Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da

Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Dissertação de Mestrado
Desenvolvimento e caracterização de
microcápsulas de alginato/quitosana contendo
ácido retinóico e óleo de babaçu
FABIANA TOLÊDO VELLOSO
Recife, 2008
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Mestranda Fabiana Tolêdo Velloso
Desenvolvimento e caracterização de
microcápsulas de alginato/quitosana contendo
ácido retinóico e óleo de babaçu
Dissertação de mestrado aprovada pelo Programa
de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas do
Centro de Ciências da Saúde da Universidade
Federal de Pernambuco, como requisito para
obtenção do grau de Mestre na linha de pesquisa:
Produção e Controle de Medicamentos.
Mestranda: Fabiana Tolêdo Velloso
Orientador: Prof. Dr. Davi Pereira de Santana
Co-orientadora: Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães
Recife, 2008
Dedico este trabalho à minha
família que me forneceu tanto
suporte
emocional
quanto
financeiro, a Deus por ter sido
sempre tão bondoso comigo e ao
meu filho Gabriel que ainda está por
nascer, mas que tanto me deu forças
para que eu pudesse finalizar esta
dissertação.
AGRADECIMENTOS
Embora uma dissertação seja, pela sua finalidade acadêmica, um trabalho individual,
há contribuições de natureza diversa que não podem nem devem deixar de ser
realçadas. Por essa razão, desejo expressar os meus sinceros agradecimentos:
Aos meus pais por terem sempre me proporcionado a melhor educação possível, por
sempre terem sido dedicados, preocupados e atenciosos. Agradeço, de forma muito
carinhosa, a atuação de minha mãe no período de construção deste trabalho. Sua
paciência infinita e sua crença absoluta na minha capacidade de realização,
indubitavelmente, foram elementos propulsores desta dissertação.
Às minhas irmãs Roberta e Fernanda pela companhia e lealdade. Uma atenção
especial para Roberta que me estendeu a mão, me emprestou o ombro e me aconselhou
num dos momentos mais difíceis da minha vida.
Ao meu namorado Allan que sempre tentou entender minhas dificuldades e minhas
ausências, procurando se aproximar de mim através da própria dissertação, por ele
cuidadosamente lida, às vezes digitada. Agradeço-lhe, por me proporcionar a
felicidade de poder ser mãe, gerar uma criança linda dentro de mim – Nosso filho
Gabriel.
Ao meu filho Gabriel que ainda nem chegou nesse mundo, mas que tanto me fortaleceu.
À Deus que sempre esteve ao meu lado, segurando na minha mão e me mostrando que
se naquele momento não tava dando certo eu não me preocupasse e continuasse
seguindo em frente, pois assim, Ele me mostraria que tudo se resolveria num passe de
perseverança.
A todos os meus familiares principalmente a minha avó Vera e meu avô Géber que
sempre me trataram como se eu fosse mais que uma filha. Sempre com palavras certas,
gestos carinhosos e muito orgulho da neta!
Ao Prof. e Dr. Davi Pereira de Santana por ter aceito a orientação da minha
dissertação, por sempre ter sido uma pessoa maravilhosa, dedicada, que me ensinou
muitas coisas entre elas a viver mais feliz e sempre lutar pelos meus ideais. Além de um
grande mestre é um grande amigo. Agradeço também por todo apoio financeiro.
À minha Co-orientadora Profa. e Dra. Nereide Stela Santos Magalhães por ter me
aceitado de braços abertos, pelo seu profissionalismo exemplar e por ter me orientado
com grande estima.
À Profa. e Dra. Ana Amélia Lira que me auxiliou com plena dedicação, consideração,
carinho e amizade.
À Rafaela Ferraz, aluna de iniciação científica, pelo apoio técnico, dedicação e
amizade durante todo o desenvolvimento do projeto.
Aos amigos Farmacêuticos Catarine, Jenayce e Alexandre pela disponibilidade sempre
manifestada.
À amiga Marianne Lira por ter me inspirado e pelo apoio irrestrito de sempre.
À amiga Danielle Di Cavalcanti por sempre estar dispostas a me ajudar sem nunca se
importar com o que quer que fosse.
Às amigas Analice, Natália, Tatiana, Cris, Mariana, Cris Perez, Kika, Isabela, por
todos os nossos almoços, encontros, farras, casamentos, chás de panela, pois eles
sempre foram muito saudáveis para desopilar. Nove mulheres fofocando, depois de
beber algumas caipiroscas, só saia um monte de besteiras. Ainda bem que vocês fazem
parte da minha vida! Nesse grupo de mulheres faltou um homem que infelizmente não
está mais aqui com a gente, mas tenho certeza que ele estaria mega feliz em
compartilhar esses momentos com a gente. Mesmo ausente continua presente sendo um
grande Exemplo de vida – Tiago Haig Toscano!
À amiga Adriana Lima pelas palavras de conforto nas horas certas.
À amiga Palloma Braga por toda sua irreverência.
À toda a Família Tolêdo que não mora aqui em Recife, mas que sempre torceu com
todo afeto e energias positivas por mim.
À toda a família Velloso principalmente a Ana Maria e Cláudia Velloso que são dois
grandes exemplos de mulheres profissionais e dedicadas, as quais sempre me serviram
como fonte de inspiração.
À família Villela por ser grandiosa em todos os sentidos, por possuir pessoas tão
maravilhosas como Marquinhos e Cris.
À professora Suzene Izídio, o professor Munfred e a Roberta por terem me ajudado
durante o desenvolvimento do projeto.
À todo o grupo SLC Catarine, André, Débora, Rafaela, Ellis, Milena, Islene, Valdenice,
Isabela pela compreensão, convivência e companheirismo.
Ao pessoal do NUDFAC Talita, Júlio, Juliana e Karine.
À André Luis por ter me auxiliado e me aconselhado durante as cinéticas de liberação
in vitro.
À Karina por ter me dado uma direção de como realizar alguns experimentos.
Ao pessoal da bioequivalência Danilo Bedor, Eduardo Miranda e Denis pelo auxílio
nas análises cromatográficas.
Ao pessoal da Farmácia Escola Carlos Drummond de Andrade Karine, Homero,
Olívia, Elisson e a todos os outrosfuncionários.
Aos funcionários do LIKA em geral e principalmente a Rafael, por liofilizar minhas
amostras, a Sérgio por sempre estar pronto para ajudar e a Vera por sempre ter sido
um doce de pessoa.
À todos aqueles que colaboraram direta ou indiretamente para realização deste
trabalho meus sinceros agradecimentos.
SUMÁRIO
LISTAS DE FIGURAS
I
LISTAS DE TABELAS
III
RESUMO
IV
ABSTRACT
V
1. Introdução
1
2. Revisão da Literatura
4
2.1 Sistemas de liberação controlada de fármacos
5
2.1.2 Microencapsulação
6
2.1.3 Polímeros para revestimento de micropartículas
8
2.1.3.1 Quitosana
9
2.1.3.2 Alginato
10
2.1.4 Principais métodos para obtenção das micropartículas de
alginato/quitosana
12
2.1.5 Mecanismo de liberação do ativo microencapsulado
13
2.2 Cinética de liberação in-vitro
13
2.3 Via tópica
15
2.3.1 Anatomia e fisiologia da pele
15
2.3.2 A função barreira da pele
18
2.3.3 Penetração de fármacos através da pele
19
2.3.4 Capacidade de Hidratação da Pele
22
2.3.5 Avaliação da hidratação cutânea
23
2.4. Ácido retinóico
2.4.1. Aspectos toxicológicos do ácido retinóico tópico
24
27
2.4.1.1. A dermatite retinóide
27
2.4.1.2. A absorção sistêmica
28
2.4.2. Estabilidade do ácido retinóico
28
2.4.3 Efeitos do ácido retinóico no envelhecimento cutâneo
30
3. Objetivos
32
3.1 Geral
33
3.2 Específicos
33
4. Artigo I
34
Resumo
35
Abstract
36
1. Introdução
37
2. Materiais e método
39
2.1. Materiais
39
2.2. Obtenção de microcápsulas de alginato e microcápsulas de
alginato/quitosana contendo ácido retinóico disperso em óleo de babaçu
39
2.3. Caracterização físico-química das microcápsulas de alginato e
alginato/quitosana contendo ácido retinóico disperso em óleo de babaçu
40
2.3.1. Rendimento das microcápsulas
40
2.3.2. Tamanho e morfologia das microcápsulas
40
2.3.3. Taxa de encapsulação das microcápsulas
40
2.3.4. Estudo de interação entre o ácido retinóico e constituintes das
microcápsulas utilizando espectroscopia em IV com transformada de
Fourier (FTIR)
41
2.4. Estudo de liberação in vitro das microcápsulas de alginato/quitosana
contendo ácido retinóico disperso em óleo de babaçu
41
2.5. Condições cromatográficas para a quantificação do AR por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
42
3. Resultados e discussão
43
3.1. Obtenção de microcápsulas de alginato e microcápsulas de
alginato/quitosana contendo ácido retinóico disperso em óleo de babaçu
3.2.
Caracterização
físico-química
de
microcápsulas
43
de
alginato/quitosana contendo ácido retinóico disperso em óleo de babaçu
46
3.2.1. Determinação do rendimento, da taxa de encapsulação,
potencial zeta e tamanho de partículas das microcápsulas de
alginato/quitosana contendo do ácido retinóico e óleo de babaçu
46
3.2.2. Morfologia das microcápsulas
48
3.3.3. Estudo de interação entre o ácido retinóico e constituintes das
microcápsulas de alginato/quitosana contendo do ácido retinóico e
óleo de babaçu utilizando espectroscopia em IV com transformada de
Fourier (FTIR)
3.3.4 Estudo do perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir
50
de microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu
53
Conclusão
55
Referências bibliográficas
56
5. Referências bibliográficas
59
6. Anexos
70
Artigo II
71
Submissão do artigo II à RBCF
72
Resumo
74
Abstract
75
1. Introdução
76
2. Materiais e métodos
78
2.1. Reagentes e materiais
78
2.2. Condições cromatográficas
78
2.3. Validação do método analítico para o ácido retinóico
78
2.3.1. Curva analítica do ácido retinóico
2.3.1.1. Linearidade
79
79
2.3.2. Seletividade
79
2.3.3. Precisão e exatidão
79
2.4. Obtenção das microcápsulas de alginato/quitosana
contendo ácido retinóico e óleo de babaçu
2.5. Estudo de liberação in vitro das microcápsulas
3. Resultados e discussão
3.1. Validação do método analítico para o ácido retinóico
80
80
81
81
3.1.1. Linearidade
81
3.1.2. Precisão e exatidão
85
3.1.3. Seletividade
86
3.2 Aplicação do método validado na avaliação da cinética de
liberação in vitro do ácido retinóico a partir de microcápsulas de
alginato/quitosana incorporadas em gel natrosol®
87
4. Conclusão
88
5. Referências bibliográficas
89
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1: Microfotografias de micropartículas: microcápsula (a) e microesfera
(b)
8
Figura 2. Fórmula estrutural da quitosana
10
Figura 3. Fórmula estrutural do alginato
11
Figura 4. Figura ilustrativa de uma célula de difusão
14
Figura 5. Fotorafia de uma célula de difusão in vitro (tipo Franz)
14
Figura 6. Representação esquemática da estrutura da pele
16
Figura 7. Representação esquemática da bicamada lipídica do corneócito
17
Figura 8. Representação esquemática dos mecanismos de penetração de
substâncias (vias intercelular e transcelular) através do estrato córneo
20
Figura 9. Representação esquemática dos mecanismos de penetração de
substâncias (via transepidémica e via apêndice) através da pele humana, 1 =
glândula sebácea, 2 = via transepidérmica e 3 = folículo piloso
21
Figura 10. Estrutura química da tretinoína
25
Figura 11. Estrutura química da isotretinoína
25
ARTIGO I
Figura 1. Fotografias de microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido
retinóico a 0,5 % e óleo de babaçu a 30 % (F11)
49
Figura 2. Fotomicrografias de microcápsulas de alginato/quitosana contendo AR
a 0,5 % e cavidade preenchida com óleo de babaçu a 30 % (F11). Microscopia
eletrônica de varredura
49
Figura 3. Espectro comparativo de FTIR do AR (linha contínua), do óleo de
babaçu (linha tracejada) e da mistura física AR e óleo de babaçu 1:1 (p/p). (linha
pontilhada). A = estrutura do AR
51
Figura 4. Espectros FTIR das microcápsulas de alginato/quitosana com AR
(0,5%) (linha contínua) e sem AR (brancas) (linha tracejada) em comparação
com o AR puro (linha pontilhada). A = alginato, B = quitosana
52
I
Figura 5. Perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir das
microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu. As formulações
utilizadas foram as F11 [AR (0,5%) e Q (0,1%)] e F8 [AR (0,5%) e Q (0,05%)]
54
ARTIGO II
Figura 1. Representação do cromatograma do ácido retinóico obtido por CLAEUV a 350 nm
83
Figura 2. Cromatogramas da análise de microcápsulas de alginato/quitosana
incorporadas em gel natrosol® sem fármaco (A) e com ácido retinóico disperso
em óleo de babaçu (B)
86
Figura 3. Perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir das microcápsulas
de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu
87
II
LISTA DE TABELAS
REVISÃO DA LITERATURA
Tabela1. Trabalhos recentes sobre microencapsulação de diferentes substâncias
utilizando diferentes métodos
9
ARTIGO I
Tabela 1. Avaliação da influência da porcentagem de óleo babaçu no
rendimento do processo de obtenção das microcápsulas de alginato
44
Tabela 2. Avaliação da influência da presença do AR (0,1%) no rendimento das
microcápsulas de alginato com concentrações variadas de óleo de babaçu
44
Tabela 3. Influência da concentração de AR no rendimento e na taxa de
encapsulação das microcápsulas de alginato contendo óleo de babaçu (30 %)
45
Tabela 4: Apresentação dos resultados dos tamanhos das microcápsulas de
alginato
45
Tabela 5. Valores do rendimento do processo e da taxa de encapsulação das
microcápsulas de alginato/quitosana contendo 2% de alginato e 30% de óleo
47
Tabela 6. Apresentação dos resultados dos tamanhos das microcápsulas
48
ARTIGO II
Tabela I - Dados das curvas analíticas autênticas
82
Tabela II - Valores obtidos na avaliação da precisão e exatidão intra-ensaio
85
Tabela III - Valores obtidos na avaliação da precisão e exatidão inter-ensaio
85
III
RESUMO
O ácido retinóico (AR) tem sido largamente utilizado em formulações dermatológicas
para o tratamento de acne, distúrbios de queratinização como psoríase e também em
formulações cosméticas com a finalidade de reduzir os efeitos do fotoenvelhecimento,
celulite e estrias. Entretanto, apesar de seus efeitos benéficos provoca irritação local
manifestada na forma de eritema, queimação, coceira, secura e descamação da pele,
além de ser instável na presença de ar e luz e pobremente solúvel na água. Para resolver
estes problemas, microcápsulas (MC) de alginato/quitosana contendo AR e óleo de
babacu, foram preparadas com o propósito de proteger e promover uma liberação
sustentada do AR e o óleo de babaçu foi acrescentado para evitar o ressecamento
causado pelo AR. Devido ao alto tempo de retenção encontrado na literatura e a
sensibilidade do AR à luz e ao calor na primeira parte deste trabalho um método rápido
e sensível para o doseamento do AR em microcápsulas de alginato/quitosana contendo
óleo de babaçu dispersas em gel natrosol® foi desenvolvido e validado por
cromatografia líquida de alta eficiência associada à espectroscopia UV. Este método foi
utilizado para quantificar o AR de forma específica em cinéticas de liberação in vitro.
As análises foram realizadas em modo isocrático, comprimento de onda de 350 nm e
foi utilizado coluna C18 de fase reversa 150 x 4,6 mm (5µm). A fase móvel foi
constituída de metanol e ácido acético 1% (85:15 v/v) e o fluxo foi de 1,8 mL/minuto.
A faixa de linearidade do estudo foi de 0,5 a 60 µg/mL (r2 = 0,999). O método validado
mostrou-se sensível, específico, exato, preciso, de baixo custo e o tempo de retenção do
AR foi de 5,8 ± 0,4 minutos sendo, desta forma, mais rápido do que os relatados na
literatura. A segunda parte do trabalho foi desenvolver e caracterizar as MC, estudar a
interação fármaco-polímero-óleo e o perfil de liberação in vitro. As MC foram obtidas
utilizando a técnica de coacervação complexa, apresentaram forma esférica, diâmetro
em torno de 400 µm e taxa de encapsulação afetada pela concentração de AR, quitosana
e solvente utilizado. A taxa de encapsulação do AR (0,1 e 0,5%) variou de 8% a 44%
para concentrações de quitosana de 0,05 e 0,1%, respectivamente, utilizando etanol
como solvente. No entanto, utilizando clorofórmio como solvente, a taxa de
encapsulação foi de 78% No estudo de interação fármaco-polímero-óleo, na mistura
física óleo-AR, alterações e deslocamentos das bandas nas regiões entre 1310 e 1046
cm-1 foram observadas. A banda 758 cm-1 (estiramento =C-H) presente na mistura
física resultou da fusão de várias bandas tanto do AR quanto do óleo de babaçu,
indicando, portanto, uma interação e/ou solubilização do fármaco no óleo de babaçu.
