APLICAÇÃO DE RT-PCR, COM INICIADORES ALEATÓRIOS, PARA

APLICAÇÃO DE RT-PCR, COM INICIADORES ALEATÓRIOS, PARA
IDENTIFICAÇÃO DE Dengue virus e Flavivirus EMERGENTES EM
AMOSTRAS CLÍNICAS
Deuzair Pereira Neves (bolsista do PIBIC/CNPq), Gustavo Portela Ferreira (Orientador,
UFPI)
INTRODUÇÃO: O gênero Flavivirus é composto por mais de setenta espécies de vírus patogênicos
para o seres humanos e animais (DAEP, et al. 2014). Dentre eles, destacam-se o vírus da Febre
Amarela (YFV), Dengue virus (DENV), vírus do Nilo Ocidental (WNV), vírus da Encefalite de Sant
Louis (SLEV), vírus da Encefalite Japonesa (JEV), entre outros, que são responsáveis por causar
arboviroses clinicamente importantes (CHAO et al, 2007; DAEP, et al. 2014). A Dengue destaca-se
como uma das mais importantes doenças reemergentes no mundo e constitui um dos principais
problemas de saúde pública mundial (WHO, 2009). O DENV é transmitido por mosquitos do gênero
Aedes e possui quatro diferentes sorotipos (DENV1-4) (HALSTEAD, 2007). Na região Nordeste, além
da presença do DENV, também foi registrado a circulação do WNV (SILVA et al., 2013) e a descrição
de febre do Nilo Ocidental, em humanos, no estado do Piauí (VIEIRA et al., 2015). A fim de realizar a
identificação do DENV e detectar a circulação de possíveis flavivírus emergentes no estado do Piauí,
em amostras de pacientes com quadro clínico sugestivo, foi empregada a técnica de RT-PCR. A
transcrição reversa (RT) foi feita a partir de iniciadores propostos por Lanciotti e colaboradores (1992)
e iniciadores aleatórios, seguida de PCR para amplificação dos genes da junção C/prM, NS5 e E.
METODOLOGIA: Foram utilizadas amostras de soro de pacientes com suspeita clínica de dengue. O
RNA viral é extraído utilizando o QIAamp® Viral RNA Mini Kit de acordo com as especificações do
fabricante. Na RT foram aplicados dois protocolos. De acordo com o método desenvolvido por
Lanciotti e colaboradores (1992), o RNA viral foi convertido em cDNA sob a ação da enzima de RT,
com o uso do iniciador D2 para sua conversão. O outro protocolo utiliza iniciadores aleatórios, que
correspondem a oligodesoxirribonucleotídeos de sequências curtas e aleatórias que anelam em
qualquer região do RNA e permitem a síntese de cDNA a partir RNA viral extraído. Após RT-PCR
segundo o método desenvolvido por Lanciotti e colaboradores (1992), foi realizada a reação de PCR
com os iniciadores D1 e D2, para amplificação dos genes da junção C/prM nos quatro sorotipos. Para
identificar os sorotipos virais foi realizada uma Semi-Nested-PCR. Nessa reação, o iniciador D2 é
substituído por 4 iniciadores sorotipo-específicos (TS1, TS2, TS3, TS4). O cDNA obtido a partir da RT
com os iniciadores aleatórios, para amplificação do gene NS5, foi submetido a uma PCR com a
utilização dos iniciadores mFU1 e CFD2, específicos para o gênero Flavivirus (CHAO et al., 2007) e
uma outra PCR para amplificação do gene E, para detecção do DENV. A visualização dos produtos
da PCR é realizada através da eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com GelRed®, para
visualização sob luz UV. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Controles positivos dos quatro sorotipos do
DENV foram analisados através de duas Transcrições Reversas (RT-PCR): uma segundo a
metodologia de Lanciotti et al. (1992), utilizando o iniciador D2, e outra, com iniciadores aleatórios. A
seguir, foi feita uma PCR segundo o método de Lanciotti e colaboradores, 1992, com a utilização dos
iniciadores D1 e D2. Os quatro sorotipos, em ambas as reações, amplificaram em um produto de
tamanho molecular de 511 pares de base (pb). O cDNA obtido na transcrição reversa por iniciadores
aleatórios foi submetido a outra PCR, com iniciadores que utilizam a região codificante da proteína
NS5 de flavivírus (CHAO et al, 2007). A reação amplificou um produto de aproximadamente 270 pb
para os quatro sorotipos. A eficiência da Transcrição Reversa com iniciadores aleatórios é
demonstrada em ambas as reações. A amplificação dos genes C/prM e NS5 nas reações de PCR
posteriores corrobora o fato de que tais iniciadores são eficazes na conversão do material genético
viral em cDNA (QUAN, et al. 2010; SIP et al., 2010), uma vez que houve a amplificação de duas
regiões genômicas distintas a partir do produto de uma mesma RT-PCR. Posteriormente, duas
amostras de pacientes (amostra 19 e amostra 279) com sorologia positiva para anticorpos IgM
antidengue e antígeno NS1 foram submetidas a uma RT-PCR com iniciadores aleatórios. Em
seguida, foram aplicados os protocolos de amplificação do gene C/prM, do gene NS5 e do gene E
(LANCIOTTI, et al. 1992; CHAO, et al. 2007; VALE, 2015). As amostras não apresentaram produtos
