OK Artigo Daniel Fernando e Jonnhy

CONTROLE E COMBATE DE MICROORGANISMOS INDESEJÁVEIS NO
PROCESSO DE FERMENTAÇÃO ETANÓLICA
Daniel Alves da Silva Junior1, Fernando Antonio Ferreira Damazo2, Johnny Cardoso Santos3
Ma. Elisete Peixoto de Lima4 , Msc. Maurício Ferreira de Macedo 5
1,2,3
4,5
Acadêmicos do Curso Pós-graduação em Tecnologia em Química Industrial do Centro
Universitário de Lins-Unilins, Lins-SP, Brasil
Docentes do Curso Pós-graduação Tecnologia em Química Industrial do Centro Universitário
de Lins - Unilins, Lins-SP, Brasil.
Resumo
Durante o processo de fermentação da
sacarose para a produção de etanol, o bem
estar da levedura Saccharomyces cerevisiae
deve ser mantido para resultar um processo
produtivo mais eficiente.
Para alcançar esse objetivo, deve-se
implantar
diferentes
técnicas
de
monitoramento operacional que visam
combater os microrganismos indesejáveis que
promovem o estress na levedura.
Neste trabalho, será apresentado dois
métodos práticos de controle de infecção
bacteriana, sendo um deles preventivo e outro
corretivo.
Esses controles de infecção bacteriana
no processo fermentativo, para produção de
etanol, foram aplicados na safra de 2010 em
uma usina de açúcar e álcool no interior do
estado de São Paulo.
O objetivo deste trabalho é avaliar se
os métodos propostos se mostram eficazes
tanto na forma preventiva como na corretiva,
demonstrando as técnicas e métodos que
podem ser utilizadas para reduzir a
proliferação bacteriana na fermentação
alcoólica, para índices aceitáveis aliados a um
severo
monitorando do andamento ou
situação da fermentação.
Assim, para se obter um processo
industrial mais eficiente, será necessário
avaliar o custo benefício de implantação das
metodologias que serão propostas.
Palavras chaves – fermentação etanólica,
infecção bacteriana, prevenção e controle.
Introdução
O ambiente que favorece a ação
competitiva das bactérias com as leveduras
utilizadas no processo fermentativo da
sacarose deriva da grande dificuldade
encontrada pelas usinas para operar com um
mosto esterilizado [1].
Esse fator contribui para que ocorra
frequentemente contaminação bacteriana,
geradora de transtornos operacionais e
econômicos para as usinas que precisam
lançar mão de programas preventivos e
curativos e eficazes.
A contaminação bacteriana também
se prolifera devido a condições operacionais
da própria usina como: sistema de moagem,
tratamento térmico (muitas vezes ineficiente),
pontos mortos ou estagnantes (no sistema
circulatório de levedo/mosto do processo),
recontaminação nos trocadores de calor a
placas, tubulações, caixa de caldo, água
utilizada na diluição do levedo, falha na
assepsia das dornas e interrupções irregulares
no processamento da matéria prima [2]. A
assepsia no processo fermentativo é
fundamental, para que haja uma redução nos
índices de infecção bacteriana, pois se trata de
um método preventivo que assegura uma
estabilidade aceitável no nos índices de
microrganismos indesejáveis no processo
fermentativo.
Atualmente compreende-se que alguns
sistemas de limpeza (preventivos) são de
valores demasiadamente elevados, o que gera
um custo inviável ao processo, encarecendo
de forma significativa a obtenção do produto
final. Dessa forma torna-se fundamental a
constante busca por alternativas, que sejam
eficientes e economicamente viáveis. Por isso
a utilização de uma substância de baixo custo
como a solução de hidróxido de sódio
(NaOH) vem sendo uma alternativa excelente
nesta situação[3].
A solução mais utilizada para esses
fins de assepsia é a hidróxido de sódio a 50%,
que ajuda retirar o restante de matéria
orgânica incrustada nas tubulações e placas
dos trocadores de calor. Essa técnica é
comumente realizada na assepsia devido seu
baixo custo financeiro e sua eficácia. “Para
assegurar uma fermentação alcoólica pura,
sem competição entre microrganismos, é
obrigatória a adição de anti-séptico aos
mostos que não receberam tratamento
térmico” [4].