Os resultados da cinética de liberação in vitro mostraram que aproximadamente 67% do
fármaco foi liberado a partir das microcápsulas preparadas com quitosana a 0,05% e em
torno de 45% daquelas preparadas com quitosana a 0,1% ao final de 48 h do ensaio. O
desenvolvimento das MC mostrou-se simples, rápido e economicamente viável além de
utilizar quitosana e alginato que são polímeros biocompatíveis e o óleo de babaçu um
componente de interesse econômico do nordeste do país podendo ser, desta forma, uma
alternativa para driblar a baixa solubilidade, a foto-instabilidade e a toxicidade do AR.
Sendo consideradas boas candidatas para sistemas de liberação sustentada do AR na
pele melhorando e deixando mais segura a terapia tópica com o AR.
Palavras chave: ácido retinóico, óleo de babaçu, alginato, quitosana, microcápsulas
IV
ABSTRACT
Retinoic acid (RA) has been widely used for dermatological applications, such as acne,
psoriasis and keratinization disorders. Of particular, retinol has been used for cosmetic
formulations to reduce wrinkles and avoid cellulite and striae. However despite many
beneficial effects, the topical application of retinoids is limited by poor water solubility,
photolability and severe local irritation manifested as mild erythema, peeling, itching,
dryness and burning. To solve this problems Alginate coating chitosan microparticles
containing RA and babassu oil were prepared with the purpose of protect and provide a
sustained release of the RA. The babassu oil was used to reduce transepidermal water
loss and reducing some side effects of RA such as peeling and drying. According to
high retention time to RA found in the literature and its rapidly degradation under light
and high temperate exposure the first part of this study was to develop and validate a
rapid and responsive method to quantify the RA in microcapsules of alginate coating by
chitosan containing babassu oil dispersed in natrosol® hydrogel using high performance
liquid chromatography (HPLC). Furthermore this method was used to quantify in vitro
release kinetics of RA from microcapsules. The analyses have been carried through an
isocratic HPLC-UV method at 350 nm using a C18 150 x 4,6 mm (5µm) reversed-phase
column and a mobile phase constituted of methanol and 1% acetic acid (85:15) at a flow
rate of 1.8 mL/min. The linearity range was 0.5-60 µg/mL (r2 = 0.999). The validated
HPLC-UV method was responsive, specific, accurate, precise, economic and the RA
retention time was 5.8 ± 0.4 minutes, being therefore, faster than that one previously
reported. The second part of this study was to develop and characterize the
microcapsules, study the drug-polymer-oil interaction and the in vitro drug release
profile. Microcapsules were obtained by complex coacervation presented spherical
shape, mean diameter of about 400 µm and variable drug loading capacity as a function
of polymers, drug concentrations and solvent used. The encapsulation efficience varied
from to chitosan concentration from 0,05 and 0,1%, respective using ethanol as a
solvent. However using chloroform as a solvent the encapsulation efficiency was 78%.
The in vitro drug release profile showed that approximately 67% of RA was released
from microcapsules with 0,05% chitosan concentration and 45% of that one prepared
with 0,1% of chitosan in a period of 48 hours. The development of microcapsules has
showed to be simple, rapid and viable economically. In spite of use chitosan and
alginate biocompatible polymers and babassu oil an economical component of northeast
of Brazil. The system could be considered a good candidate to drop off the low
solubility, sensitivity to light exposure e toxicity of RA and to deliver RA in the skin,
improving and making safer the topical therapy with retinoids.
Keywords: retinoic acid, babassu oil, alginate, chitosan, microcapsules
V
1. Introdução
_____________________________________________________________Introdução
1. INTRODUÇÃO
A área de sistemas de liberação controlada (SLC) vem crescendo rapidamente e
ganhando a atenção de cientistas, farmacêuticos e das indústrias do mundo inteiro. O
desenvolvimento de SLC efetivos, que podem transportar a droga de forma precisa e
eficaz para o local de ação desejado, tem sido a grande preocupação dos pesquisadores.
Nos últimos anos, as micropartículas despertaram crescente interesse como
sistemas de liberação controlada (ALENCASTRE et al., 2006). Muitos autores
demonstraram que as micropartículas poderiam ser utilizadas para carrear compostos
ativos na pele em maiores quantidades que as formulações tópicas convencionais,
maximizando o tempo de estadia na pele, minimizando a absorção transdérmica e
provocando uma melhor ação no local desejado como, por exemplo: retinol
(ROSSELER et al., 1994) e vitamina E (ALENCASTRE et al., 2006).
O ácido retinóico atua na proliferação e diferenciação celulares, e ainda na
secreção sebácea. Ele tem tido destaque na terapia tópica de diferentes alterações
cutâneas como acne, foto-envelhecimento, psoríase e outras desordens da pele
(BRISAERT et al., 2001; DINARVAND et al., 2003). Entretanto, apesar dos vários
benefícios, a aplicação tópica do ácido retinóico frequentemente causa irritação da pele
manifestada na forma de eritema, descamação e ressecamento do estrato córneo
(BRISAERT et al., 2001). O ácido retinóico é ainda fotossensível e pouco solúvel em
água (LEHMAN et al., 1988).
Os óleos vegetais são opções interessantes para o desenvolvimento de
formulações farmacêuticas e cosméticas, pois além de fontes de vitaminas e outros
ativos, podem também oferecer benefícios devido a sua composição de ácidos graxos
(OLIVEIRA, 2003). Seus benefícios incluem: umectação, lubrificação, oclusão e
melhoria de retenção de água na pele (KAMERSHWARL, MISTRY, 2001;
RODRIGUES, SALKA, 2001).
A Orbignya phalerata Mart., da família Arecaceae, conhecida como babaçu é
uma palmeira nativa que se concentra nas regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste do
Brasil merecendo maior destaque para a região nordeste a qual detém, atualmente, a
maior produção de amêndoas e apresenta a maior área ocupada de cocais. Outra espécie
de babaçu, Attalea, ocorre em regiões específicas da Bahia, Minas Gerais e Espírito
Santo (FILHO, 1983).
2
_____________________________________________________________Introdução
A amêndoa é a parte mais interessante e valiosa da palmeira do babaçu, com sua
elevada proporção de óleo que atinge 66-67% quando madura. Esse óleo apresenta-se
claro, ligeiramente ambreado, com odor agradável e sabor adocicado (ARIÉ, 1931).
O óleo de babaçu é muito utilizado na fabricação de sabão e detergente. Ele
possui uma combinação de ácidos graxos que são de grande importância em
cosmetologia, como por exemplo, os ácidos mirístico e oléico, pois estes fornecem
formação de um filme que impede a evaporação de água da pele (OLIVEIRA et al.,
1995).
Um melhor aproveitamento do óleo de babaçu é de grande interesse atualmente,
pois, apesar da importância do babaçu como oleaginosa, observa-se o desmatamento
gradual, em boa parte dos babaçuais, para implantação de pastos objetivando a criação
de gado ou até mesmo sua substituição pela agricultura (CLAY et al., 2000). Tal fato
vem acarretando o desequilíbrio do ecossistema, assim como interferindo nas relações
sócio-econômica-cultural da população diretamente relacionada ao aproveitamento
desta palmeira.
Nesse contexto, o objetivo desse trabalho consiste em encapsular o ácido
retinóico em microcápsulas de alginato e alginato/quitosana com cavidade preenchida
com óleo de babaçu, visando o aumento de sua estabilidade, a diminuição do
ressecamento da pele causado pelo uso tópico do ácido retinóico e agregar valores
sócio-econômicos e sócio-ecológicos ao óleo de babaçu. As microcápsulas contendo
ácido retinóico serão incorporadas em gel natrosol® (hidroxietilcelulose) para uso
tópico.
3
2. Revisão
da
Literatura
_____________________________________________________Revisão da literatura
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Sistemas de Liberação Controlada (SLC) de fármacos
O desenvolvimento de SLC tem sido alvo de pesquisas há pelo menos quatro
décadas (ARAÚJO et al., 2003). Estes sistemas de liberação representam uma das
fronteiras da ciência, a qual envolve diferentes aspectos multidisciplinares e pode
contribuir muito para o avanço da saúde humana (KUMAR, 2000).
O primeiro produto com material encapsulado só surgiu em 1954. A empresa
norte-americana “Nacional Cash Register” foi a pioneira ao comercializar um papel de
cópia sem carbono (“no carbon required”). Este papel recebeu uma fina camada de
microcápsulas contendo uma tinta incolor. Tal camada era recoberta com um reagente
também incolor. A pressão da ponta do lápis sobre a superfície do papel rompia as
microcápsulas, liberando a tinta incolor que, ao entrar em contato com o reagente,
tornava-se colorida e propiciava a obtenção de uma cópia idêntica ao que estava sendo
escrito no primeiro papel (SOUZA, 2001).
As pesquisas em torno das microtecnologia foram embasadas pelo trabalho de
Würster, por volta de 1950, com o processo patenteado de encapsulamento de finas
partículas sólidas em leito fluidizado (WURSTER, 1964).
Nas últimas décadas, a indústria farmoquímica se destacou no uso e no
aproveitamento de matérias primas de baixo custo e fácil acesso para o desenvolvimento
de novos materiais poliméricos, o que permitiu o uso de várias técnicas para
encapsulamento de compostos em sistemas de micropartículas, como microesferas e
microcápsulas, no intuito de proteger, estabilizar, mascarar os sabores indesejáveis ou
modificar as propriedades de liberação (JOSUÉ et al., 2000).
Os Sistemas de Liberação Controlada oferecem inúmeras vantagens quando
comparados aos sistemas de dosagem convencional como: maior eficácia terapêutica,
liberação progressiva e controlada do fármaco; diminuição significativa da toxicidade,
maior tempo de permanência na circulação; natureza e composição variadas dos
veículos, administração segura e conveniente (menor número de doses); maior aceitação
da terapia pelo paciente, direcionamento a alvos específicos e possibilidade de
5
_____________________________________________________Revisão da literatura
incorporação tanto de substâncias hidrofílicas quanto lipofílicas (BRANNON-PEPPAS,
1997; DURAN, 2003).
Um SLC ideal deve ser inerte, biocompatível, mecanicamente resistente,
confortável para o paciente, capaz de encapsular uma grande quantidade de fármaco,
estar livre da possibilidade de liberações acidentais, ser de simples administração,
remoção, fabricação e esterilização (BRANNON-PEPPAS, 1997).
Ampla variedade de sistemas, visando controlar a velocidade e o local de
liberação dos fármacos, tem sido objeto de investigação na área da indústria
farmacêutica. Entre estes sistemas estão incluídos os lipossomas, as bombas osmóticas,
os revestimentos entéricos, os sistemas transdérmicos, os pró-fármacos, as
micropartículas, entre outros (LOPES et al., 2005).
As micropartículas são sistemas de liberação que têm se destacado por
conferirem proteção de materiais sensíveis ao meio ambiente, conversão de líquidos a
pós, liberação lenta ou sustentada de princípios ativos e também uma liberação sítioespecífico (BENITA, 2006).
Para prover a pele com um ativo por períodos prolongados e reduzir sua
absorção sistêmica um SLC é necessário. Deste modo, vários autores usaram esses
sistemas para carrear diferentes ativos como retinol (ROSSELER et al., 1994) e
vitamina E (ALENCASTRE et al., 2006).
2.1.2. Microencapsulação
A microencapsulação é um procedimento para revestimento e proteção de
substâncias, estudada desde algumas décadas com as primeiras aplicações na indústria
de fotocópias (FANGER, 1974). Nos últimos trinta anos os estudos dessa técnica
permitiram a ampliação do seu uso para a indústria de alimentos, farmacêutica, aromas
e sabores, tintas, química, agrícola, dentre outras (FANGER, 1974; POTHAKAMURY,
BARBOSA-CÁNOVAS, 1995; RÉ, 1998; WIELAND-BERGHAUSEN et al., 2002).
O conceito primário e também o modelo mais bem sucedido de
microencapsulação é observado nas células vivas, nas quais uma membrana natural
protege os componentes celulares e exerce função importante no metabolismo,
controlando seletivamente a entrada e saída de substâncias das células (FANGER,
6
_____________________________________________________Revisão da literatura
1974). Foi a partir da observação e mimetização deste modelo vivo que os cientistas
foram capazes de desenvolver a técnica de microencapsulação altamente utilizada
atualmente.
Além da função de proteção, outras vantagens podem ser associadas à
encapsulação de substâncias (SHAHIDI, HAN, 1993; Ré, 1998):
♦ Conversão de substâncias líquidas ou gasosas em pós, permitindo sua melhor
utilização em sistemas desidratados;
♦ Mascarar propriedades indesejáveis do material encapsulado como sabor, odor,
pH, propriedades catalíticas, dentre outras;
♦ Permitir mecanismos de liberação controlada das substâncias encapsuladas para
fins específicos nos produtos onde está veiculada.
Essas vantagens permitem que os produtos microencapsulados apresentem
melhor potencial de uso, tanto pela minimização na perda de suas características
desejáveis quanto pela possibilidade de uma liberação controlada.
A possibilidade de controle na taxa de liberação do material encapsulado das
cápsulas é uma das mais exploradas funções dessa tecnologia e está diretamente
relacionada com as características do revestimento formado como: estrutura química,
espessura, tamanho, porosidade e solubilidade (FANGER, 1974). Por sua vez, essas
características determinam a permeabilidade e a difusividade do material encapsulado
pelo revestimento. As características funcionais das micropartículas produzidas
dependem, além do material de revestimento escolhido, das características do material a
ser encapsulado, do método empregado na produção das micropartículas e do meio onde
serão utilizadas.
O controle da taxa de liberação do fármaco é muito desejado no
desenvolvimento de microcápsulas e algumas variáveis que permitem esse controle são:
o coeficiente de difusão, a espessura do revestimento e a porosidade da cápsula, a
variação na concentração de saturação do material encapsulado e sua distribuição na
partícula (HEGER, 2001).
O termo micropartículas, aplicado à liberação controlada de fármacos, é amplo e
refere-se a dois tipos de estruturas diferentes, microesferas e microcápsulas (Figura 1).
Essas partículas têm tamanhos entre 1-1000 µm (MOSHFEGHI, PEYMAN, 2005).
7
_____________________________________________________Revisão da literatura
(a)
(b)
Figura 1: Microfotografias de micropartículas: microcápsula (a) (Adaptado de RONG
et al., 2004) e microesfera (b) (Adaptado de CHOI et al., 2000).
2.1.3. Polímeros para revestimento de micropartículas
O material de revestimento é usado para cobrir, dar forma à microcápsula, reter
o material encapsulado e permitir a sua liberação de forma controlada. A escolha do
revestimento está relacionada com as propriedades físicas e químicas do material a ser
encapsulado, o processo empregado para produção das micropartículas e a aplicação
final destas (JACKSON, LEE, 1991; NORI, 1996). Fundamentalmente, o material de
revestimento não deve reagir com o material encapsulado e nem ser solúvel neste
(FANGER, 1974; JACKSON, LEE, 1991).
Segundo Ré (1998), o material de revestimento deve apresentar as seguintes
características tecnológicas:
♦ Boa propriedade emulsificante e de formação de filme;
♦ Baixa viscosidade, mesmo em soluções com alta concentração de sólidos;
♦ Baixa higroscopicidade e boas propriedades de secagem;
♦ Estabilidade e boa proteção ao material encapsulado.
Polímeros diversos como gomas, carboidratos, celuloses, lipídios, proteínas e
alguns materiais inorgânicos (silicatos, argilas, etc.) apresentam as características
8
_____________________________________________________Revisão da literatura
supracitadas e são muito utilizados na microencapsulação de substâncias (JACKSON,
LEE, 1991).
A Tabela 1 mostra diversos trabalhos publicados nos últimos anos sobre o uso de
vários polímeros em microencapsulação de substâncias por diversas técnicas.
Tabela1. Trabalhos recentes sobre microencapsulação de diferentes substâncias
utilizando diferentes métodos.
