Dubinsky, 2003; Herrlinger et al., 2004;
Marinaki et al., 2004; Sandborn et al., 2004; Sanderson et al., 2004).
O aparecimento de diferentes efeitos adversos e a intensidade das
manifestações desses efeitos pode sofrer variações de indivíduo para indivíduo, em
decorrência do nível de atividade do gene TPMT. Pacientes que apresentam a
atividade baixa ou intermediária da enzima TPMT possuem grande risco de
desenvolver toxicidade, quando administrado doses padrões do 6-MP, para esses
pacientes são administrados doses reduzidas desse medicamento, para que possam
tolerar a terapia (Lennard et al ., 1990; Lennard et al., 1993; Evans et al., 2001; Aricó
at al., 2005; Cheok & Evans, 2006).
O 6-MP é amplamente utilizado no tratamento da leucemia linfoblástica
aguda durante a fase de manutenção (Pui & Evans, 2006; INCA, 2010). O principal
efeito adverso associado ao 6-MP é a mielotoxicidade, seguida de neutropenias. A
6-MP é hepatotóxico e a incidência de hepatotoxicidade em pacientes é variável e
pode ocorrer na administração de qualquer dosagem, mais frequentemente quando
se excede a dose recomendada diariamente de 50 mg/m2 (Aricó et al., 2005; Cheok
& Evans, 2006).
Pacientes com leucemia aguda têm maior predisposição para desenvolver
neutropenias geralmente associado à quimioterapia agressiva durante o tratamento
por agentes antineoplásicos (Pizzo, 1993; Hernandez et al., 2000; Donowitz et al.,
2001).
Em pacientes com LLA observa-se com mais frequência neutropenia
quando a contagem de neutrófilo é inferior a 500/mm³. Além da neutropenia,
observam-se alterações na função fagocítica e dano da barreira da mucosa
resultando em mucosite (Corey & Boeckh, 2002).
A neutropenia associada ao tratamento de leucemia é a principal causa
relacionada à infecções, com um risco maior para bacteremia e sepse (Noskin et al.,
1997). As infecções decorrentes da neutropenia são as principais causas de mortes
17
em crianças com câncer em tratamento quimioteráptico (Brown, 1993; Paganini,
1999; Ray-Coquard, 2001; Miranda et al., 2002).
Os principais efeitos adversos relatados em diferentes publicações,
associados com o uso do 6-MP são: Neutropenia, mielossupressão, náuseas,
episódios de vômito, icterícia, anorexia, febre, erupções cutâneas, pancreatite,
hepatotoxicidade,
leucopenia
leve,
sintomas
gripais,
trombocitopenia,
granulocitopenia e anemia, (Lennard et al., 1997; Present et al., 1989; Kirschner,
1998; Dervieux et al., 1999; Dubinsky, 2003; Herrlinger et al., 2004; Marinaki et al.,
2004; Sandborn et al., 2004; Sanderson et al., 2004).
1.4. LELUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA NO ESTADO DO PARÁ
Silva et al. (2011) realizaram um estudo de levantamento de dados de 92
crianças portadoras de LLA na infância atendidos período de Janeiro de 2005 a
Janeiro de 2008 no serviço de quimioterapia no Hospital Ophir Loyola, referência no
tratamento de câncer da região Norte do Brasil. O estudo observou taxas de cura
em torno de 34% em crianças submetidas ao tratamento para LLA, este índice é
considerado baixo quando comparado a outras regiões nacionais e mesmo outros
países onde a taxa de cura para LLA é de aproximadamente 80% (Pui et al., 2000;
Pui & Evans, 2006; Silva et al., 2011). Os protocolos de quimioterapia empregada no
tratamento das acriança portadoras de LLA atendidas no Hospital Ophir Loyola foi a
mesma utilizada em outros centros de tratamento de leucemias tanto nacionais
(região Sul e Sudeste do Brasil) quanto internacionais (em populações européias e
americanas).
O estudo de Silva et al. (2011) demonstrou a procedência e número de
casos de pacientes pediátricos com LLA no estado do Pará, 59% das crianças
provem do interior do Pará, 30% da região metropolitana de Belém (Figura 5).
18
Figura 5. Procedência e números de casos por município de pacientes pediátricos portadores
de LLA no estado do Pará. Fonte: SILVA, W.L.; ALMEIDA, G.V.; HAMOY, M. &
WANDERLEY, A.V. Perfil clínico dos efeitos tóxicos oriundos da quimioterapia e sobrevida
em pacientes pediátricos portadores de Leucemia Linfoblástica Aguda em municípios da
Região Amazônica. Simpósio de Hematologia, Belém, PA: UFPA, 2011.
No estudo de Silva et al. (2011) foi descrito os aspectos tóxicos da terapia
submetida aos pacientes de LLA Hospital Ophir Loyola, segundo os critérios do
Instituto Nacional de Câncer dos Estados Unidos (NCI/NIH). Observou-se que a
maior incidência de toxicidades nos Pacientes com LLA provinham de Neutropenia e
Infecções, conforme evidenciado pela Figura 6. O índice de mortalidade dos
pacientes com LLA nesse estudo foi de 55,5 %.
19
Figura 6. Frequência de Toxicidade em pacientes pediátricos portadores de LLA provenientes
do estado do Pará. Fonte: SILVA, W.L.; ALMEIDA, G.V.; HAMOY, M. & WANDERLEY, A.V.
Perfil clínico dos efeitos tóxicos oriundos da quimioterapia e sobrevida em pacientes
pediátricos portadores de Leucemia Linfoblástica Aguda em municípios da Região
Amazônica. Simpósio de Hematologia, Belém, PA: UFPA, 2011.
Existem lacunas genéticas a serem pesquisadas no comportamento
clínico dos pacientes portadores de leucemia linfoblástica aguda na região Norte do
Brasil em resposta a terapêutica oncológica.
A hipótese principal do presente estudo envolve a variabilidade genética
em gene de resposta ao quimioterápico 6-MP a qual pode se explicar, em parte, a
baixa taxa de sobrevida de pacientes portadores de LLA. Pesquisas em
farmacogenética podem contribuir para melhor caracterizar o perfil de resposta
farmacológica desses pacientes e dessa forma, contribuir para um melhor
prognóstico terapêutico.
20
1.5. FARMACOGENÉTICA
Em todo mundo é conhecido a grande variabilidade na eficácia e na
toxicidade causadas pelos medicamentos usados no tratamento de diferentes
enfermidades (Ingelman-Sundberg, 2001). Diversos fatores tais como; sexo, idade,
etnia, fumo, etilismo e variações genéticas podem influenciar na resposta de um
paciente ao medicamento (Evans & Johnson, 2001; Sadee & Dai, 2005). Neste
contexto a farmacogenética se enquadra por estudar como as diferenças genéticas
influenciam na resposta a agentes farmacológicos (Evans et al., 2001; McLeod &
Evans, 2001; Meyer, 2004).
A abordagem tradicional da farmacogenética baseia-se em estudar
polimorfismos na sequência de DNA de genes que, provavelmente, afetam a
resposta aos medicamentos. Portanto, o objetivo dos estudos farmacogenéticos é
buscar uma terapia individualizada que possa maximizar a eficácia dos
medicamentos e minimizar os efeitos colaterais associados aos fármacos
(Weinshilboum & Wang, 2004).
É importante que em estudos de associação a população estudada seja
homogênia com relação a ancestralidade. Em populações miscigenadas essa
homogeneidade não é possivel devido a elevada estratificação populacional. Logo
compreender a diversidade genética das populações é importante em estudos
farmacogenéticos. Desta forma, investigar a diversidade de polimorfismos
farmacogenéticos em grupos miscigenados é importante uma vez que a maioria dos
estudos
são
realizados
em
populações
europeias.
As
investigações
farmacogeneticas em diferentes grupos humanos podem identificar populações que
podem se beneficiar mais de um fármaco, ou indentificar efeitos colaterais que não
são vistos em outras populações (Suarez-Kurtz, 2005).
21
1.5.1. FARMACOGENÉTICA APLICADA AO CÂNCER
A quimioterapia emprega medicamentos ou substâncias químicas, que
podem está em diferentes combinações, para matar ou lesar células cancerígenas.
Essas substâncias interferem no crescimento das células atuando de maneiras
distintas. A maioria dos medicamentos utilizados na quimioterapia não são seletivos,
ou seja, afetam não só as células cancerígenas mas também as células normais. A
baixa seletividade dos fármacos antineoplásicos contribui para a grande toxicidade
que leva a uma frequente morbidade e mortalidade decorrente dos tratamentos, uma
vez que os alvos moleculares dos quimioterápicos também estão presentes em
células não-tumorais (Reis, 2006).
A aplicação da farmacogenética na área
oncológica é um processo complexo, por que envolve o difícil manejo clínico da
quimioterapia aplicada a dois genomas: O do indivíduo (representada por mutações
germinativa) e o do tumor (representada por mutações somáticas) este ultimo
apresenta um papel crítico na resposta a terapia antineoplásica (Reis, 2006; Wang
et al., 2011).
As variações farmacogenéticas em ambos os genomas podem interferir
na reposta terapêutica, nesse quesito a farmacogenética pode ser aplicada na
identificação de marcadores moleculares que ajudem na otimização de fármacos,
dose e duração de tratamentos, fornecendo conhecimentos para o desenvolvimento
de novas terapias (Eichelbaum et al ., 2006; Wang et al., 2011).
Existe uma grande variedade de fármacos em que a farmacogenética
pode contribuir para o aprimoramento da terapia oncológica, para esses
medicamentos a FDA (Food and Drug Administration) recomenda a utilização de
testes farmacogeneticos especificos capazes de predizer a resposta do paciente ao
medicamento (Wang et al., 2011). Desta forma é possivel maximizar a eficacia
terapeutica e evitar efeitos tóxicos decorrentes da terapia.
Diversos trabalhos no mundo associam polimorfismos genéticos, em
especial SNP (Polimorfismos de Nucleotídeos Únicos), em genes de metabolização
de drogas a resposta terapêutica. (Ulrich et al., 2003; Abraham et al., 2006; Stearns
et al., 2008; Danesi et al., 2008). A identificação de genes (e de formas alternativas
desses genes) responsáveis por efeitos adversos em resposta aos fármacos pode
22
ser muito útil no estabelecimento de políticas de saúde pública e no desenho e
interpretação de ensaios clínicos (Suarez-Kurtz, 2005).
A Figura 7 demonstra os
principais modelos
farmacogenéticos
aprovados pela FDA utilizados na pratica clínica para terapia antineoplasicas . Entre
esse marcadores a FDA recomenda a investigação de polimorfismos no gene TPMT
associado a resposta farmacologica do 6-MP e Tioguanina.
Tipo de Biomarcadores e Fármacos associados
Biomarcador com efeito farmacocinético
TPMT
Mercaptopurina
Tioguanina
UGT1A1
Irinotecano
Nilotinib
Biomarcador com efeitos farmacodinâmicos
EGFR
Cetuximab
Erlotinib
Gefitinib
Panitumumab
KRAS
Cetuximab
Panitumumab
ABL
Imatinib
Dasatinibe
Nilotinib
C-Kit (Kit)
Imatinib
23
HER2 (ERBB2)
Lapatinib
Trastuzumab
RECEPTOR DE ESTROGÊNIO
Tamoxifeno
Figura 7. Fármacos aprovados pela FDA referentes a marcadores farmacogenômicos. Fonte:
WANG, L.; MCLEOD. H. L. & WEINSHILBOUM, R. M. Genomics and drug response. N Engl
J Med, 364: 1144-1153. 2011.
1.5.2. FARMACOGENÉTICA DO 6-MP
Um dos melhores exemplos da aplicação da farmacogenética na medicina
clínica é caracterizado pelos polimorfismos presentes no gene Tiopurina
Metiltransferase que influencia tanto na toxicidade quanto na eficácia do tratamento
terapêutico em diferentes fármacos (Weinshilboum et al., 1999).
A Tiopurina metiltransferase é uma enzima citosólica que participa da
metabolização de vários quimioterápicos comumente usados no tratamento de
diversas doenças. Entre os medicamentos metabolizados pela TPMT estão os
análogos de purina como a azatioprina (AZA), 6-mercaptopurina (6-MP), e 6tioguanina (6-TG) a estrutura química das tiopurinas é demonstrada na Figura 8
(Weinshilboum & Woodson, 1983). Esses fármacos são amplamente utilizados em
uma variedade de condições clínicas, sendo comumente utilizadas no tratamento de
doenças
inflamatórias
crônicas
como
inflamações
intestinais,
neoplasias
hematológicas como leucemias, distúrbios auto-imunes e em receptores de
transplantes de órgãos (Paterson & Tidd, 1975; Zimm et al., 1983; Lennard
&
Singleton, 1992).
O 6-MP é um dos quimioterápicos mais utilizados em todo mundo no
tratamento de leucemia linfoblástica aguda na infância. O 6-TP é recomendado no
tratamento de leucemia mielóide aguda e no tratamento mais intensivo de leucemia
linfoblástica aguda em crianças. AZA é amplamente utilizada no tratamento de
doenças inflamatórias intestinas, hepatite auto-imune, artrite reumatóide e em
receptores de transplantes de órgãos (Johnson et al., 1995; Shapiro et al., 2005).
24
Figura 8. Estrutura química dos fármacos tiopurina. Fonte: Modificado de: SHUFENG,
ZHOU. Clinical Pharmacogenomics of Thiopurine S-methyltransferase. Current Clinical
Pharmacology, 1: 119-128. 2006.
A metabolização desses fármacos ocorre a partir de um processo de Smetilação catalisada pela enzima TPMT (Weinshilboum & Woodson, 1983).
Polimorfismos genéticos presentes na sequência de DNA do gene TPMT controlam
os níveis de atividade dessa enzima nos tecidos humanos (Weinshilboum & Sladek,
1980).
Pacientes com LLA, submetidos a tratamento com 6- MP, que possuem
atividade baixa ou intermediária dessa enzima apresentam risco elevado de
desenvolver toxicidade hematopoiética quando submetidos a doses padrões desses
medicamentos, enquanto os que apresentam uma alta atividade dessa enzima estão
sujeitos a uma ineficácia terapêutica (Lennard & Lilleyman, 1989; Lennard et al.,
1990; Weinshilboum et al., 1999). Portanto, polimorfismos no gene TPMT
influenciam na toxicidade e na eficácia terapêutica de diversos agentes
metabolizados por essa enzima (Elion, 1967).
