Iniciadores conjugados com M13: uma alternativa para

56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Iniciadores conjugados com M13: uma alternativa para
genotipagem de feijão
Almeida, CB1; Pereira, TP1; Vale, NM1; Arruda, B1; Guidolin, AF1; Coimbra, JLM1
Laboratório de Análises Genéticas da UDESC, Instituto de Melhoramento e Genética Molecular (IMEGEM), Departamento de Agronomia,
Universidade do Estado de Santa Catarina
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Palavras-chave: Microssatélites, Triplex de iniciadores, Iniciador universal, Iniciador fluorescente, Phaseolus vulgaris L.
Com o aumento na disponibilidade de iniciadores para as diversas espécies e a rapidez proporcionada pelo uso
de sequenciadores automáticos, o estudo do genoma com marcadores microssatélites tem apresentado um
considerável incremento. Contudo, a automatização das análises requer a síntese de iniciadores fluorescentes,
o que resulta em um expressivo acréscimo nos custos e um limitante para pesquisas que envolvem um grande
número de marcadores. Uma alternativa é a utilização de um tríplex de iniciadores na reação de amplificação,
que consiste na síntese de um dos iniciadores específicos a região alvo do genoma com uma cauda adicional
na extremidade 5’. Esta cauda corresponde exatamente a sequência do iniciador universal, sendo este, o único
marcado com fluoróforo. Esta metodologia possibilita uma efetiva redução dos custos, pois apenas um iniciador
é marcado. Além do que, o iniciador universal pode ser utilizado em combinação com qualquer outro iniciador
que possua a sequência adicional, permitindo que um maior número de marcadores sejam analisados. Entretanto,
a verificação quanto a homologia entre a sequência do iniciador universal e o genoma da espécie em estudo é
de suma importância, devido a possível ocorrência de múltiplas bandas e falsos alelos, que induzem a erros de
genotipagem. Deste modo, objetivou-se verificar a viabilidade da conjugação da sequência M13 em iniciadores
microssatélites para Phaseolus vulgaris L. e sua utilização em seqüenciador automático. Foram utilizados onze
genótipos de feijão, sendo 6 cultivares (IPR Chopim, Diamante Negro, BRS Horizonte, SCS Guará, BRS Supremo e
BRS Valente) e 5 acessos do Banco Ativo de Germoplasma de Feijão da UDESC (BAF 07, BAF 09, BAF 35, BAF 50 e
BAF 97). Nove pares de iniciadores microssatélites dinucleotídeos foram usados na análise molecular, sendo que,
um iniciador de cada par foi sintetizado com 19 nucleotídeos adicionais (5’- CACGACGTTGTAAAACGAC - 3’),
referentes a sequência M13. As amostras de DNA foram extraídas de folhas jovens pelo método Doyle e Doyle
(1990), e submetida a PCR com os iniciadores caudados e o iniciador universal 6-FAM+M13. Os amplicons foram
avaliados no analisador genético ABI PRISM® 3130 (Applied Biosystems). Os iniciadores caudados apresentaram
amplificações satisfatórias e alta especificidade, sem ocorrência de múltiplas bandas. Logo, a conjugação manteve
a fidelidade dos iniciadores a região alvo. Para a maioria dos iniciadores houve variação no tamanho dos alelos
entre genótipos, indicando que os mesmos são polimórficos e informativos. Entretanto, os amplicons são definidos
com 19 nucleotídeos a mais, em virtude, da incorporação da sequência M13 nos fragmentos sintetizados a partir do
iniciador conjugado. Deste modo, há necessidade de subtração desse adicional no tamanho dos alelos. Conclusão:
O uso de iniciadores com a extensão M13 demonstrou ser eficiente e viável, sendo assim, o tríplex pode ser aplicado
para análise de microssatélites em genótipos de feijão.