Material de
Material
Método de
revestimento
encapsulado
encapsulação
Alginato/quitosana
Dextrana
Geleificação
SEZER; AKBUGA,
Ionotrópica
1999
Coacervação
ALENCASTRE et
complexa
al., 2006
Coacervação
DINARVAND et al.,
Carboximetilcelulose/
Vitamina E
quitosana
Gelatina
Ácido retinóico
Autores
2003
PLGA
Ácido retinóico
Formação de
CIRPRANLI et al.,
emulsão/evaporação
2005
de solvente
PLLA/PEG-PLLA
Ácido retinóico
Formação de
CHOI et al., 2001
emulsão/evaporação
de solvente
PLGA
Ácido retinóico
Formação de
JEONG et al., 2003.
emulsão/evaporação
de solvente
2.1.3.1. Quitosana
A quitosana (Figura 2) é um carboidrato insolúvel em água, mas que pode ser
solubilizado em ácido acético diluído através de formação do seu acetato (THANOO et
al., 1992). Quimicamente é o β(1→4)-2-amino-2-desoxi-D-glicose, obtido pela
hidrólise dos grupos aminoacetil da quitina, um polissacarídeo abundante, componente
9
_____________________________________________________Revisão da literatura
estrutural das carapaças protetoras de crustáceos (JAMEELA; JAYAKRISHNAN,
1995; KAS, 1997).
Figura 2. Fórmula estrutural da quitosana.
Entre suas vantagens podem ser destacadas a biodegradabilidade, a atoxicidade e
a biocompatibilidade (WANG et al., 1996). Além dessas propriedades, a excelente
capacidade em formar filme e a disponibilidade em grande quantidade torna-o um
material muito interessante para utilização em sistemas de liberação controlada.
Devido à presença de grupos aminos livres na sua estrutura, a quitosana
apresenta uma carga positiva que pode reagir com muitas superfícies e polímeros
carregados negativamente (FUKUDA et al., 1980). Essa característica estrutural
também é responsável por suas propriedades mucoadesivas, já que sua carga positiva
pode interagir com as superfícies de mucosas carregadas negativamente (SHIMODA et
al., 2001; KOCKISCH et al., 2003).
Comercialmente, a quitosana está disponível na forma de pós e solução com
massa molecular variando entre 3.800 e 2.000.000 Da e grau de deacetilação entre 66 e
95% (KAS, 1997). O tamanho de partícula, a densidade, a viscosidade, o grau de
deacetilação e a massa molecular constituem importantes características da quitosana
que podem influenciar nas propriedades das formulações farmacêuticas.
2.1.3.2. Alginato
O alginato de sódio é um polissacarídeo linear (Figura 3) obtido a partir de algas
marrom ou bactérias e é composto por resíduos dos ácidos β-D-manurônico e α-L-
10
_____________________________________________________Revisão da literatura
gulurônico na forma de sal de sódio, unidos por ligações glicosídicas e distribuídos em
diferentes proporções ao longo da cadeia.
Figura 3. Fórmula estrutural do alginato.
Esse polímero tem sido utilizado há muitos anos na indústria de alimentos e de
bebidas como espessante e estabilizador coloidal (JOHNSON et al., 1998). Além disso,
este material apresenta crescentes aplicações na indústria de biotecnologia e possui
propriedades únicas o que viabilizam como matriz em sistemas de liberação. Essas
propriedades incluem: 1 – formação de ambiente matricial relativamente inerte, 2 –
processo de encapsulação a temperatura ambiente livre de solventes orgânicos, 3 – alta
porosidade do gel que permite alta velocidade de liberação de macromoléculas, 4 –
capacidade de controlar a porosidade com procedimentos de revestimento simples
(SEZER; AKBUGA, 1999).
O alginato possui propriedade mucoadesiva que poderia proporcionar uma
vantagem na liberação de fármacos em superfícies mucosas. Vários estudos têm
mostrado que polímeros com carga constituem bons agentes mucoadesivos
(CHICKERING,
MATHIOWITZ,
1995).
Tem
sido
relatado
que
polímeros
polianiônicos são bioadesivos mais efetivos que polímeros policatiônicos ou nãoiônicos. Alginato com o seu grupo carboxílico é classificado como um polímero
mucoadesivo aniônico e, em particular, as micropartículas de alginato têm apresentado
essas propriedades (CRAIG, TAMBURIC, 1997).
Em estudos de mucoadesão conduzidos por CHICKERING et al., a força
adesiva entre vários polímeros diferentes e o epitélio intestinal foi avaliada e mostraram
que o alginato tem maior força adesiva quando comparado com outros polímeros tais
como
poliestireno,
quitosana,
carboximetilcelulose
e
ácido
poli-(láctico)
(CHICKERING et al., 1992, CHICKERING, MATHIOWITZ, 1995). Posteriormente,
11
_____________________________________________________Revisão da literatura
WITTAYA-AREEKUL et al. (2006) testaram a mucoadesividade de micropartículas de
alginato revestida com quitosana. As micropartículas sem o revestimento apresentaram
mucoadesão de 43% (número de partículas que permaneceram ligadas à superfície
mucosa) enquanto as micropartículas revestidas com 0,5, 1,0 e 1,5% de quitosana
promoveram o aumento da mucoadesão para 52, 82 e 88%, respectivamente.
2.1.4. Principais métodos para obtenção das micropartículas de alginato/quitosana
As micropartículas de alginato/quitosana podem ser preparadas gotejando ou
nebulizando uma solução de alginato contendo o fármaco sobre uma solução de
quitosana. Em geral, partículas maiores que 1 mm podem ser preparadas pelo uso de
uma seringa com agulha ou pipeta (WEE, GOMBOTZ, 1994; AUSTIN et al., 1996;
ELÇIN, 1995). O tamanho das partículas formadas é dependente do diâmetro da agulha
e da viscosidade da solução de alginato. Agulhas de diâmetro maiores e soluções mais
viscosas produzem partículas com diâmetro maior. A viscosidade pode influenciar
também a morfologia das partículas que se tornam mais esféricas com o aumento da
viscosidade (BADWAN et al., 1985). As partículas formadas são deixadas em contato
com a solução para reticulamento por um curto período de tempo, geralmente alguns
minutos, antes de serem lavadas com água destilada. O reticulamento ou crosslinking
ocorre através da formação de uma membrana coacervada complexa quando uma
solução de alginato é gotejada diretamente em uma solução de cloreto de cálcio e
quitosana (WITTAYA-AREEKUL et al., 2006).
Há três métodos bem conhecidos para preparar micropartículas de alginato
menores que 0,2 mm de diâmetro: atomização, emulsificação e coacervação. O mais
comumente usado é o método de atomização ou spray sobre uma solução de
crosslinking usando um sistema de extrusão e com pequeno orifício. Inúmeras variações
deste método são propostas por diferentes grupos de pesquisa (KWOK et al., 1991;
WEE et al., 1995; BOWERSOCK et al., 1996). O tamanho dessas micropartículas pode
ser controlado pela pressão do sistema de extrusão, pelo fluxo que bombeia a solução de
alginato de sódio que vai ser nebulizado e pela distância entre o orifício e a superfície da
solução de crosslinking. As microgotas da solução de alginato contendo o fármaco
originarão as micropartículas após crosslinking com agente apropriado.
12
_____________________________________________________Revisão da literatura
2.1.5. Mecanismo de liberação do ativo microencapsulado
Os mecanismos de liberação de um ativo a partir das matrizes poliméricas são
governados predominantemente por três fatores: tipo e morfologia do polímero e
presença de excipientes no sistema. Várias revisões foram relatadas na literatura sobre
os mecanismos e os aspectos matemáticos que modelam a liberação de fármacos a partir
de matrizes poliméricas. (BRANNON-PEPPAS, 1997). De acordo com estes estudos a
liberação pode ocorrer por difusão e/ou erosão do polímero ou intumescimento.
A substância encapsulada pode ser liberada por ação mecânica, a partir do
rompimento do revestimento exterior através de pressão, quando suas membranas forem
susceptíveis a isso. Outra possibilidade é provocar o rompimento submetendo as
microcápsulas a variações físico-químicas do meio em que se encontram, como, por
exemplo, alterações de temperatura ou pH (SOUZA, 2001). Em uma loção cosmética
para o corpo, por exemplo, as microcápsulas que contêm a fragrância são rompidas,
liberando-a, pela pressão dos dedos durante a aplicação na pele (ruptura mecânica). Já
em um medicamento oral, para que a mucosa do estômago seja protegida do contato
com o princípio ativo e este seja liberado apenas no local exato de sua absorção (no
intestino), pode-se usar um agente encapsulante que só se dissolva em meio alcalino
(como o intestinal) (PORTE, COUARRAZE, 1994).
2.2. Cinética de liberação in vitro
Na cinética de liberação in vitro as condições fisiológicas de temperatura, meio
de dissolução e agitação são simuladas a fim de se determinar a capacidade da
formulação liberar o ativo em função do tempo (BERKLAND et al., 2001).
Dentre os modelos mais empregados para este fim, destacamos as células de
difusão do tipo FRANZ (FRANZ, 1975). Elas são compostas basicamente de:
compartimento doador, onde será depositado o fármaco em estudo e compartimento
receptor, local que contém uma solução na qual a droga será difundida. Entre estes dois
compartimentos se interpõe a membrana (sintética, tecido animal ou humano) que tem o
papel de barreira à permeação ou difusão através da pele (Figuras 4 e 5).
13
_____________________________________________________Revisão da literatura
Figura 4. Figura ilustrativa de uma célula de difusão.
Figura 5. Fotografia de uma célula de difusão in vitro (tipo Franz)
Estas células simulam o fenômeno de passagem percutânea da droga in vivo
(SESTER, 1997). No entanto, os parâmetros que envolvem esta metodologia como a
natureza da membrana, temperatura, dose e agitação devem ser bem monitorados para
uma boa correlação in vitro/in vivo. Para a manutenção de temperaturas próximas as da
pele as células são dotadas de compartimento receptor de duas paredes com um banho
termostatizado, possibilitando temperaturas controladas, mimetizando assim, as
condições fisiológicas da pele. O fármaco que conseguir ultrapassar a barreira é
monitorado através da quantificação das amostras coletadas do fluido presente no
compartimento receptor.
Os principais parâmetros a serem determinados são: a escolha da membrana que
deve ser feita em função das propriedades físico-químicas do princípio ativo; a fase
receptora que deve ter composição tal que permita a solubilização do princípio ativo e
14
_____________________________________________________Revisão da literatura
volume suficiente para respeitar as condições “Sink”, e as condições operatórias do
ambiente circundante (SEILLER, MARTINI, 1996).
As células podem ser de dois tipos:
♦ Células de difusão estática: sem renovação do meio de difusão;
♦ Células de difusão dinâmica: com renovação do meio de difusão.
As células de difusão dinâmica são mais empregadas, pois evitam uma saturação
em nível da camada de difusão em contato com a membrana, sob simples agitação ou
circulação do meio (BARRY, 1983).
2.3. Via tópica
2.3.1. Anatomia e fisiologia da pele
A pele constitui uma via potencial de administração de fármacos devido ao fácil
acesso e à sua grande superfície. Representa um dos órgãos mais extensos do corpo,
cobrindo uma superfície de aproximadamente 1,73 m2 sendo banhada por 1/3 do
sangue, correspondendo a 5% da massa corporal (BARRY,1983; CHIEN, 1992).
A pele funciona como uma barreira de proteção. Separa órgãos vitais do meio
exterior, protege o organismo de substâncias estranhas de natureza química, física e
microbiológica e impede a saída de compostos fisiológicos como a água. Ela também
desempenha um importante papel na manutenção da temperatura corporal e na
regulação da pressão sangüínea (JASS, ELIAS, 1991).
É um órgão de revestimento complexo e heterogêneo, composto essencialmente
de três grandes camadas de tecidos: a epiderme, a derme e o tecido subcutâneo ou
hipoderme (Figura 6).
15
_____________________________________________________Revisão da literatura
Figura 6. Representação esquemática da estrutura da pele (adaptado de SAMPAIO;
RIVITTI, 2001).
A epiderme é recoberta pela camada córnea e possui espessura entre 0,1 a 0,2
mm. Representa a principal barreira a penetração, não contém vasos sangüíneos e é
formada basicamente por tecido epitelial estratificado, queratinizado ou não. Possui uma
película de material emulsificado composto por complexo de sebo, suor e lâmina córnea
descamativa, além de uma capa gasosa chamada manto gasoso, constituída
principalmente por vapores de água provenientes da volatilização corporal (MOSER et
al., 2001).
A epiderme é dividida em duas camadas: o estrato córneo e a epiderme viável. O
estrato córneo constitui a camada mais superficial da pele e possui uma estrutura
estratificada, hidrófila-lipófila, formada por células sem vitalidade chamadas
corneócitos (WILLIAMS, BARRY, 1992). Essas células, achatadas de formato
hexagonal, são compostas por queratina e água envolvidas por um envelope protéico e
bicamadas lipídicas sobrepostas, que incorporam água em sua estrutura, como mostra a
Figura 7 (BUCK, 2004).
16
_____________________________________________________Revisão da literatura
Figura 7. Representação esquemática da bicamada lipídica do corneócito (adaptado de
BUCK, 2004).
A epiderme viável é subdividida em quatro partes: estrato lúcido, estrato
granuloso, estrato espinoso e estrato germinativo ou basal. Nas regiões palmar e plantar,
entre as camadas granulosa e córnea, encontra-se mais uma, a lúcida. A epiderme viável
contém queratinócitos em vários estágios de diferenciação, melanócitos, células de
Langerhans (importante no reconhecimento de antígenos e resposta imune) e células
Merkel (envolvidas na percepção sensorial) (ASBILL, MICHNIAK, 2000).
Na camada basal originam-se as células epidérmicas, que vão sofrendo
modificações graduais na forma e na composição química, passando pelos estratos
espinhoso, córneo, granuloso, e pouco a pouco ganham a superfície até se tornarem
anucleadas no estrato córneo e se esfoliarem. Ocorre, assim, um deslocamento
permanente e repetido de células, que da camada basal atingem gradualmente a
superfície da epiderme, para se desprenderem já mortas. O ciclo de ceratinização, ou
corneificação, consiste na transformação de células epiteliais em células córneas, mortas
(BECHELLI, CURBAN, 1975).
É separada da derme pela junção dermo-epidérmica e suas quatro camadas, do
interior para a superfície, representam a transformação de um queratinócito basal ou
germinativo em um queratinócito córneo ou corneócito (ASBILL, MICHNIAK, 2000,
BUCK, 2004, WILLIAMS, BARRY, 1992).
17
_____________________________________________________Revisão da literatura
A derme, segunda camada da pele, possui espessura entre 2 mm e 4 mm, sendo
constituída de uma matriz de proteínas fibrosas imersas num tecido coloidal amorfo.
Apresenta-se rica em capilares sangüíneos, canais linfáticos e terminações nervosas,
além de conter os segmentos inferiores das glândulas sebáceas e folículos pilosos. A
elasticidade da derme é atribuída às fibras protéicas presentes, incluindo colágeno (tipo
I e III) e elastina. A derme contém também fibroblastos, macrófagos, mastócitos e
leucócitos. Ela executa assim, papel de sustentação e de nutrição e divide-se em duas
partes: derme papilar ou tecido conjuntivo frouxo e derme reticular ou tecido conjuntivo
denso (WILLIAMS; BARRY, 1992; FOLDVARI, 2000, MOSER et al., 2001).
A hipoderme está localizada abaixo da derme é formada por tecido conjuntivo
frouxo e contém células adiposas que desempenham papel de proteção mecânica, de
conservação da temperatura corporal e de reserva de calorias (WILLIAMS, BARRY,
1992).
A pele contém ainda, dois tipos de órgãos anexos: as glândulas sudoríparas,
constituídas por um longo tubo que penetra na hipoderme, e o aparelho pilossebáceo,
constituído por uma depressão cutânea (o folículo piloso ou FP), no qual o pêlo inserese, e por uma bainha que o circunda, por onde escoa o sebo secretado pela glândula
sebácea, preenchendo os espaços livres da bainha.
2.3.2. A função barreira da pele
A função barreira da pele é principalmente atribuída ao estrato córneo que
apresenta permeabilidade à água 1000 vezes menor que a maioria das outras membranas
biológicas. Essa camada superficial possui espessura entre 10 µm e 20 µm e é altamente
hidrofóbica, formada por 10 a 15 camadas de corneócitos interligados por ligações
chamadas desmossomos que constituem uma barreira para prevenir a perda de fluidos
do corpo e a absorção de compostos estranhos (FOLDVARI, 2000).
O estrato córneo, ao contrário das outras membranas biológicas, não é composto
por fosfolipídios, mas é rico em ceramidas e lipídios neutros que estão arranjados em
uma bicamada lipídica (conforme mostrado na Figura 7). Assim, a função barreira da
pele parece também depender do teor e da composição dos lipídios e, em particular, do
arranjo estrutural das matrizes lipídicas intercelulares e da bicamada lipídica que
envolve as células do estrato córneo (SUHONEN et al., 1999).