É importante identificar se o paciente que será submetido a um
tratamento que envolva a 6-MP apresenta metabolização intermediária ou deficiente,
para que haja uma redução da dose a ser administrada (Lennard et al., 1990;
Lennard et al., 1993; Relling et al ., 1999; Evans et al., 2001).
São relatados na literatura diversos medicamentos que podem influenciar
na resposta da atividade da enzima TPMT quando co-administrados com os
fármacos tiopurinas. Por exemplo, Aspirina em doses terapêuticas pode levar a
inibição da TPMT, assim como sulfassalazina e seus metabólitos, e a olsalazina são
25
potentes inibidores da TPMT. Os diuréticos, furosemida, bendroflumetiazida e
triclormetiazida também possuem efeito inibitório sobre TPMT (Glauser et al., 1993;
Szumlanski & Weinshilboum, 1995; Lysaa et al.,1996; Lewis et al.,1997; Lennard et
al.,1998).
1.6. GENE TPMT- POLIMORFISMOS GENÉTICOS
A enzima TPMT é responsável pela metabolização do fármaco 6-MP.
Diversas investigações na literatura especializada indicam que polimorfismos no
gene TPMT influenciam intensamente a atividade da 6-MP no organismo levando a
sérios efeitos adversos. Pacientes que apresentam atividade baixa dessa enzima
estão sujeitos a sérias toxicidades hematopoiéticas devido ao acúmulo de
compostos metabólitos ativos de 6-TGN (Relling et al.,1999; Krynetski & Evans,
1999; McLeod et al., 2000; Cheok & Evans, 2006).
Diversos estudos relatam que existe uma grande variação inter individual
na atividade do TPMT. A atividade desse gene é herdada como uma característica
autossômica co-dominante e os seus polimorfismos genéticos já foram descritos na
maioria das grandes populações, conforme evidenciado na Tabela 1 (Weinshilboum,
2001; Mcleod & Siva, 2002).
26
Tabela 1. Frequência das variantes alélicas do TPMT em diferentes grupos étnicos.
Grupos étnicos
Número
*2
*3A
*3B
*3C
Americanos Caucasianos
282
0,2
3,2
**ND
0,2
Britânicos Caucasianos
398
0,5
4,5
ND
0,3
Franceses Caucasianos
382
0,5
5,7
ND
0,8
Franceses Caucasianos
932
0,7
3
0
0,4
Alemães Caucasianos
2,428
0,5
8,6
0
0,8
Poloneses Caucasianos
716
0,4
2,7
0
0,1
Suecos Caucasianos
1600
0,06
3,75
0,13
0,44
Noruegueses Caucasianos 132
0
3,4
0
0,3
Noruegueses Saami
388
0
0
0
3,3
Búlgaros Caucasianos
626
0,16
2,24
0
0,16
Americanos Afro –
descendestes
248
0,4
0
ND
2,4
Argentinos
294
0,7
2,1
0
0
Ganeses
434
0
0
ND
7,6
Quenianos
202
0
0
ND
5,4
Chineses
384
0
0
ND
2,3
Chineses
206
0
0
0
1,0
Japoneses
1,044
0
0
0
1,6
Tailandeses
400
0
0
0
4,75
Asiáticos do Sudoeste
198
0
1
ND
0
Asiáticos do Sudeste
1,098
0
0
ND
1
Brasileiros
408
2,2
1,5
0,2
1
Crianças Chinesas
426
0
0
0
0,2
27
Tabela 1. Continuação
Grupos étnicos
Número
*2
*3A
*3B
*3C
Colombianos
280
0,4
3,6
0
0
Egípcios
400
0
0,003
0
0, 0013
** ND: Não Identificado. Fonte: SAHASRANAMAN, S.; HOWARD, D. & ROY, S. Clinical
pharmacology and pharmacogenetics of thiopurines. Eur J Clin Pharmacol, 64:753–
767.2008
Aproximadamente 90% da população branca e afro-descendente
possuem uma alta atividade da enzima devido à homozigose para alelos de alta
atividade da TPMT, 6% a 11% apresentam uma atividade intermediária devido à
heterozigose do locus TMPT e 0,33% apresenta a baixa atividade da enzima TPMT
devido à homozigose para alelos de baixa atividade (Weinshilboum & Sladek, 1980;
Lennard et al., 1990; Mcleod et al., 1994; Gisbert et al., 2007). A Figura 9 demonstra
a distribuição populacional da atividade da TPMT.
Figura 9. Distribuição Populacional da Atividade da enzima TPMT. Individos que apresentam
atividade enzimática alta apresentam o genótipo homozigoto selvagem (S/S). Individos que
apresentam atividade intermediária apresentam genótipo heterozigoto (S/M). Individuos que
apresentam atividade enzimática baixa ou indetectável apresentam dois alelos mutantes
(M/M). Fonte: REIS, M. Farmacogenética aplicada ao câncer. Quimioterapia Individualizada e
especificidade molecular. Simpósio: Farmacogenética, 39: 577-586. 2006.
28
A TPMT é uma enzima citosólica humana presente na maioria dos
tecidos, como coração, células sanguíneas, placenta, pâncreas, intestino e fígado. O
gene TPMT está localizado no cromossomo 6p 22.3 e possui aproximadamente
25Kb com 10 exons e 9 introns (Krynetski et al., 1997).
As
alterações
na
atividade
do
gene
TPMT
são
decorrentes
predominantemente de polimorfismos do tipo SNP. Atualmente já foram descritos
mais de 25 variantes alélicas do TPMT. O alelo selvagem é denominado de TPMT*1
e os indivíduos que apresentam uma alta atividade da enzima TPMT são
homozigotos para este alelo. A mutação 474C, presente no Exon 7 do gene TPMT
que caracteriza o alelo TPMT*1S corresponde a uma mutação silenciosa e também
caracteriza
uma
alta
atividade
enzimática
da
TPMT.
Essa
mutação
foi
frequentemente encontrada em populações Norte Portuguesas, com frequência de
21% (Alves et al., 1999).
Os alelos mutantes mais frequentemente encontrados em diversas
populações estudadas incluem o TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3B, TPMT*3C
(Krynetski et al., 1995; Tai et al., 1997; Loennechen et al., 1988). Esses alelos já
foram descrito em cerca de 80% a 95% das populações brancas, afro-descendentes,
africanas e asiáticas estudada com atividade baixa e/ou intermediária para enzima
TPMT (Yates et al., 1997; Eichelbaum et al., 2006).
O alelo mutante TPMT*2 é definido por uma mudança de um único
nucleotídeo, G >C, na posição 238 do gene. Essa modificação leva a uma mudança
do aminoácido Alanina por Prolina no códon 80, o que resulta em uma redução 100
vezes da atividade da TPMT em relação ao alelo selvagem (Krynetski et al., 1995).
O alelo TPMT*3A é caracterizado por duas mutações do tipo SNP (G460 A e
A719G) que resulta em mudança do aminoácido formado no códon 154 (mudança
da Alanina por Treonina) e no códon 240 (mudança da Treonina por Cisteína) (Tai et
al., 1996). O alelo TPMT*3B resulta de uma mutação no códon 154 (mudança da
Alanina por Treonina) e o alelo TPMT*3C resulta em uma mudança no códon 240
(mudança da Treonina por Cisteína) (Krynetski et al., 1995). A Figura 10 mostra as
principais variantes alélicas no locus TPMT.
29
Figura 10. Variantes alélicas predominantes do locus TPMT. O alelo selvagem TPMT*1
codifica para alta atividade enzimática. Os alelos mutantes TPMT*2, *3A, *3B e *3C codificam
para baixa atividade da enzima. Fonte: Modificado de: REIS, M. Farmacogenética aplicada
ao câncer. Quimioterapia Individualizada e especificidade molecular. Simpósio:
Farmacogenética, 39: 577-586. 2006.
Existe um grande número de alelos mutantes raros do gene TPMT (TPMT
* 3D, *4,* 5, * 6, * 7,* 8, * 10, * 11, * 12, * 13, * 14, * 15, * 16 e * 19) que já foram
descritos na literatura. Desses alelos a variante TPMT*4 resulta de uma
transposição (G>A) na junção do intro 9-exon 10, que interrompe o nucleotídeo final
do intron 3’ da sequência (Otterness et al., 1997; Otterness et al., 1998; HamdanKhalil et al., 2005; Hon et al., 1999).
O alelo TPMT*8 apresenta um SNP (G644A) que resulta na mudança de
um aminoácido no códon 215 (Arg>His) (Hon et al., 1999). A Tabela 2 descreve as
25 variantes alélicas do gene TPMT mais descritas na Literatura.
30
Tabela 2. Alelos da Tiopurina metiltransferase e fenótipos associados à atividade da enzima
TPMT.
Alelos do Gene
TPMT
Alteração de nucleotídeo
Mudança de aminoácido
Fenótipo
associado
*1
------
------
Alta
*2
G238C
Ala 80 Pro
Baixa
*3A
G460A
Ala 154 Ter
Baixa
A719G
Tri 240 Cis
*3B
G460A
Ala 154 Ter
Baixa
*3C
A719G
Tri 240 Cis
Baixa
G292T
Glu 985 TOP
G460A
Ala 154 Tri
A719G
Tri 240 Cis
*4
G19 (-1) A
------
Baixa
*5
T156C
Leu 49 Ser
Intermediária
*6
A539T
Tri 180 Fen
Baixa
*7
T681G
His 227Gln
Intermediária
*8
G644A
Arg 215 His
Intermediária
*9
A356C
Lis 119 Tri
------
*10
G430C
Gli 144 Arg
------
*11
G395A
Cis 132 Tri
Baixa
*12
C374T
Ser 125 Leu
------
*13
A83 T
Glu 28 Val
------
*14
A1G
Met 1 Val
Baixa
*15
Perda dos nucleotídeos 419494 (Exon 7)
Perda dos aminoácidos de
140 a 165
Baixa
*16
G 488 A
Arg 163 His
Intermediária
*17
C 142 G
Gln42 Glu
Intermediária
*18
C121A
Gli 71 Arg
Intermediária
*19
A365TC
Lis 122 Tri
Baixa
*20
A712 G
Lis 238 Gli
Intermediária
*3D
Intermediária
31
Tabela 2. Continuação
Alelos do Gene
TPMT
Alteração de nucleotídeo
Mudança de aminoácido
Fenótipo
associado
*21
C205G
Leu 69 Val
Intermediária
*22
G488C
Arg 163 Pro
Intermediária
Fonte: SALAVAGGIONE, O. E.; WANG, L.; WIEPERT, M.; YEE, V.C. & WEINSHLBOUM, R.M.
Thiopurine S- methyltransferase pharmacogenetics: Variant allele function and comparative genomics.
Pharmacogenet genomics, 15: 801-815. 2005.
1.7. DOSAGEM RECOMENDADA DE 6-MP
O 6-MP possuem um papel único no tratamento da Leucemia Linfoblática
Aguda. A abordagem para ajuste de dosagem com base na atividade enzimática da
TPMT pode variar dependendo da indicação clínica da doença (Aricó et al., 2005).
As doses convencionais de partida utilizado Tiopurinas, como 6-MP, são
geralmente altas, uma vez que estas doses foram derivadas de ensaios
pensadamente ponderados para a grande parcela da população (cerca de 90 %)
que possuem alelos do TPMT com atividade enzimática alta (alelo tipo selvagem)
(Lennard & Lilleyman, 1996; Stocco et al., 2009; Relling et al., 2010).
Para os pacientes com LLA com atividade enzimática da TPMT alta a
dose incial de 6-MP tendem a ser elevadas (75 mg/m2 de 6-MP). Doses iniciais
menores que o normal devem ser administrados em pacientes heterozigotos e em
pacientes homozigotos deficientes as doses inicias de 6-MP devem ser reduzidas
em pelo menos 10 vezes (Schmiegelow et al.,2009; Relling et al., 2010).
A abordagem de redução de dosagem para heterozigotos e homozigotos
deficientes tem diminuido o risco de toxicidade aguda em pacientes com LLA,
fortalecendo a necessidade de empregar ensaios clínicos para estudar o estado
enzimático do TPMT nesses pacientes, independentemente da raridade da doença
e/ou dos polimorfismos no gene TPMT (Relling et al., 2010).
32
A Tabela 3 evidencia as doses recomendadas de 6-MP para pacientes
com LLA
de acordo com a atividade enzimática da TPMT, ressaltando as
implicações clínicas de acordo com o fenótipo observado (Relling et al., 2010).
Tabela 3. Dosagem recomendada de 6-Mercaptopurina de acordo com o fenótipo do TPMT.
Fenótipo
(Genótipo)
Homozigotos
tipo selvagem
ou normal
atividade, alta
(dois alelos
funcionais * 1)
Heterozigoto
ou atividade
intermediária
(um alelo
funcional - * 1,
além de um
alelo não
funcional –
* 2, * 3A, * 3B,
*3C,*8, ou * 4)
Exemplos de
haplótipos
*1/*1
*1/*2,
*1/*3A,
*1/*3B,
*1/*3C,
*1/*4,*1/*8
Medidas
farmacológicas:
Implicações para
mercaptopurina
Concentrações
mais baixas de
metabólitos TGN
Concentrações
moderadas a
elevadas de
metabólitos TGN
Recomendações de
dosagem para
mercaptopurina
Começar com dose inicial
normal (por exemplo, 75
2
mg/m /d ou 1,5 mg / kg /
d) e ajustar doses de
mercaptopurina (e de
qualquer outra terapia
mielossupressora)
sem
qualquer ênfase especial
na 6-MP em comparação
com outros agentes.
Começar
com
doses
reduzidas (início em 3070% da dose total: por
2
exemplo, a 50 mg/m /d ou
0,75 mg / kg / d) e ajustar
doses de MP com base no
grau de mielossupressão e
orientações de doenças
específicas. Naqueles que
necessitam
de
uma
redução da dose com base
em mielossupressão, a
dose mediana pode ser
2
40% menor (44 mg/m ) do
que tolerado em pacientes
do tipo selvagem (75
mg/m2). Na definição de
mielossupressão,
e
dependendo de outras
terapias, a ênfase deve ser
na
redução
mercaptopurina
sobre
outros agentes.
