atividade_pratica_virus_Prions_transpososn_MVII - EAD

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ – UESC
COLEGIADO DE BIOLOGICAS – EaD
CURSO DE LICENCIATURA EM BIOLOGIA – EaD
Módulo VI – Eixo Biológico – Soluções adaptativas e filogenia – Vírus, elementos
transponíveis e prions (Profa. Acássia Benjamim Leal Pires)
Atividade Prática Presencial: Simulação de Diagnósticos de Vírus
1. Introdução
Nesta aula abordaremos como são feitos testes diagnósticos para identificar a presença
de vírus e demonstraremos em vídeo os equipamentos e outras técnicas utilizadas para
isso, além de diagnósticos possíveis para a presença de príons e de transposons.
Ao final da aula os estudantes terão fundamento para elaborar um texto descrevendo
as metodologias possíveis para esses diagnósticos e terão uma semana para enviar o
arquivo para o e-mail [email protected]
2. Atividade proposta 1: Extração de DNA total de mamão
Introdução: A extração de ácidos nucléicos (DNA e/ou RNA) geralmente é a primeira
de várias etapas para o estudo da biologia molecular de qualquer organismo. Nesta
aula, serão utilizados produtos de uso doméstico para a extração de DNA da cebola
(Allium cepa), para demonstrar que procedimentos para extração de ácidos nucléicos
são simples e podem ser executados mesmo em laboratórios sem infra-estrutura
específica para este fim.
Referência: Loreto, E. L. S. & Sepel, L. M. N. Atividades experimentais e didáticas de
Biologia Molecular e Celular. São Paulo, Editora da Sociedade Brasileira de Genética,
2002.
Objetivo: extrair DNA de mamão utilizando produtos de uso doméstico (detergente
para lavar louça, sal de cozinha e álcool) para identificar a presença de vírus nessas
amostras.
Material
• Um pedaço de mamão maduro
• Um garfo
• Sal de cozinha (NaCl)
• Detergente para lavar louça (líquido ou gel)
• Água quente (65°C a 80°C)
• Papel-filtro ou filtro de café
• Funil ou suporte para filtro de café
• Gelo
• Álcool 96°GL gelado
• Dois frascos de vidro (~200ml)
• Bastão ou pipeta de vidro
• Recipiente (plástico ou isopor) para o banho de gelo
Procedimento
1. Machuque o mamão com um garfo e coloque o material em um dos frascos.
2. Adicione 100 ml de uma solução feita com 80 ml de água quente, 20 ml de
detergente e uma colher de sopa de sal (NaCl). Misture bem a solução com a cebola
ralada. Aguardar aproximadamente 10 min.
3. Coloque o frasco com o mamão amassado em um banho de gelo (recipiente com um
pouco de água e gelo). À medida que a suapensão onde está o mamão amassado
esfriar, deverá ser possível observar que o líquido parece estar “talhando” (formando
grumos).
4. Quando a suspensão com a cebola ralada estiver fria, filtre-a e colete o líquido
filtrado em um frasco limpo.
5. Incline o frasco de vidro com o líquido filtrado (ângulo de 30° a 40°) e derrame
vagarosamente, pela parede lateral, o álcool gelado. Você verá que o álcool não se
mistura prontamente com a solução filtrada, havendo a formação de duas fases (na
superior fica o álcool). Entre as duas fases é possível observar a formação de um
precipitado com aspecto de “fiapos” esbranquiçados, que são os ácidos nucléicos.
6. Com a ajuda do bastão ou da pipeta de vidro, é possível enrolar os ácidos nucléicos
que estão precipitando, ou seja, você pode “pescar” o DNA do mamão.
7. Uma vez enrolados no bastão, os ácidos nucléicos devem secar por alguns minutos
ao ar para a evaporação do etanol; depois o material deve ser transferido da
extremidade do bastão para um tubo com 0,5 ml de água destilada. Assim, a amostra
estará reidratada rapidamente e o DNA em solução poderá posteriormente ser
analisado por eletroforese em gel de agarose.
3. Atividade Prática 2: Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Introdução
Em 1985, foi descrita a metodologia da reação em cadeia da polimerase (PCR,
de polymerase chain reaction). Seu idealizador, Kary Mullis, recebeu, por isso, o Prêmio
Nobel de Medicina e Fisiologia em 1993. A PCR permite a produção de grandes
quantidades de um determinado segmento de DNA in vitro a partir de uma pequena
quantidade de DNA-molde, evitando assim a necessidade de introdução (clonagem) do
DNA de interesse em bactérias.
