A via proteolítica dependente de ubiquitina/proteassoma

Seminário Orientado nº 5-Aspectos bioquímicos do proteassoma (guião
tem que ser sujeito a alterações e reduzido!!)
1. Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma
Toda a gente sabe que as proteínas que já não são úteis para o organismo não permanecem
nele para sempre. Mas como é que elas são eliminadas?
Pois bem, foi precisamente em 2004 que se atribuiu o prémio Nobel da Química a 3
investigadores que desvendaram como ocorre o processo de degradação celular de proteínas
mediado por ubiquitina. Mas o que será isto da ubiquitina? E como é que ela actua?
Ora a ubiquitina não actua sozinha, mas sim num sistema complexo denominado sistema
ubiquitina-proteassoma. Porém, antes de iniciarmos a descrição deste sistema propriamente,
é fundamental que nos familiarizemos com alguns conceitos que iremos encontrar ao longo do
presente trabalho.
O que é o Proteassoma?
Os proteassomas são complexos proteicos de grandes dimensões, presentes em todos os
eucariotas e em alguns procariotas sob a forma de estruturas homólogas, dispersos no
citoplasma da célula e no núcleo, mas mais concentrados no centrossoma. Constituem quase
1% das proteínas da célula eucariótica, tendo uma concentração comparativamente superior
às outras proteínas celulares. A sua função é degradar proteínas marcadas quimicamente pela
ubiquitina, como iremos ver mais à frente.
E a ubiquitina?
A ubiquitina é uma proteína de pequenas dimensões comum a todas as células eucarióticas
constituída por 76 aminoácidos, dispersa no citoplasma ou ligada a outras proteínas celulares e
que foi bastante conservada entre os organismos eucariontes. Esta proteína vai funcionar
como marcador das proteínas a degradar.
Motivo de Existência:
Cada célula tem as suas necessidades metabólicas e necessidade de homeostasia, que é
satisfeita à custa da degradação e síntese de proteínas. O equilíbrio entre a síntese e a
degradação enzimática é o turnover, que é essencial no house keeping da célula,
especialmente abundante em tecidos que estão em modificação estrutural ou situações de
stress (e.g. cirurgia, trauma, queimaduras, infecções). Os proteassomas têm a função de
manter as proteínas certas, no local certo, à altura certa, através da degradação de proteínas.
As proteínas que são alvo de degradação são usualmente: proteínas que deixaram de ser
funcionais (por misfolding ou erros na tradução do RNA), proteínas danificadas (por oxidação
por exemplo) e proteínas semi-vida curta (importantes na actividade metabólica).
Deste processo resultam aminoácidos, alguns dos quais necessários para o organismo e não
sintetizados por ele – aminoácidos essenciais. Estes são usados em síntese proteica ou em
bases nucleotídicas (visto terem azoto na sua constituição).
Função da Ubiquitina:


Marcar as proteínas que precisam de ser degradadas.
Diminuir a taxa de dissociação entre proteassomas e proteínas-substrato que
interagem. Ou seja, sem a Ub, as proteínas poderiam interagir com o proteassoma,
mas rapidamente se dissociariam. A Ub atrasa esta dissociação, aumentando assim a
probabilidade de o proteassoma a degradar.
Como é que a célula distingue que proteínas devem ser sujeitas a degradação?
A ubiquitina liga-se covalentemente a proteínas que têm sequências de aminoácidos
específicas - cyclin destruction boxes (Arg–Thr–Ala–Leu–Gly–Asp–Ile–Gly–Asn) ou PEST
sequences (contêm prolina, ácido glutâmico, serina e thereonine) através da hidrólise de ATP.
Estas sequências de aminoácidos encontram-se frequentemente em proteínas que vão ser
removidas pelo sistema ubiquitina-proteassoma. A ubiquitinação, ou seja, a ligação da
ubiquitina, também depende do terminal N das proteínas (que está relacionado com a meiavida das proteínas), que pode ou não favorecer esse processo.
Ubiquitinação:
O aminoácido glicina presente na ubiquitina tem um grupo carboxilo que se liga aos
grupos ε –amino dos resíduos de lisina das proteínas a degradar, formando ligações
isopeptídicas.
Isto requer a actuação de três enzimas:
E1 – enzima activadora da ubiquitina (funciona como
primer).