Classificação das
recomendações
Altamente
recomendado
Altamente
recomendado
33
Tabela 3. Continuação
Fenótipo
(Genótipo)
Variante
homozigótica,
atividade
mutante, baixa
ou deficiente
(dois alelos
não-funcionais
–
* 2, * 3A, *3B,
*3C,*8 ou * 4).
Exemplos de
haplótipos
3A/*3A,
*2/*3A,
*3C/*3A,
*3C/*4,
*3C/*2,
*3A/*4
*3A/*8
Fonte: www.pharmgkb.org
Medidas
farmacológicas:
Implicações para
mercaptopurina
Concentrações
extremamente
elevadas de
metabólitos TGN
Recomendações de
dosagem para
mercaptopurina
Para tratamento da LLA,
começar
com
doses
drasticamente reduzidas
(reduzir a dose diária em
10 vezes e reduzir a
frequência de três vezes
por semana em vez de
diariamente, por exemplo,
10 mg/m2/d dado apenas
3 dias / semana) e ajustar
as doses de MP com base
no
grau
de
mielossupressão e doenças
de orientações específicas.
mielossupressão, a ênfase
deve ser na redução
mercaptopurina
sobre
outros agentes.
Classificação das
recomendações
Altamente
recomendado
34
1.8. JUSTIFICATIVA
A Leucemia linfóide aguda representa mais de 80% dos casos de
leucemias infantis, sendo a região Norte do Brasil a que apresenta maiores
percentuais para esse tipo de neoplasia, acima de 39%. Embora nos últimos anos
as taxas de sobrevida dos pacientes com LLA tenham aumentando devido ao
progresso terapêutico, cerca de 30% das crianças não respondem ao tratamento
quimioterápico convencional, apresentando sérias complicações toxicológicas.
Levantamentos epidemiológicos realizados em pacientes tratados para LLA na
região Norte do Brasil mostrou que cerca de 70% dos pacientes oriundos dessa
região não respondem ao tratamento quimioterápico convencional, o que contribui
para um maior índice de mortalidade nessa região se comprado com outras regiões
do Brasil. Os estudos de como as variações genéticas do gene TPMT podem
interferir na resposta ao medicamento 6-MP, um dos fármacos mais importantes
usados no tratamento da LLA, é de extrema importância para o desenvolvimento de
novas drogas e ajuste da dosagem recomendada a esses pacientes, o que
melhoraria a sobrevida das pessoas submetidas ao tratamento da LLA, pela
diminuição dos efeitos adversos decorrentes da terapia convencional. Para predizer
a frequência desses polimorfismos relacionados a respostas aos fármacos,
pesquisas farmacogenéticas necessitam serem empregadas em populações
brasileiras miscigenadas, como é caso das populações da região Norte do Brasil. O
presente trabalho pretende investigar a frequência dos polimorfismos genéticos no
gene TPMT em uma população de pacientes com LLA em tratamento com 6-MP e
em uma população de pessoas sadias, usadas como controle no estudo, da cidade
de Belém, região Norte do Brasil. É válido ressaltar que o presente trabalho é
primeiro, realizado na região Norte do Brasil a investigar polimorfismos
farmacogenéticos do gene TPMT em resposta ao fármaco 6-MP, em pacientes com
LLA.
35
1.9. OBJETIVOS
1.9.1. OBJETIVO GERAL
Investigar a frequência das variantes alélicas do gene Tiopurina
Metiltransferase; TPMT*1S (474T>C), TPMT*2 (238G>C), TPMT* 3A (460G>A e
719A>G), TPMT*3B (460G>A), TPMT*3C (719A>G), TPMT*4 (G_1A), TPMT*8
(644G>A)
em 24 pacientes com Leucemia Linfóide Aguda, tratados com 6-
mercaptopurina, no Estado do Pará, com a finalidade de correlacionar esses
polimorfismos com os dados clínicos desses pacientes.
1.9.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Padronizar um protocolo de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) e
sequenciamento direto para a investigação de 6 polimorfismos do gene TPMT
474T>C, 238G>C, 460G>A , 719A>G, G_1A, 644G>A.
2. Estimar o grau de desequilíbrio de ligação, para identificar os haplótipos derivados
desses polimorfismos nas amostras de pacientes com leucemia linfóide aguda e na
população de Belém-PA.
3. Investigar e comparar a distribuição de frequências dos alelos TPMT*1S , TPMT*2,
TPMT* 3A, TPMT*3B, TPMT*3C, TPMT*4 e TPMT*8 no gene TPMT em pacientes com
LLA tratados com o quimioterápico 6-MP.
4. Investigar e comparar a distribuição de frequências dos alelos TPMT*1S, TPMT*2,
TPMT* 3A, TPMT*3B, TPMT*3C, TPMT*4 e TPMT*8 no gene TPMT em 49 indivíduos
sadios representativos da população de Belém-PA
5. Investigar possíveis associações dos haplótipos com a heterogeneidade clínica
dos pacientes com LLA, de forma a verificar se ocorre o efeito sinérgico entre essas
mutações, em associação com a resposta a farmacogenética da 6-MP.
6. Investigar a associação entre o genótipo do paciente com LLA e os dados clínicos
e laboratoriais desses pacientes.
36
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. AMOSTRAS ESTUDADAS
Na investigação foi utilizada uma população de 24 pacientes com idade
inferior a 18 anos em tratamento convencional para Leucemia Linfóide Aguda,
atendidos no ano de 2011 no Hospital Ophir Loyola, referência no tratamento de
câncer da região Norte do Brasil, localizado na cidade de Belém, no Estado do Pará.
Os dados clínicos foram obtidos por meio de pesquisa em prontuários cedidos pelo
serviço de arquivo médico do hospital.
O
grupo
controle
do
estudo
foi
constituído
de
49
indivíduos
representativos da população investigada de Belém-PA.
Durante o estudo foi realizado um contato prévio com cada indivíduo ou
responsável pelo paciente, onde foram fornecidas informações acerca do objetivo da
pesquisa, além do formulário para assinatura do consentimento livre e esclarecido
para posterior coleta do material utilizado para a pesquisa.
2.2. EXTRAÇÃO DE DNA
Para o isolamento do DNA genômico foram utilizados como material
sangue periférico. O sangue total foi obtido no momento das coletas de rotina para
realização de hemogramas. Portanto o sangue não foi coletado exclusivamente para
a
realização
do
estudo.
O
anticoagulante
utilizado
foi
o
EDTA
(etilenodiaminotetracetato).
O material genético foi extraído a partir de uma amostra de 300 µL do
sangue total pelo método convencional com fenol-clorofórmio e precipitação com
etanol, conforme descrito por Sambrook et al. (1989).
O sangue foi processado inicialmente com tampão salino PBS (NaCl 0,14
M; KCl 2,7 mM; Na2HPO4 5,4 M; KH2PO4 1,8 mM; pH 8,4) em uma proporção de 2
37
partes de tampão para uma parte de camada celular, agitando a mistura
suavemente. Após essa etapa, centrifugou-se o material a 4.000 rpm por 10
minutos.
O sobrenadante (solução + restos orgânicos indesejáveis) foi retirado e
adicionou-se 500 µL de solução de lise celular (NaCl 0,3 M; EDTA 100 mM com pH
7,5 e uréia 7,0 M) que promoveu a ruptura dos leucócitos. A solução foi
homogeneizada e adicionou-se 500 µL de SDS a 20% e, em seguida, incubou-se a
solução em banho-maria a 37°C por 16 horas.
Após o período de incubação, adicionou-se 500 µL de fenol-clorofórmio
(1:1), agitando a mistura suavemente por 10 minutos e, posteriormente, centrifugouse a 4.000 rpm por minuto. A primeira fase foi transferida para outro tubo onde se
repetiu a utilização do fenol-clorofórmio (1:1).
O sobrenadante obtido foi adicionado a uma solução de clorofórmioisopropanol (24:1), homogeneizado por 10 minutos e centrifugado nas mesmas
condições anteriores. Depois foi repetido o procedimento por mais uma vez. Em
seguida, transferiu-se a primeira fase para outro tubo e adicionou-se uma solução de
acetato de sódio a 3,0 M (pH: 5,2) na proporção de 10% do valor obtido. Esta
solução precipita o DNA juntamente com o Etanol absoluto gelado (2,5 vezes o
volume da mistura), agitando-se suavemente até a observação do precipitado de
DNA.
A hidratação do material extraído, DNA, foi realizada em água deionizada
estéril, agitando-se até homogeneização total. O material extraído foi deixado à
temperatura ambiente por 24 horas para a completa diluição.
Após a extração foi processada a quantificação do DNA, após o processo
de quantificação o DNA foi diluído para 10 ng/µL, a concentração de uso.
2.3. QUANTIFICAÇÃO
A concentração do DNA das amostras foi calculado pelo índice de
absorbância (A) das bases a 260 nm em espectrofotômetro NanoDropTM ND-1000
(Thermo Scientific).
38
2.4.
SELEÇÃO DOS SNP
Foram selecionados 6 polimorfismos do tipo SNP no gene TPMT
descritos na literatura como associados a resposta ao 6-MP no tratamento da LLA. A
Tabela 4 estão descritos os polimorfismos selecionados e com seus respectivos
fenótipos associados a atividade enzimática da TPMT.
Tabela 4. Polimorfismos farmacogenéticos selecionados do gene TPMT associados a
resposta terapêutica do 6-MP.
Polimorfismo
Gene TPMT
rs da
mutação
238G>C (TPMT *2)
460G>A (TPMT*3B)
474T>C (TPMT * 1S)
644G>A (TPMT*8)
719A>G(TPMT*3C)
(-1) G>A(TPMT*4)
1800462
1800460
2842934
56161402
1142345
1800584
2.5.
Fenótipo
associado
Baixa
Baixa
Alta
Intermediária
Baixa
Baixa
Alelos
G
G
T
G
A
G
C
A
C
A
G
A
DESENHO DOS INICIADORES
Foram selecionados três iniciados empregando-se o Programa Primer 3
(Rozen & Skaletsky, 2000). Os parâmetros utilizados na escolha dos iniciadores
foram: número de nucleotídeos=25, tamanho do produto=200-400 pares de bases,
temperatura de fusão=60ºC. A Tabela 5 descreve os iniciadores utilizados e as
mutações correspondentes a cada iniciador.
39
Tabela 5. Descrição dos iniciados utilizados na genotipagem dos polimorfismos do gene
TPMT.
Primer
Tamanho
dos primes
Temperatura (°C)
25
54,7
25
56,4
22
60,8
644G>A
22
60,8
5' AGAATCCCTGATGTCATTCTTCAT 3'
719A>G
24
59,4
5' ACAGGTAACACATGCTGATTGGT 3'
(-1) G>A
23
61
Sequência dos Primes
Mutações
Investigadas
5'TTTCCAAATTTTTATTGTTTCCTGA3'
PRIMER 1 F
238G>C
5' TACCCAAATCAAAACAAACCTTAAA 3'
PRIMER 1 R
5' AACGCAGACGTGAGATCCTAAT 3'
PRIMER 2 F
460G>A
474T>C
5' CACAGCTTGAAAGTGATTGAGC 3'
PRIMER 2 R
PRIMER 3 F
PRIMER 3 R
2.6.
REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR)
A amplificação foi realizada em um termociclador ABI Verity (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA). O protocolo padrão para os três primers
utilizados empregou: 20 pmol de cada oligonucleotídeo, 2.5 mM de MgCl2, 0.25mM
de dNTP, 3 mM de Taq polimerase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA,
USA), 10 mM de Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM de Kcl e 10 ng de DNA genômico em
cada 25 µL de volume de reação. As amostras foram incubadas a 95°C por 3
minutos, posteriormente por 35 ciclos de 94°C por 4 0 segundos, 62°C por 1 minuto e
72°C por 2 minutos, com a extensão final de 70°C po r 30 minutos e 4° por 5 minutos.
As regiões de interesse foram amplificadas com a utilização de pares de
primers específicos para as sequências analisadas no presente trabalho, as quais
têm suas seqüências complementares às regiões que flanqueiam os sítios
estudados (Tabela 5). O produto da amplificação foi analisado por eletroforese em
gel de agarose a 1,5% para posterior sequenciamento direto das amostras.
40
2.7.
SEQUENCIAMENTO DIRETO DO DNA
O sequenciamento direto do DNA, utilizando ABI PRISM 3130 Genetic
Analyzer, sequenciou uma região em torno de 446 pb do gene TPMT por reação.
A reação se desenvolveu em um volume de 15 µL, contendo 10 µL de
água; 1 µL do produto amplificado (PCR); 0,5 µL do Kit Big Dye (Terminator Cicle
Sequence v 3.0) 3,0µL do tampão Save Money; e 0,5 µL de iniciador por 35 ciclos
(96ºC por 50 segundos; 60ºC por 30 segundos; 72ºC por 3 minutos).
As sequências foram analisadas e comparadas com sequências já
descritas de referencia para posterior detecção dos seis SNP associados com
variação da atividade enzimática da TPMT. Através das técnicas de PCR e
sequenciamento foi possível analisar conjuntamente os seis polimorfismos
estudados em três reações por indivíduo.
2.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A frequência dos alelos foi estimada por contagem gênica. A adequação
das frequências gênicas estimadas às esperadas de acordo com equilíbrio de Hardy
Weinberg foram estimadas pelo teste do χ2
(qui-quadrado) em cada uma das
amostras dos grupos de pacientes e sadios. Os haplótipos entre os SNPs
investigados foram derivados através de estimativas de máxima verossimilhança
utilizando-se o programa Phase (Stephens et al., 2001).
Todas as outras análises estatísticas foram realizadas usando o programa
estatístico SPSS v.17.0 (SPSS, Chicago, IL). Os grupos foram comparados por
variáveis categóricas utilizando o teste do χ2, enquanto o teste t Student foi utilizado
para as análises de variáveis contínuas. A taxa de risco (Odds ratios-OR) e o
Intervalo de confiança (IC= 95%) também foram calculados. A utilização da
regressão logística considerou como variável dependente: os desfechos clínicos e
toxicidades decorrentes do tratamento da LLA, e como variáveis independentes
foram empregadas: idade, sexo e outras variáveis clínicas que pudessem ser fator
de confusão nas análises.