18
_____________________________________________________Revisão da literatura
Os principais lipídios intercelulares são as ceramidas (41%), o colesterol (27%)
e seus ésteres (10%), os ácidos graxos (9%) e uma pequena fração de sulfato de
colesterol (2%). Estudos em que lipídios relativamente polares e não polares foram
seletivamente extraídos com éter de petróleo e acetona, respectivamente, indicaram que
os lipídios mais polares são mais importantes para a integridade da barreira da pele
(FOLDVARI, 2000). Um grupo estruturalmente heterogêneo contendo sete ceramidas
diferentes representa os lipídios mais polares presentes no estrato córneo e, devido às
suas cadeias alifáticas saturadas e longas, parecem ser adequados para a formação das
membranas impermeáveis altamente ordenadas que promovem resistência às variações
na temperatura, exposição à radiação UV e à oxidação pelo ar (SUHONEN et al., 1999).
Embora o estrato córneo represente a principal barreira da pele, sabe-se que na
ausência de integridade desta camada, uma outra barreira à permeação de fármacos
permanece em outra camada da pele, a epiderme viável. A função de barreira da
epiderme viável está principalmente relacionada aos canais lipídicos intercelulares e aos
vários fenômenos de partição (FOLDVARI, 2000, ASBILL, MICHNIAK, 2000).
2.3.3. Penetração de fármacos através da pele
A pele tem a função essencial de proteger o organismo da desidratação e das
agressões exteriores. Ela pode ser, desta forma, mais ou menos permeável às
substâncias químicas e permitir a passagem de fármacos em certas condições, podendo
ser considerada uma interface terapêutica. A permeação das camadas que formam a pele
ocorre por difusão passiva através de duas vias: a via transepidérmica, que compreende
a penetração transcelular (através das células) e a penetração intercelular (entre as
células), e via apêndice (através dos folículos pilosos e glândulas sudoríparas) (Figura
8).
19
_____________________________________________________Revisão da literatura
Figura 8. Representação esquemática dos mecanismos de penetração de substâncias
(vias intercelular e transcelular) através do estrato córneo (adaptado de BARRY, 2001).
Tem havido grande discussão nas últimas décadas sobre qual via apresentaria
ação predominante na penetração de substâncias na pele, mas evidências experimentais
sugerem que sob condições normais a via predominante é a intercelular, ou seja,
difundindo-se pela bicamada lipídica entre as células (HADGRAFT, 2004). Entretanto,
de uma forma geral, substâncias polares e não polares podem se difundir através dos
variados mecanismos.
A bicamada lipídica forma uma fase contínua dentro do estrato córneo e
constitui a principal via para moléculas pequenas e não carregadas atravessarem esta
barreira (BUCK, 2004). A distância difusional percorrida por essas moléculas nesta via
é muito maior que a espessura do estrato córneo (10-20µm) e têm sido estimada em
aproximadamente 500µm. Além disso, esse espaço intercelular contém lipídios
estruturados, por isso o fármaco permeante tem que atravessar uma variedade de
domínios hidrofílicos e lipofílicos antes de alcançar a epiderme viável (HADGRAFT,
2004).
A via intracelular é geralmente a via predominante para moléculas mais polares
(hidrofílicas), já que os componentes celulares são predominantemente de natureza
aquosa (BUCK, 2004). Nesta via, as moléculas atravessam diretamente o estrato córneo
e a barreira limitante são as bicamadas lipídicas que também devem ser atravessadas.
20
_____________________________________________________Revisão da literatura
A via apêndice (Figura 9) possui área superficial bastante pequena,
correspondendo a aproximadamente 0,1% da superfície da pele e, segundo alguns
autores, contribui, de forma insignificante para a penetração das substâncias na pele
(SUHONEN et al., 1999, BARRY, 2001). Contudo, ela sido utilizada para o transporte
rápido de várias moléculas, incluindo principalmente algumas macromoléculas e íons, já
que os apêndices oferecem poros criando um desvio à barreira do estrato córneo
(SUHONEN et al., 1999, BARRY, 2002).
Figura 9. Representação esquemática dos mecanismos de penetração de substâncias
(via transepidérmica e via apêndice) através da pele humana, 1 = glândula sebácea, 2 =
via transepidérmica e 3 = folículo piloso (adaptado de BARRY, 2002).
Desta forma, as três vias não são utilizadas exclusivamente e, a maioria das
moléculas, atravessará o estrato córneo utilizando uma combinação delas (BUCK,
2004).
Então, embora a pele constitua uma barreira muito eficaz, ela pode ser
atravessada por pequenas quantidades de substâncias capazes de penetrar nas camadas
córneas e, em alguns casos, chegar a uma absorção sistêmica. Nesse processo, o estrato
córneo constitui a principal barreira, enquanto a epiderme e a derme se comportam
como um gel aquoso, apresentando assim, efeito reservatório. As doses diárias passíveis
de absorção pela pele são bastante baixas, o que requer a administração de fármacos de
grande potência para obtenção do efeito desejado. Além disso, um bom fármaco para
administração cutânea deve apresentar baixa massa molecular, boa solubilidade em
21
_____________________________________________________Revisão da literatura
água e em óleo e não deve ser irritante ou sensibilizante cutâneo. É importante conhecer
exatamente o grau de penetração, pois para determinados princípios ativos, uma
penetração profunda pode provocar intoxicações (BONNABRY et al.,1999).
2.3.4. Capacidade de Hidratação da Pele
A pele possui um “manto natural” formado pelo sebo cutâneo, produzido pela
glândula sebácea, que juntamente com o suor, forma uma emulsão denominada
“emulsão epicutânea” ou filme hidrolipídico. Este sebo é de extrema importância para a
pele por possuir uma composição graxa variada (triglicerídeos, ácidos graxos livres,
ceras, esteróis, esqualeno e parafinas), conseqüentemente esse “manto natural” atua
como barreira protetora que tem como principal função manter a pele hidratada,
saudável e jovem. Os ácidos graxos livres presentes nesse sebo proporcionam, uma
capacidade bactericida e fungicida (OLIVEIRA, 2003; BLOISE, 2003).
A pele é constantemente exposta às agressões externas como calor, sol, poluição
as quais podem provocar mudanças nas propriedades de proteção do sebo, aumentando
a perda transepidérmica de água (TEWL), deixando a pele ressecada (BLOISE, 2003).
A água age como um plastificante em associação com as proteínas e materiais solúveis
sendo assim, a sua presença na camada córnea é de fundamental importância para a
manutenção de suas propriedades físicas de flexibilidade e elasticidade (BLANK, 1976;
ROSSI, VERGNANINI, 1997).
Existem dois principais mecanismos de hidratação: oclusão e umectação. O teor
de hidratação é um dos fatores mais importantes para se manter as condições ideais da
pele. A pele deficiente em hidratação torna-se seca e frágil, resultando em rachaduras da
camada córnea (JONES, BROWN, 1992).
Essas condições são geralmente agravadas devido às instabilidades climáticas,
comumente associada à baixa umidade em climas tropicais quentes ou baixas
temperaturas em climas mais frios. O uso excessivo de detergente, disfunções
metabólicas ou simplesmente o tipo de pele, podem também influenciar no teor de
hidratação da pele (JONES, BROWN, 1992).
22
_____________________________________________________Revisão da literatura
O estrato córneo é a principal barreira contra a perda transepidérmica de água.
Na verdade, o conteúdo de água da pele está diretamente relacionado com sua
aparência, elasticidade e maciez. O efeito hidratante de uma emulsão pode ser direto,
quando esta contribui na retenção de água no estrato córneo, e/ou pode ser indireto
quando a mesma impede ou diminui a perda transepidérmica de água (ROSSI,
VERGNANINI, 1997).
2.3.5. Avaliação da hidratação cutânea
A comprovação dos efeitos biológicos das chamadas formulações hidratantes é
de grande interesse, pois manter a pele hidratada retarda o envelhecimento cutâneo bem
como previne ou trata certas doenças de pele (GASPAR et al., 2001). As formulas
hidratantes podem agir seja evitando a perda de água formando uma barreira contra a
evaporação superficial (oclusiva), seja hidratando o estrato córneo pela água contida no
produto aplicado ou pela absorção da água da amostra (umectante) (NAVARRO et al.,
2002). O óleo vegetal quando aplicado na pele, devido a sua tensão superficial e
imiscibilidade com a água, não forma uma película contínua. Ele se dispõe em gotículas
nos espaços interfoliculares e entre os poros sudoríparos. Consequentemente, a
perspiração não é impedida e a pele também não se torna seca, pois, o óleo incorporado
na camada córnea impede a descamação, tornando-a mais macia (OLIVEIRA et al.,
1995).
Há algum tempo os dermatologistas, para avaliar a eficácia de um produto
hidratante, baseavam-se, na maioria das vezes, apenas na observação clínica, o que,
devido a sua subjetividade, pode ser um método pouco preciso. Com os avanços
tecnológicos, surgiram metodologias não invasivas, que estão sendo bastante utilizadas
e não causam agressão ou desconforto aos voluntários envolvidos nos estudos da análise
qualitativa ou quantitativa dos reais efeitos dos produtos cosméticos (GASPAR et al.,
2001).
Esses métodos são baseados em diversos princípios; propriedades elétricas,
mecânicas, térmicas e espectrofotométricas. Cada método pode proporcionar vantagens
e desvantagens, mas, sem dúvida, os métodos eletrométricos se tornaram os mais
23
_____________________________________________________Revisão da literatura
utilizados devido a confiabilidade, baixo custo e facilidade de operação. O seu princípio
baseia-se na determinação das alterações de natureza elétrica tais como: impedância,
condutância e capacitância, mensuráveis no estrato córneo. Sendo que a capacitância é o
método mais empregado, pois é capaz de medir o conteúdo aquoso do estrato córneo
com corrente de baixa freqüência, enquanto a condutância precisa de corrente de alta
freqüência. Além disso, a utilização da medida da capacitância para abordagem da
hidratação cutânea parece ser menos afetada pela temperatura e umidade relativa que
quando comparada a outros métodos citados (GASPAR et al., 2001; DE PAULA,
2001).
A corneometria é o método de referência mais estudado e utilizado na avaliação
da eficácia dos produtos de aplicação tópica. A medição é efetuada na pele pelo
equipamento
corneometer®
que
possui
uma
sonda,
a
qual
é
colocada
perpendicularmente à superfície cutânea, onde se encontram dois circuitos paralelos
(condensadores). Uma mola no interior assegura o estabelecimento do contato à pressão
constante, evitando assim, fenômenos adicionais de oclusão, enquanto uma membrana
de polietileno evita o contato entre os elementos condutores da sonda e a pele. A
modificação da capacitância registrada pelo corneômetro, será, assim, função do
conteúdo em água do estrato córneo com o qual está em contato. Os valores do
conteúdo aquoso do estrato córneo são expressos em unidades arbitrarias (UA),
parecendo existir relação próxima no intervalo de 60-120 UA onde se estima que 1 UA
corresponda a 0,2-0,9 mg de água, determinada por método gravimétrico, por grama de
estrato córneo anidro (GASPAR et al., 2001).
2.4. Ácido retinóico
Retinóides é o termo genérico utilizado para os compostos naturais e sintéticos
com atividades biológicas similares as da vitamina A. O termo vitamina A é utilizado
para referir-se ao retinol, forma álcool desta vitamina. Se houver uma função aldeído
em lugar de álcool, no grupo polar terminal da molécula da vitamina A, tem se o retinal,
e se houver esterificação tem-se o palmitato de retinila. Caso haja um grupo carboxila,
tem-se o ácido retinóico. Existem dois isômeros do ácido retinóico: ácido 11 – trans-
24
_____________________________________________________Revisão da literatura
retinóico ou tretinoína (Figura 10) e o ácido 13 – cis – retinóico ou isotretinoína (Figura
11) (HERMITTE, 1992).
Figura 10. Estrutura química da tretinoína.
z
Figura 11. Estrutura química da isotretinoína.
Os retinóides têm como função atuar na proliferação e diferenciação celular, na
produção do sebo e na síntese de colágeno. Eles têm sido utilizados em diferentes níveis
farmacológicos para o tratamento de várias disfunções dermatológicas com acne, rugas
e distúrbios de queratinização incluindo psoríase. Recentemente, o retinol e o ácido
retinóico foram descobertos como úteis no tratamento de estrias e celulite (SHAPIRO,
SALIOU, 2001).
Por causa de seus efeitos colaterais muito pronunciados quando administrado
sistemicamente o AR é quase que exclusivamente utilizado pela via tópica, resultando
em pouco ou quase nenhum AR absorvido sistemicamente. Mesmo assim sua aplicação
tópica é limitada por várias desvantagens como irritação da pele, muito pouco solúvel
em água, e altamente instável na presença de água e luz. Sua insolubilidade pode limitar
sua veiculação em alguns veículos e sua foto-sensibilidade pode fazer com que a
aplicação tópica se torne ineficiente. Além de que quando aplicado topicamente o AR
pode provocar irritação local como eritema, descamação e queimação e ainda provocar
maior sensibilidade a exposição solar. Para minimizar todas essas desvantagens do AR
vários autores incorporaram o AR em lipossomas para diminiur sua ação irritante sobre
a pele, maximizar sua acumulação na pele e ainda prevenir sua degradação rápida
(SINICO et al, 2005).
25
_____________________________________________________Revisão da literatura
Diferentes autores demonstraram in vitro um aumento o AR acumulado na pele
e in vivo uma diminuição na irritação após o tratamento com lipossomas. FOONG et al.
demonstraram uma melhor concentração do AR na epiderme e na derme após a
aplicação de lipossomas em comparação com cremes convencionais. MASINI et al.
acharam que a porcentagem do AR na epiderme e na derme após a aplicação de
formulações lipossomais foram significantemente maiores do que as formulações em
gel. SCHAFER-KORTING demonstraram que formulações lipossomais menos
concentradas do que as formulações comerciais tópicas tiveram a mesma eficácia e uma
menor irritação na pele (SINICO et al, 2005).
O ácido retinóico apresentou também ação tratamento de estrias, onde uma
diminuição da extensão e da amplitude das marcas em 80% das pacientes foi verificada
(FISHER et al., 1997; ELSON, 1994; KANG et al., 1996). Sua utilização tópica
demonstrou ainda, efeitos benéficos no tratamento de lesões hiperpigmentadas de vários
tipos tais como aquelas associadas com dano solar em pacientes brancos e aquelas
causadas por inflamação ou melasma em pacientes negros e também no tratamento de
celulite (SHAPIRO; SALIOU, 2001; RAFAL et al., 1992; BULENGO-RANSBY et al.,
1993; KLIGMAN, et al., 1999).
Há ainda um grande interesse na utilização do ácido retinóico para o tratamento
de doenças dermatológicas como acne e psoríase. Ele tem sido utilizado como primeira
linha de tratamento tópico para acne inflamatória e não-inflamatória há 3 décadas,
atuando nos três dos quatro fatores patogênicos da acne (BRISAERT et al., 2001;
LUPO, 2001).
A acne é a doença de pele mais comum em humanos e afeta mais de 80% da
população em diferentes graus (SHAPIRO; SALIOU, 2001). A etiologia da acne é
multifatorial apresentando principalmente seborréia, hiperqueratinização folicular,
colonização bacteriana pela Propionibacterium acnes (P. acnes) e inflamação na
patogênese (YONKOSKY, POCHI, 1986). O ácido retinóico atua normalizando a
descamação folicular resultante da hiperqueratinização anormal do epitélio folicular
promovendo o fluxo do sebo dos comedões pré-existentes, inibindo a formação de
novos comedões e reduzindo assim o crescimento da P. acnes. Acredita-se que esses
efeitos promovidos pelo ácido retinóico são mediados pelo seu receptor na pele, o RARα (LEYDEN; SHALITA, 1986).
26
_____________________________________________________Revisão da literatura
2.4.1. Aspectos toxicológicos do ácido retinóico tópico
2.4.1.1. A dermatite retinóide
Como efeitos adversos da utilização tópica do ácido retinóico, a dermatite
retinóide é relatada em grande parte dos pacientes submetidos à terapia convencional
com ácido retinóico, evento caracterizado por eritema macular, inflamação localizada,
xerose e discreta descamação, sinais que correspondem histologicamente as alterações
na camada córnea e hiperplasia epidérmica (KANG; VOORHEES, 1998).