Referências:
Kubista, M.; Andrade, J.M.; Bengtsson, M.; Forootan, A.; Jonak, J.; Lind, K.; Sindelka,
R.; Sjoback, R.; Sjogreen, B.; Strombom, L.; Stahlberg, A. & Zoric, N. The real-time
polymerase chain reaction.
Mol. Aspects. Med., 27(2-3): 95-125, 2006.
Mullis, K.; Faloona, F.; Scharf, S.; Saiki, R.; Horn, G. & Erlich, H. Specific enzymatic
amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp
Quant Biol., 51 Pt 1: 263-273, 1986.
Saiki, R.K.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K.B.; Horn, G.T.; Erlich, H.A. & Arnheim, N.
Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis
for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230(4732): 1350-1354, 1985.
Objetivo: amplificar um fragmento de DNA clonado no vetor pUC18.
Material:
• Iniciadores de cadeia direto (anela na extremidade 5’ do molde) (20 pmol/μl)
• Iniciadores de cadeia inverso (anela na extremidade 3' do molde) (20 pmol/μl)
• DNA-molde (DNA total de mamão extraído na prática 1)
• dNTPs (desoxirribonucleotídeos): dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (10mM)
• Tampão da Taq DNA-polimerase (10X)
• Taq DNA-polimerase (1 U/μl)
Os iniciadores (primers) direto e inverso são oligonucleotídeos complementares a
seqüências do vetor (conhecidas) que flanqueiam o sítio no qual está inserido o
fragmento clonado. A seqüência e a Tm de cada iniciador serão fornecidas pelo
professor.
A temperatura de anelamento dos iniciadores ao DNA-molde na PCR é definida com
base na Tm. Geralmente, ela deve ser de cerca de 20 a 25ºC abaixo da Tm dos
iniciadores.
Estimativa da Tm de iniciadores
A seguinte fórmula pode ser utilizada para estimar a temperatura média de fusão (Tm)
de um iniciador:
Tm (°C) = 4 x (G + C) + 2 x (A + T)
Procedimentos:
1. Pipetar as seguintes soluções em um tubo de centrífuga de 0,5 ml:
água bidestilada 38 μl
DNA molde (50 ng/μl) 1,0 μl
Iniciador 5' (20 pmol/μl) 1,0 μl
Iniciador 3' (20 pmol/μl) 1,0 μl
Tampão da Taq DNA-polimerase (10X)* 5,0 μl
dNTP's (10 mM) 2,0 μl
Taq DNA-polimerase (0,5 U/μl)** 2,0 μl
__________
Volume total 50,0 μl
* 100mM Tris-HCl (pH 9,0), 15mM MgCl2, 500mM KCl
** em 50mM Tris-HCl (pH7,5); 0,1mM EDTA; 5mM DTT, e 50% glicerol
Nota: Uma unidade enzimática da DNA-polimerase é definida como a quantidade de
enzima necessária para catalizar a incorporação de 10 nmol de dNTP durante 30 min à
74°C.
2. Colocar a reação em um termociclador com a seguinte programação de ciclos de
temperatura:
95°C - 2 min DESNATURAÇÃO
95°C - 45 s DESNATURAÇÃO ⏐
65°C - 45 s ANELAMENTO ⎬ 30 ciclos
72°C - 45 s EXTENSÃO ⏐
4° C - indefinidamente ARMAZENAMENTO
3. Transferir cerca de 40μl da fase inferior do tubo de reação (lembre que a camada
superior é o óleo mineral) para um outro tubo.
4. Preparar uma amostra de 10 μl do produto da reação para eletroforese em gel de
agarose, adicionando 2 ml de tampão de amostra 5X.
5. Submeter a amostra a eletroforese em gel de agarose 0,8%..
4. Atividade Prática 3: Vídeos demonstrativos com resultados possíveis e outras
técnicas diagnósticas
5. Atividade prática 5
Esta atividade será não presencial. Você deve elaborar um texto didático de no máximo
5 páginas e mínimo 3 explicando testes diagnósticos para vírus. Deve ser enviado para
o e-mail [email protected] em até 8 dias após essa aula prática.