41
Todos os testes estatísticos consideraram probabilidade (p-valor)
significativa quando ≤0, 05.
42
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os polimorfismos genéticos do TPMT são considerados como um dos
melhores exemplos da aplicação clínica da farmacogenética. A enzima TPMT é
responsável pela metabolização do fármaco 6-MP, amplamente utilizado no
tratamento da LLA. A análise molecular do gene TPMT pode contribuir para a
otimização do uso desse quimioterápico. Evitando falências terapêuticas seja por
reações adversas ou ausência de eficácia do fármaco (Relling et al.,1999; Krynetski
& Evans, 1999; McLeod et al., 2000; Cheok & Evans, 2006).
Polimorfismos no gene TPMT influenciam a atividade da 6-MP no
organismo levando a sérios efeitos adversos. Pacientes que apresentam atividade
baixa dessa enzima estão sujeitos a sérias toxicidades hematopoiéticas devido ao
acúmulo de compostos metabólitos ativos de 6-TGN, e pacientes que apresentam
atividade enzimática alta da TPMT estão sujeitos a uma ineficácia terapêutica devido
à alta metabolização do fármaco (Relling et al.,1999; Cheok & Evans, 2006; Relling
et al., 2010).
A região Norte apresenta a maior taxa de incidência de leucemias do
Brasil, acima de 39% (INCA, 2010). Nos últimos anos as taxas de sobrevida dos
pacientes com LLA têm aumentando devido ao progresso terapêutico, mas ainda
assim cerca de 30% dos pacientes submetidos à terapia convencional para LLA não
respondem ao tratamento (Lange et al., 2002; Hutchinson et al., 2003). Na região
Norte do Brasil essa taxa de resposta farmacológica é mais agravante, cerca de
70% dos pacientes não respondem a terapia convencional para LLA apresentando
uma baixa taxa de sobrevida, devido principalmente a graves complicações
toxicológicas decorrentes do tratamento quimioterápico (Silva et al., 2011). Nesse
contexto o presente projeto tem como principal objetivo fornecer base para estudos
farmacogenéticos que sejam capazes de investigar o efeito de polimorfismos no
gene TPMT que poderiam estar influenciando a ausência de resposta terapêutica na
população do Norte do Brasil e colaborar de maneira a efetivar um teste preditivo
para melhor auxiliar no manejo clínico destes pacientes.
Recentemente a FDA recomenda a genotipagem de polimorfismos
investigados no presente projeto como teste preditivo de resposta a 6-MP em
pacientes com LLA antes do início deste tratamento. Desta forma é possivel
43
maximizar a eficacia terapeutica e evitar efeitos tóxicos decorrentes da terapia
(Wang et al., 2011).
3.1. OTIMIZAÇÃO DA PCR E SEQUENCIAMENTO PARA INVESTIGAÇÕES DOS
POLIMORFISMOS NO GENE TPMT.
O presente trabalho teve como um dos objetivos padronizar um protocolo
de PCR e Sequenciamento direto para a investigação de seis polimorfismos do gene
TPMT 474T>C, 238G>C, 460G>A , 719A>G, G_1A, 644G>A. Através das técnicas
de PCR e Sequenciamento foi possível amplificar com sucesso os seis
polimorfismos estudados em três reações por indivíduo. As condições estabelecidas
para as reações de PCR e Sequenciamento foram mencionadas na seção Material e
Métodos. A Figura 11 demonstra um exemplo de eletroferograma de um paciente
pediátrico com LLA, heterozigoto para as mutações 460G>A e 474T>C.
Figura 11. Exemplo de Eletroferograma de um paciente pediátrico com LLA, heterozigoto para dois
Polimorfismos do tipo SNP: 460G>A e 474T>C.
44
3.2. FREQUÊNCIA DOS ALELOS DO GENE TPMT NAS POPULAÇÕES
ESTUDADAS
Foram
investigados
no
presente
trabalho
seis
polimorfismos
caracterizados por sete alelos importantes para definir a atividade enzimática do
gene TPMT: TPMT*1S (474T>C), TPMT*2 (238G>C), TPMT* 3A (460G>A e
719A>G), TPMT*3B (460G>A), TPMT*3C (719A>G), TPMT*4 (G_1A) e TPMT*8
(644G>A) em 24 pacientes com Leucemia Linfóide Aguda, em tratamento com 6MP e em 49 indivíduos representativos da população miscigenada da cidade de
Belém-PA, utilizados como controle no estudo.
Nas populações estudadas os locos genotipados do gene TPMT estão de
acordo com de equilíbrio de Hardy-Weinberg (p>0,05).
3.2.1. FREQUÊNCIA DOS ALELOS DO GENE TPMT NA POPULAÇÃO DE BELÉMPA
A Tabela 6 descreve a frequência em indivíduos da população
miscigenada da cidade de Belém-PA para as seis mutações principais do gene
TPMT com seus respectivos haplótipos associados com a resposta farmacológica da
6-MP. A mutação mais frequente encontrada em 22% da amostra foi a 474C,
caracterizada pelo alelo TPMT*1S, e a menos frequente foram as 238C,
caracterizada pelo alelo TPMT*2, e a mutação 719G, que caracteriza o alelo
TPMT*3C, ambas encontradas em 1% na amostra investigada. Não foi identificado o
alelo TPMT*4 nessa população investigada, considerada rara na maioria das
populações.
45
Tabela 6. Frequência estimada na População de Belém para os seis SNP investigados e
seus haplótipos derivados do gene TPMT.
Nucleotídeo*
Mod.Amin**
238 C
460 A
Ala80Pro Ala154Thr
474 C
_1A
NÃO
-----
0.22
0.00
Frequência
0.01
0.02
Haplótipos
G238C
G460A
TPMT*1
G
G
T
TPMT*1S
.
.
TPMT*3A
.
TPMT*3C
644 A
719 G
Arg215His Tyr240Cys
0.05
0.03
G644A
A719G
G
G
A
0.6837
Alta
C
.
.
.
0.2245
Alta
A
.
.
.
G
0.0204
Baixa
.
.
.
.
.
G
0.0102
Baixa
TPMT*8
.
.
.
.
A
.
0.0510
Baixa
TPMT*2
C
.
.
.
.
.
0.0102
Baixa
T474C G _1 A
Frequência Fenótipo
*Mutaçções definidoras do fenótipo.
** Modificação do aminoácido.
Na literatura consultada foram encontrados poucos trabalhos envolvendo
a investigação do gene TPMT em populações Brasileiras.
Boson et al. (2003) determinaram a frequência de seis variantes alélicas
do gene TPMT em 202 indivíduos de Minas Gerais. A frequência alélica foi de
TPMT*2, 2,2%; TPMT*3A, 1,5%; TPMT*3B, 0,2%; TPMT*3C; 1%. Nessa população
brasileira não foram detectados os alelos raros TPMT* 5 e *6.
Outro estudo desenvolvido por Reis et al. (2003) investigou polimorfismos
do gene TPMT em 306 indivíduos da população brasileira. Os indivíduos foram
estratificados de acordo com a ancestralidade auto-declarada. Foram investigados
os alelos TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3C. No grupo considerado descendente de
europeus a frequência encontrada dessas mutações foram 0,76%, 2,03% e 2,5%,
respectivamente. Na população miscigenada a frequência foi de 0,6%, 1,8% e 1,8%,
respectivamente. Na população afro-descendentes não foram detectados alelos
mutantes.
46
Um estudo desenvolvido por Chiabai (2010) investigou 20 SNP
relacionados à resposta aos fármacos utilizados no tratamento para LLA,
empregando a técnica de SnaPShot Multiplex, em 200 amostras provenientes das
cinco regiões geográficas Brasileiras e em 95 pacientes com LLA atendidos em um
Hospital de referência em Brasília-DF. Foram investigados quatro SNP (TPMT*2,
TPMT*3B, TPMT*3C e TPMT*4) relacionado a resposta farmacogenética no gene
TPMT. Nesse estudo a frequência encontra para esses polimorfismos foram
respectivamente: 3,8%, 2,8%, 4,8%, não foi encontrado nesse estudo o alelo
TMPT*4.
Os resultados encontrados nos três trabalhos brasileiros foram diferentes
dos observados no presente estudo. Os trabalhos desenvolvidos por Boson et al.
(2003), Reis et al. (2003) e Chiabai (2010) não investigaram a mutação 474C,
caracterizada pelo alelo TPMT*1S, e
a mutação 644A, que caracteriza o alelo
TPMT*8, ambas encontradas em maior frequência no presente estudo. No trabalho
desenvolvido por Boson et al. (2003) o alelo mais frequente foi o TPMT *2, no
trabalho desenvolvido por Reis et al. (2003) e por Chiabai (2010) o alelo mais
frequente foi o TPMT*3C. A frequência desses alelos encontrados no presente
estudo para a população de Belém-PA foi de 1%. A diferença do número amostral
utilizado nos diferentes trabalhos e a diferente composição genética destas
populações podem explicar as divergências nas frequências dos alelos para o gene
TPMT encontradas no presente estudo.
A mutação 474C, caracterizada pelo alelo TPMT*1S, foi a mais frequente
encontrada na amostra estudada da população saudável de Belém-PA (frequência
de 22%). Na literatura investigada foram encontrados apenas dois trabalhos que
investigaram a mutação 474C, nenhum deles em populações brasileiras. TajaChayeb et al. (2008) investigou a frequência de polimorfismos do gene TPMT na
população mexicana em 108 indivíduos sadios e em 39 pacientes com LLA, a
frequência encontrada para a população sadia da mutação 474C foi de 19,4 %.
Alves et al. (1999) também descreveu essa mutação com elevada frequência em
populações Norte Portuguesas, com frequência de 21%. Esses dados corroboram
com a frequência encontrada para a mutação 474C na população sadia de BelémPA.
47
A mutação 644A que caracterizada pelo alelo TPMT*8, foi a segunda
mais frequente encontrada na amostra estudada da população saudável de BelémPA (frequência de 5%). Na literatura consultada não foi encontrado nenhum trabalho
que tenha investigado essa mutação em populações brasileiras. Um trabalho
desenvolvido em populações africanas por Oliveira et al. (2007) estudou 103
indivíduos provenientes de Moçambique, o alelo TPMT*8 foi responsável por uma
proporção significativa de alelos não funcionais, cerca de 40%. Esse alelo parece
ser altamente específico nas populações sub-saarianas (Oliveira et al., 2007).
A literatura descreve influências étnicas na frequência dos SNP estudado
no gene TPMT (Collie-duguid et al., 1999). No Brasil, essa influência fica mais
evidente em função do alto grau de miscigenação desta população em diferentes
grupos étnicos (Callegari-Jacques et al., 2003). O trabalho de Santos & Guerreiro
(1995), demonstrou que a composição étnica da população do Norte do país
apresenta uma distribuição genética de europeus, ameríndios e afro descendentes,
representadas por 47 %, 41 % e 12 %, respectivamente.
Os dados das frequências estimadas para cada SNP investigado devem
sofrer influência da região do Brasil, na qual o estudo foi realizado. Portanto, é
fundamental ressaltar a importância de se caracterizar o perfil genético do gene
TPMT para cada região brasileira.
3.2.2. FREQUÊNCIA DOS ALELOS DO GENE TPMT EM PACIENTES COM LLA
A tabela 7 descreve a frequência em pacientes com LLA para as seis
mutações principais do gene TPMT e seus respectivos haplótipos associados com a
resposta terapêutica da 6-MP. Nossos dados demonstraram que a mutação mais
frequente foi a 474C, caracterizada pelo alelo TPMT*1S presente em 21% da
amostra. As mutações 460A e 719G, caracterizadas pelo alelo TPMT* 3A, tiveram
frequência de 4% na amostra. Não foram identificados cinco outros alelos do gene
TPMT (TPMT*2, TPMT*3B, TPMT*3C, TPMT*4, TPMT*8), encontrados com
frequências reduzidas na maioria das populações.
48
Tabela 7. Frequência estimada em pacientes com LLA para os seis SNP investigados e
seus haplótipos derivados do gene TPMT.
Nucleotídeo*
Mod.Amin**
238 C
460 A
Ala80Pro Ala154Thr
474 C
_1A
NÃO
-----
0.21
0.00
Frequência
0.00
0.04
Haplótipos
G238C
G460A
TPMT*1
G
G
T
TPMT*1S
.
.
TPMT*3A
.
A
644 A
719 G
Arg215His Tyr240Cys
0.00
0.04
G644A
A719G
G
G
A
0.7500
Alta
C
.
.
.
0.2083
Alta
.
.
.
G
0.0417
Baixa
T474C G _1A
Frequência Fenótipo
*Mutações definidoras do fenótipo.
** Modificação do aminoácido.
Na literatura consultada apenas dois trabalhos foram encontrados
envolvendo investigações do gene TPMT em populações brasileiras de pacientes
com LLA.
Um estudo desenvolvido por Silva (2007) estimou a frequência das
principais variantes alélicas do gene TPMT em uma população de 116 crianças e
adolescentes com LLA, tratados com 6-MP, no Hospital das Clínicas de Minas
Gerais - Belo Horizonte. A frequência das variantes alélicas foram: TPMT*3A 3,9 %,
TPMT*3C 0,9%, TPMT*2 0,4%. Não foi detectado os alelo TPMT* 3B.
O estudo desenvolvido por Chiabai (2010) investigou três polimorfismos
(TPMT*2, TPMT*3B, TPMT*4) relacionados à resposta farmacogenética do gene
TPMT em 95 pacientes atendidos pelo Núcleo de Onco-Hematologia Pediátrica da
secretaria de Saúde do Distrito Federal (SES/DF) que se encontravam em diferentes
fases de tratamento para a LLA. Nesse estudo a frequência encontrada do
polimorfismo TPMT*2 foi 1,6%, não foram encontrados os alelos TPMT*3B e
TPMT*4 na população estudada.
Nos estudos realizados por Silva (2007) e Chiabai (2010) não foram
investigados a mutação 474C, caracterizada pelo alelo TPMT*1S, encontrado em
49
maior frequência em nosso estudo. No trabalho desenvolvido por Silva (2007) entre
os alelos deficientes do TPMT foi encontrada uma maior frequência do alelo
TPMT*3A (3,9%), essa frequência é similar a encontrada no presente estudo, cuja
frequência para esse alelo foi de 4% entre os pacientes com LLA.