Essas
alterações histológicas resultam, em princípio, na proliferação aumentada de
queratinócitos e levam à descamação, ocorrendo também a supressão da atividade das
glândulas sebáceas com conseqüente diminuição da produção do sebo, que resultaria na
xerose. Uma vez que esses efeitos acompanham a aplicação tópica do ácido retinóico,
muitos autores têm acreditado que este tipo de irritação dérmica seria o responsável por
alguns dos efeitos dos retinóides. Atualmente, alguns estudos nos tratamentos de
fotoenvelhecimento têm mostrado a ação específica deste fármaco sob receptores
endógenos. Em 1995, GRIFFITHS; VOORHEES demonstraram que não houve
diferença significativa na eficácia clínica no tratamento do fotoenvelhecimento
utilizando concentrações de 0,025% e 0,1%. Contudo o grau de irritação diferiu bastante
entre os dois grupos, mostrando que não há qualquer correlação entre a eficácia clínica e
o nível de irritação. Desta forma, seria totalmente desnecessário forçar o uso do ácido
retinóico a ponto de desenvolver dermatite retinóide ativa para alcançar máxima
melhora clínica da pele envelhecida. Alguns estudos realizados têm demonstrado que a
hiperplasia epidérmica e a descamação têm ação mediada por receptores, mas a ativação
destes receptores não parece estar associada com o eritema e o desconforto (queimação,
ardor, prurido etc.) da dermatite retinóide (GRIFFITHS et al, 1993; FENG et al., 1997;
KANG; VOORHEES, 1998). Em 1997, THACHER et al. observaram em seu estudo
que o aparecimento de citotoxidade em cultura de células não estava relacionado com o
aparecimento de hiperplasia epidérmica. Este fato pode levar a acreditar que a melhora
clínica pode ser alcançada sem o uso excessivo do fármaco, minimizando desta maneira
a ocorrência de irritação na pele. Apesar de algum grau de descamação ser inevitável
devido à ativação de receptores, o efeito associado ao eritema pode ser evitado,
melhorando a segurança da utilização do ácido retinóico tópico e a aceitação pelo
paciente.
27
_____________________________________________________Revisão da literatura
2.4.1.2. A absorção sistêmica
Com relação aos efeitos adversos sistêmicos, a aplicação tópica não apresentou
absorção percutânea capaz de alterar significativamente os níveis endógenos desta
substância e de seus metabólitos (LATRIANO et al., 1997). Entretanto, vários relatos
de casos individuais de defeitos congênitos associados com a utilização de ácido
retinóico tópico durante o primeiro trimestre de gestação foram descritos na literatura
(LIPSON et al., 1993; CAMERA; PEGLIASCO, 1992). Contudo, estudos realizados
em pacientes utilizando veículos tópicos contendo este fármaco não mostraram o
aparecimento de malformações congênitas atribuídas ao produto (JICK et al., 1993;
WALS et al., 1991).
2.4.2. Estabilidade do ácido retinóico
Devido à presença de ligações duplas conjugadas, retinóides em geral são
compostos instáveis, facilmente oxidados ou isomerizados especialmente na presença de
oxidantes (incluindo o ar), luz e calor excessivo. Eles são também sensíveis a ácidos
fortes e solventes que possuam oxigênio ou peróxido dissolvido (GATTI et al., 2000).
Solventes anidros contendo traços de ácido provocam modificações estruturais nos
retinóides e por isso a utilização de ácidos fortes deve ser evitada. Soluções alcalinas
geralmente não promovem alterações estruturais desses compostos (GATTI et al.,
2000).
O ácido retinóico sofre extensa degradação quando exposto a luz para produzir
diferentes isômeros principalmente em soluções alcoólicas (HWANG et al., 2004; LIM
et al., 2004; IOELE et al., 2005).
Estudos de estabilidade de várias formulações comerciais contendo ácido
retinóico foram também realizados. Os efeitos da temperatura e da exposição à luz
foram avaliados sendo encontrada notável degradação (GATTI et al., 2000; NYRADY
et al., 2002). Uma loção deste fármaco contém somente 30% da concentração inicial
após 10 minutos de irradiação (BRISAERT, PLAIZIER-VERCAMMEN, 2000;
BRISAERT et al., 2001). Cremes e soluções contendo ácido retinóico e conservadas
sob proteção da luz em temperatura de 2-8 ºC apresentam aproximadamente 86-87% da
concentração inicial deste fármaco após 90 dias, enquanto que nas temperaturas de 37 e
28
_____________________________________________________Revisão da literatura
50 ºC apresentam 57-72% da concentração inicial (GATTI et al., 2000). A
fotoestabilidade do gel contendo 0,1% ácido retinóico encapsulado em micropartículas
(Retin-A micro®) e do gel de ácido retinóico 0,025% (Retin-A®), isolado ou em
combinação com eritromicina-peróxido de benzoíla, foi avaliada por NYRADY et al.
(2002) que recuperaram 87% do ácido retinóico veiculado em micropartículas e apenas
41% dele no gel 0,025% após 24 horas. Na presença de eritromicina-peróxido de
benzoíla, o gel de ácido retinóico 0,025% apresentou valores ainda mais baixos,
correspondente a 11% da concentração inicial após 24horas. Por isso, muitos autores
têm sugerido sua veiculação em sistemas de liberação tais como lipossomas
(MONTENEGRO et al., 1996; BRISAERT et al., 2001; SHIMIZU et al., 2003;
CONTRERAS et al., 2005; SINICO et al., 2005), microemulsões (TROTTA et al.,
2003; HWANG et al., 2004), niossomas (MANCONI et al., 2002; DESAI; FINLAY,
2002), micropartículas (JEONG et al., 2003; CIRPRANLI et al., 2005; CHOI et al.,
2001) entre outros.
Sistemas de liberação do tipo lipossomas para veiculação do ácido retinóico têm
sido desenvolvidos por diversos autores até o momento (MONTENEGRO et al., 1996;
BRISAERT et al., 2001; MANCONI et al., 2002; SHIMIZU et al., 2003;
CONTRERAS et al., 2005; SINICO et al., 2005). Lipossomas contendo ácido retinóico
foram estudados por MONTENEGRO et al. (1996), que avaliaram o perfil de liberação
e a permeação a partir destas preparações, mostrando-se favoráveis à utilização tópica.
Lipossomas foram também utilizados por BRISAERT et al. (2001) para encapsulação
deste fármaco obtendo-se uma boa estabilidade química com menor fotodegradação e
alta liberação. SHIMIZU et al. (2003) incorporaram glicosídeos derivados da soja na
composição de lipossomas de ácido retinóico e constataram um aumento da estabilidade
do fármaco. CONTRERAS et al. (2005) utilizaram hidrogéis de ácido retinóico
encapsulados em lipossomas e obtiveram um perfil de liberação mais controlado,
resultando na diminuição dos efeitos colaterais da aplicação tópica. SINICO et al.
(2005) compararam lipossomas com carga positiva e negativa. Os estudos in vitro
demonstraram que os lipossomas carregados negativamente proporcionaram melhor
retenção do fármaco nas camadas da pele. Alternativamente aos lipossomas, os
niossomas também tem sido utilizados para controlar a liberação do AR e conferir
estabilidade de maneira similar aos lipossomas, mas com menor custo e maior
estabilidade (MANCONI et al., 2002; DESAI; FINLAY, 2002).
29
_____________________________________________________Revisão da literatura
Microemulsões tem sido o veículo de escolha utilizado por alguns autores
(TROTTA et al., 2003; HWANG et al., 2004). TROTTA et al. (2003) avaliaram as
microemulsões contendo ácido retinóico através da realização de ensaios de permeação
e de retenção in vitro considerando-as como uma boa alternativa para administração
tópica.
2.5 Efeitos do ácido retinóico no envelhecimento cutâneo
Todos os organismos chegam a uma fase regressiva de seu ciclo vital, que se
manifesta por modificações anatômicas e fisiológicas a qual é conhecida como
envelhecimento (ESTEVE, 1990). A pele, sendo um órgão de superfície, sofre as
agressões do meio ambiente e, particularmente, das radiações solares as quais têm um
papel relevante no envelhecimento cutâneo. O processo de envelhecimento altera a
estrutura e a função dos órgãos e, no caso da pele, que é um órgão externo, modifica
também seu aspecto. Os sinais clínicos e fisiológicos do envelhecimento cutâneo são
numerosos e variados. O envelhecimento cutâneo pode ser dividido em componentes
intrínsecos (cronológicos) e extrínsecos (LÉVÈQUE, 1997).
O envelhecimento cutâneo intrínseco é resultante do declínio nas funções e
capacidades fisiológicas que garantem o bom funcionamento do organismo.
Clinicamente, o envelhecimento intrínseco é atrófico e resulta na perda progressiva da
elasticidade, na atrofia da pele e no aumento das linhas de expressão. As principais
características histológicas são a atrofia epidérmica, o achatamento da junção dermoepidérmica, atividade metabólica mais lenta e o aumento do tamanho dos corneócitos
com a idade. Especificamente, o estrato córneo permanece relativamente inalterado,
mas a epiderme afina-se com um achatamento da junção dermo-epidérmica que é
refletida por um aumento da fragilidade da pele. Há considerável diminuição na
espessura da derme e na vascularização, assim como, uma redução no número e
capacidade biossintética de fibroblastos. Finas fibras elásticas dérmicas espessam com a
idade e, então, desaparecem (GILCHREST, 1996; LÉVÈQUE, 1997; STILLER et al.,
1996).
O termo envelhecimento extrínseco e fotoenvelhecimento são freqüentemente
utilizados como sinônimos embora, outros fatores extrínsecos, diferentes da radiação
solar, possam afetar a pele como: poluição atmosférica, hábito de fumar e metabólitos
30
_____________________________________________________Revisão da literatura
de substâncias ingeridas ou inaladas. As mudanças clínicas visíveis no fotoenvelhecimento causadas pelos efeitos acumulativos da exposição solar freqüente e
prolongada, especificamente radiação UV, podem abranger: irregularidades de
pigmentação, rugas, uma variedade de lesões malignas e alteração na estrutura e na
função da epiderme e da derme. A espessura da epiderme pode aumentar ou diminuir
correspondendo a áreas de hiperplasia ou atrofia severa, respectivamente. Na pele
severamente fotodanificada, há perda da polaridade epidérmica (maturação ordenada) e
os queratinócitos podem apresentar atipia especialmente nas camadas mais inferiores da
epiderme. Mudanças profundas ocorrem na derme, como degeneração do colágeno,
deposição de material elástico anormal refletindo em rugas, sulcos e coloração
amarelada da pele e, ainda, redução dos glicosaminoglicanos. Há um espessamento,
uma aglomeração e uma degradação de fibras elásticas. A microcirculação também é
afetada, os vasos sangüíneos tornam-se dilatados, tortuosos e muito escassos
(GILCHREST, 1996; LÉVÈQUE, 1997; RIDGE, 1990; STILLER et al., 1996).
O ácido retinóico repara os danos causados pelo foto-envelhecimento
restaurando e limitando a progressão do dano já existente. Ele bloqueia a indução UV
da matriz das metaloproteinases, enzimas responsáveis pela quebra do colágeno, o
maior constituinte da derme. O acido retinóico também estimula a proliferação dos
queratinócitos e dos fibroblastos. Mais colágeno deixa a pele mais espessa e mais
resistente a traumas. Maior proliferação de queratinócitos resulta em desprendimento
dos queratinócitos maduros resultando em uma pele mais macia. Uma maior produção
de colágeno pode explicar o desaparecimento de linhas finas e rugas (GRIFFITHS;
VOORHEES, 1995).
KLIGMAN et al. (1986) relataram o primeiro estudo para verificação da eficácia
de um creme contendo ácido retinóico na reversão dos danos solares sobre a pele facial.
Foram observadas alterações clínicas discretas, embora, fragmentos de biópsia da pele
apresentassem muitos efeitos histológicos como: espessamento da epiderme
previamente atrófica, eliminação de displasia e atipia, dispersão mais uniforme da
melanina e a formação de colágeno dérmico e novos vasos sanguíneos.
31
3. Objetivos
_______________________________________________________________Objetivos
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
Microencapsular o ácido retinóico juntamente com o óleo de babaçu para uso
tópico a fim de diminuir seus efeitos indesejáveis na pele.
3.2. Específicos
♦ Obter microcápsulas de alginato e alginato/quitosana contendo ácido retinóico e
óleo de babaçu;
♦ Desenvolver e validar a medologia analítica de quantificação do ácido retinóico a
partir das microcápsulas desenvolvidas;
♦ Otimizar as microcápsulas para tamanho e eficiência de encapsulação adequados
à via de administração;
♦ Realizar a caracterização físico-química das microcápsulas obtidas;
♦ Incorporar as microcápsulas em gel natrosol®;
♦ Estudar a liberação in vitro das microcápsulas utilizando membrana artificial;
♦ Aplicar a metodologia analítica de quantificação do ácido retinóico em cinéticas
de liberação in vitro.
33
4. Artigo I
________________________________________________________________Artigo I
Desenvolvimento e caracterização de microcápsulas de alginato/quitosana
contendo ácido retinóico e óleo de babaçu
Velloso, F. T.1,2, Ferraz, R. S. 2, Lira, A. A. M. 3, Santana, D. P.1, SantosMagalhães, N.S.2
1
Núcleo de Desenvolvimento Farmacêutico e Cosmético, Universidade Federal de
Pernambuco, Recife, Brasil
2
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami, Universidade Federal de Pernambuco,
Recife, Brasil
3
Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico, Universidade Federal de Sergipe,
São Cristóvão, Brasil
RESUMO
O ácido retinóico (AR) tem sido largamente utilizado na terapia tópica de acne,
foto-envelhecimento, psoríase, celulite e estrias. Entretanto, apesar de seus efeitos
benéficos provoca irritação local manifestada na forma de eritema, queimação, coceira,
secura e descamação da pele, além de ser instável na presença de ar e luz e pobremente
solúvel na água. Microcápsulas (MC) de alginato/quitosana foram preparadas com o
propósito de proteger e promover uma liberação controlada do AR minimizando sua
irritação cutânea. O óleo de babaçu foi acrescentado para evitar o ressecamento da pele
causado pelo AR. A caracterização das MC, a interação fármaco-polímero-óleo e o
perfil de liberação in vitro foram investigados. As MC apresentaram forma esférica,
diâmetro em torno de 400 µm e taxa de encapsulação dependente da concentração de
AR, da concentração de quitosana e do solvente utilizado. A liberação in vitro também
foi afetada pela concentração de quitosana. As MC com maiores concentrações de
quitosana apresentaram perfil de liberação mais sustentado. Assim as microcápsulas
desenvolvidas podem ser boas candidatas para sistemas de liberação controlada do AR
na pele melhorando a terapia tópica com o AR.
Palavras chave: microcápsulas, ácido retinóico, óleo de babaçu, alginato, quitosana
35
________________________________________________________________Artigo I
ABSTRACT
Retinoic acid (RA) has been widely used for dermatological applications, such
as acne, photo damage, psoriasis, cellulite and striae. However despite many beneficial
effects, the topical application of RA is limited by severe local irritation manifested as
mild erythema, peeling, itching, dryness and burning and also its light and air expoisure
instability and its poor water solubility. Alginate coating chitosan microparticles were
prepared with the purpose of protect and provide a controlled release of the RA
minimizing cutaneous irritation. The babassu oil was used to reduce side effects of RA.
Microparticles characterization, drug-polymer interaction and in vitro drug release
profile was investigated. Microcapsules presented spherical shape, mean diameter of
about 400 µm and variable drug loading capacity as a function of polymers and drug
concentrations. The in vitro release of RA was also affected by chitosan concentration.
Microcapsules with higher chitosan concentration resulted in microparticles with more
controlled profile. Than, the microcapsules developed in this work can be a good
candidate to deliver RA in the skin, improving the topical therapy with retinoids.
Keywords: microcapsules, retinoic acid, babassu oil, alginate, chitosan
36
________________________________________________________________Artigo I
1. INTRODUÇÃO
Ácido retinóico (AR), também chamado de vitamina A ácida, tem sido
largamente utilizado em formulações dermatológicas para o tratamento de acne,
psoríase, distúrbios de queratinização e também em formulações cosméticas com a
finalidade de reduzir os efeitos de fotoenvelhecimento, celulite e estrias (SHAPIRO,
SALIOU, 2001). Entretanto, apesar de seus efeitos benéficos provoca irritação local
manifestada na forma de eritema, queimação, coceira, secura e descamação da pele
(SINICO et al., 2005).
A irritação causada na pele pelo AR é um fator limitante para a continuidade do
tratamento pelo paciente. O AR diminui o tamanho das glândulas sebáceas assim como
a sua secreção fazendo com que ele seja bastante atrativo para tratamento de acne
(LEWIN et al.,1994), porém para tratamentos de psoríase, celulite, estrias e rugas não é
interessante que a pele fique ressecada. Sendo assim, a incorporação de emolientes
atuaria favoravelmente para diminuição do ressecamento da pele causado pelo AR.