Na fermentação pode-se realizar o
Teste de Sensibilidade para por em prova a
eficiência dos produtos usados para o
combate de bactérias, sendo possível prever o
estado da fermentação e como será sua
reação.
“Os mesmos remédios não servem
para todos os doentes”. Essa frase expressa o
quanto é indispensável o monitoramento, o
diagnóstico correto e a solução eficaz para
conter
um
determinado
agente
de
contaminação [5]. A fermentação alcoólica
em si é obrigatoriamente composta por vários
microrganismos vivos que merecem cuidados
especiais, e como existe uma variedade muito
grande de microrganismos indesejáveis que
podem causar infecção no mosto, é de
extrema importância a identificação desses
agentes para que se efetue com eficiência seu
controle.
A implantação de ação corretiva na
fermentação faz-se necessário no sentido de
que todos os pontos críticos de contaminação,
sejam monitorados com a necessidade de
implantar para cada um deles uma ação
diferente, porém, exclusiva e eficaz sendo
elaborada a base de análises de laboratório e
rotas de monitoramento. Essas etapas
corretivas do processo fermentativo são
realizadas para a diminuição dos gastos com
compras de antibióticos e para elevar a
eficiência na transformação da sacarose em
etanol. [6]
Metodologia
O foco deste artigo é a abordagem de
dois métodos comumente utilizados nos
processos de fermentação etanólica: um deles
baseia-se numa medida preventiva que
consiste em Controles de Assepsia e a outra é
a implantação de uma medida corretiva, que
se baseia num Teste de Sensibilidade para
melhor escolha dos antibióticos a serem
aplicados na produção de etanol.
O sistema de alimentação da
fermentação é composto por duas linhas de
tubos que por linguagem técnica são
denominados linha A e linha B. A
necessidade da existência de duas linhas de
tubulações
paralelas
independentes
é
exatamente, para que haja uma alternância na
utilização das mesmas, devido à necessidade
de se ter uma delas em operação e a outra
linha em assepsia, simultaneamente.
Para a realização da assepsia é preciso
o bloqueio da entrada do caldo na linha A, em
que se deseja realizar o método de assepsia
denominado
“Clean-In-Place"
(CIP).
Simultaneamente, deve-se desbloquear a
segunda linha (linha B) de alimentação, para
que não ocorra uma interrupção desnecessária
na alimentação de caldo nas dornas da
fermentação.
Após as trocas do sistema de linhas de
alimentação, faz-se necessário injetar água
clarificada no sistema de linha A, para que o
excedente de caldo desse sistema seja retirado
e despejado nas dornas da fermentação
(continuando a alimentação), até que não haja
mais resíduo de caldo tanto nas tubulações
quanto, nas placas dos trocadores de calor.
Depois de realizado o enxágüe com
água, efetua-se a realização da drenagem da
linha A, que será promovido pelas válvulas
instaladas na parte inferior dos trocadores de
calor. Essa água é extraída por gravidade,
ficando toda a tubulação e placas, dos
trocadores de calor vazios.
Com a linha adequada para realização
da assepsia inicia-se o processo com a
abertura de válvulas de entrada e retorno da
solução de Hidróxido de Sódio a 50%,
estando com a mesma em recirculação
constante pelo tempo estimado de 2 horas.
Após a circulação em circuito fechado
pelo tempo de 2 horas a solução de Hidróxido
de Sódio a 50%, é novamente reaproveitada
para o tanque de fibra de vidro utilizando-se
as válvulas automáticas de retorno. O enxágüe
com água clarificada é novamente realizado
para a retirada completa dessa solução,
evitando uma contaminação com o fermento.
Após o término do enxágüe a linha estará
pronta para entrar novamente em operação da
circulação do caldo e estará encerrado o
método preventivo de contaminações
bacterianas no processo de fermentação do
etanol.
Como método corretivo faz-se de
extrema importância a aplicação do Teste de
Sensibilidade, realizado pelo laboratório,
demonstrando o quanto esse instrumento
serve para monitorar e diagnosticar a situação
atual de contaminação, e quais são os
bactericidas mais indicados, para ser
utilizados em alta escala nas dornas de
fermentação.