A observação de uma maior variabilidade alélica encontrada na
população miscigenada da cidade de Belém, em relação à população de pacientes
com LLA (Figura 12), pode ser explicada pelo maior número amostral (49 indivíduos)
na população controle em relação a população de pacientes (24 indivíduos).
A mutação 474C, que caracteriza o alelo TPMT*1S foi encontrada em
frequências altas nos dois grupos estudados (pacientes com LLA e na população de
Belém), ambos com 21% e 22% respectivamente. Esse polimorfismo corresponde a
uma mutação silenciosa (não modifica aminoácido), logo caracteriza um perfil
genético
de alta atividade enzimática da TPMT, assim como o alelo selvagem
TPMT*1. Essa mutação foi descrita com elevada frequência em populações Norte
Portuguesas, com frequência de 21% (Alves et al., 1999). Essa distribuição de
frequência semelhante a encontrada em nosso estudo pode ser explicada por uma
maior contribuição de ancestralidade européia advinda de Portugal durante a
formação populacional da região Norte do Brasil (Santos & Guerreiro, 1995). Um
trabalho recente desenvolvido por Santos et al. (2010) entregando 48 marcadores
informativos de ancestralidade identificou um elevado grau de ancestralidade
européia na população de Belém-PA.
50
O presente trabalho é o primeiro, realizado na região Norte do Brasil, a
descrever o perfil genético do gene TPMT em pacientes pediátricos portadores de
LLA. Esta região do Brasil sofre grande influência do efeito da subestruturação
genética, gerada pela contribuição desigual dos grupamentos ancestrais formadores
da população brasileira (europeus, africanos e ameríndios) em cada individuo da
população. A frequência de distribuição dos alelos mutantes do gene TPMT variam
de acordo com o grupo étnico estudado (Collie-duguid et al., 1999). Este fato se
torna relevante quando se considera a grande heterogeneidade genética
da
população brasileira. Para atingir os objetivos farmacogenéticos, é importante a
utilização de ferramentas de controle genômico para determinar com precisão o
papel de polimorfismos nos genes candidatos em populações miscigenadas como a
brasileira (Santos et al., 2010).
Figura 12. Gráfico comparando a frequência alélica do gene TPMT entre as populações de Pacientes
com LLA e a População sadia de Belém-PA.
51
3.3.
GENÓTIPOS
ENCONTRADOS
DO
GENE
TPMT
NAS
POPULAÇÃO
ESTUDADAS
A Tabela 8 apresenta a distribuição dos indivíduos estudados de acordo
com o genótipo e sua capacidade de metabolização do 6-MP, nas duas populações
investigadas (Pacientes com LLA e População de Belém). Três grupos de genótipos
foram definidos conforme a atividade enzimática da TPMT: I) Atividade alta;
Indivíduos portadores de dois alelos de alta atividade da TPMT; II) Intermediária;
Indivíduos portadores de um alelo de atividade alta e um alelo de atividade baixa ou
intermediária da TPMT; III) Atividade baixa ou deficiente; Portadores de dois alelos
deficientes da TPMT.
Na amostra total investigada (população controle e de pacientes)
representada por 73 indivíduos, 62 (85 %) apresentam atividade alta da TPMT e
11(15%) apresentam atividade intermediária. Não foram encontrados na população
estudada indivíduos homozigotos para a atividade deficiente da TPMT. Entre os
indivíduos da amostra total investigada com atividade intermediária o genótipo mais
frequente encontrado em foi o TPMT*1/ TPMT*8, com frequência de 7%.
Entre os pacientes portadores de LLA o genótipo mais frequente no grupo
de atividade intermediária foi o TPMT*1/ TPMT*3A, frequente em 4% nessa
população.
Na comparação entre as duas populações estudadas (pacientes com LLA
e População de Belém) não foi possível identificar diferenças significativas entre os
grupos que apresentavam atividade alta e intermediária da enzima TPMT (p> 0,05
em ambos os casos).
52
Tabela 8. Distribuição dos indivíduos estudados de acordo com o genótipo do TPMT e sua
capacidade de metabolização do 6-MP.
Total
Pacientes com
LLA
N= 24 (%)
População de
Belém
N= 49 (%)
62 (85 %)
22 (91, 6 %)
40 (81, 6%)
37 (50%)
13 (54, 2%)
24 (49%)
6 (8, 2%)
1 (4, 1%)
5 (10, 2%)
19 (26%)
8 (33, 3%)
11 (22, 4%)
11 (15 %)
2 (8, 3%)
9 (18, 4%)
3 (4, 1%)
2 (8, 3%)
1 (2, 04%)
TPMT*1/ TPMT*3C
1 (1, 3%)
0
1 (2, 04%)
TPMT*1S/ TPMT*3C
1 (1, 3%)
0
1 (2, 04%)
TPMT*1/ TPMT*8
5 (7%)
0
5 (10, 2%)
TPMT*1/ TPMT*2
1 (1, 3%)
0
1 (2, 04%)
Fenótipo
N= 73 (%)
HOMOZIGOTOS
TIPO SELVAGEM OU
ATIVIDADE ALTA
TPMT*1/ TPMT*1
TPMT*1S/ TPMT*1S
TPMT*1/ TPMT*1S
HETEROZIGOTO OU
ATIVIDADE
INTERMEDIÁRIA
TPMT*1/ TPMT*3A
P
OR (95%IC)
0,32
0,4 (0,080-2,038)
0,32
2,47 (0,49-12,482)
O estudo desenvolvido por Silva (2007) estimou a frequência das
principais variantes alélicas do gene TPMT em uma população de 116 crianças e
adolescentes com LLA. Doze dos 116 (cerca de 10%) pacientes apresentaram
mutações no gene TPMT, todos em heterozigose. A assim como observado no
presente estudo, nenhum indivíduo com baixa atividade da TPMT foi encontrado.
As perspectivas atuais no que se refere ao tratamento com 6-MP nos
pacientes com LLA, diversos trabalhos na literatura propõem o ajuste da dose de 6MP conforme o perfil de metabolizador do paciente (Schmiegelow et al., 2009;
Relling et al., 2010). Os pacientes com LLA tratados no Hospital Ophir Loyola
receberam as doses de 6-MP de 50 mg/m2 por peso corporal, conforme estipulado
pelos protocolos do Grupo Brasileiro de Tratamento das Leucemias da Infância
(GBTLI)- protocolo GBTLI-LLA-93.
53
O Consórcio de Implementação Clínica da Farmacogenética (Clinical
Pharmacogenetics Implementation Consortium - CPIC) formado no ano de 2009, e
que tem o objetivo de incentivar a implementação de testes de farmacogenéticos na
prática clínica, tem publicado trabalhos científicos que sugerem a redução da dose
administrada de 6-MP em pacientes com LLA de acordo com o perfil metabolizador
do paciente (Relling et al., 2010). Para os pacientes com LLA com atividade
enzimática da TPMT alta, a dose incial de 6-MP recomendada tendem a ser
elevadas (75 mg/m2 de MP). São recomendadas doses menores que o protocolo
padrão de 50 mg/m2 utilizada pelo GBTLI em pacientes heterozigotos e homozigotos
metabolizadores deficientes as doses padrão de 6-MP devem ser reduzidas em ate
10 vezes (Schmiegelow et al., 2009; Relling et al., 2010).
Para a identificação de grupos de risco e melhora o manejo terapêutico
pacientes com LLA, a utilização de testes farmacogenéticos preditivos é muito
importante. A identificação de polimorfismos genéticos do TPMT podem permitir a
otimização da dose do fármaco utilizado, melhorando o tratamento dos pacientes,
através da redução de toxicidades e evitando ineficácias terapêuticas (Davidsen et
al., 2008).
3.4.
DADOS CLÍNICOS DOS PACIENTES COM LLA
Foram analisados 24 pacientes pediátricos com LLA todos tratados com
6-MP em um Hospital de referência no tratamento do câncer no estado do Pará . O
presente trabalho teve como um dos objetivos correlacionar polimorfismos no gene
TPMT com os dados clínicos dos pacientes portadores de LLA. Dos 24 pacientes
analisados dez (41, 6%) apresentaram reações adversas decorrentes do tratamento,
4 (18, 7%) apresentaram falência terapêutica caracterizada pela ausência de
resposta ao medicamento.
Os dados epidemiológicos na amostra de pacientes portadores de LLA
indicam uma idade média de 5,91+/-4,095 anos e predominância do sexo masculino
representado por 17 indivíduos correspondendo a
investigada.
cerca de 71% da amostra
54
Com relação a Imunofenotipagem obtivemos informações de apenas 16
pacientes dos 24 investigados. Cerca de 81 % dos pacientes submetidos ao
tratamento com LLA apresentaram subtipos imunofenotípicos de linfoblastos de
células B. Segundo a literatura esse subtipo é o mais comum, presente em cerca de
80% dos casos em pacientes com LLA e esta em muitos casos associado a uma
melhor resposta terapêutica do paciente (Pui et al., 2004; Cheok et al., 2006; Onciu,
2009).
Na Tabela 9 estão discriminados os dados clínicos dos 24 pacientes
portadores de LLA estratificados de acordo com o genótipo do TPMT (homozigotos
para atividade alta e Heterozigoto). A comparação realizadas com relação as
características clínicas entre os pacientes heterozigotos para o gene TPMT e
homozigoto de alta atividade não mostrou diferenças estatísticas significantes
(p>0,05).
Os resultados referentes a correlação entre o genótipo do TPMT com os
dados clínicos dos pacientes durante o tratamento na fase de manutenção da
terapia da LLA, apresentaram algumas limitações em decorrência do pequeno
número amostral do estudo. Todas as mutações investigadas foram observadas em
heterozigose (portadores de um alelo de baixa atividade da TPMT), não havendo a
possibilidade e avaliar as características clínicas em pacientes com alelos
deficientes do TPMT (homozigoto mutante).
Quanto a falência terapêutica podemos evidenciar uma tendência de risco
pois observamos que todos os pacientes que não responderam ao tratamento (4
indivíduos) foram agrupados no fenótipo homozigoto de atividade elevada, contudo
as diferenças não são estatisticamente significativas (p:1,00, OR: 0, 895, IC95%: 0,
765-1,044). A ausência de resultado significativo pode ser explicado devido o
número investigado ser ainda restrito.
Um resultado similar foi observado com relação ao número de óbitos (p:
1,00; OR: 0,889; IC95%: 0, 755-1,047) onde todos os pacientes que sofreram óbitos
durante
o
tratamento
foram
genotipados
com
homozigotos
para
rápida
metabolização do 6MP.
No presente trabalho 91,7 % dos pacientes eram Homozigotos para
atividade alta do TPMT e 8, 3 % dos pacientes eram heterozigotos. É importante
55
caracterizar os pacientes portadores de alelos de metabolização rápida do 6-MP,
uma vez que este grupo pode apresentar uma resposta terapêutica ineficaz ao
tratamento da LLA. Baixos níveis plasmáticos do fármaco nos pacientes
metabolizadores rápidos são uma das razões para a falência terapêutica, fato este
que pode resultar também no óbito destes pacientes. Segundo a literatura cerca de
25 % das crianças com LLA apresentam recidiva da doença, as possíveis causas
das recidivas são a resistência aos fármacos e os efeitos insuficiente da
quimioterapia (Relling et al., 1999; Pui et al., 2004). Portanto para que ocorram
melhorias no tratamento da LLA é essencial que sejam realizados estudos cujo
enfoque seja no entendimento dos mecanismos de resistências aos fármacos
utilizados na quimioterapia. Devemos destacar que segundo a literatura a dose
padrão de 50 mg/m2 utilizado no Brasil para os pacientes com LLA (inclusive para
homozigotos de elevada metabolização da 6-MP) seria insuficiente para ocorrer o
sucesso terapêutico, podendo para esses pacientes ajustar a dose para 75 mg/m2.
Entre as reações adversas observadas nos 24 pacientes com LLA as que
se mostraram mais frequentes foram as mucosites (cinco pacientes, 22, 7%) e
neutropenia (três pacientes, 12, 5%).
A literatura descreve que o aparecimento de mucosite em pacientes com
LLA, esta mais comumente associado ao uso do metrotrexado (Kishi et al., 2007;
Cheok et al., 2009), enquanto que o aparecimento de neutropenias em pacientes
com LLA esta associado com o uso do 6-MP (Kirschner, 1998; Dubinsky, 2003;
Herrlinger et al., 2004; Sanderson et al., 2004).
As análises com relação tanto as reações adversas gerais e
particularmente a neutropenia não foram significativamente associados aos
pacientes portadores de mutação no gene TPMT (p>0,05).
Nossos resultados sugerem que a interações de múltiplos polimorfismos
associados aos diferentes fármacos utilizados no tratamento dos pacientes com LLA
podem está influenciando a resposta ao tratamento. Futuramente pretendemos
desenvolver modelos farmacogenéticos poligênicos para melhor caracterizar o perfil
de resposta dos pacientes com LLA submetidos ao tratamento. Pretendemos
também ampliar o tamanho da população do estudo e o tempo de acompanhamento
dos pacientes para a realização de análises mais precisas.
56
Tabela 9. Dados Clínicos dos 24 Pacientes com LLA estratificados de acordo com genótipo
do TPMT.
Total N=24 (%)
Genótipo do TPMT (%)
Homozigotos para atividade alta
Heterozigotos
N= 22 (91, 7)
N =2 (8, 3)
p valor
OR (95%IC)
0, 507
2 ,67 (0, 14-49, 76)
Dados Clínicos dos pacientes LLA
Sexo
Masculino
17 (70,83)
Média de idade
Feminino
7 (29, 17)
Imunofenotipagem
16
16 ( 72, 73)
1 (50, 0)
6 +/- 4,2
5 +/- 1,4
6 (27,27)
1 (50,0)
0, 093
Células B
13 (81, 2)
12 (54,55)
1 (100)
1, 083
1, 08 (0, 93-1, 27)
Células T
3 (18, 8)
3 (13,64)
0
1, 000
0, 92 (0, 79-1, 08)
9 (40, 90)
1 (100)
1, 000
0, 75(0, 04-13, 67)
2 (9, 1)
1 (100)
0, 249
0, 10(0, 005-2, 41)
5 (22,72)
0
1, 000
0, 89 (0,75-1, 05)
Falência terapêutica 4 (18, 67)
4 (18, 18)
0
1, 000
0, 89 (0, 76-1, 04)
Óbitos
4 (18, 18)
0
1, 000
0, 89 (0, 75-1, 05)
Reações adversas*
10 (4 1, 6)
Principais toxicidades clínicas
Neutropenias
3 (12,5)
Mucosites
5 (22, 72)
Desfecho Clínico
4 (16, 67)
* Reações adversas encontradas: Mucosites, neutropenias, osteonecrose de quadril e
cardiotoxicidade.