O AR além de ser instável na presença de ar e luz é pouco solúvel na água. A
baixa solubilidade limita sua incorporação em certos veículos e a fotosensibilidade
pode promover uma terapia tópica ineficaz (LEHMAN et al.,1988). Para suplantar
esses inconvenientes e aumentar a eficácea terapêutica do AR, várias formulações
foram propostas como, por exemplo, complexo de inclusão em β-ciclodextrina
(AMDIDOUCHE et al., 1994), gel (SHIN et al., 2005), lipossomas (BRISAERT et al.,
2001; CONTRERAS et al., 2005; IOELE et al., 2005; SINICO et al., 2005), niossomas
(DESAI; FYNLAY, 2002), nanoemulsão (JENNING et al., 2000), microemulsões
(HWANG et al., 2004), nanopartículas (EZPELETA et al., 1995), nanopartículas
lipídicas (LIM et al., 2004) e micropartículas (CIRPRANLI et al., 2005; LIRA et al.,
2007; ROSSLER et al., 1994; TROTTA et al., 2003).
As micropartículas são sistemas poliméricos de liberação controlada, sustentada
ou prolongada de fármacos ou substâncias biologicamente ativas. Elas podem ser de
dois tipos: matriciais conhecidos como microesferas ou reservatórios conhecidos como
microcápsulas (cápsulas ocas ou com cavidade oleosa). As micropartículas
proporcionam proteção a substâncias lábeis e promovem liberação controlada de
princípios ativos (BENITA, 2006). De acordo com a rigidez da parede desses sistemas
uma liberação controlada é possível, o que é bastante importante no caso dos fármacos
que provocam irritação na pele, pois estes promovem a obtenção de efeitos terapêuticos
37
________________________________________________________________Artigo I
com a utilização de doses menores e diminuição dos efeitos colaterais, tornando-o
viável clinicamente.
Desta forma o uso das microcápsulas (MC) pode ser uma alternativa viável para
veicular o ácido retinóico a fim de melhorar a estabilidade e minimizar a irritação
produzida na pele através da obtenção de uma liberação controlada. Além disso, o uso
de óleo de babaçu como cavidade interna oleosa de microcápsulas pode auxiliar na
diminuição do ressecamento provocado pelo ácido retinóico na pele.
O objetivo deste estudo foi, portanto, desenvolver uma formulação tópica de
ácido retinóico encapsulado em microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de
babaçu, incorporá-las em gel natrosol® e avaliar a cinética de liberação in vitro
utilizando células de difusão de Franz para obtenção de perfil sustentado.
38
________________________________________________________________Artigo I
2. MATERIAIS E MÉTODO
2.1. Materiais
Ácido retinóico grau farmacêutico (Purifarma, São Paulo, Brasil), alginato,
quitosana e polissorbato 80 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), etanol (Vetec, Rio de
Janeiro, Brasil), ácido acético (Merck, Darmstadt, Alemanha), óleo de babaçu (Volp,
São Paulo, Brasil), hexano (Synth, São Paulo, Brasil), metanol grau HPLC (J.T.Baker,
USA), clorofórmio e diclorometano (Merck, Darmstadt, Alemanha), dihidrógenofosfato
de sódio, hidróxido de sódio e cloreto de cálcio grau analítico (Vetec Rio de Janeiro,
Brasil), metilparabeno e EDTA dissódico (DEG, São Paulo, Brasil); Natrosol® e
propilenogicol (Codossal, São Paulo, Brasil).
2.2. Obtenção de microcápsulas de alginato e microcápsulas de alginato/quitosana
contendo ácido retinóico disperso em óleo de babaçu
No estudo de pré-formulação microcápsulas de alginato de sódio sem
revestimento de quitosana (microcápsulas de alginato) contendo ácido retinóico e óleo
de babaçu foram obtidas através da técnica de coacervação complexa em etapa única
(WITTAYA-AREEKUL et al. 2006) utilizando cloreto de cálcio e um solvente
apropriado para solubilizar o AR. As microcápsulas foram obtidas por nebulização
(atomizador spray, BP 5.0, Biotecnosis do Brasil, Rio de Janeiro, Brasil), filtradas a
vácuo, lavadas com água destilada e liofilizadas (Liofilizador - EZ-DRY, FTS System,
New York, USA).
Após otimização do processo, microcápsulas de alginato revestidas pela
quitosana (microcápsulas de alginato/quitosana) contendo ácido retinóico e óleo de
babaçu foram obtidas pela técnica a nteriormente descrita para as microcápsulas de
alginato, sendo a quitosana (deacetilada com ácido acético) adicionada a solução de
cloreto de cálcio. Depois de obtidas, as microcápsulas de alginato/quitosana foram
incorporadas em gel natrosol® para ensaios de liberação in vitro. O gel natrosol® foi
preparado pelo aquecimento de metilparabeno, EDTA dissódico e propilenoglicol com.
39
________________________________________________________________Artigo I
um pouco de água até completa solubilização O natrosol® foi pulverizado na mistura e
deixado sob agitação média por 30 minutos ou até ficar consistente.
2.3.
Caracterização
físico-química
das
microcápsulas
de
alginato
e
alginato/quitosana contendo ácido retinóico disperso em óleo de babaçu
2.3.1. Rendimento das microcápsulas
As microcápsulas de alginato ou de alginato/quitosana contendo ácido retinóico
e óleo de babaçu liofilizadas foram pesadas e o rendimento do processo foi calculado
através da razão entre a quantidade de MC obtidas e a quantidade teórica de MC
expressa em porcentagem. A quantidade teórica das microcápsulas foi baseada na
quantidade total inicial de alginato, óleo de babaçu e AR.
2.3.2. Tamanho e morfologia das microcápsulas
Para a determinação do tamanho das microcápsulas de alginato e
alginato/quitosana contendo ácido retinóico e óleo de babaçu foi utilizado o método de
difração de laser (analisador de tamanho de partícula LSTM 13 320, Beckman Coulter,
EUA). A morfologia das microcápsulas de alginato/quitosana foi avaliada por
microscopia ótica (câmera digital Sony, modelo DSC-T100) e microscopia eletrônica
de varredura (microscópio JEOL, Tókio, Japão) após metalização das amostras com
ouro coloidal.
2.3.3. Taxa de encapsulação das microcápsulas
As microcápsulas contendo ácido retinóico e óleo de babaçu (0,5 g) foram
dispersas em solução tampão pH 7,4 e submetidas a agitação ultra-som (Vibra Cell,
BRANSON, EUA) por 2 minutos, sendo mantidas sob agitação magnética por 12 h após
dispersão em hexano. O ácido retinóico foi separado pelo processo de partição
40
________________________________________________________________Artigo I
adicionando-se hexano. O conteúdo orgânico foi transferido para um balão volumétrico
e o volume foi completado com hexano para 50 mL. As amostras obtidas foram
convenientemente diluídas com metanol e analisadas por cromatografia líquida de alta
eficiência. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
2.3.4. Estudo de interação entre o ácido retinóico e constituintes das microcápsulas
utilizando espectroscopia em IV com transformada de Fourier (FTIR)
A análise da interação entre o AR e os constituintes das microcápsulas de
alginato/quitosana foi efetuada através de espectroscopia de infravermelho. Amostras
das microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico, fármaco isolado,
óleo de babaçu, quitosana, alginato, microcápsulas de alginato/quitosana brancas (sem
o AR) e das misturas físicas de AR-quitosana (1:1 p/p), óleo-AR (1:1 p/p) e alginatoAR (1:1 p/p) foram avaliadas utilizando método de pastilhas de KBr (espectrofotômetro
FTIR F 566, Bruker I).
2.4. Estudo de liberação in vitro das microcápsulas de alginato/quitosana contendo
ácido retinóico disperso em óleo de babaçu
O estudo de liberação in vitro do AR a partir das formulações foi realizado com
células de difusão do tipo FRANZ com área difusional de 1,15 cm2, volume de 6 mL e
utilizando membranas sintéticas hidrofílicas (ME 25/21 ST, 0,45 µm ± 0,5 µm). O
compartimento receptor foi preenchido com tampão fosfato pH 7,4 e etanol (70:30) em
um sistema composto de seis células individuais conectados a um banho termostatizado
à 37°C ± 0,5°C sob agitação constante de 100 rpm por um período de 48 hs. As
membranas foram colocadas cuidadosamente entre o compartimento doador e receptor
de forma que ficassem em contato com a solução receptora. Todas as membranas foram
previamente umedecidas (1 hora antes do experimento) com a solução receptora. No
compartimento doador uma amostra de microcápsulas contendo 0,025% do fármaco
incorporadas em 0,4 g gel natrosol® foi colocada sobre a membrana artificial de cada
célula. Em períodos de tempos pré-determinados (1,5; 3; 5; 7; 10; 24; 48 hs) todo o
41
________________________________________________________________Artigo I
líquido do compartimento receptor foi coletado e imediatamente reposto. O ácido
retinóico liberado foi quantificado em cromatografia líquida de alta eficiência.
2.5. Condições cromatográficas para a quantificação do AR por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE)
As análises cromatográficas de quantificação do ácido retinóico foram efetuadas
em cromatógrafo SPD 10 AVP, equipado com detector UV-VIS operando a 350 nm
com bomba LC-10 ADVP e programa LC-10 (Shimadzu, Kyoto, Japão). A separação
foi realizada em coluna C18 de fase reversa (Gemini®, Phenomenex) 150 x 4,6 mm
(5µm). A fase móvel foi constituída por metanol e ácido acético glacial a 1% (85:15
v/v) com fluxo de 1,8 mL/min e volume de injeção de 20 µL.
42
________________________________________________________________Artigo I
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Obtenção de microcápsulas de alginato e microcápsulas de alginato/quitosana
contendo ácido retinóico disperso em óleo de babaçu
O alginato de sódio e a quitosana são polímeros naturais que tem sido bastante
utilizados para a obtenção de micropartículas (MURATA et al., 1993a,b; SEZER;
AKBUGA, 1999a,b; WITTAYA-AREEKUL et al., 2006). A técnica utilizada é
chamada coacervação complexa (WITTAYA-AREEKUL et al., 2006) onde uma
membrana é formada na interface entre as soluções de alginato e quitosana quando a
solução de alginato é gotejada diretamente em uma solução de cloreto de cálcio
misturada com quitosana. A malha polimérica de alginato é formada tanto pela reação
com quitosana quanto pela reação com íons cálcio (WITTAYA-AREEKUL et al.,
2006).
Para se obter uma liberação adequada de fármacos as micropartículas de
quitosana são frequentemente reticuladas através de crosslinking químico com
glutaraldeído (JAMEELA, JAYAKRISHMAN, 1995; BERTHOLD et al., 1996,
GENTA et al., 1997). Entretanto, resíduos desse agente químico nas micropartículas
pode causar irritação nas mucosas e induzir efeitos colaterais indesejáveis. Por outro
lado a quitosana pode formar géis com ânions não tóxicos como o alginato de sódio
através de crosslinking iônico (ANAL, STEVENS, 2005). A rigidez da parede de
micropartículas provoca uma liberação mais controlada o que é bastante importante no
caso dos fármacos que provocam irritação na pele, pois estes promovem a obtenção de
efeitos terapêuticos com a utilização de doses menores e diminuição dos efeitos
colaterais, tornando-o viável clinicamente.
No estudo de pré-formulação foram desenvolvidas microcápsulas de alginato de
sódio (2%) sem o revestimento de quitosana (microcápsulas de alginato) contendo
ácido retinóico disperso em óleo de babaçu através da modificação do método proposto
por WITTAYA-AREEKUL et al. (2006).
No estudo de pré-formulação foi variada a quantidade de óleo de babaçu (20 a
40%) necessária para se obter uma emulsão estável na etapa inicial do processo de
produção das microcápsulas de alginato, com sensorial agradável e com rendimento
elevado. O rendimento do processo, a estabilidade da emulsão (ausência de separação
43
________________________________________________________________Artigo I
de fases por um período de 3 hs) e o aspecto sensorial (espalhabilidade, suavidade de
toque e hidratação da pele) foram avaliados (Tabela 1).
Tabela 1. Avaliação da influência da porcentagem de óleo babaçu no rendimento do
processo de obtenção das microcápsulas de alginato.
Óleo de babaçu (%)
Rendimento (%)
Sensorial
Estabilidade da emulsão
20
79,84
++
+++
30
77,20
+++
+++
40
75,32
+
+++
* Sensorial = espalhabilidade, suavidade no toque e hidratação.
** Estabilidade da emulsão (+) = visualização de separação de fases; (++) = visualização de separação de
fases no período de 3 hs; (+++) = ausência de separação de fases;
Dos resultados é possível observar que quanto maior a porcentagem de óleo de
babaçu na formulação (40%) menor é o rendimento (75%). Isso se deve a um aumento
na viscosidade da emulsão inicial implicando em maior perda de material durante o
processo de obtenção das microcápsulas. Apesar da formulação de microcápsulas de
melhor rendimento (~ 80%) ter sido obtida com 20% de óleo, o sensorial das mesmas
não é tão agradável quanto ao das microcápsulas com 30% de óleo de babaçu, as quais
propiciam um toque de maior suavidade e hidratação. A formação da emulsão foi
estável em todas as formulações.
A influência da adição de AR (0,1%) no rendimento das microcápsulas de
alginato contendo óleo de babaçu (20 a 40%) foi avaliada e os resultados estão
apresentados na Tabela 2. A presença do ácido retinóico a 0,1% diminuiu o rendimento
das microcápsulas de alginato que passa de 79% para 75% na formulação com de óleo
de babaçu a 20% e de 75% para 70% na formulação com de óleo de babaçu a 40%
(Tabelas 1 e 2).
Tabela 2. Avaliação da influência da presença do AR (0,1%) no rendimento das
microcápsulas de alginato com concentrações variadas de óleo de babaçu.
Óleo (%)
Rendimento (%)
20
75,34
30
74,75
40
70,44
44
________________________________________________________________Artigo I
Da análise dos resultados dessa etapa de pré-formulação, a taxa de óleo de
babaçu foi fixada em 30% a fim de promover rendimento elevado e boa hidratação da
pele na aplicação tópica. Na etapa seguinte, microcápsulas de alginato contendo óleo de
babaçu a 30% foram preparadas com diferentes concentrações de AR (0,1%; 0,25% e
0,5%). O rendimento, a taxa de encapsulação do AR (Tabela 3) e o tamanho médio das
microcápsulas foram determinados (Tabela 4).
Tabela 3. Influência da concentração de AR no rendimento e na taxa de encapsulação
das microcápsulas de alginato contendo óleo de babaçu (30 %).
Formulação
AR (%)
Rendimento (%)
Taxa de encapsulação (%)
F1
0,10
74,75
23,32 ± 0,018
F2
0,25
71,26
26,93 ± 0,065
F3
0,50
74,80
51,67± 0,028
AR solubilizado em etanol
Tabela 4: Apresentação dos resultados dos tamanhos das microcápsulas de alginato.
Formulação
d10
d50
d90
F1
111,8
329,5
742,8
F2
108,2
284,7
731,5
F3
106,1
324
766,9
d10 = 10% das microcápsulas apresentam tamanho < que (...) µm; d50 = 50% das microcápsulas apresentam tamanho < que (...) µm;
d90 = 90% das microcápsulas apresentam tamanho < que (...) µm
O rendimento do processo correspondeu a mais de 70% para todas as
formulações. A taxa de encapsulação aumentou com o aumento da quantidade de ácido
retinóico. O aumento na concentração de AR de 0,1% para 0,5% aumentou a taxa de
encapsulação de 23% para 52%, Estes dados estão de acordo com SEZER; AKBUGA
(1999a,b) e ANAL, STEVENS (2005). Eles perceberam que com o aumento da
concentração do fármaco havia um aumento na taxa de encapsulação.
Nas formulações F1, F2, e F3 o tamanho médio das partículas foi de 384, 359 a
387 µm para F1, F2 e F3 respectivamente. Existem muitos trabalhos na literatura onde
esse método é empregado por diferentes grupos para obtenção de micropartículas com
diâmetro menor que 200 µm (WEE; GOMBOTZ; FANSLOW, 1995; BOWERSOCK et
al., 1996; GOMBOTZ; WEE, 1998). O tamanho dessas microcápsulas pode ser ajustado
45
________________________________________________________________Artigo I
mediante o controle da pressão do sistema de extrusão, da velocidade do fluxo da
solução de alginato de sódio que vai ser nebulizado e da distância entre o orifício e a
superfície da solução de cloreto de cácio (GOMBOTZ; WEE, 1998). Embora esses
parâmetros pudessem ser utilizados para obtenção de partículas com uma faixa de
distribuição de tamanho mais estreita, algumas limitações tecnológicas impediram a
otimização do processo.
Fundamentado nos resultados do estudo de pré-formulação, diferentes
formulações de microcápsulas de alginato (2%) revestido pela quitosana (microcápsulas
de alginato/quitosana) contendo ácido retinóico e óleo de babaçu (30%) foram obtidas
variando-se as concentrações do ácido retinóico (0,1; 0,25 e 0,5%), da quitosana (0,05 e
0,1%) e do tipo de solvente utilizado na solubilização do ácido retinóico (etanol,
diclometano e clorofórmio).