E2 – enzima conjugadora da ubiquitina.
E3 – ubiquitina ligase (lê o resíduo N-terminal da
proteína – funciona como reader).
Primeiro, a Ub é activada pela E1 num modo
dependente de ATP.
A Ub activada liga-se à E2 e a E1 liberta-se.
A E3 catalisa a ligação do grupo carboxilo da Ub com
a proteína alvo, libertando-se a E2. A E3 detecta os
resíduos N-terminais. A partir deste ponto, a
proteína ubiquitinada é lançada para o proteassoma
para sofrer degradação. O processo repete-se –
poliubiquitinação.
Então e depois que aconece às proteínas ubiquitinadas?
Actuação do Proteassoma:
Proteassoma – função: destruir as proteínas ligadas à ubiquitina
O proteassoma 26S (o mais comum de todos) é constituído por duas unidades:
- unidade reguladora (19S) – assegura que só as cadeias poliubiquitinadas (com 4 ou mais
moléculas de Ub) são degradadas através das ATPases, que:


actuam como unfoldases à semelhança da DNA helicase (para que a proteína possa ser
passado para o centro do proteassoma)
induzem mudanças de conformação da unidade catalítica, de modo que a proteína
marcada possa ligar-se à mesma
- unidade catalítica (20S) – é a estrutura central. Nesta unidade o substrato (proteína marcada)
é degradado até que a proteína inicial seja reduzida a produtos peptídicos (de 7-9
aminoácidos) que posteriormente são reduzidos a aminoácidos por outras proteases celulares.
A ubiquitina é depois reciclada pelas enzimas de desubiquitinação.
2. Explicar a importância bioquímica deste sistema
Nas células eucarióticas, a principal via de degradação de proteínas não ocorre nos lisossomas
– ela é dependente de ATP e de ubiquitina, tratando-se, pois, do sistema ubiquitinaproteassoma, que foi já explicado no tópico anterior.
Numerosos processos celulares regulados por este sistema incluem, por exemplo, o ciclo
celular, reparação de DNA, etc, como se pode ver na seguinte figura:
Funções da via proteolítica dependente de ubiquitina:
Poderíamos falar de inúmeras funções do sistema ubiquitina-proteassoma, esclarecendo desta
forma a importância bioquímica deste sistema. No entanto, iremos centralizar a nossa atenção
em três exemplos bastante significativos: controlo do ciclo celular, regulação da transcrição
(síntese de mRNA) e reparação do DNA. Após uma explicação algo detalhada de cada um
deles, irá ser feita uma breve abordagem a outras funções desempenhadas pelo sistema
ubiquitina-proteassoma.
Controlo do ciclo celular
A via proteolítica dependente de ubiquitina/proteassoma desempenha um papel muito
importante pelo menos em três períodos do ciclo de divisão celular.

Na transição G1/S, a iniciação da replicação do DNA é desencadeada pela degradação
de um inibidor de uma cinase dependente de ciclina. Quando este inibidor sofre
fosforilação, uma E3 reconhece-o como substrato ocorrendo ubiquitilação e
subsequente degradação.

Durante a mitose, na anafase, a securina, um inibidor da separina (uma endoprotease
envolvida na separação dos cromatídeos), sofre ubiquitilação sendo depois degradada
pelo proteassoma.

Na fase final da mitose (telofase) as ciclinas características desta fase, bem como
factores que controlam a desmontagem do fuso mitótico sofrem degradação pela via
proteolítica dependente de ubiquitina/proteassoma.
É de notar que a falta de controlo do ciclo de divisão celular está implicada no
desenvolvimento de tumores.
Regulação da transcrição
A síntese do RNA mensageiro nos eucariotas é catalisada pela enzima RNA polimerase II e
depende de muitos factores de transcrição que controlam a sua actividade. Uma forma de
regular o nível de certos factores de transcrição é através da sua ubiquitilação e subsequente
degradação pelo proteassoma. A proteína p50, uma subunidade do NF-kB, um factor de
transcrição que medeia a resposta inflamatória, tem como precursor o polipéptido p105, um
substrato pouco usual do proteassoma. O domínio do terminal C do p105 é completamente
degradado pelo proteassoma, enquanto que o domínio no terminal N contendo o p50 fica
intacto. Neste caso, o proteassoma funciona como protease de processamento, não levando à
degradação do substrato em pequenos péptidos.