O desenvolvimento de pesquisas em farmacogenética iniciará uma nova
era na medicina. Estabelecendo o conceito de uma terapia individualizada, onde o
fármaco certo é administrado na dose certa para o paciente correto também é
bastante promissor, pois a redução dos efeitos adversos além de serem alcançadas
57
pela seleção do melhor fármaco e a melhor dose para aqueles pacientes que têm
metabolização deficiente, poderá ainda abrir as portas para a pesquisa e o
desenvolvimento de novos alvos terapêuticos, que não sejam metabolizados por
determinada enzima ou via (Fiegenbaum & Hutz, 2006).
58
4. CONCLUSÃO
Os protocolos de PCR e Sequenciamento padronizados no presente
estudo mostraram serem eficaz na detecção dos seis principais polimorfismos
(474T>C, 238G>C, 460G>A , 719A>G, G_1A, 644G>A) do gene TPMT investigados com
relação a resposta farmacogenética do 6MP.
Entre a população de Belém utilizado como controle do estudo, a
frequência dos alelos do gene TPMT foi: TPMT*1S: 22%, TPMT*3A: 2%, TPMT*3C:
1%, TPMT*8: 5%, TPMT*2: 1%. Os alelos mais frequentes foram TPMT*1S e
TPMT*8 essa distribuição pode esta relacionada a miscigenação da população
estudada, uma vez que segunda a literatura, esses alelos são mais comumente
frequentes em populações européias portuguesas e africanas, respectivamente.
Quando foi analisada a população de pacientes portadores de LLA os
alelos encontrados foram TPMT*1S, com 21% e TPMT*3A, com 4 %.
A observação de uma maior variabilidade alélica encontrada na
população miscigenada da cidade de Belém, em relação à população de pacientes
com LLA, pode ser explicada pelo maior número amostral (49 indivíduos) na
população controle em relação a população de pacientes (24 indivíduos).
Devido ao elevado grau de subestruturamento na população que
compõem a amostra investigada, propomos em estudos futuros a realização de um
controle genômico entre os indivíduos com e sem LLA, utilizando 48 marcadores
informativos de ancestralidade já desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa.
Na amostra total investigada representada por 73 indivíduos estudados
(tanto de pacientes quanto da população controle), 62 (85 %) apresentam atividade
alta da TPMT e onze (15%) apresentam atividade intermediária. Não foram
encontrados na população estudada indivíduos homozigotos para a atividade
deficiente da TPMT.
Na comparação entre as duas populações estudadas (pacientes com LLA
e população de Belém) não foi possível identificar diferenças significativas entre os
grupos que apresentavam atividade alta e intermediária da enzima TPMT (p> 0,05
em ambos os casos).
59
Quando foram analisados os dados clínicos dos pacientes pediátricos
com LLA. Dos 24 pacientes analisados dez (41, 6%) apresentaram reações
adversas decorrentes do tratamento, 4 (18, 7%) apresentaram falência terapêutica
caracterizada pela ausência de resposta ao medicamento. Quando se comparou os
grupos (homozigotos para atividade alta da TPMT e heterozigotos) foi observado um
maior número de indivíduos que obtiveram falecia terapêutica e óbitos no grupo de
pacientes homozigotos para a alta atividade da TPMT, embora essas diferenças não
sejam estatisticamente significativas (p >0,05).
Futuramente
pretendemos
desenvolver
modelos
farmacogenéticos
poligênicos para melhor caracterizar o perfil de resposta dos pacientes com LLA
submetidos ao tratamento, assim como também ampliar o tamanho da população
estudada e o tempo de acompanhamento dos pacientes com LLA para a realização
de análises mais precisas.
60
REFERÊNCIAS
ABRAHAM, J.; EARL, H. M.; PHAROAH, P. D. et al. Pharmacogenetics of cancer
chemotherapy. Biochimica et biophysica acta. 168-183. 2006.
ALVES,
S.;
PRATA,
M.
J.;
FERREIRA,
F.
&
AMORIM,
A.
Thiopurine
methyltransferase pharmacogenetics: alternative molecular diagnosis and
preliminary data from northern Portugal. Pharmacogenetics, 9: 257-261. 1999.
APPELBAUM, F.R. Molecular diagnosis and clinical decisions in adult acute
leukemia. Semin Hematol, 4: 401-10. 1999.
ARICÓ, M.; BARUCHEL, A.; BERTRAND, Y.; BIONDI, A. CONTER, V. ÉDEN, T.
GARDNER, H. GAYDON, P. et al. The Seventh International Chilhood Acute
Lymphoblastic Leukemia Workshop Report: Palermo, Italy, January 29-30.
Leukemia 2005, 19: 1145-1152. 2005.
BENNETT,
J.M.; CATOVSKY,
D.; DANIEL,
M.T.; FLANDRIN,G.; GALTON,
D.A.; GRALNICK, H.R. & SULTAN, C. Proposals for the classification of the
acute leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative group.Br J
Haematol, 4: 451-458.1976.
BOSON, W.L.; ROMANO-SILVA, M.A.; CORREA H.; FALCÃO, R.P.; TEIXEIRAVIDIGAL, P.V. & DE MARCO, L. Thiopurine methyltransferase polymorphisms
in a Brazilian population. Pharmacogenomics J, 3: 178–182.2003.
BROWN, B.W; BRAUNER. C. & MINNOTTE, M.C. Noncancer deaths in white adult
cancer patients. J Natl Cancer Inst, 85: 979-87. 1993.
CALLEGARI-JACQUES, S.M.; GRATTAPAGLIA, D.; SALZANO, F. M.; SALAMONI,
S. P.; CROSSETT, S. G.; FERREIRA, M. E.; & HUTZ, M. H. Historical
Genetics: Spatiotemporal Analysis of the Formation of the Brazilian Population.
Annuals Journal Human Biology, 15: 824-834.2003.
CHABNER, B.A.; RYAN, D.P.; PAZ-ARES, L.; GARCIA-CARBONERO, R.&
CALABRESI, P. Antineoplastic agents. In: Hardman JG, Limbird LE, Goodman
61
Gillman A (eds) Goodman & Gilman’s the pharmacological basis of
therapeutics, 10th ed. McGraw- Hill, New York, 2001.
CHALMERS, A.H.; KNIGHT,P.R. & ATKINSON, M.R. 6-Thiopurines as substrates
and inhibitors of purine oxidases: a pathway for conversion of azathioprine into
6-thiouric acid without release of 6- mercaptopurine. Aust J Exp Biol Med Sci;
47: 263-73.1969.
CHEOK, M.H. & EVANS, W.E. Acute lymphoblastic leukemia: a model for the
pharmacogenomics of cancer therapy. Nat Rev Cancer, 6: 117-129. 2006.
CHEOK, M.H.; LUGTHART, S. & EVANS, W.E. Pharmacogenomics of acute
leukemia. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 46: 317-353.2006.
CHEOK, M.H.; POTTIER, N.; KAGER, L. & EVANS, W.E. Pharmacogenetics in acute
lymphoblastic leukemia. Semin Hematol., 46: 39-51. 2009
CHIABAI, M. A. Polimorfismos farmacogenéticos relacionados a drogras
utilizadas no tratamento da leucemia linfoide aguda na população
brasileira. Dissertação de Mestrado. Brasília. Universidade Católica de Brasília,
2010, 85p.
COLLIE-DUGUID, E. S. R.; PRITCHARD, S.C.; POWRIE, R. H.; SLUDDEN, J.;
COLLIER, D.A.; LI, T. & MCLEOD, H.L. The frequency and distribution of
thiopurine methyltransferase alleles in caucasian and Asian populations.
Pharmacogenetics, 9: 37-42.1999.
COREY, L.; BOECKH, M. Voriconazole as empirical antifungal therapy in patients
with neutropenia and persistent fever. The New England Journal of Medicine,
v.346, n.4, p.221-224, 2002.
DANESI, R.; PAOLO, A.D.; BOCCI, G. et al. Pharmacogenetics in oncology.
European Journal Clinic Pharmacology, 6: 74-78.2008.
DAVIDSEN, M.L.; DALHOFF, K. & SCHMIEGELOW, K. Pharmacogenetics influence
treatment efficacy in childhood acute lymphoblastic leukemia. J Pediatr.
Hematol. Oncol., 30: 831-849. 2008.
62
DERVIEUX, T.; MEDARD, Y.; BAUDOUIN, V. et al. Thiopurine methyltransferase
activity and its relationship to the occurrence of rejection episodes in paediatric
renal transplant recipients treated with azathioprine. Br J Clin Pharmacol, 48:
793-800. 1999.
DONOWITZ, G. R. et al. Infections in the neutropenic patient – New views of an old
problem. Hemathology, 1: 113-139. 2001.
DOUER, D.; PRESTON- MARTIN, S.; CHANG, E.; NICHOLS, P.W.; WATKINS, K.J.
& LEVINE, A.M. High frequency of acute Promyelocytic leukemia among Latinos
with acute myeloid leukemia. Blood, 87: 308-313. 1996.
DUBINSKY, M.C. Optimizing immunomodulator therapy for inflammatory bowel
disease. Curr Gastroenterol Rep, 5: 506–511.2003.
EICHELBAUM, M.; SUNDBERG, M.I. & EVANS, W.E. Pharmacogenomics and
individualized drug therapy. Annu. Rev. Med, 57: 119-137. 2006.
ELION, G.B . The purine path to chemotherapy. Science, 244: 41–47.1989.
ELION,
G.B.
Symposium
on
immunosuppressive
drugs.
Biochemistry
and
pharmacology of purine analogues. Fed Proc, 26: 898-904.1967
EVANS, W.E. & JOHNSON, J.A. Pharmacogenomics: the inherited basis for
interindividual differences in drug response. Annu Rev Genom Human Genet,
2: 9-39.2001.
EVANS, W.E.; HORNER, M.;CHU, Y.Q.; KALWINSKY, D. & ROBERTS, W.M.
Altered mercaptopurine metabolism, toxic effects and dosage requirement in a
thiopurine methyltransferase-deficient child with acute lymphocytic leukemia. J
Pediatr, 119: 985-989.1991.
EVANS. W.E.; HON, Y.Y.; BOMGAARS, L. et al. Preponderance of thiopurine Smethyltransferase deficiency and heterozygosity among patients intolerant to
mercaptopurine or azathioprine. J ClinOncol , 19: 2293-2301.2001.
FIEGENBAUM,
M. & HUTZ,
M. H. Pharmacogenetic of lipid-lowering drugs.
Simpósio: Farmacogenética, 39: 543-553. 2006.
63
FINKELSTEIN, M.M. Leukemia after exposure to benzene: temporal trends and
implications for standards. Am J Ind Med., 1: 1-7.2000.
GAJJAR, A.; RIBEIRO, R.; HANCOCK, M.L; RIVERA, G.K. MAHMOUD, H.;
SANDLUND, JT.
et al. Persistence of circulating blasts after 1 week of
multiagent chemotherapy confers a poor prognosis in childhood acute
lymphblastic leukemia. Blood, 86: 1292-1295. 1995.
GALLAGHER, DJ.; PHILLIPS, D.J. & HEINRICH, S.D. Orthopedic manifestations of
acute pediatric leukemia. Orthop Clin North Am, 27: 635-644. 1996.
GISBERT, J.P.; GOMOLLON, F.; CARA, C.; LUNA, M. GONZALEZ-LAMA, Y.;
PAJARES, J.M.; MATE, J. & GUIJARRO, L.G. Thiopurine methyltransferase
activity in spain: a study of 14545 patients. Dig Dis Sci, 52:1262-1269. 2007.
GIVERHAUG, T.; LOENNECHEN, T. &
AARBAKKE, J. The interaction of 6-
mercaptopurine (6-MP) and metrotrexate (MTX). Gen Pharmacol, 33: 341346.1999.
GLAUSER, T. A.; NELSON, A.N.; ZEMBOWER, D. E.; LIPSKY, J.J. &
WEINSHILBOUM, R. M. Diethyldithiocarbamate S-methylation: evidence for
catalysis
by
human
liver
thiol
methyltransferase
and
thiopurine
methyltransferase. J Pharmacol Exp Ther, 266: 23-32. 1993.
GREAVES, M. F. & ALEXANDER, F.E. Epidemiological characteristics of childhood
acute lymphocytic leukemia. Leukemia, 7: 349-360. 1993.
GREAVES, M. F.; COLMAN, S. M.; BEARD, M. E.; BRADSTOCK, K.; CABRERA, M.
E.; CHEN, P. M. et al., Geographical distribution of acute lymphoblastic
leukaemia subtypes: second report of the collaborative group study. Leukemia,
7: 27-34. 1994.
HAMDAN-KHALIL, R.; GALA, J.L.; ALLORGE, D.; LO-GUIDICE, J.M.; HORSMANS,
Y. & BROLY, F.Identification and functional analysis of two rare allelic variants of
the thiopurine S- methyltransferase gene, TPMT*16 and TPMT*19. Biochem
Pharmacol, 69: 525-529. 2005.
64
HERNANDEZ, M. A. L.; ALVARADO, R. J.; ESCOBOZA, R. B.; CHAPA, J. D. F.;
IBARRA, M. A.; AVANTE, M. G.; CHRYSTI, M. E. T. & CUELLAR, I. A. Factor
estimulante de colonias de granulócitos en el tratamiento de neutropenia febril.
Gac Med Mex,136: 99-105. 2000.
HERRLINGER, K.R.;SCHWAB, M.; FELLERMANN, K & STANGE, E.F. 6thioguanine- buried alive?. Gastroenterology, 126: 940-941. 2004.