3.2. Caracterização físico-química de microcápsulas de alginato/quitosana
contendo ácido retinóico disperso em óleo de babaçu
3.2.1. Determinação do rendimento, da taxa de encapsulação e do tamanho de
partículas das microcápsulas de alginato/quitosana contendo do ácido retinóico e
óleo de babaçu
O rendimento, a taxa de encapsulação do AR (Tabela 5) e o tamanho das
microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico e óleo de babaçu foram
determinados (Tabela 6).
46
________________________________________________________________Artigo I
Tabela 5. Valores do rendimento do processo e da taxa de encapsulação das
microcápsulas de alginato/quitosana contendo 2% de alginato e 30% de óleo.
Formulação
Solvente
AR
(%)
Quitosana
(%)
Rendimento
(%)
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
Et-OH
Et-OH
Et-OH
Et-OH
Et-OH
Et-OH
CH2CL2
CHCL3
0,1
0,1
0,25
0,25
0,5
0,5
0,5
0,5
0,05
0,1
0,05
0,1
0,05
0,1
0,1
0,1
74,06
75,25
72,83
73,17
74,98
76,18
71,86
70,80
Taxa de
Encapsulação
(%)
7,96 ± 0,03
14,48 ± 0,84
18,68 ± 0,033
24,04 ± 0,018
22,82 ± 0,45
44,32 ± 0,01
73,18 ± 0,07
78,22 ± 0,01
Em todas as formulações o rendimento obtido foi acima de 70%. Concentrações
crescentes de fármaco e de quitosana resultaram em aumentos significativos na taxa de
encapsulação que variou de aproximadamente 8% a 44% quando o etanol foi utilizado
como solvente o que também foi percebido pelos autores SEZER, AKBUGA (1999a,b)
e ANAL, STEVENS, (2005).
A utilização de solventes mais apolares levou há aumentos ainda maiores na taxa
de encapsulação sendo de 73% para o diclorometano e 78% para o clorofórmio. Esses
resultados podem ser explicados pela maior solubilidade do AR em clorofórmio e
diclorometano com relação ao etanol, desta forma há uma melhor solubilização do AR
fazendo com que este fique mais homogeneamente disperso na emulsão e seja melhor
incorporado na matriz de alginato ficando assim protegido do contato com o ambiente
externo.
47
________________________________________________________________Artigo I
Tabela 6. Apresentação dos resultados dos tamanhos das microcápsulas.
Formulação
d10
d50
d90
F4
137
386,2
842
F5
118
354
1051
F6
142
384
874
F7
129
380
993
F8
124
341
776
F9
127
355
767
F10
146
433
1049
F11
128
412
922
d10 = 10% das microcápsulas apresentam tamanho < que (...) µm; d50 = 50% das
microcápsulas apresentam tamanho < que (...) µm; d90 = 90% das microcápsulas
apresentam tamanho < que (...) µm
Nas formulações F4-F11 o tamanho médio das partículas variou de 400 a 480 nm.
Como explicado anteriormente, para as formulações de alginato, limitações
tecnológicas não permitem a otimização do processo para a produção de uma faixa de
distribuição de tamanhos mais estreita
3.2.1. Morfologia das microcápsulas
As fotografias obtidas por microscopia óptica das microcápsulas de
alginato/quitosana contendo AR e óleo de babaçu, antes da liofilização, estão
apresentadas na Figura 1, onde podem ser visualizadas microcápsulas esféricas e com
uma pequena saliência decorrente do processo de gotejamento.
A morfologia das microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico
(0,5 %) e óleo de babaçu, após liofilização, foi também avaliada por microscopia
eletrônica de varredura (Figura 2). As microcápsulas são esféricas com superfície
rugosa (A). Na Figura 2B, após corte transversal, é possível observar a matriz de
alginato e a perda da cavidade oleosa caracterizando um sitema reservatório. Pode ser
enfatizado que não há visualização de cristais de AR na superfície das microcápsulas,
corroborando a taxa de encapsulação elevada para essa formulação (F11).
48
________________________________________________________________Artigo I
Figura 1. Fotografias das microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico
a 0,5 % e óleo de babaçu a 30 % (F11): A) microcápsulas esféricas; B) microcápsulas
com pequena saliência decorrente do processo de gotejamento. (100 ×).
A
B
Figura 2. Fotomicrografias de microcápsulas de alginato/quitosana contendo AR a 0,5
% e cavidade preenchida com óleo de babaçu a 30 % (F11). Microscopia eletrônica de
varredura.
49
________________________________________________________________Artigo I
3.3.3. Estudo de interação entre o ácido retinóico e constituintes das microcápsulas
de alginato/quitosana contendo do ácido retinóico e óleo de babaçu utilizando
espectroscopia em IV com transformada de Fourier (FTIR)
Os espectros em infravermelho obtidos a partir da mistura física de óleo de
babaçu e AR comparado aos de óleo de babaçu e AR isolados estão representados na
Figura 3. Na mistura física, alterações e deslocamentos das bandas nas regiões entre
1310 e 1046 cm-1 foram observadas. As bandas em 1335 cm-1 e 1310 cm-1 (estiramento
C-O do grupamento carboxílico) presentes tanto no óleo de babaçu como no AR
fundiram-se na mistura física. A banda 1036 cm-1 (deformação O-H) presente no óleo
de babaçu e no ácido retinóico, respectivamente, desapareceu na mistura física. As
bandas em 808 cm-1 (estiramento C-C) e 551 cm-1 (deformação C-C) presentes no óleo
de babaçu foram deslocadas e intensificadas na mistura física, enquanto que a banda em
487 cm-1 (deformação C-C) deslocou-se e diminuiu de intensidade na mistura física. A
banda em 758 cm-1 (estiramento =C-H) presente na mistura física resultou da fusão de
várias bandas tanto do AR quanto do óleo de babaçu, indicando, portanto, uma
interação e/ou solubilização do fármaco no óleo de babaçu.
50
________________________________________________________________Artigo I
Figura 3. Espectro comparativo de FTIR do AR (linha contínua), do óleo de babaçu
(linha tracejada) e da mistura física AR e óleo de babaçu 1:1 (p/p). (linha pontilhada). A
= estrutura do AR.
Os espectros FTIR obtidos a partir do AR e das microcápsulas de
alginato/quitosana contendo ou não fármaco estão apresentados na Figura 4. Os
espectros das microcápsulas de alginato/quitosana e das microcápsulas de
alginato/quitosana brancas são bastante semelhantes, diferindo apenas pela presença da
banda 676 cm-1 pertencente ao AR. Constata-se, assim, a fraca presença do AR na
superfície das microcápsulas.
Alterações foram observadas nas bandas 1170 – 1130 cm-1, vibrações C-O-N
atribuídas a ligações C-N e O=C-N, indicando uma forte interação entre os grupos
carboxilas do AR e os grupos aminas da quitosana, provavelmente por uma ligação
amida como sugerido por Lira et al., (2007). Esses autores propuseram uma interação
51
________________________________________________________________Artigo I
entre o AR e a quitosana formando retinoatos ou retinoamidas em microparticulas de
quitosana preparadas utilizando tripolifosfato como agente de reticulação. A presença
de AR na superfície pode fazer com que a taxa de encapsulação seja diminuída nas MC
com quitosana com solventes menos polares (etanol) quando comparadas a aquelas sem
o revestimento de quitosana pela possível interação do AR com a quitosana como LIRA
(2007) sugeriu.
A
B
1 ,0
101 4
833
1954
952
1067
1518
2 919
1572
3007
700
1 243
602
485
601
647
530
500
1132
3045
1154
1619
1334
1745
691
649
1092
1410
1442
3327
791
1378
0 ,6
131 1
Transmitance (%)
Transmitance (%)
0 ,9
0 ,8
457
1414
964
907
836
8 22
506
1447
0 ,6
530
1083
1027
1506
0 ,4
1739
1379
1330
1178
1136
7 55
1303
1261
1592
0 ,2
757
0 ,3
4000
1,0
1680
1690
3 00 0
2000
W a v e n u m b e rs (c m
1000
-1
0 ,0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
W a v e n u m b e rs (c m
)
-1
1000
500
)
0,9
Transmitance (%)
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
-1
Wavenumbers (cm )
Figura 4. Espectros FTIR das microcápsulas de alginato/quitosana com AR (0,5%)
(linha contínua) e sem AR (brancas) (linha tracejada) em comparação com o AR puro
(linha pontilhada). A = alginato, B = quitosana.
52
________________________________________________________________Artigo I
3.3.4 Estudo do perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir de
microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu
As microcápsulas de alginato preparadas com diferentes concentrações de
quitosana (0,05% - F8 e 0,1% - F11) foram avaliadas no estudo de liberação in vitro e os
resultados obtidos estão apresentados na Figura 5.
As microcápsulas que utilizaram solução de quitosana mais concentrada
resultaram em um perfil de liberação mais sustentado provavelmente devido ao maior
enrijecimento da parede pela reação de crosslinking mais intensa. Esses resultados estão
de acordo com SEZER; AKBUGA (1999a,b) que verificaram que o aumento da
concentração de quitosana afetou as propriedades das partículas obtidas, resultando em
liberação mais controlada.
Aproximadamente 67% do fármaco foi liberado a partir das microcápsulas
preparadas com quitosana a 0,05% e em torno de 45% daquelas preparadas com
quitosana a 0,1% ao final de 48 h. Uma diferença pode ser observada claramente nos
perfis de liberação das duas formulações a partir de 12 h da cinética. Essa liberação
mais controlada obtida será vantajosa para veiculação do ácido retinóico na pele,
diminuindo, provavelmente a irritação cutânea assim como para obtenção de uma
eficácia terapêutica utilizando doses menores. No entanto, a variação experimental foi
elevada (intersecção dos desvios padrões), sendo necessários estudos mais aprimorados
para aplicação de microcápsulas de alginato/quitosana com cavidade interna de óleo de
babaçu como veículo para o ácido retinóico por via tópica.
53
________________________________________________________________Artigo I
Figura 5. Perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir das microcápsulas de
alginato/quitosana contendo óleo de babaçu. As formulações utilizadas foram as F11
[AR (0,5%) e Q (0,1%)] e F8 [AR (0,5%) e Q (0,05%)].
54
________________________________________________________________Artigo I
CONCLUSÃO
A utilização da técnica de coacervação complexa com cloreto de cálcio permitiu
a obtenção de microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico e óleo de
babaçu, utilizado como promotor de oclusão da pele evitando assim o ressecamento
causado pelo AR na pele. As microcápsulas obtidas no presente estudo são
economicamente viáveis, sendo de fácil e rápida obtenção e utiliza um componente de
interesse econômico do Nordeste do país, o óleo de babaçu. Pela biocompatibilidade,
baixo custo e alta disponibilidade do alginato e quitosana, as microcápsulas
desenvolvidas podem ser boas candidatas para sistema de liberação controlada do AR
na terapia tópica. Esses sistemas serão reavaliados quanto ao perfil de cinética de
liberação in vitro e permeação cutânea do ácido retinóico para uma futura aplicação
tópica.
55
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69
6. Anexos
Artigo II
_______________________________________________________________Artigo II
Desenvolvimento e validação de método analítico em CLAE-UV para a
quantificação de ácido retinóico e doseamento em microcápsulas de alginato e
quitosana
Velloso, F. T.1,2, Ferraz, R. S.2, Lira, A. A. M.3, Santana, D. P.1, Santos-Magalhães,
N.S.2*
1
Núcleo de Desenvolvimento Farmacêutico e Cosmético, Universidade Federal de
Pernambuco, Recife, Brasil.
2
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami, Universidade Federal de Pernambuco,
Recife, Brasil.
3
Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico, departamento de Fisiologia,
Universidade Federal de Sergipe, São Cristovão, Brasil.
* Autor para correspondência:
Nereide Stela Santos Magalhães
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Grupo de Sistemas de Liberação Controlada de Medicamentos (SLC)
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA)
Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária,
50670-901, Recife, PE, Brazil
Tel: +55-81-21268587; fax: +55-81-21268485
E-mail address: [email protected]
73
_______________________________________________________________Artigo II
RESUMO
O ácido retinóico (AR) tem sido utilizado para o tratamento de acne severa, rugas,
estrias e celulite, no entanto, provoca irritação na pele e sofre rápida degradação quando
exposto à luz e ao calor. Métodos analíticos rápidos para quantificação do AR são,
portanto, necessários para ensaios de cinética de liberação in vitro. Nesse contexto, o
objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método rápido e sensível para o
doseamento do AR em microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu
dispersas em gel natrosol® por cromatografia líquida de alta eficiência associada à
espectroscopia UV e aplicá-lo na avaliação do perfil de liberação in vitro dessas
formulações. As análises foram realizadas em modo isocrático, em comprimento de
onda de 350 nm e utilizando coluna C18 de fase reversa 150 x 4,6 mm (5µm). A fase
móvel foi constituída de metanol e ácido acético 1% (85:15 v/v) com fluxo de 1,8
mL/minuto. A faixa de linearidade do estudo foi de 0,5 a 60 µg/mL (r2 = 0,999). O
método validado mostrou-se sensível, específico, exato, preciso, de baixo custo e o
tempo de retenção do AR foi de 5,8 ± 0,4 minutos sendo, desta forma, mais rápido do
que os relatados na literatura.
Unitermos: validação, CLAE-UV, ácido retinóico, microcápsulas, liberação in vitro.
74
_______________________________________________________________Artigo II
ABSTRACT
All-trans retinoic acid (RA) has been used in the treatment of severe acne, wrinkles,
striae and cellulite. However, it induces skin irritation and rapidly suffers degradation
under light and high temperate exposure. Rapid analytical methods to quantify retinoic
acid are therefore mandatory. In this framework, the aim of this study was to develop
and validate a rapid and responsive method to quantify the RA in microcapsules of
chitosan and alginate containing babassu oil dispersed in natrosol® hydrogel using high
performance liquid chromatography (HPLC). Furthermore this method was used to
quantify in vitro release kinetics of RA from microcapsules. The analyses have been
carried through an isocratic HPLC-UV method at 350 nm using a C18 150 x 4,6 mm
(5µm) reversed-phase column and a mobile phase constituted of methanol and 1%
acetic acid (85:15) at a flow rate of 1.8 mL/min. The linearity range was 0.5-60 µg/mL
(r2 = 0.999). The validated HPLC-UV method was responsive, specific, accurate,
precise, economic and the RA retention time was 5.8 ± 0.4 minutes, being therefore,
faster than that one previously reported.
Keywords: validation, HPLC, all-trans retinoic acid, microcapsules, in vitro release
75
_______________________________________________________________Artigo II
1. INTRODUÇÃO
O ácido retinóico tem como função fisiológica atuar na proliferação e
diferenciação celular, na produção do sebo e na síntese de colágeno (Kligman et al.,
1986). Ele tem sido utilizado em diferentes níveis farmacológicos para o tratamento de
várias disfunções dermatológicas como acne, rugas e distúrbios de queratinização
incluindo psoríase. Recentemente, foi descoberto como útil no tratamento de estrias e
celulite (Shapiro, Saliou, 2001).
Apesar da comprovada eficácia do ácido retinóico, ele apresenta algumas
desvantagens que limitam fortemente a sua utilização, tais como a baixa solubilidade
em água, a instabilidade na presença de luz e oxigênio e a ocorrência de reações de
irritação local tais como eritema, xerose e discreta descamação (Lehman et al., 1988).
As microcápsulas são sistemas de liberação que têm se destacado por
proporcionarem proteção a materiais instáveis, liberação lenta ou sustentada de
princípios ativos e ainda uma liberação sítio-específico (Benita, 2006). As
microcápsulas podem ser alternativas viáveis para veicular ácido retinóico na pele a fim
de minimizar a irritação produzida quando utilizado topicamente, devido a sua liberação
prolongada, além de conferir maior estabilidade à molécula (Dinarvand et al., 2003).
Para avaliar se as microcápsulas são capazes de prevenir os efeitos indesejáveis do AR
na pele é preciso fazer um estudo de permeação e retenção cutânea, porém
primeiramente é necessário estudar seu perfil de liberação in vitro. Na cinética de
liberação in vitro as condições fisiológicas de temperatura, meio de dissolução e
agitação são simuladas a fim de se determinar a capacidade da formulação liberar o
ativo em função do tempo (Berkland et al., 2001).
O grande desafio para a quantificação de fármacos em amostras derivadas de
estudo de cinética de liberação in vitro consiste em reduzir o tempo de análise devido à
elevada quantidade de amostras a serem avaliadas. No caso específico do ácido
retinóico, o armazenamento das amostras e análises de longa duração podem ocasionar
perda de estabilidade ou aparecimento de produtos de degradação, sendo necessário o
desenvolvimento de métodos rápidos, específicos e que permitam a utilização dos
mesmos parâmetros cromatográficos tanto para a análise da forma farmacêutica quanto
para as amostras da cinética de liberação in vitro.
