padronização de rt-pcr, com iniciadores aleatórios, para

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PADRONIZAÇÃO DE RT-PCR, COM INICIADORES ALEATÓRIOS, PARA
IDENTIFICAÇÃO DE DENGUE VIRUS EM EPIDEMIAS NO PIAUÍ.
Deuzair Pereira Neves¹, Gustavo Portela Ferreira²
¹Bolsista do PIBIC/CNPq; ²Orientador -Docente do Curso de Biomedicina – UFPI.
Resumo
A atual reemergência da dengue tem chamado a atenção de diversos órgãos de saúde pública
no mundo. A doença tem um amplo espectro de manifestações clínicas, que vão desde um quadro
assintomático a uma forma grave com consequente óbito. No Brasil, a incidência de casos de dengue
tem variado substancialmente, sendo a região Nordeste uma das mais afetadas. A proposta tem como
objetivo realizar a padronização de RT-PCR, com iniciadores aleatórios, para identificação do Dengue
vírus (DENV) circulante em amostras com quadro clínico sugestivo no Estado do Piauí.
Palavras-chave: Padronização. RT-PCR. Dengue vírus.
Introdução
A dengue constitui um dos principais problemas de saúde pública, destacando-se como uma
das mais importantes arboviroses reemergentes no mundo. A infecção pelo Dengue vírus (DENV) gera
uma doença sistêmica e dinâmica. Tem um amplo espectro que inclui uma variação de quadro clínico
(WHO, 2009): pode causar infecção sintomática leve, doença febril indiferenciada chamada dengue
clássica (DF) ou uma doença mais grave, potencialmente fatal, conhecida como dengue hemorrágica
(FHD) ou síndrome do choque da dengue (FERREIRA, et. al., 2010).
O diagnóstico pode ser realizado através de métodos indiretos (detecção de antígenos,
métodos sorológicos) ou por métodos diretos (isolamento viral em cultura de células de mosquito,
detecção do genoma do vírus). Vários protocolos para a técnica de RT-PCR vêm sendo desenvolvidos
de modo a detectar e sorotipar o DENV com elevada especificidade e sensibilidade. Este método tem
como base a detecção do vírus na amostra por meio da conversão do genoma viral (RNA) em uma fita
de DNA complementar (cDNA) por meio da ação da Transcriptase Reversa (RT).
Metodologia
As amostras utilizadas consistem no soro de pacientes com suspeita clínica de Dengue e
controles positivos do vírus. Estas foram devidamente acondicionadas e transportadas. Os soros foram
imediatamente submetidos à extração do RNA viral utilizando QIAGEN® QIAamp Viral RNA Mini Kit
com procedimento conforme o protocolo do fabricante.
A princípio, as amostras foram analisadas pela técnica RT-PCR de acordo com o método
desenvolvido por Lanciotti et al. (1992), submetidas à ação da transcriptase reversa, com o uso do
iniciador D2 para conversão do RNA viral em cDNA (DNA complementar) e amplificação do cDNA pela
ação da enzima Taq DNA polimerase e dos iniciadores D1 e D2 dengue específicos, gerando um
produto de 511 pares de base (pb). Em casos de amostras positivas, fez-se uma sorotipagem por meio
de uma semi-nested PCR, sob as mesmas condições de amplificação da 1º PCR, utilizando o iniciador
D1 e substituindo o iniciador D2 pelos iniciadores reversos sorotipo específicos: TS1, TS2, TS3 e TS4.
Para DENV-1, DENV-2, DENV-3 DENV-4 as amostras amplificam regiões na junção C/prM
correspondentes a 453pb, 119pb, 28pb e 394pb, respectivamente.
Em seguida, por meio de modificações da reação de Lanciotti et al. (1992), foi padronizada a
utilização de iniciadores aleatórios (Random Hexamers) em RT-PCR. Estes consistem em sequências
randômicas curtas de desoxirribonucleotídeos que anelam em sítios aleatórios no DNA ou RNA alvo e
permitem a síntese de cDNA. A posterior amplificação do cDNA obtido pela reação com os Random
Hexamers foi realizada por meio da utilização do par de iniciadores mFU1 e CFD2, específicos para o
gênero Flavivirus (CHAO et al., 2007). Por meio deste protocolo, são consideradas positivas as
amostras que amplificarem em um produto de, aproximadamente, 270 pb.
Os produtos de ambas as reações são visualizados por meio de eletroforese em gel de agarose
1,5% cora
luz UV.
Resultados e discussão
Foi realizada a análise de amostras de controle positivo de DENV 3 utilizando-se o método de
Lanciotti et al. (1992), como descrito acima, e a RT-PCR com iniciadores aleatórios e amplificação do
cDNA por meio de iniciadores para o gênero Flavivirus. A reação pelo método de Lanciotti amplificou
em um produto de 511 pb, como o esperado. A reação com iniciadores aleatórios, bem como para o
gênero Flavivirus, amplificou em uma única banda como peso molecular de aproximadamente 270 pb.
Figura 1: Eletroforese em gel de agarose 1,5% dos produtos da PCR utilizando iniciadores D1 e D2 segundo o método de
Lanciotti (a). O produto amplificado contem aproximadamente 511 pb, demonstrando a presença do DENV. Produto da PCR
utilizando iniciadores para o gênero Flavivirus. (b) O cDNA utilizado foi obtido através de uma RT-PCR com iniciadores aleatórios.
O produto amplificado contem, aproximadamente, 270 pb. Lad: marcador de peso molecular de 100pb; Br: branco.
A transcrição reversa feita ao se utilizar os Random Hexamers mostra-se mais eficaz que a
reação de Lanciotti et al. (1992) uma vez que estes iniciadores amplificam boa parte do material
genético presente na amostra, mesmo quando em baixos títulos. O produto de 270 pb obtido com a
semi-nested PCR evidencia a vantagem do uso dos iniciadores voltados para a região codificante de
NS5 em Flavivirus, os quais permitem a amplificação dos 4 sorotipos do DENV, bem como de outras
espécies clinicamente importantes dentro do gênero.
Os resultados demonstram a eficiência da reação utilizando-se iniciadores aleatórios (Random
Hexamers) para a síntese de cDNA e posterior amplificação por meio de iniciadores para o gênero
Flavivirus. Tal método pode vir a se tornar uma alternativa na detecção do DENV, uma vez que tais
iniciadores amplificam de maneira bastante satisfatória o material genético presente nas amostras,
aumentando a sensibilidade da reação.
Conclusão
As técnicas de análise molecular para identificação do Dengue virus são métodos rápidos,
sensíveis e específicos. Sua implantação em Laboratórios de rotina auxiliaria uma detecção precoce
do vírus, diferenciando infecções causadas por DENV de outras com sintomatologia semelhante. A
padronização de novos métodos moleculares, mais sensíveis e específicos, contribui para o aumento
de sua eficiência. A otimização de tais protocolos fornece mais alternativas na identificação dos
sorotipos circulantes do DENV no estado do Piauí.
Ainda são necessários muitos estudos sobre a evolução da doença na região, além de
análises epidemiológicas complementares. O aperfeiçoamento do padrão das reações de RT-PCR e
sorotipagem utilizando-se iniciadores randômicos ainda deve ser avaliado, apesar de essas reações
terem se mostrado perfeitamente reprodutíveis.
Apoio

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq);

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Piauí (FAPEPI);

Laboratório Central Drº Costa Alvarenga (LACEN-PI).
Referências bibliográficas
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WHO. Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. New Edition. World Health
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