HON, Y. Y.; FESSING, M. Y.; PUI, C.H.; RELLING, M. V.; KRYNETSKI, E.Y. &
EVANS W.E. Polymorphism of the thiopurine S-methyltransferase gene in
African-Americans. Hum Mol Genet 8: 371–376. 1999.
HORSMAN, D.E; PANTZAR, J.T.; DILL, F.J. &
KALOUSEK, D.K. Klinefelter's
syndrome and acute leukemia. Cancer Genet Cytogenet., 2 :375-376. 1987.
HUTCHINSON, R.J.; GAYNON, P.S.; SATHER, H.; BERTOLENE, S.J.; COOPER,
H.A.; TANNOUS, R. WELLS, L.M.; HEEREMA, N.A.; SAILER, S. & TRIGG, M.E.
Intensification of therapy for children with lower-risk acute lymphoblastic
leukemia: long-term follow-up of patients treated on children’s cancer Group Trial
1881. J Clin Oncol, 21: 1790-1797. 2003.
INAMOCHI, H.; HIGASHIGAWA, M.; SHIMONO, Y.; NAGATA, T.; CAO, D.C.; MAO,
X.Y.; M’SOKA, T.; HORI, H.; KAWASAKI, H. & SAKURAI, M. Delayed
cytotoxicity of 6-mercaptopurine is compatible with mitotic death caused by DNA
damage due to incorporation of 6- thioguanine into DNA as 6-thioguanine
nucleotide. J Exp Clin Cancer Res, 18: 417- 424.1999.
INGELMAN-SUNDBERG, M . Phamacogenetics: an opportunity of safer and more
efficient pharmacotherapy. J. Intern. Med, 250: 189-200. 2001.
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER (Brasil). Coordenação de Prevenção e
Vigilância de Câncer. Câncer da Criança e adolescente no Brasil: Dados dos
registros de base populacional e de mortalidade/Instituto Nacional de CâncerRio de Janeiro: INCA, 2008.200p.
INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER, Estimativa 2010/2011: incidência de
câncer no Brasil. Rio de Janeiro, 98p. 2009.
65
JABBOUR, E.J; FADERL, S. & KANTARJIAN, H.M. Adult acute lymphoblastic
leukemia. Mayo Clin Proc, 80: 1517-1527.2005.
JAFFE, E.S.; HARRIS, N.L.; STEIN, H. & VARDIMAN, J.W. World Health
Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of
Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon: IARC Press,
2001.352p.
JOHNSON, P.J.; MCFARLANE, I.G. & WILLIAMS, R. Azathioprine for long-term
maintenance of remission in autoimmune hepatitis. N Engl J Med, 333: 958963.1995.
JONSSON, O.G. & KAMEN, B.A. Methotrexate and childhood leukemia. Cancer
Invest, 9: 53-60. 1991.
KAPOOR, G.;
MAITRA,
A.
&
SOMLATA, BRAHMACHARI,
V.
Application
of SNaPshot for analysis of thiopurine methyltransferase gene polymorphism.
Indian J Med Res.,129: 500-555.2009.
KIRSCHNER, B.S. Safety of azathioprine and 6-mercaptopurine in pediatric patients
with inflammatory bowel disease. Gastroenterology, 115: 813–821.1998.
KISHI, S.; CHENG, C.; FRENCH, D.; PEI, D.; DAS, S.; COOK, E.H. et al. Ancestry
and pharmacogenetics of antileukemic drug toxicity. Blood, 109:4151–4157.
2007.
KONOGOROV, A.P.; IVANOV, V.K.; CHEKIN, S.Y. & KHAIT, S.E. A case-control
analysis of leukemia in accident emergency workers of Chernobyl. J Environ
Pathol Toxicol Oncol., 1-2: 143-151.2000.
KRYNETSKI, E.Y. & EVANS, W.E. Pharmacogenetics as a molecular basis for
individualized drug therapy: the thiopurine S-methyltransferase paradigm. Pharm
Res, 16: 342–349. 1999.
KRYNETSKI, E.Y.; SCHUTZ, J.D.; GALPIN, A.J.; PUI, C.H.; RELLING, M.V. &
EVANS, W.E. A single point leading to loss of catalytic activity in human
thiopurine s-methyltransferase. Proc. Natl. Acad.Science, 92: 949-953. 1995.
66
LANGE, B. The management of neoplastic disorders of haematopoiesis in children
with Down's syndrome.Br J Haematol, 3: 512-524.2000.
LANGE,
B.J.; BOSTROM,
B.C.; CHERLOW,
J.M.; SENSEL,
M.G.; LA,
M.K.; RACKOFF, W.; HEEREMA, N.A.; WIMMER, R.S.; TRIGG, M.E.; SATHER,
H.N.& CHILDREN'S CANCER GROUP. Double-delayed intensification improves
event-free survival for children with intermediate-risk acute lymphoblastic
leukemia: a report from the Children's Cancer Group. Blood, 99: 825-833. 2002.
LENNARD, L & SINGLETON, H.J. High-performance liquid chromatographic assay
of methyl and nucleotide metabolites of 6-mercaptopurine: quantitation of red
blood
cell
6-thioguanine
nucleotide,
6-thioinosinic
acid
and
6
methylmercaptopurine metabolites in a single sample. J. Chromatogr, 583: 8390. 1992.
LENNARD, L. & LILLEYMAN, J. S. Individualizing therapy with 6-mercaptopurine and
6-thioguanine related to the thiopurine methyltransferase genetic polymorphism.
Ther. Drug Monit. 18, 328–334. 1996.
LENNARD, L. & LILLEYMAN, J.S. Variable mercaptopurine metabolism and
treatment outcome in childhood lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol, 7:1816–
1823.1989.
LENNARD, L., VAN LOON, J.A. & WEINSHILBOUM, R.M. Pharmacogenetics of
acute azathioprine toxicity: relationship to thiopurine methyltransferase genetic
polymorphism. Clin. Pharmacol. Ther, 46: 149–154. 1989.
LENNARD, L.; GIBSON, B.E.; NICOLE, T. & LILLEYMAN, J.S. Congenital thiopurine
methyltransferase deficiency and 6-mercaptopurine toxicity during treatment for
acute lymphoblastic leukaemia. Arch Dis Child, 69: 577-579.1993.
LENNARD, L.; LILLEYMAN, J.S.; VAN LOON, J. & WEINSHILBOUM, R.M. Genetic
variation in response to 6-mercaptopurine for childhood acute lymphoblastic
leukemia. Lancet, 336: 225–229.1990.
LENNARD, L.; WELCH, J.C. & LILLEYMAN, J.S. Thiopurine drugs in the treatment
of childhood leukaemia: the influence of inherited thiopurine methyltransferase
67
activity on drug metabolism and cytotoxicity. Br J Clin Pharmacol, 44: 456461.1997.
LEWIS LD, BENIN A, SZUMLANSKI CL, et al. Olsalazine and 6- Mercaptopurinerelated bone marrow suppression: a possible drugdrug interaction. Clin
Pharmacol Ther 1997, 62: 464-75. 1997.
LOENNECHEN, T.; YATES, C.R.; FESSING, M.Y.; RELLING, M.V.; KRYNETSKI,
E.Y. & EVANS, W.E. Isolation of a human thiopurine Smethyltransferase (TPMT)
complementary DNA with a single nucleotide transition A719G (TPMT*3C) and
its association with loss of TPMT protein and catalytic activity in humans. Clin
Pharmacol Ther, 64: 46–51.1988.
LOURO, ID.; LIERENA JR., J.C.; VIEIRA MELO,
M.S. & ASHTON-PROLLA, P.
Genética Molecular do Câncer. 2ªed.São Paulo: MSG Produção Editorial,
2002.
LYSAA, R.A.; GIVERHAUG, T.; WOLD, H.L. & AARBAKKE, J. Inhibition of human
thiopurine
methyltransferase
by
furosemide,
bendroflumethiazide
and
trichlormethiazide. Eur J Clin Pharmacol, 49: 393-6. 1996.
MARINAKI, A.M.; ANSARI, A.; DULEY, J. A. et al. Adverse drug reactions to
azathioprine therapy are associated with polymorphism in the gene encoding
inosine triphosphate pyrophosphatase (ITPase). Pharmacogenetics, 14: 181-7.
2004.
MCLEOD, H. L.; KRYNETSKI, E.Y.; RELLING, M.V. & EVANS, W.E. Genetic
polymorphism of thiopurine methyltransferase and its clinical relevance for
childhood acude lymphoblastic leukemia. Leukemia, 14: 567-572. 2000.
MCLEOD, H.L. & EVANS, W.E. Pharmacogenomics: unlocking the human genome
for better drug therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 41: 101-21. 2001.
MCLEOD, HL.; LIN, J.S.; SCOTT, E.P.; PUI, C.H. & EVANS, W.E.
Thiopurine
methyltransferase activity in American white subjects and black subjects. Clin
Pharmacol Ther, 55: 15–20.1994.
68
MCLEOD,HL. & SIVA, C. The thiopurine S-methyltransferase gene locus -implications for clinical pharmacogenomics. Pharmacogenomics, 3: 89-98.
2002.
MEYER, U.A. Pharmacogenetics – five decades of therapeutic lessons from genetic
diversity. Nature, 5: 669-676.2004.
MILLER, R.W. & MACKAY, F.W. Decline in US childhood cancer mortality. 150
though 1980. JAMA, 251: 1567-1570. 1984.
MILLER, R.W. Childhood cancer and congenital defects. A study of U.S. death
certificates during the period 1960-1966. Pediatr.Res, 3: 389-397.1969.
MIRANDA, R. P. A.; ROCHA, R. P.; JÚDICE, M. O.; ALVES, E. & TUBINO, P.
Neutropenia febril : experiência do serviço de oncologia pediátrica do centro de
cirurgia pediátrica do Hospital Universitário da Universidade de Brasília. Brasília
Médica, 39: 16-21. 2002.
MOHAN, A.; HAUPTMANN,
B.; BOICE,
J.; MANDEL,
M.; DOODY, M.; FREEDMAN, D.; ALEXANDER,
J. CORREA-VILLASENOR,
A.; MATANOSKI,
G.
& LINET, M. Mortality among radiologic technologists in the united states (19261997). 2(nd) Follow up. Ann Epidemiol, 7: 480. 2000.
MULLIGHAN, C.G. Genomic analysis of acute leukemia. Int J Lab Hematol, 31:
384-397.2009.
NOSKIN, G.A.; PHAIR, J.P. & MURPHY,R.L. Diagnosis and management of
infection in the immunocompromised host. In: SCHULMAN, S.T. et al. Infectious
Diseases. 5ª ed. U.S.A.: Saunders Company, 1997.cap.24, p.361-381.
OLIVEIRA, E.; QUENTAL, S.; ALVES, S.; AMORIM, A. & PRATA, M.J. Do the
distribution patterns of polymorphisms at the thiopurine S-methyltransferase
locus in sub-Saharan populations need revision? Hints from Cabinda and
Mozambique. Eur J Clin Pharmacol, 7:703-6. 2007.
ONICIU, M. Acute Lymphoblastic Leukemia. Hematol Oncol Clin North Am, 23:
655-674. 2009.
69
OTTERNESS, D. M.; SZUMLANSKI, C.L.; WOOD, T. C. & WEINSHILBOUM, R. M.
Human thiopurine methyltransferase pharmacogenetics. Kindred with a terminal
exon splice junction mutation that results in loss of activity. J Clin Invest, 101:
1036–1044. 1998.
OTTERNESS,
D.;
SZUMLANSKI,
C.;
LENNARD,
L.;
KLEMETSDAL,
B.;
AARBAKKE, J.; PARK-HAH, J. O.; IVEN, H.; SCHMIEGELOW, K.; BRANUM,
E.; O BRIEN, J. & WEINSHILBOUM, R. Human thiopurine methyltransferase
pharmacogenetics: gene sequence polymorphisms. Clin Pharmacol Ther, 62:
60–73.1997.
PAGANINI, H. R. Diez pautas básicas para el manejo del paciente oncológico con
neutropenia y fiebre. Archivos Argentinos de Pediatría, 97: 116-123. 1999.
PINKEL, D. Five-year follow-up of “total therapy” of childhood lymphocytic leukemia.
JAMA, 216: 648-652. 1971.
PIZZO, P.A. Management of fever in patients with câncer and treatment-induced
neutropenia. The New England Journal of Medicine, United Kingdon, v. 328,
n.18, p.1323-1332, 1993.
PIZZO, P.A., Poplack David G. Principles and Practice of Pediactric Oncology. 6
ed. 2011.
PRESENT, D.H.; KORELITZ, B.I.; WISCH, N.; GLASS, J.L.; SACHAR, D.B.&
PASTERNACK, B.S. Treatment of Crohn’s disease with 6- mercaptopurine. A
long-term, randomized, double-blind study. N Engl J Med, 302:981–987.1989.
PUI, C.H. & EVANS, W.E. Treatment of cute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med,
354: 166-178. 2006.
PUI, C.H. Acute Lymphoblastic leukemia in children. Curr Opin Oncol, 12: 3-12.
2000.
PUI, C.H.; RELLING, M.V. & DOWNING, J.R. Acute Lymphoblastic Leukemia. N
Engl.J. Med, 350: 1535-1548. 2004.
PULSONI, A.; STAZI, A.; COTICHINI, R.; ALLIONE, B.; CERRI, R.; DI BONA, E. et
al. Acute Promyelocytic leukaemia: epidemiology and risk factors. A report of the
70
GIMEMA Italian archive of adult acute leukaemia. GIMEMA Cooperative Group.
Eur J Haematol, 61:327-332. 1998.
RANG,
H.P.;
DALE,
M.M.
&
RITTER,
J.M.
Agentes
antibacterianos.
Farmacologia. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. 2001. 703p.
RAY-COQUARD, I.; GHESQUIERE, H.; BACHELOT, T.; BORG, C.; BIRON, P.;
SEBBAN, C. & et al. Identification of patients at risk for early death after
convential chemotherapy in solid tumours and lymphomas. Br J Cancer, 85:
816-22. 2001.
REIS, M. Farmacogenética aplicada ao câncer. Quimioterapia Individualizada e
especificidade molecular. Simpósio: Farmacogenética, 39: 577-586. 2006.