Reparação do DNA
A enzima Ubc2 (uma das treze E2 de levedura) foi a primeira enzima da via dependente de
ubiquitina a ser relacionada com uma função fisiológica, devido à sua identidade com a
proteína Rad6 – componente essencial na reparação do DNA: participa na mono-ubiquitilação
de uma subunidade da DNA polimerase (PCNA) envolvida na síntese e reparação do DNA.
3.Indicar exemplos de desregulação deste sistema e algumas patologias
associadas.
1º Diapositivo:
O terceiro objectivo do nosso trabalho consiste em indicar exemplos de
desregulações que podem ocorrer no sistema ubiquitina-proteassoma, e abordar
algumas patologias associadas a esse incorrecto funcionamento do sistema.
A desregulação do sistema ubiquitina-proteassoma pode levar a consequências
no organismo conduzindo, nomeadamente, a patologias essencialmente
neurodegenerativas (problemas nos sistemas nervosos central e periférico) e
neoplásicas (cancros – benignos e malignos).
2º Diapositivo:
Algumas das patologias associadas à desregulação do sistema ubiquitinaproteassoma são:
 Alzheimer
 Parkinson
 Vírus do Papiloma Humano (HPV)
 Huntington
 Esclerose amiotrófica lateral (ALS)
 Cancro Colorrectal
 Cancro Cervical
De todas estas patologias, decidimos abordar em maior profundidade a doença
de Alzheimer, Parkinson e o Vírus do Papiloma Humano (HPV) pois considerámo-las as
mais interessantes e, como são das mais prevalentes na população, na nossa vida
futura certamente teremos de contactar com elas sendo então importante saber como
podem ser desencadeadas.
3º Diapositivo:
Alzheimer:
É uma doença crónica neurodegenerativa que afecta o SNC (Sistema Nervoso
Central), ou seja, o cérebro.
Alguns dos seus sintomas são a perda de memória e das capacidades
cognitivas, e afecta essencialmente pessoas idosas.
É causada pela degeneração progressiva das células do tecido nervoso. Esta
ocorre porque, devido ao mau funcionamento do sistema ubiquitina-proteassoma ou
devido à alteração estrutural de proteínas (que impede a sua destruição), se verifica
uma acumulação progressiva de proteína Tau hiperfosforilada que, em conjunto com a
proteína β-amilóide, promove a morte dos neurónios.
4º Diapositivo:
Parkinson:
Tal como Alzheimer, é uma doença neurodegenerativa.
Provoca rigidez, tremuras e dificuldades na locomoção.
Pode ser causada por:
 Apenas uma anomalia no sistema ubiquitina-proteassoma, não ocorrendo a
degradação de proteínas não desejadas que, acumulando-se no interior das
células, formam os Corpos de Lewy (agregação e acumulação anormal de uma
proteína);
 No entanto, existem duas “proteínas-chave”, a proteína Parkina e a proteína
UCH-L1, sendo que uma mutação em qualquer uma destas pode desencadear
um mau funcionamento no sistema ubiquitina-proteassoma, levando às
mesmas consequências que acabei de descrever.
5º Diapositivo:
Vírus do Papiloma Humano (HPV):
O HPV consiste num vírus que afecta a pele e mucosas provocando-lhes lesões.
1º - O vírus manipula o sistema ubiquitina-proteassoma pois produz uma
proteína (E6-AP) que activa uma E3 específica.
2º - A E3 activada conduz à ubiquitinação, e posterior degradação por parte do
proteassoma, de proteínas supressoras de tumores e reparadoras de DNA (como a
proteína p53).
3º - Sem estas proteínas, a reparação e apoptose celulares não podem ocorrer.
4º - Assim, é favorecido o aparecimento e a proliferação de tumores.
INFORMAÇÃO EXTRA
(ÚTIL PARA AS PERGUNTAS MAS AINDA
ESTÁ DESORGANIZADA)
1º tópico
1. Porque se diz que a ubiquitina foi conservada entre os eucariontes?
Entre os eucariontes, a ubiquitina é fortemente conservada, o que significa que a sequência de
aminoácidos não difere muito se compararmos organismos muito diferentes. Por exemplo,
existem apenas três diferenças na sequência se compararmos a ubiquitina da levedura com a
do ser humano. Esta forte conservação da sequência sugere que a grande maioria dos
aminoácidos que constituem a Ub são essenciais, uma vez que, aparentemente, qualquer
mutação que tenha ocorrido ao longo da história evolutiva foi removida por selecção natural.
