Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Campus Campo Mourão
Disciplina de Microbiologia de Alimentos
Profa. Leila Larisa M. Marques
Técnicas de coloração de Gram
INTRODUÇÃO
A coloração é chamada de Gram devido ao Dr. Christian Gram, que descreveu pela
primeira vez esse processo de coloração em 1884, ao fazer uma referência à composição da
parede celular. As bactérias Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptidioglicano e
de ácido teicóico; enquanto as Gram-negativas possuem uma fina camada de peptidioglicano
sobre a qual se encontra uma camada de lipoproteínas, de fosfolipídeos, de proteínas e de
lipopolissacarídios.
A coloração de Gram envolve a aplicação de quatro reagentes: cristal violeta (CV) e lugol
(iodo metálico e iodeto de potássio) (I), que formam um complexo insolúvel (CV-I); álcool-acetona,
que funciona como solvente de lipídios e desidratante de proteínas, e fucsina ou safranina.
O tratamento com álcool-acetona extrai os lipídios, resultando no aumento da
permeabilidade da parede celular das bactérias Gram-negativas. Assim, o complexo cristal
violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado, e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede
celular das bactérias Gram-positivas, em virtude de sua composição, torna-se desidratada
durante o tratamento com álcool. Além disso, a permeabilidade é reduzida, e o complexo CV-I
não pode ser extraído. Finalmente, utiliza-se fucsina ou safranina que funciona como corante
básico de contraste (contracorante). O tratamento com fucsina ou safranina não altera a cor roxa
das Gram-positivas, ao passo que as Gram-negativas, descoradas pelo álcool, tornam-se
avermelhadas.
MÉTODO
- Fazer um esfregaço bem homogêneo, fixar pelo calor e esperar esfriar;
- Cobrir com cristal violeta, e deixar agir por 1 minuto;
- Lavar rapidamente com água;
- Cobrir com solução de lugol durante 2 minutos;
- Lavar em água corrente;
- Lavar a lâmina com álcool-acetona até que não se desprenda mais corante da preparação
(aproximadamente 15 segundos);
- Lavar rapidamente a lâmina com água;
- Corar com fucsina durante 30 segundos;
- Lavar a lâmina com água e, em seguida, deixar secar ao ar ou entre papel de filtro;
- Observar ao microscópio, focalizando com a objetiva de imersão (100x).