Alguns métodos analíticos estão relatados na literatura para a quantificação de
ácido retinóico em diversas preparações farmacêuticas (Ezpeleta et al., 1996; Brisaert,
76
_______________________________________________________________Artigo II
Plaizier-Vercammen, 2000; Brisaert et al., 2001; Trotta et al., 2003 Lim et al., 2004;
Hwang et al., 2004; Contreras et al., 2005). No entanto, os tempos de retenção são
elevados variando de 7,95 a 18 minutos, o que não é conveniente para a análise do ácido
retinóico visto que este sofre rapidamente degradação quando exposto à luz ou ao calor,
além da grande quantidade de amostras a serem analisadas decorrentes de estudo de
cinética de liberação in vitro.
Fundamentado na revisão dos métodos de quantificação do ácido retinóico por
CLAE-UV em modo isocrático ou gradiente, utilizando na sua grande maioria
acetonitrila como solvente com tempos de retenção igual ou superior a 8 minutos, o
objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método analítico por CLAE-UV
para quantificar o ácido retinóico, de forma rápida e sensível em microcápsulas de
alginato/quitosana contendo óleo de babaçu dispersas em gel natrosol®. O método foi
aplicado para quantificar o ácido retinóico em cinéticas de liberação in vitro.
77
_______________________________________________________________Artigo II
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Reagentes e materiais
Ácido retinóico grau farmacêutico (Purifarma São Paulo, Brasil), alginato,
quitosana e polissorbato 80 (Sigma-Aldrich, St.Louis, USA), etanol (Vetec Rio de
Janeiro, Brasil), ácido acético (Merck Darmstadt, Alemanha), óleo de babaçu (Volp,
São Paulo, Brasil), hexano (Synth, São Paulo, Brasil), metanol grau HPLC (J.T. Baker,
USA), fosfato de potássio monobásico, hidróxido de sódio e cloreto de cálcio grau
analítico (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil), metilparabeno e EDTA dissódico (DEG, São
Paulo, Brasil); Natrosol® e propilenogicol (Codossal São Paulo, Brasil).
2.2. Condições cromatográficas
As análises cromatográficas de quantificação do ácido retinóico foram efetuadas
em cromatógrafo SPD 10 AVP, equipado com detector UV-VIS operando a 350 nm
com bomba LC-10 ADVP e programa LC-10 (Shimadzu, Kyoto, Japão). A separação
foi realizada em coluna C18 de fase reversa (Gemini®, Phenomenex) 150 x 4,6 mm
(5µm). A fase móvel foi constituída por metanol e ácido acético glacial a 1% (85:15
v/v) com fluxo de 1,8 mL/min e volume de injeção de 20 µL.
2.3. Validação do método analítico para o ácido retinóico
A metodologia analítica foi validada de acordo com a RE 899 de 29 de maio de
2003 – ANVISA (Brasil, 2003).
78
_______________________________________________________________Artigo II
2.3.1. Curva analítica do ácido retinóico
Foi pesado, exatamente, o equivalente a 5 mg de ácido retinóico e dissolvido em 5
mL de metanol (1 mg/mL). Alíquotas desta solução foram diluídas em metanol para
obter concentrações correspondentes a 0,5, 2, 5, 10, 20, 40 e 60 µg/mL. As soluções
foram analisadas por CLAE-UV e os resultados obtidos foram relacionados em um
gráfico da concentração da solução em função da área sob pico. As curvas foram
efetuadas em triplicata (n=3) e uma curva média foi obtida.
2.3.1.1. Linearidade
A avaliação da linearidade do método analítico, ou seja, a proporcionalidade entre
a concentração e a resposta foi efetuada mediante a obtenção de três curvas autênticas,
do cálculo do coeficiente de variação (CV%) entre os pontos da curva e do coeficiente
de correlação linear (r2).
2.3.2. Seletividade
A seletividade do método foi verificada pela análise de possíveis interferentes
experimentais. Dessa forma, foram analisados todos os componentes da formulação a
partir de microcápsulas de alginato/quitosana, contendo ou não fármaco, incorporadas
em gel natrosol®.
2.3.3. Precisão e exatidão
As amostras para avaliação da precisão e exatidão foram preparadas da seguinte
forma: microcápsulas brancas (sem AR) foram impregnadas com quantidades
conhecidas de ácido retinóico. O fármaco foi recuperado através de extração com
hexano e tampão pH 7,4 com sonicação prévia das amostras. Amostras com
concentrações de ácido retinóico de 10, 20 e 30 µg/mL foram injetadas em triplicata
79
_______________________________________________________________Artigo II
(n=3). A exatidão (E %) foi calculada a partir dos erros relativos entre as concentrações
obtida e teórica. A precisão foi calculada a partir do coeficiente de variação (CV%).
2.4 Obtenção das microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico e
óleo de babaçu
As microcápsulas de alginato de sódio e quitosana foram obtidas através da
técnica de coacervação complexa em etapa única (WITTAYA-AREEKUL et al. 2006).
2.5. Estudo de liberação in vitro das microcápsulas
O estudo de liberação in vitro do ácido retinóico a partir das formulações foi
realizado em células de liberação do tipo FRANZ com área difusional de 1,15 cm2 e
volume de 6 mL, utilizando membranas sintéticas hidrofílicas (ME 25/21 ST, 0,45 µm ±
0,5 µm). O compartimento receptor foi preenchido com tampão fosfato pH 7,4 e etanol
(70:30) em um sistema composto de seis células individuais conectados a um banho
termostatizado à 37°C ± 0,5°C sob agitação constante de 100 rpm por um período de 48
hs. As membranas foram colocadas cuidadosamente entre o compartimento doador e o
receptor de forma que ficassem em contato com a solução receptora. Todas as
membranas foram previamente umedecidas (1 hora antes do experimento) com a
solução receptora. No compartimento doador uma amostra de microcápsulas (0,025%
de AR) incorporadas em gel natrosol® (0,4 g) foi colocada sobre a membrana artificial
de cada célula. Em períodos de tempos pré-determinados todo o líquido do
compartimento receptor foi coletado e imediatamente reposto. O ácido retinóico
liberado foi quantificado em CLAE-UV através do método analítico desenvolvido e
validado previamente.
80
_______________________________________________________________Artigo II
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Validação do método analítico para o ácido retinóico
O desenvolvimento do método analítico envolve a otimização de vários estágios
como a preparação da amostra, a separação cromatográfica e a quantificação.
Parâmetros como a fase móvel, o fluxo, a coluna cromatográfica e o comprimento de
onda de detecção devem ser pré-estabelecidos com critério. A validação do método
analítico é importante porque garante o sucesso da utilização da metodologia
desenvolvida além de detectar erros de procedimento analítico e oferecer evidências
comprovadas da eficiência do método (Causon, 1997).
No presente trabalho, o pico de absorção máxima do ácido retinóico dissolvido em
metanol ocorreu em 350 nm, valor similar àqueles relatados na literatura em 350-352
nm (Brisaert, Plaisier-Vercammen, 2000). Valores ligeiramente diferentes decorrentes
de dissolução, solvatação, pontes de hidrogênio, interação com o solvente e temperatura
podem ocorrer (Berbenni et al., 2001).
3.1.1. Linearidade
Os dados das curvas analíticas autênticas estão representados na Tabela I. A
linearidade da curva analítica na faixa de 0,5 a 60 µg/mL foi obtida a partir do ajuste de
regressão linear (r2= 0,999). Segundo a ANVISA (Brasil, 2003), o coeficiente de
correlação linear deve ser igual ou superior a 0,99. Sendo assim, o valor de r2 obtido na
análise do ácido retinóico pelo método CLAE-UV desenvolvido obedece aos limites
estabelecidos.
81
_______________________________________________________________Artigo II
TABELA I - Dados das curvas analíticas autênticas.
Ácido retinóico (µg/mL)
0,5
2
5
10
20
40
60
1
248116
285914
773357
1331295
2669056
5345501
7184232
2
242705
285003
782991
1327976
2644804
5334693
7857837
3
242479
286280
789302
1321824
2641697
5347198
7860449
Média
244433
285732
781883
1327031
2651852
5342464
7634173
DP
3191
658
8030
4806
14980
6783
389662
CV%
1,31
0,23
1,03
0,36
0,56
0,13
5,10
O cromatograma típico obtido a partir das condições de análise de quantificação
do ácido retinóico está representado na Figura 1. O tempo de retenção para o ácido
retinóico foi de 5,8 ± 0,4 minutos.
82
_______________________________________________________________Artigo II
FIGURA 1. Representação do cromatograma do ácido retinóico obtido por CLAE-UV
a 350 nm. As análises foram realizadas em cromatógrafo SPD 10 AVP com detector
UV-VIS, bomba LC-10 ADVP e programa LC-10 (Shimadzu, Kyoto, Japão). Coluna
C18 de fase reversa (Gemini®, Phenomenex) 150 x 4,6 mm (5µm) e fase móvel
constituída de metanol e ácido acético a 1% (85:15 v/v) com fluxo de 1,8 mL/minuto e
volume de injeção de 20 µL.
O tempo de retenção do ácido retinóico (5,8 min) encontrado no presente trabalho
com método CLAE-UV modo isocrático foi 2,15 minutos menor em relação ao menor
tempo citado na literatura de 7,95 minutos para um método CLAE-UV modo gradiente
83
_______________________________________________________________Artigo II
(Contreras et al., 2005). Este ganho na diminuição do tempo é bastante significativo
para estudo de cinética de liberação in vitro, onde uma quantidade considerável de
amostras deve ser analisada.
De fato, analisando trabalhos anteriores, o ácido retinóico foi quantificado por
CLAE-UV em nanopartículas de gliadin utilizando fase móvel constituída por metanol e
acetato de amônio10 mM (75:25 v/v) com fluxo de 1,8 ml/min em comprimento de
onda 350 nm. O tempo de retenção do ácido retinóico foi de 8,34 min (Ezpeleta et al.,
1996).
Brisaert e Plaizier-Vercammen (2000) avaliaram a degradação do ácido retinóico
em loção utilizando método CLAE-UV modo gradiente com fase móvel constituída de
metanol, água e ácido acético (75:12,5:1 v/v) variando para acetonitrila, água e ácido
acético (80:20:1 v/v) com a função de separar seus isômeros, sendo o fluxo modificado
de 1,8 para 1 mL/min. O comprimento de onda variou de 320 a 350 nm e o tempo de
retenção obtido para o ácido retinóico foi em torno de 15 minutos em 403 nm.
A estabilidade do ácido retinóico incorporado em lipossomas e sua cinética de
liberação in vitro foi avaliada por CLAE-UV em 350 nm com fase móvel constituída de
acetonitrila e ácido acético a 1% (80:20 v/v) e fluxo de 1 mL/min. O tempo de retenção
do ácido retinóico não foi especificado (Brisaert et al., 2001).
O método isocrático CLAE-UV utilizado por Trotta et al. (2003) teve como fase
móvel acetonitrila, metanol, ácido acético e água (45:40:1:14). O tempo de retenção foi
de 12,3 minutos.
Lim et al. (2004) avaliou a estabilidade do ácido retinóico em nanopartículas. O
método CLAE-UV utilizado teve como fase móvel acetonitrila, metanol e acetato de
amônio a 2,5% (50,6:24,4:25,6 v/v). O comprimento de onda utilizado foi 340 nm,
fluxo de 1 mL/min, e tempo de retenção para o ácido retinóico foi 17,5 minutos. A faixa
de linearidade obtida foi entre 0,1 e 5 µg/mL (r2 = 0,999).
A estabilidade do ácido retinóico foi avaliada em microemulsão através de CLAEUV com coluna C18 de fase reversa (Gemini®, Phenomenex) 250 x 4,6 mm (5µm). A
fase móvel foi composta de acetonitrila, metanol, água com 2,5% de acetato de amônio
(50,6:24,4:25,6 v/v), fluxo de 1 mL/min, volume de injeção 20 µg/mL. A linearidade foi
de 0,1-5 µg/mL (r2 = 0,999) e o tempo de retenção do ácido retinóico foi em torno de 18
minutos (Hwang et al., 2004).
Mais recentemente, Contreras et al. (2005) avaliaram a liberação in vitro do ácido
retinóico a partir de lipossomas incorporados em hidrogel (carbopol®) e de sua forma
84
_______________________________________________________________Artigo II
livre em células de Franz, além de ter avaliado sua permeação em pele abdominal de
rato. O método de quantificação por CLAE-UV utilizado foi em modo gradiente com
fase móvel composta de uma mistura de ácido acético glacial 1,8% pH=3,9 (A) e
metanol (B). O gradiente foi de 85% de B e 15% de A nos 3 primeiros minutos da
corrida, variando para 97% de B e 3% de A entre 3 e 8 minutos e retornando para 85%
de B e 15% de A entre 8 e 10 minutos. O fluxo foi de 1 mL/min e o comprimento de
onda utilizado foi 345 nm. O tempo de retenção para o ácido retinóico foi em torno de
7,95 minutos.
3.1.2. Precisão e exatidão
Os resultados referentes à avaliação da precisão e da exatidão inter e intra-ensaio,
realizada em dias diferentes por analistas diferentes, para o ácido retinóico estão
apresentados nas Tabelas II e III. A ANVISA (Brasil, 2003) recomenda que o CV% e o
E% não excedam 5%. Assim, os valores encontrados atendem aos limites estabelecidos.
TABELA II - Valores obtidos na avaliação da precisão e exatidão intra-ensaio.
Concentração teórica
Concentração obtida
Precisão
Exatidão
de AR (µg/mL)
de AR (µg/mL)
(CV%)
(E%)
10
9,96
0,20
99,64
20
20,10
1,12
100,49
30
29,79
1,52
99,30
TABELA III - Valores obtidos na avaliação da precisão e exatidão inter-ensaio.
Concentração teórica
Concentração obtida de
Precisão
Exatidão
de AR (µg/mL)
AR (µg/mL)
(CV%)
(E%)
10
9,74
3,59
97,43
20
19,66
3,44
98,30
30
28,79
2,59
95,96
85
_______________________________________________________________Artigo II
3.1.3. Seletividade
A seletividade do método é a capacidade de avaliar, de forma inequívoca, as
substâncias em exame na presença de componentes que possam interferir com a sua
determinação em uma amostra. A seletividade avalia o grau de interferência de espécies
como, por exemplo, outros ingredientes ativos, excipientes, impurezas e produtos de
degradação bem como outros compostos de propriedade similares que possam estar
presentes (Brasil, 2003).
Com relação à seletividade do método desenvolvido para análise do ácido
retinóico, não foram observados interferentes em nenhuma das amostras analisadas
(Figura 2), portanto, o método é seletivo para a quantificação do ácido retinóico a partir
das microcápsulas incorporadas em gel natrosol®.
FIGURA 2. Cromatogramas da análise das microcápsulas de alginato/quitosana
incorporadas em gel natrosol® sem fármaco (A) e das microcápsulas de
alginato/quitosana incorporadas em gel natrosol® com fármaco (B) com ácido retinóico
disperso em óleo de babaçu (B).
86
_______________________________________________________________Artigo II
3.2 Aplicação do método validado na avaliação da cinética de liberação in vitro do
ácido retinóico a partir de microcápsulas de alginato/quitosana incorporadas em
gel natrosol®
As microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico disperso em óleo
e babaçu foram preparadas com diferentes concentrações de quitosana (0,05% e 0,1%) e
os resultados da cinética de liberação in vitro estão apresentados na Figura 3.
Aproximadamente 75% do fármaco foi liberado a partir das microcápsulas com
quitosana a 0,05% e apenas 45% daquelas com quitosana a 0,1% em 48 h.
FIGURA 3. Perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir das microcápsulas de
alginato/quitosana contendo óleo de babaçu.
87
_______________________________________________________________Artigo II
4. CONCLUSÃO
O método CLAE-UV isocrático desenvolvido e validado no presente trabalho foi
simples, seletivo, exato, preciso, mais rápido e econômico do que os métodos propostos
na literatura para a quantificação do ácido retinóico. Além disso, o solvente utilizado na
fase móvel (metanol) é menos oneroso que a acetonitrila utilizada na maioria dos
trabalhos prévios. Este método foi de grande valia para o doseamento do ácido retinóico
a partir de microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu dispersas em
gel natrosol®, além de ser específico para a quantificação de amostras oriundas de
estudo de cinética de liberação in vitro sem a necessidade de técnicas adicionais de
extração e com tempo de análise inferior aos da literatura. Este método será importante
para o desenvolvimento e otimização de formulações de hidrogéis contendo
microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico e óleo de babaçu e para
promover a futura elucidação de seu mecanismo de permeação e retenção cutânea.
88
_______________________________________________________________Artigo II
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