REIS, M.; SANTORO, A. & SUAREZ-KURTZ, G. Thiopurine methyltransferase
phenotypes and genotypes in Brazilians. Pharmacogenetics, 13:371–373.
2003.
RELLING ,M.V.; GARDNER, E.E.; SANDBORN, W.J.; SCHMIEGELOW, K.; PUI, CH.; YEE, S.W .; STEIN, C.M.; CARRILLO, M.; EVANS, W.E. & KLEIN, T.E.
Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium Guidelines for Thiopurine
Methyltransferase Genotype and Thiopurine Dosing.Clinical Pharmacology &
Therapeutics, 89: 387–391.2010.
RELLING, M.V.; HANCOCK, M.L.; BOYETT, J.M.; PUI, C-H. & EVANS, W.E.
Prognostic importance of 6-mercaptopurine dose intensity in acute lymphoblastic
leukemia. Blood, 93: 2817-2823.1999.
ROSS,
J.A.
Dietary
flavonoids
and
the MLL gene:
A
pathway
to
infant
leukemia?Proc Natl Sci U.S.A, 9: 4411-4413.2000.
ROSS, J.A. Maternal diet and infant leukemia: a role for DNA topoisomerase II
inhibitors? Int J Cancer Suppl, 11:26-28. 1998.
ROSS, J.A; POTTER, J.D.; SHU, X.O.; REAMAN, G.H.; LAMPKIN, B. & ROBISON,
L.L. Evaluating the relationships among maternal reproductive history, birth
characteristics, and infant leukemia: a report from the Children's Cancer Group.
Ann Epidemiol, 3: 172-179. 1997.
71
ROWLEY, J.D. Melecular genetics in acute leukemia. Leukemia, 14: 513-517.2000.
SACHS, L. The control of hematopoiesis and leukemia: from basic biology to the
clinic. Proc Natl Acad Sci USA, 93: 4742-4749. 1996.
SADEE, W. & DAI, Z. Pharmacogenetics/genomics and personalized medicine. Hum
Mol Genet, 14: R207-14. 2005.
SALAVAGGIONE, O.E.; WANG, L.; WIEPERT, M.; YEE, V.C. & WEINSHLBOUM,
R.M. Thiopurine S- methyltransferase pharmacogenetics: Variant allele function
and comparative genomics. Pharmacogenet genomics, 15: 801-815. 2005.
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F. & MANIATIS, T. Molecular Cloning: A laboratory
manual. 2 ed. Cold Spring Habor Laboratory Press, New York, 1989.
SANDBORN, W. J.; TREMAINE, W.J.; WOLF, D. C.; TARGAN, S.R.; SNINSKY,
C.A.; SUTHERLAND, L.R.; HANAUER, S.B.; MCDONALD, J.W.; FEAGAN, B.G.;
FEDORAK, R.N.; ISAACS, K.L.; PIKE, M.G.; MAYS, D.C.; LIPSKY, J.J.;
GORDON, S.; KLEOUDIS, C.S. & MURDOCK, R. H. JR. Lack of effect of
intravenous administration on time to respond to azathioprine for steroid-treated
Crohn’s disease. North American Azathioprine Study Group. Gastroenterology,
117: 527–535. 1999.
SANDBORN, W.; SUTHERLAND, L.; PEARSON, D.; MAY, G.; MODIGLIANI,R.&
PRANTERA, C. Azathioprine or 6-mercaptopurine for induction of remission in
Crohn’s
disease.Cochrane
Database
Syst
Rev.
DULEY,
J.
DOI
10.1002/14651858.CD000545.
SANDERSON,
J.;
ANSARI,
A.;
MARINAKI,
T.&
Thiopurine
methyltransferase: should it be measured before commencing thiopurine drug
therapy? Ann Clin Biochem, 41:294-302.2004.
SANTOS, N.P.C.; RIBEIRO-RODRIGUES, E. M.; RIBEIRO-DOS-SANTOS, A.K.C.;
PEREIRA, R.; GUSMÃO, L.; AMORIM, A.; GUERREIRO, J.F.; ZAGO, M.A.;
MATTE, C.; HUTZ, M.H. & SANTOS, S.E. Assessing individual interethnic
admixture and population substructure using a 48 insertion-deletion ancestry
informative markers panel. Human mutation, 31:184-90. 2010.
72
SANTOS, S.E.B. & GUERREIRO,J.F. The indigenous contribution to the formation
of the Brazilian Amazon Region. Brasil genet,1995.
SCHMIEGELOW, K. et al. Thiopurine methyltransferase activity is related to the risk
of relapse of childhood acute lymphoblastic leukemia: results from the NOPHO
ALL-92 study. Leukemia, 23: 557–564. 2009.
SEVERSON, R.K.; BUCKLEY, J. D.; WOODS, W.G.; BENJAMIN, D. & ROBISON, L.
L. Cigarette Smoking and alcohol consum ption by parents of children with acute
myeloid leukemia: an analysis within morphological sub groups-a report from the
Childrens Cancer Group. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2: 433-439.
1993.
SHAPIRO, R.; YOUNG, J.B.; MILFORD, E.L.; TROTTER, J.F.; BUSTAMI, R.T. &
LEICHTMAN, A.B. Immunosuppression: evolution in practice and trends, 19932003. Am J Transplant, 5: 874-86. 2005.
SHAW,
M.
P.; EDEN,
O.
B.;
GRACE,
E.
&
ELLIS,
P.
M.
Acute
lymphoblastic leukemia and Klinefelter's syndrome. Pediatr Hematol Oncol.,1:
81-85.1992.
SHU, X. O.; ROSS, J. A.; PENDERGRASS, T.W.; REAMAN, G.H.; LAMPKIN, B. &
ROBISON, L.L. Parental alcohol consum ption, cigarette smoking, and risk of
infant leukemia: a Childrens Cancer Group study. J Natl Cancer Inst, 88: 24-31.
1996.
SHUFENG, ZHOU. Clinical Pharmacogenomics of Thiopurine S-methyltransferase.
Current Clinical Pharmacology, 1: 119-128. 2006.
SILVA, M. R. Polimorfismo do gene da Tiopurina Metiltransferase (TPMT) em
uma população de crianças e adolescentes com Leucemia Linfocítica
Aguda (LLA). Dissertação de Mestrado. Belo Horizonte. Universidade Federal
de Minas Gerais, 2007, 124p.
SILVA, W.L.; ALMEIDA, G.V.; HAMOY, M. & WANDERLEY, A.V. Perfil clínico dos
efeitos tóxicos oriundos da quimioterapia e sobrevida em pacientes pediátricos
portadores de Leucemia Linfoblástica Aguda em municípios da Região
Amazônica. Simpósio de Hematologia, Belém, PA: UFPA, 2011.
73
SIMONE, J.V.; VERZOSA, M.S. & RUDY, J.A. Initial features and prognosis in 363
children with acute lymphocytic leukemia. Cancer , 36: 2099-2108.1975.
SMITH, M.A. & RIES, L,A,G. Childhood cancer: incidence, survival, and mortality. In:
Pizzo PA, Poplack DG, editors. Principles and practice of pediatric oncology.
4th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2002. p.1-12.
SNYDER , R. Recent developments in the understanding of benzene toxicity and
leukemogenesis.Drug Chem Toxicol, 1:13-25. 2000.
STANULLA, M.; SCHAEFFELER, E.; FLOHR, T.; CARIO, G.; SCHRAUDER, A;
ZIMMERMANN, M.; WELTE, K. LUDWIG, W.D, BARTRAM, C.R.; ZANGER,
U.M.; EICHELBAUM, M.; SCHRAPPE, M.; & SCHWAB, M. Thiopurine
methyltransferase
(TPMT)
genotype
and
early
treatment
response
to
mercaptopurine in childhood acute lymphoblastic leukemia. JAMA, 293: 14851489.2005.
STEARNS, V. & RAE, J.M. Pharmacogenetics and breast cancer endocrine therapy:
CYP2D6 as a predictive factor for tamoxifen metabolism and drug response.
Expert reviews in molecular medicine, 10: 34. 2008.
STEPHENS, M.;
SMITH, N.J. &
DONNELLY, P. A new statistical method for
haplotype reconstruction from population data. Am J Hum Genet, 68: 978–989
2001.
STOCCO, G. et al. Genetic polymorphism of inosine triphosphate pyrophosphatase
is a determinant of mercaptopurine metabolism and toxicity during treatment for
acute lymphoblastic leukemia. Clin. Pharmacol. Ther, 85: 164–172. 2009.
SUAREZ-KUTZ, G.Pharmacogenomics in admixed populations.Trends Pharmacol,
Sci. 26: 196-201.2005.
SWANN, P.F.; WATERS, T.R.; MOULTON, D.C.; XU, Y.Z.; ZHENG, Q.; EDWARDS,
M. & MACE, R. Role of postreplicative DNA mismatch repair in the cytotoxic
action of thioguanine. Science, 5278: 1109-1111.1996.
74
SZUMLANSKI, C. L & WEINSHILBOUM, R. M. Sulphasalazine inhibition of
thiopurine methyltransferase: possible mechanism for interaction with 6mercaptopurine and azathioprine. Br J Clin Pharmacol, 39: 456-9. 1995.
TAI, H. L.; KRYNETSKI, E.Y.; SCHUETZ, E.G.; YANISHEVSKI, Y. & EVANS, W.E.
Enhanced Proteolysis of thiopurine S-methyltransferase (TPMT) encoded by
mutants alleles in humans (TPMT*3A, TMPT*2): mechanisms for the genetic
polymorphism of TPMT activity. Pro Natl Acad Sci, 94: 6444-6449. 1997.
TAI, H.L.; KRYNETSKI, E.Y.; YATES, C.R.; LOENNECHEN, T.; FESSING, M.Y.;
KRYNETSKAIA,
N.F.
&
EVANS,
W.E.
Thiopurine
S-methyltransferase
deficiency: two nucleotide transitions define the most prevalent mutant allele
associated with loss of catalytic activity in Caucasians. Am J Hum Genet, 58:
694–702.1996.
TAJA-CHAYEB, L.; VIDAL-MILLÁN, S.; GUTIÉRREZ, O.; OSTROSKY-WEGMAN,
P.;
DUENÃS-GONZÁLEZ,
A.
&
CANDELARIA,
M.
Thiopurine
S-
methyltransferase Gene (TMPT) polymorphisms in. Med Oncol, 25: 56-62.
2008.
TAY, B.S.; LILLEY, R.M.; MURRAY, A.W.& ATKINSON, M.R. Inhibition of
phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase from Ehrlich ascites-tumour
cells by thiopurine nucleotides. Biochem Pharmacol 18: 936–938. 1969.
TIDD, D.M. & PATERSON, A.R. A biochemical mechanism for the delayed cytotoxic
reaction of 6-mercaptopurine. Cancer Res 1974, 34: 738-46.1975.
ULRICH,
C.M.;
ROBIEN,
K.;
MCLEOD,
H.L.
Cancer
pharmacogenetics:
polimorphisms, pathways and beyond. Nature Reviews Cancer, 3.2003.
VESSEY,
C.
J.; NORBURY,
C.
J.
&
HICKSON,
I.
D.
Genetic
disorders associated with cancer predisposition and genomic instability. Prog
Nucleic Acid Res Mol Biol, 63: 189-221. 1999.
VOGELSTEIN, B. & KINZLER, K.W. Cancer genes and the pathways they control.
Nat Med, 10: 789-799.2004.
75
WANG,L.; MCLEOD,H.L.& WEINSHILBOUM,R.M.Genomics and drug response.
N
Engl J Med., 364: 1144-1153.2011.
WAYNE, A.S.; BAIRD, K. & EGELER, R.M. Hematopoietic Stem Cell Transplantation
for Leukemia. Pediatric. Clin. N. Am., 57: 1–25. 2010.
WEINSHILBOUM, R. & WANG, L. Pharmacogenomics: Bench To Bedside. Nature
Reviews, 3: 739-748.2004.
WEINSHILBOUM, R. Thiopurine pharmacogenetics: clinical and molecular studies of
thiopurine methyltransferase. Drug Metab Dispos , 29: 601 605.2001.
WEINSHILBOUM, R.M. & SLADEK, S.L. Mercaptopurine pharmacogenetics:
monogenic inheritance of erythrocyte thiopurine methyltransferase activity. Am J
Hum Genet, 32:651–662.1980.
WEINSHILBOUM, R.M.; OTTERNESS, D.M. & SZUMLANSKI, C.L. Methylation
pharmacogenetics: catechol O-methyltransferase, thiopurine methyltransferase,
and histamine N-methyltransferase. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 39:19–52.
1999.
WELCH, G.H & BLACK, W.C. Are deaths within 1 month of cancer-directed surgery
attribuited to cancer? J Natl Cancer Inst, 94:1066-70.2002.
WOODSON,
L.C.
&
methyltransferase.
WEINSHILBOUM,
Purification
and
R.M.
Human
biochemical
kidney
thiopurine
properties.
Biochem
Pharmacol, 32:819-826. 1983.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. World Cancer Report, 2008. International
Agency for Research on Cancer, Lyon. 2009.
YATES, C.R.; KRYNETSKI, E.Y.; LOENNECHEN, T.; FESSING, M.Y.; TAI, H.L.;
PUI, C.H.; RELLING, M.V.; EVANS, W.E. Molecular diagnosis of thiopurine Smethyltransferase deficiency: genetic basis for azathioprine and mercaptopurine
intolerance. Ann Intern Med, 126:608–614.1997.
ZAGO, M.A.; FALCÃO, R. P. & PASQUINI, R. Hematologia: Fundamentos e
Prática.1ª Ed. São Paulo: Editora Atheneu, 2004.
76
ZIMM, S.; COLLINS, J.M.; O’NEILL, D.; CHABNER, B.A. & POPLACK, D.G.
Inhibition of first-pass metabolism in cancer chemotherapy: interaction of 6mercaptopurine and allopurinol. Clin Pharmacol Ther, 34: 810–817.1983.
ZIPURSKY, A.; BROWN, E.; CHRISTENSEN, H.; SUTHERLAND, R. & DOYLE, J.
Leukemia and/or myeloproliferative syndrome in neonates with Down syndrome.
Semin Perinatol., 1: 97-101.1997.