associação do fármaco norfloxacina com quitosana

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ASSOCIAÇÃO DO FÁRMACO NORFLOXACINA COM QUITOSANA PURA E
SEUS DERIVADOS E SEU POTENCIAL ANTIMICROBIANO
Francisco José Lustosa Ferreira (Bolsista PIBIC/CNPq), Edson Cavalcanti da Silva Filho
(Orientador, Depto de Ciência dos Materiais - UFPI)
Introdução
A quitosana é um produto natural, atóxico, de baixo custo, renovável e biodegradável, de
grande importância econômica e ambiental. A sua estrutura cristalina altamente organizada torna este
polímero insolúvel em meio aquoso e na maioria dos solventes orgânicos, e com baixa reatividade
química. As principais modificações da quitosana envolvem a imobilização de agentes quelantes,
quaternização, carboxilação, acilação, sulfonação, amidação, formação de complexo polieletrolítico,
etc, e servem para melhorar algumas propriedades mecânicas da quitosana, tais como área
superficial, porosidade, resistência térmica, solubilidade e estabilidade em soluções ácidas,
(LARANJEIRA, FÁVERE, 2009).
Este trabalho tem como objetivo a modificação da quitosana com acetilacetona e
etilenodiamina, adsorção do fármaco norfloxacina nos derivados e avaliação da atividade
antimicrobiana.
Metodologia
A modificação da quitosana com acetilacetona foi realizada na ausência de solvente. Para tal
reação acontecer, foram utilizados 25,0 mL de acetilacetona em contato com 6,0 g de quitosana, sob
refluxo e agitação constante durante 4 h a 140 °C. Posteriormente, o sólido resultante foi separado
por filtração, submetido à lavagem com água e acetona com a finalidade de se extrair o excesso de
reagente, e em seguida seco em estufa a 100 °C. Este material recebeu a denominação de Qac. Em
um sistema idêntico foram colocadas 5,1 g de Qac em contato com 45,0 mL de etilenodiamina, sob
refluxo e agitação constante durante 4 h a 123 °C sendo esse polímero modificado denominado
Qacen. Após diversas lavagens com água destilada e em seguida com etilenodiamina, o material foi
seco a temperatura de 100 °C. Os materiais quitosana, Qac e Qacen foram caracterizados por
Análise Elementar e Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourrier (FTIR).
Aproximadamente 20,0 mg de cada material (quitosana pura, Qac e Qacen) foram colocados
-3
-1
em contato com 20 mL de soluções do fármaco norfloxacina com concentrações de 1 x 10 mol∙L , 5
-3
x 10
-1
mol∙L
e 1 x 10
-2
-1
mol∙L
mantendo-se em agitação a 130 rpm por 24 h a 37 °C e
posteriormente o sólido foi separado por centrifugação, lavado com água deionizada e posto para
secagem em estufa a 50 °C por 24 h. Os testes de adsorção foram realizados em triplicata.
A atividade antibacteriana da quitosana e dos derivados foi investigada antes e após o contato
dos materiais com soluções do fármaco. Foram utilizadas duas cepas bacterianas padrão
(Staphylococcus aureus SA ATCC 25.923 e Escherichia coli EC ATCC 25.922). O teste de contato
direto em meio sólido foi realizado de acordo com Zheng e Zhu (2003). Para realização destes
4
ensaios, preparou-se uma suspensão contendo aproximadamente 10 células/mL em solução salina
fisiológica. Em seguida pesou-se 0,002 g das amostras de quitosana e dos derivados (Qac e Qacen)
com norfloxacina incorporada em diferentes concentrações e adicionou-se 2 mL do inóculo. Foram
adicionados 0,1mL da mistura em placas de Petri contendo o meio Agar Nutriente. As placas foram
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semeadas com um auxílio de uma alça de Drigalsky pelo método spread plate e incubadas a 37 C
por 24h. Como controle positivo de crescimento, foram utilizadas placas de Agar Nutriente contendo a
suspensão bacteriana e solução salina. Todos os ensaios realizados com as soluções-testes e
soluções-controle foram realizados em triplicata. O efeito inibitório produzido por cada solução-teste
foi calculado de acordo com a seguinte equação:
𝜂=
𝑁1 − 𝑁2
𝑥100%
𝑁1
Onde 𝜂 é definido como o efeito inibitório, 𝑁1 é a média aritmética das unidades formadoras de
colônia das placas controle e 𝑁2 é a média aritmética das unidades formadoras de colônia de cada
uma das soluções testadas.
