Isolamento de microrganismos com potencial uso para a

Isolamento de microrganismos com potencial uso para a produção de
lipases a partir de resíduos gordurosos domésticos(1).
João Victor Costa Guesser(2); Gisele Serpa(3)
Resumo Expandido
(1)
Trabalho executado com recursos do Edital 12/2013, da Pró-Reitoria de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação.
Estudante; Instituto Federal de Santa Catarina; Florianópolis; Santa Catarina; [email protected];
(3)
Professora; Instituto Federal de Santa Catarina; Florianópolis; Santa Catarina; [email protected].
(2)
RESUMO: O presente trabalho teve por objetivo o isolamento e a caracterização de microrganismos
produtores de lipases, obtidos a partir de amostras de caixa de gordura e de solo exposto a resíduo oleoso
vegetal de uso doméstico, a fim de selecionar as melhores cepas para serem utilizadas, obtendo-se uma
seleta coleção de microrganismos (bactérias, leveduras e fungos) com potencial uso biotecnológico. Os
diferentes organismos foram selecionados como produtores de lipase a partir do teste com Rodamina B, que
é um indicador da liberação de ácidos graxos por ação de lipases microbianas. Os organismos selecionados
através deste método foram testados quanto a sua potencial atividade lipolítica. Dentre os diversos
microrganismos selecionados pelo teste de Rodamina B, destacam-se quatro cepas de bactérias e quatro
cepas de fungos, que apresentaram elevada atividade lipolítica.
Palavra Chave: atividade lipolítica, Rodamina B, óleos e gorduras.
INTRODUÇÃO
A alta demanda de óleos e gorduras, que são
componentes lipídicos da alimentação humana,
estão resultando no aumento de efluentes ricos em
substâncias oleosas (PEIL et al, p. 1, 2012). Esses
efluentes podem causar a formação de filmes
oleosos na superfície da água que impedem a
difusão de oxigênio com o meio, acarretando assim
a mortandade da vida aquática, além de entupir
redes e dutos de tratamento de esgoto provocando
vazamentos e mau cheiro (MENDES et al, p. 298,
2005). O tratamento desses efluentes pode ser
realizado utilizando lipases, que são enzimas que
catalisam a hidrólise das ligações ésters-carboxilicas
de óleos e gorduras em ácidos graxos, acilgliceróis
e gliceróis .(SEMIONATO et al,p. 35, 2006;
FALCONE et al, p. 27 2009). A capacidade dessas
enzimas hidrolisarem óleos e gorduras gera um
grande interesse em sua utilização em tratamentos
de efluentes gordurosos. Sendo os microrganismos
as principais fontes de lipases comercializadas e
utilizadas em processos industriais, existe um
grande interesse no seu isolamento (PEIL et al, p. 1,
2012).
Lipases
também
são
importantes
4º Seminário de Pesquisa, Extensão e Inovação do IFSC
catalisadores na química orgânica, devido a sua alta
regiosseletividade
e/ou
enantiosseletividade,
ampliando, desta forma, sua aplicação industrial
(FALCONE et al, p. 27, 2009).
Dentro deste contexto, o presente trabalho
buscou isolar cepas de microrganismos (bactérias,
leveduras e fungos) produtores de lipases
extracelular de alta atividade lipolítica, obtendo uma
coleção com potencial uso biotecnológico.
METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada no laboratório de
Química Orgânica do Departamento Acadêmico de
Saúde e Serviços (DASS) do Instituto Federal de
Santa Catarina - Campus de Florianópolis.
Isolamento dos microrganismos
Amostras de caixa de gordura e de solo
submetido a resíduos de óleo vegetal doméstico
foram homogeneizados e inoculados em três
ISSN 2357-836X
diferentes meios líquidos: meio mínimo contendo
fungicida para o enriquecimento de bactérias, meio
YEPG para leveduras e ABD para fungos contendo
bactericida. Os meios foram acrescidos de óleo de
soja (5% v/v) emulsificados com Triton X-100 (20%
v/v) como fonte de carbono e permaneceram
durante 120 horas a temperatura de 30°C sob
rotação de 120 rpm. Após a fase de enriquecimento,
1 mL de amostra foi diluida em água deionizada
-2
-4
-6
estéril nas seguintes proporções : 10 , 10 e 10 .
De cada diluição retirou-se uma alíquota de 1 mL
que foi espalhada em placas de Petri com o meio
sólido respectivo para cada tipo de microrganismo
contendo óleo de soja emulsificado, permaneceram
por um período de 96 horas à 30°C em uma estufa
incubadora. As placas com a diluição, que permitiu
melhor visualização das colônias, foram utilizadas
para cada tipo de organismo. Cada colônia foi
repicada pela técnica de esgotamento por estria até
obter o isolamento de cada cepa.
