AVALIAÇÃO NEUROQUÍMICA DO SISTEMA COLINÉRGICO DE

CRISTINA MARTINS E SILVA
AVALIAÇÃO NEUROQUÍMICA DO SISTEMA
COLINÉRGICO DE
CAMUNDONGOS COM O GENE DO
TRANSPORTADOR VESICULAR DE
ACETILCOLINA (VAChT) MODIFICADO
GENETICAMENTE
Belo Horizonte
Junho
2008
CRISTINA MARTINS E SILVA
AVALIAÇÃO NEUROQUÍMICA DO SISTEMA
COLINÉRGICO DE
CAMUNDONGOS COM O GENE DO
TRANSPORTADOR VESICULAR DE
ACETILCOLINA (VAChT) MODIFICADO
GENETICAMENTE
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia Bioquímica e Molecular do Departamento de
Farmacologia da Universidade Federal de Minas Gerais
como requisito parcial para obtenção do grau Doutor em
Ciências Biológicas: Farmacologia Bioquímica e Molecular
Orientador: Vânia Ferreira Prado
Co-orientador: Marco Antônio Máximo Prado
Belo Horizonte
Junho
2008
i
Esse trabalho foi realizado no Laboratório de Neurofarmacologia do Departamento de
Farmacologia e no Laboratório de Neurobiologia Molecular do Departamento de
Bioquímica, ambos do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de
Minas Gerais, com auxílio das seguintes instituições:
- Conselho Nacional do Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
- American Health Assistance Foundation
- Pronex-MG
- NIH-Forgaty
-Instituto do Milênio
ii
AGRADECIMENTOS
A DEUS;
Agradeço imensamente aos meus pais pelo amor incondicional e por sempre
acreditarem que o ensino é a maior e melhor herança. Amo muito vocês;
À minha irmã Kiu, amo muito você!
Ao meu bebê Marie, que mesmo sendo tão criança, soube entender quando a titia tinha
que cuidar de camundongos;
À minha querida orientadora Vânia, meu espelho profissional, que em muitos
momentos soube aconselhar além dos assuntos científicos;
Ao meu Big Boss Marcão, pela confiança, exemplo e pelo profissionalismo;
À minha Amigator, pela amizade, confiabilidade e aconselhamentos (Estamos juntas
neste barco!);
À Magdinha, que foi, voltou e foi de novo: muitas saudades;
Ao meu pequeno Cearense que eu adoro e admiro;
Ao Bráulio, companheiro e amigo que conquistou minha admiração e respeito;
À Fabi, minha doce pequena, meiga e amável, foi maravilhoso conviver com você;
Ao Professor Marcus Vinícius pela honra de trabalhar junto, pelo exemplo de
pesquisador, pela luta em causa dos estudantes e principalmente pela simplicidade.
Sentirei muito sua falta!
Ao Helton (honorável professor) pela amizade e ajuda nos momentos de ignorância
digital;
À Luciene e Melissa, companheiras e amigas de todas as horas;
À Driele, pela amizade conquistada a muito custo, por sempre me atualizar nos assuntos
de televisão e principalmente por me ajudar nos experimentos quando você estava a fim.
Valeu Driele, te adoro!
Ao Celinho, pela amizade, alegria, pelo Cruzeiro Esporte Clube e ajuda neste momento
difícil;
À minha grande amiga Janaína, irmã de coração e parceira de todas as horas;
À Lucimar e à Grace (agora ilustre professora), vocês são fundamentais, amo vocês;
Aos companheiros do Laboratório de Neurofarmacologia: Alessandra (leite quente
adorada!), Aninha Cristina, Nancy, Iaci, Jomara, Xavier, Patrícia e Danuza;
iii
Ao Dioguete, que me ajudou e ensinou muito sobre o Biotério, mas principalmente por
despertar meu respeito e admiração (Cê chega longe moço, acredite, pois eu tenho
certeza!);
Aos companheiros do Laboratório de Neurobiologia: Ivana, Rita, Andréa, Natália,
Patrícia, Cíntia, Diane e Rodrigo;
Aos grandes amigos do Laboratório de Eletrofisiologia: Chris, Sílvia, Marcinha, Éder,
Adriano, Enéas, Anita, Aline, Flaviana, Rose e Marina;
À Cristina (ilustríssima professora), por sempre deixar as portas do seu laboratório
abertas para meus experimentos de domingo e pela amizade e carinho de seus
estudantes Ernani, Bento e Mona;
Ao professor Renato Gomez, pelo exemplo, amizade e a presença nos experimentos de
domingo;
À Lica, minha amiga de todas as horas. Desejo-te todas as alegrias do mundo;
À minha tia Ló, parte desta conquista também é sua!