2. O que é o protein misfolding?
Na formação das proteínas há três fases: transcrição, tradução e folding. O folding é a
construção de uma cadeia tridimensional. Um erro na formação desta estrutura é um
misfolding.
(A ubiquitina é uma proteína tolerante ao calor que se dobra numa estrutura globular
compacta. É encontrada ao longo da célula e pode existir tanto na sua forma livre como
fazendo parte de um complexo juntamente com outras proteínas. Neste último caso, a Ub é
conjugada a proteínas através de uma ligação covalente entre a glicerina presente no limite
final C da Ub e as cadeias laterais da lisina nas proteínas. Moléculas de Ub isoladas pode ser
conjugadas com a lisina destas proteínas, ou, mais comummente, cadeias de Ub podem ser
interligadas. A conjugação é um processo que depende da hidrólise de ATP. )
ATPase: o que é?
Apesar da ubiquitina ser usada para marcar proteínas para degradação nos
proteassomas, é necessário notar que é o número e forma de disposição das moléculas
de ubiquitina que se encontram na cauda ligada à proteína que determina a acção
relativamente a essa proteína, havendo outras alternativas que não a degradação da
proteína, como mostra a figura.
2º tópico
Como já vimos, a degradação proteica pode ser usada para regular o funcionamento biológico,
intervindo em vários processos.
A tabela seguinte apresenta uma lista de processos psicológicos que são controlados, pelo
menos em parte, pela degradação proteica, operada através da via ubiquitina-proteassoma.
Em cada caso, as proteínas que são degradadas são proteínas reguladoras. Consideremos, por
exemplo, o controlo da resposta inflamatória. Um factor de transcrição chamado NF-kB (sendo
que NF significa “Nuclear factor”, que, em português, significa factor nuclear) inicia a
expressão de um número de genes que tomam parte activa nesta resposta. Este factor é por si
só activado pela degradação de uma proteína inibidora que lhe está adjacente, I-kB (sendo que
I significa “Inibidora”). Em resposta aos sinais inflamatórios que se ligam aos receptores
membranares, a I-kB é fosforilada em dois resíduos de serina, criando um local de ligação E3. A
ligação de E3 conduz à ubiquitinação e degradação da I-kB, desencadeando NF-kB. O factor de
transcrição libertado migra para o núcleo para simular a transcrição de genes alvo. O sistema
NF-kB-I-kB ilustra a interacção de vários motivos chave de regulação: transdução de sinal
mediada por receptores, fosforilação, degradação controlada e específica, e expressão
selectiva de genes. O sistema ubiquitina-proteassoma é, então, muito importante para a
regulação da expressão de genes.
Tabela 1 – Processos regulados por degradação proteica
Transcrição de genes
Progressão do ciclo celular
Formação de órgãos
Ritmos ci-cardíacos
Resposta inflamatória
Supressão tumoral
Metabolismo do colestrol
Processamento de antigénios
A endocitose de receptores da membrana celular é outro exemplo de um processo que
envolve ubiquitilação, mas não a degradação da proteína-substrato. A mono-ubiquitilação
dessas proteínas é suficiente para que ocorra internalização destas proteínas e o seu
transporte para o vacúolo.
3º tópico
PARKINA:
A proteína parkina é uma ubiquitina ligase (E3), responsável pela ligação das
moléculas de ubiquitina às “proteínas alvo”.
A mutação nessa proteína pode afectar a ubiquitinação, e, consequentemente,
não ocorrendo a degradação das proteínas alvo, estas acumulam-se, agregam-se em
Corpos de Lewy e causam a morte celular.
UCH-L1 (ubiquitina hidroxilase carboxi-terminal L1):
A proteína UCH-L1 separa a ubiquitina da “proteína alvo” para que a “proteína
alvo” seja degradada pelo proteassoma.
Quando ocorre uma mutação nesta proteína, a ubiquitina não se separa da
“proteína alvo”, não podendo ocorrer a degradação da mesma. Formam-se então os
Corpos de Lewy e, posteriormente, a morte celular.