Sequenciamento de Proteínas

Sequenciamento de Proteínas
A sequencia de aminoácidos de uma proteína pode ser
determinada pelo sequenciamento de Edman, a partir da
determinação da ordem dos aminoácidos na cadeia peptídica,
ou inferida a partir da sequencia de DNA do gene.
Preparo da Proteína para o Sequenciamento
•
Determinar o número e tipos de subunidades presentes na
proteína
•
Clivar as pontes de enxofre (se houver)
•
Purificar cada uma das subunidades
•
Determinar a composição de aminoácidos de cada subunidade
•
Determinar o resíduo N-terminal
I. Redução das Pontes Dissulfeto
II. Composição de Aminoácidos da Proteína
II. Composição de Aminoácidos da Proteína
Seal
N2
Protein
6N HCl
e.g. AlaAspSer
110o
24 h
6N HCl
110°, 24h
Individual Amino Acids
Ala + Asp + Ser*
+
H3N
R1
CH
R2
O
C
NH
CH
_
COO
H+
H
+
R1
H3N
CH
O
C
+
R2
NH
CH
H
_
COO
O
C
: :
O
H
NH
H+
O
H
H
R1
H
H3N
CH
COO–
+
R2
H3N
CH
COO–
•
Completa destruição de Trp
•
Perda parcial de Ser, Thr e Tyr
•
Não destingue Glu de Gln e Asp de Asn
NH 2
O
C
+
H3N
O
CH 2
H
O
C
C
N
C
C
N
C
C
R1
H
O
R2
Asn
H+
(also hydrolysis of
peptide bonds)
Hidrólise Alcalina
B:
H
CH3
C
NH
C
CH 3
base
H B
CH 3
C
NH
O
H
+ :B
C
C
NH
O_
L-amino acid
C
O
D-amino acid
A hidrólise alcalina é realizada em NaOH a 100°C por 4-8h
•Decomposição de Cys, Ser e Thr
•Desaminação e racemização de outros aminoácidos
•Permite a quantificação de Trp
Determinação do Resíduo N-terminal (Sanger)
Análise do N-terminal (Edman)
C-terminal Análise por Carboxipeptidase
H O H H O H
H3N C C N C
CH3
C N
CH2OH
A
H O H
H O H
H O H
H O
C
C
C
C
C N
CH2
C N
CH(CH3)2 H
F
S
C N
CH2CH2SCH3
M
G
V
C O
Carboxypeptidase
H O H H O H
H3N C C N C
CH3
C N
CH2OH
H O H
H O H
H O
C
C
C
C N
CH2
C N
H O
CO
H3N C CO
+
CH(CH3)2 H
CH2CH2SCH3
M
Carboxypeptidase
H O H H O H
H O H
H O
H3N C C N C C N
C C N
C
CH2
CH(CH3)2
CH3
CH2OH
CO
H O
+
H3 N C CO
H
G
Sequenciamento da Cadeia Polipeptídica
•
Fragmentar a cadeia polipeptídica em locais específicos de modo a
gerar peptídeos pequenos o suficiente para serem sequenciados
diretamente
•
Purificar cada fragmento
•
Determinar a sequencia de aminoácidos de cada fragmento purificado
•
Repetir as etapas anteriores usando peptídeos obtidos a partir do uso
de outro método de clivagem
Princípio básico
Etapas
Bombardeamento das moléculas por
um feixe de elétrons de alta energia
Aceleração dos íons em um campo
elétrico ou magnético e separação
pela razão massa/carga
Detecção dos íons com determinada
razão massa/carga
Espectrometria de massa com ionização
por spray de elétrons (ESI) – ligada à
saída de um HPLC (CLAE)