Resultados e Discussão
A Análise Elementar mostrou que a quantidade de nitrogênio na quitosana antes da
modificação era 5,49 mmol/g e, após reação com acetilacetona, o valor sofreu uma redução para 3,75
mmol/g ocasionando assim um aumento na razão C/N de 6,13 para 10,44, comprovando a eficácia da
reação. Observou-se que o material Qacen apresentou um aumento na razão C/N em comparação à
quitosana e uma diminuição quando comparado ao derivado Qac em virtude do aumento da
quantidade de nitrogênio. O aumento da razão C/N no derivado Qacen em relação à quitosana é
explicado levando-se em conta a incorporação da molécula de etilenodiamina que possui dois átomos
de nitrogênio comprovando assim a modificação.
Os espectros de FTIR dos materiais estão apresentados na Figura 1. Ao se comparar os
espectros da Qac e da Qacen com a quitosana pura pode-se observar que o espectro da Qac (Figura
1b) apresenta um aumento da intensidade da banda em aproximadamente 1609 cm
-1
atribuída ao
-1
grupo carbonila de cetona e uma banda em torno de 1650 cm devido à formação da ligação imina
(C=N) que aparece tanto no espectro da Qac quanto da Qacen, porém com uma maior intensidade
para o último material devido a maior quantidade de grupos formados, após a reação com
etilenodiamina.
Figura 4 – Espectros de absorção no infravermelho de (a) quitosana, (b) Qac e (c) Qacen.
C=O
Transmitância / u.a.
(b)
(c)
NH e OH
(a)
C=N
CH2 e CH3
NH e OH
4000
3500
3000
2500
2000
C-OC 1500
Numero de onda / cm
1000
500
-1
No estudo da atividade antibacteriana dos materiais, observou-se que para Escherichia coli
(EC) a quitosana não apresentou atividade antibacteriana enquanto os materiais Qac e Qacen
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mostraram valores 12,42 % e 52,27%, respectivamente. No entanto, a associação com o fármaco em
-2
-1
concentração 1x10 mol∙L resultou num aumento de atividade para 81,74%, 100% e 77,35%. Contra
Staphylococcus aureus (SA) tanto a quitosana quanto Qac proporcionaram atividades muito
próximas, 52,4% e 56,14%, respectivamente. Na figura 2 encontram-se os resultados de atividade
antibacteriana dos materiais contra SA.
Figura 2-Atividade antibacteriana da quitosana e Qac associada com norfloxacina em diferentes
concentrações contra Staphylococcus aureus.
100
100
Quitosana
90
Qac
80
70
Atividade (%)
Atividade (%)
80
60
50
60
40
40
30
20
20
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
Concentraçao (mol/L)
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
Concentraçao (mol/L)
Conclusão
As modificações químicas da quitosana com os ligantes acetilacetona e etilenodiamina na
ausência de solvente foram realizadas com sucesso. Isto pôde ser confirmado pelos resultados de
análise elementar onde foi observado o aumento da razão C/N dos derivados e por FTIR que permitiu
identificar o aparecimento de novas bandas que caracterizam a incorporação dos ligantes
empregados nas reações.
Todos os materiais sem o fármaco adsorvido, com exceção da quitosana contra Escherichia
coli, mostraram atividade antibacteriana frente às cepas testadas indicando que a modificação
melhorou esta característica da quitosana. A associação com norfloxacina melhorou a atividade
antibacteriana dos materiais frente às cepas testadas.
Apoio: CNPq, UFPI, LIMAV
Referências
LARANJEIRA, M. C. M.; FÁVERE, V. T. Quitosana: biopolímero funcional com potencial industrial
biomédico. Química Nova, v. 32, n. 3, p. 672-678, 2009.
Palavras-chave: Quitosana.Modificação.Adsorção