Para o combate direto nas infecções é
necessário a utilização de antibióticos
específicos que reduzem a população de
bactérias na fermentação. A realização do
Teste de Sensibilidade, efetuado no
laboratório de microbiologia, visa identificar
qual o melhor antibiótico para o combate das
bactérias, portando essa medida torna-se um
método de correção. [6]
O procedimento em laboratório de
microbiologia, consiste em transferir para um
tubo de ensaio 15 mL de vinho fermentado, o
meio de cultivo, mais 0,15 mL de actidiona,
mais 0,45 mL de antibiótico e mais 0,15 mL
de vinho turbinado. Após a preparação
descrita acima, direciona-se a amostra para o
aparelho denominado espectrofotômetro e
realiza-se a leitura de absorbância (ABS)
inicial a 520 nanômetros (nm).
Coloca-se essa solução na estufa à 35
+/- 2 ºC por 6 horas.
Após 6 horas realiza-se a leitura de
ABS final a 520 nm.
Resultados e Discussões
O método CIP é uma medida de
prevenção da contaminação bacteriana na
fermentação, ou seja, sua função é fazer a
descontaminação dos equipamentos e
tubulações reduzindo e eliminando a presença
de bactérias e evitando sua proliferação.
Com a adição da solução aquosa de
NaOH a 50% é possível remover a matéria
orgânica, evitando e inibindo a proliferação
de microrganismos contaminantes. Após a
realização da limpeza por método CIP nas
paredes internas dos trocadores de calor a
placas, fica evidente que há uma drástica
redução na taxa de infecção bacteriana na
fermentação.
Os resultados apresentados na Tabela
1 demonstram que entre os meses de abril a
julho de 2010, os valores na taxa de infecção
bacteriana estavam em constante ascensão,
devido ao fato de ainda não ter sido
implantado o método da assepsia com NaOH.
Tabela-1 Razão de infecção de bactérias
por mL em relação aos meses de Abril a
Outubro da safra 2010.
Meses
Razão infecção bactéria/mL
Média
1º quinzena
2º quinzena
Abril
1,482x108
1,777x108
Maio
1,592x109
1,691x109
Junho
1,739x109
1,902x1010
Julho
1,992x1010
1,029x1011
Agosto
1,021x1010
1,355x107
Setembro
1,854x107
1,213x106
Outubro
1,003x106
1,957x105
Fonte: Próprios autores.
Após a realização da assepsia com a
solução de NaOH a 50% no processo de
distribuição de mosto, observou-se que houve
redução significativa dos microrganismos
contaminantes do processo fermentativo.
O emprego de assepsia por método
CIP, aliado a seleção correta do antibiótico
promoveu um declínio satisfatório no grau de
infecção bacteriana. A redução no índice de
infecção bacteriana no processo fermentativo
na safra de 2010, da usina em questão fica
bem evidente se comparados os valores de
infecção no mês de abril com o mês de
outubro (em especial os valores da segunda
quinzena de outubro), descritos na Tabela 1.
O método CIP é uma ferramenta muito
poderosa na prevenção da proliferação
bacteriana, porém não é o suficiente para
combatê-las, sendo necessário a utilização de
antibióticos.
Para a escolha do melhor antibiótico
se faz necessário à realização do Teste de
Sensibilidade das bactérias aos antibióticos
pré-selecionados. Esse método é um excelente
recurso no que diz respeito ao controle da
população bacteriana que tanto afeta a
produção de etanol. Tendo em vista a
necessidade de selecionar o melhor
antibiótico que se adequada ao tipo de
infecção bacteriana presente no processo
fermentativo, foram realizados os Testes de
Sensibilidade das bactérias em relação a seis
diferentes tipos de antibióticos. Os valores
relacionados à eficiência de cada antibiótico
estão expressos no Figura 1.
Conforme análise realizada em todos
os antibióticos, aquele que apresentou menor
variação entre a absorbância inicial e a final
foi o mais indicado para uso na fermentação.
Notou-se que os antibióticos Discovery
(Reibrand) líquido, Efective (Reibrand)
líquido, Betabio45 (Hopstener) líquido,
apresentaram
baixa
variação,
de
aproximadamente 0,1 absorbâncias (AU)
mostrando uma eficiência de 100% contra as
bactérias.