Seleção de microrganismos lipolíticos
As cepas isoladas foram incubadas em meio
sólido contendo óleo de soja emulsificado com
Triton-X e uma solução (1% m/v) de Rodamina B
com concentração final de 1% v/v, por 72 horas à
30°C. Após o período de incubação, as cepas foram
submetidas à luz UV para identificar os organismos
produtores de lipase. A Rodamina B forma um
complexo fluorescente com ácidos graxos
detectável nesta faixa de luz. As cepas que
apresentaram resultado positivo para o teste, foram
isoladas em Agar inclinado contendo óleo de soja
emulsificado e Rodamina B e armazenadas a 4°C.
Efetuou-se a determinação da atividade
lipolítica por meio da titulação dos ácidos graxos
liberados com uma solução de KOH 50mM usando
fenolftaleína como indicador. Um branco contendo o
mesmo meio reacional que os ensaios e mantido
nas mesmas condições de reação, recebeu o
extrato enzimático após a adição da mistura
etanol/acetona e titulado para a determinação de
acidez inicial do meio reacional.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste trabalho foram isoladas 22 cepas de
bactérias, 7 cepas de leveduras e 15 cepas de
fungos a partir das amostras homogeneizadas de
escuma de caixa de gordura e de solo exposto a
resíduos de óleo vegetal usado. Após o isolamento
as cepas foram submetidas ao teste com Rodamina
B e classificadas como lipolíticas aquelas que
apresentaram um halo fluorescente quando
expostas a luz UV, como mostrado na Figura 1. Das
cepas isoladas, seis de bactérias e oito de fungos
apresentaram resultado positivo para o teste com
Rodamina B.
Determinação da atividade lipolítica
Foram adicionados cinco mililitros de água
deionizada estéril aos tubos contendo Agar
inclinado. Retirou-se um mililitro da suspensão
inoculando-os em frascos contendo 50 mL de meio
líquido e cinco mililitros de óleo emulsificado. Os
frascos permaneceram incubados por 120 horas à
30ºC. O extrato bruto enzimático foi obtido através
da centrifugação do meio de crescimento dos
microrganismos à 3000 rpm durante cinco minutos.
Adicionou-se um mililitro do extrato bruto
enzimático ao meio reacional composto por: uma
grama de óleo de soja, quatro mililitros de solução
tampão fosfato 50 mM (pH = 6). O meio
permaneceu por 60 minutos à 120 rpm na
temperatura de 30°C. Após a incubação, 15 mL de
acetona/etanol (1:1 volume) foram adicionados ao
meio reacional com intuito de parar a ação da lipase.
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Figura 1 – Halo fluorescente apresentado por
uma cepa bacteriana.
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As cepas selecionadas foram analisadas
quanto à atividade lipolítica. Com os resultados
desta análise, foram escolhidas quatro cepas de
bactérias e quatro cepas de fungos com alta
atividade lipolítica, que variou entre 24,8 e 75,4 µmol
de ácido-graxo produzido por mL de extrato
enzimático bruto.
CONCLUSÕES
A partir da amostra da escuma de caixa de
gordura e de solo submetido periodicamente a
despejo de óleo de cozinha já utilizado, foram
isoladas quatro cepas de bactéria e quatro de
fungos produtores de lipases extracelular, que
apresentaram halo fluorescente no crescimento no
meio contendo Rodamina B e alta atividade lipolítica.
Esses microrganismos selecionados apresentam
grande potencial como produtores de lipases para
aplicações industriais ou de bioremediação.
REFERÊNCIAS
FALCONE, C. O. Avaliação de lipase bacteriana
visando sua utilização na geração de biodiesel a
partir de resíduos oleosos do saneamento. [s.l]
Universidade Federal do Espírito Santo, 2009.
MENDES, A. A.; PEREIRA, E. B.; CASTRO, H. F.
DE. Aplicação de lipases no tratamento de águas
residuárias com elevados teores de lipídeos.
Química Nova, v. 28, p. 296-305, 2005.
PEIL, G. S.; KUSS, A. V. Microrganismos produtores
de lipases para biorremediação. Universidade
Federal de Pelotas, 2012.
SEMIONATO, S. Avaliação da atividade lipolítica de
bactérias isoladas dos dispositivos de remoção de
gordura da ETE-UFES. Dissertação de Mestrado;
Curso de Pós-graduação em Engenharia Ambiental;
Universidade Federal do Espírito Santo, 2006.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao CNPq ao apoio
fornecido para realização do trabalho.
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