de amplificação na reação descrita por Lanciotti e colaboradores (1992). Apenas o controle positivo
foi visualizado. Nas demais reações, as duas amostras amplificaram em um produto de
aproximadamente 270 pb (NS5) e 1012 pb (gene E), caracterizando infecção por flavivírus,
especificamente o DENV, sorotipo 3. A circulação simultânea dos 4 sorotipos do DENV no estado
facilita o surgimento de variações genotípicas intrassorotipo (RICO-HESSE, 2007) que podem
influenciar na gravidade da doença (OHAINLE, et al. 2011) e no estabelecimento de novos surtos
epidêmicos. A utilização do gene E para o desenvolvimento de técnicas moleculares torna-se uma
alternativa viável na detecção de variantes genotípicas virais devido a sua alta taxa de mutação
(DETTOGNI, et al. 2011). O uso desta região permite o desenvolvimento de estudos que melhor
caracterizem as variantes no estado (VALE, 2015). A região NS5 é altamente conservada entre os
flavivírus (CHAO et al. 2007; EVANGELISTA et al., 2013). Diante disso, o protocolo para amplificação
que utiliza como alvo esta região tornou-se uma importante ferramenta na detecção do DENV e de
outras espécies emergentes no estado do Piauí. Apesar de o WNV circular, com descrição inicial, na
região do pantanal brasileiro (OMETTO et al., 2013; PAUVOLID-CORRÊA et al., 2014), evidências de
sua expansão para a região nordeste foram descritas por Silva et al. (2013), através de uma amostra
de equino com sorologia positiva para o vírus, no estado da Paraíba. Em 2014, no estado do Piauí, foi
diagnosticado o primeiro caso de infecção por WNV em humanos. Um paciente de 52 anos
apresentou quadro clínico de encefalite aguda e paralisia flácida, o qual evoluiu para severidade, com
paralisia facial, tetraparesia e ausência de reflexo miotático. (VIEIRA et al, 2015). A inserção de novas
espécies virais e reemergência de outras caracterizam um problema de saúde pública não só no
estado, mas no Brasil (MACHADO et al., 2014). O desenvolvimento de novos métodos diagnósticos,
bem como a detecção e caracterização molecular destas espécies é fundamental para direcionar as
medidas de tratamento, prevenção e controle adequadas. CONCLUSÃO: A circulação de flavivírus
como o DENV, WNV e SLEV no país (PAUVOLID-CORRÊA, 2014; SILVA et al., 2013; SIMONE et
al., 2004; TEMPORÃO et al., 2011; VIEIRA, et al. 2015) vêm preocupando as autoridades em saúde
pública no Brasil (MACHADO et al., 2014). As técnicas de análise molecular para identificação destes
vírus são métodos rápidos, sensíveis e específicos. A otimização de protocolos moleculares fornece
mais alternativas na identificação dos sorotipos circulantes do DENV e demais flavivírus no estado do
Piauí contribuindo para implantação de medidas preventivas junto a vigilância epidemiológica. Apesar
das reações de RT-PCR com os iniciadores aleatórios terem mostrado uma boa reprodutibilidade,
análises epidemiológicas complementares são fundamentais para o monitoramento das arboviroses
no estado.
PALAVRAS CHAVE: Flavivírus. Dengue. RT-PCR.
APOIO: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Universidade
Federal do Piauí (UFPI).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CHAO, DY; DAVIS, BS; CHANG, GJ. Development of multiplex real-time reverse transcriptase PCR
assays for detecting eight medically important flaviviruses in mosquitoes. J Clinical Microb. 2007.
CLETON, N. et al. Come fly with me: review of clinically important arboviruses for global travelers. J
Clin Virol. 2012.
DAEP, Carlo Amorin; MUÑOZ-JORDÁN, Jorge L.; EUGENIN, Eliseo Alberto. Flaviviruses, an
expanding threat in public health: focus on dengue, West Nile, and Japanese encephalitis virus.
Journal Of Neurovirology. p. 539-560. 2014.
HALSTEAD, S. B. Dengue. Lancet. 2007.
LANCIOTTI, R.S. et al. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using
reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Clin Microbiol. 1992.
PAUVOLID-CORRÊA, Alex et al. Serological Evidence of Widespread Circulation of West Nile Virus
and Other Flaviviruses in Equines of the Pantanal, Brazil. Plos Neglected Tropical Diseases. 2014.
SANTOS, Laís Sousa. Vigilância Epidemiológica e Análise Molecular do Dengue virus no Piauí:
busca dos sorotipos circulantes. 2012. Dissertação (Mestrado), Universidade Federal do Piauí,
Parnaíba, 2012.
VALE, Vanessa de Sousa do. Análise Molecular eFilogenética Do Dengue virus no Nordeste
Brasileiro. 2015. Dissertação (Mestrado), Universidade Federal do Piauí, Parnaíba, 2015.
VIEIRA, M.A., et al. West Nile Virus Encephalitis: The First Human Case Recorded in Brazil. Am J
Trop Med Hyg. 2015.
WHO. Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. New Edition. World
Health Organization, Geneva, 2009.