A Figura 2 demonstra a sensibilidade
alcançada pelos antibióticos testados,
exaltando quais são os indicados para a
aplicação na fermentação.
Figura 2 Índice de eficácia dos antibióticos.
Figura-1 Variação de eficiência de
antibióticos na fermentação.
Fonte: Próprios autores.
Fonte:Próprios autores.
Conforme já discutido anteriormente,
os antibióticos Isostab (LNF) líquido,
Discovery (Reibrand) em pó, Efective
(Reibrand) em pó apresentaram alta variação
de
absorbância,
demonstrando
baixa
eficiência em relação aos outros antibióticos
testados, com eficiências de 14% , 2% e 1%
respectivamente, ou seja, quanto menor a
variação entre a absorbância inicial e a final
mais eficiente será o combate bacteriano.
Baseados
nestes
testes,
dos
antibacterianos testados, os que apresentaram
maior eficiência e alto desempenho em
relação ao rendimento foram os antibióticos
Discovery (Reibrand) líquido, Efective
(Reibrand) líquido, Betabio45 (Hopstener)
líquido.
Conclusões
Para se ter uma fermentação livre de
bactérias é de extrema importância o controle
preventivo e pró-ativo, pois os mesmos
promovem a manutenção dos parâmetros
fermentativos dentro dos limites aceitáveis de
infecção não havendo assim nenhum tipo de
não conformidades.
Constatou-se que sem nenhum tipo de
prevenção pró-ativa, a proliferação bacteriana
tende a crescer, aumentando gradativamente
os índices de infecção acarretando a redução
da eficiência das leveduras utilizadas no
processo fermentativo da sacarose em etanol.
Por meio desse estudo, diagnosticouse que após a implantação do método CIP nas
placas internas dos trocadores de calor e
tubulações, com a adição de solução de
Hidróxido de Sódio a 50 %, para promover a
desinfecção através da remoção de matéria
orgânica nos pontos de infecção (pontos
mortos), houve alteração nos níveis de
manifestações bacterianas, inibindo de forma
significativa a recontaminação do processo
fermentativo na fase de alimentação.
Consequentemente esse é um fator
decisivo na obtenção de excelentes resultados
na aplicação diária de CIP no processo
fermentativo.
Os Testes de Sensibilidade das
bactérias aos antibióticos selecionados,
demonstraram ser uma excelente ferramenta,
que viabiliza a escolha correta do
antibacteriano, que melhor se ajusta ao tipo de
infecção predominante no processo de
fermentação etanólica.
Conclui-se
que
o
Teste
de
Sensibilidade, aliado a implantação do
método de assepsia adequado, promove a
redução nos índices de contaminação
bacteriana nos pontos de infecção do
processo, e são parceiros de suma
importância, no que diz respeito à eficácia no
controle preventivo e pró-ativo de infecção no
processo fermentativo da produção de etanol,
mostrando melhor rentabilidade em relação
do consumo de insumos químicos,
diminuindo gastos financeiros com correção
microbiológica e elevando o volume da
produção de etanol.
Referências Bibliográficas
[1] Stupiello, J.P., Horii, J. Considerações
sobre tratamentos de caldo de cana para
fermentação alcoólica. Álcool e Açúcar, Nº3,
p: 40-46, 1981.
[2] Pereira César, A.R. Programa de controle
operacional da fermentação alcoólica, p. 6871, 1997.
[3] Nolasco-Junior, J. Desenvolvimento de
processo térmico otimizado para mosto de
caldo de cana na fermentação alcoólica.
Dissertação de Mestrado, FEA-UNICAMP,
2005.
[4] Nolasco-Junior, J., Finguerut, J.
Esterilização de mosto-processo cip-sip, CTC,
RT-835-97/98, 1998b.
[5]
Phillips
Aureolus
Theophrsatus
Bombastus Von Hoheneim Salsburgo, Zahar,
p.130-131, 2002.
[6] ANVISA. Metodologia dos Testes de
Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por
Diluição para Bactéria de Crescimento
Aeróbico. Disponível em <http://www.anvisa
.gov.br/reblas> Acesso em:16 out 2010.