Ao Zé Lope, por tornar este período final muito alegre e divertido;
Aos filhos e neta do Zé Lope, valeu, valeu e valeu!
À toda a minha família, meu esteio e meu porto seguro;
A todos que direta ou indiretamente fizeram parte desta conquista, muito obrigada.
iv
SUMÁRIO
Lista de figuras e tabelas..................................................................................................ix
Lista de abreviaturas........................................................................................................xii
Resumo...........................................................................................................................xiv
Abstract...........................................................................................................................xvi
I- INTRODUÇÃO
1.0
Acetilcolina e o sistema colinérgico..........................................................2
2.0
O lócus colinérgico....................................................................................4
2.1)
A enzima colina acetiltransferase (ChAT)................................................6
2.2)
O transportador vesicular de acetilcolina (VAChT)..................................8
2.3)
O transportador de colina de alta afinidade (CHT1)................................11
3.0
Classificação dos neurônios colinérgicos no sistema nervoso central.....14
4.0
Sistema colinérgico e doenças neurodegenerativas.................................17
5.0
O sistema Cre/loxP...................................................................................20
6.0
Animais modelo para estudos da disfunção colinérgica..........................23
II- OBJETIVOS
Objetivo geral............................................................................................................31
A) Objetivos específicos para os camundongos knockdown...................................31
B) Objetivos específicos para os camundongos nocaute condicionais....................31
III- MATERIAL E MÉTODOS
1.0
Genotipagem dos camundongos..............................................................34
1.1)
Extração de DNA genômico....................................................................34
1.2)
Southern Blotting e PCR..........................................................................35
2.0
Expressão de RNA mensageiro................................................................38
2.1)
Extração de RNA total.............................................................................38
2.2)
Purificação de RNA mensageiro..............................................................39
2.3)
Northern Blotting.....................................................................................40
2.4)
PCR em tempo real..................................................................................41
2,4.1)
Tratamento com DNAse I........................................................................41
v
2.4.2)
Síntese de cDNA......................................................................................41
2.4.3)
Reação de PCR em tempo real.................................................................42
3.0)
Expressão Protéica...................................................................................44
3.1)
Western Blotting......................................................................................44
3.2)
Imunofluorecência...................................................................................45
4.0
Dosagem de acetilcolina nos tecidos.......................................................47
5.0
Liberação de acetilcolina.........................................................................48
6.0
Medida da atividade da colina acetiltransferase (ChAT).........................49
7.0
Transporte de colina.................................................................................49
8.0
Testes comportamentais...........................................................................50
8.1)
Wire Hang................................................................................................50
8.2)
Footprint..................................................................................................51
IV- RESULTADOS
Camundongos VAChT com recombinação na região 5’ não traduzida do
VAChT....................................................................................................53
1.0
Genotipagem dos camundongos..............................................................53
2.0
Análise dos níveis de transcrição do VAChT. e outros marcadores
colinérgicos..............................................................................................55
2.1)
Análise por Northern-blot........................................................................55
2.2)
Análise da expressão gênica por PCR em tempo real..............................57
3.0
Análise da expressão protéica do VAChT no cérebro.............................58
3.1)
Análise por Western Blot.........................................................................58
3.2)
Análise por imunofluorescência em fatia.................................................62
4.0
Efeito da diminuição da expressão do VAChT na liberação de
acetilcolina...............................................................................................68
5.0
Efeito da diminuição da expressão do VAChT na concentração de
acetilcolina no cérebro.............................................................................71
6.0
Efeito da diminuição da expressão do VAChT na atividade da enzima
colina acetiltransferase (ChAT)...............................................................73
7.0
Efeito da diminuição da expressão do VAChT na captação de colina pelo
CHT1........................................................................................................75
Camundongos VAChT com recombinação na região 3’ não traduzida do
VAChT....................................................................................................77
vi
Camundongos VAChTFlox/Flox..................................................................77
1.0
Genotipagem dos camundongos VAChTFlox/Flox......................................77
2.0
Análise dos níveis de mRNAs do VAChT e outros marcadores
colinérgicos nos camundongos VAChTFlox/Flox........................................78
3.0
Análise da liberação de acetilcolina na junção neuromuscular dos
camundongos VAChTFlox/Flox...................................................................82
4.0
Dosagem de acetilcolina no cérebro dos camundongos VAChTFlox/Flox..82
Camundongos VAChTFlox/Flox, cre+............................................................86
1.0
Estratégia de cruzamento para a geração de camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
.............................................................................................................88
2.0
Genotipagem dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+................................88
3.0
Características fenotípicas dos animais VAChTFlox/Flox, cre+.....................90
4.0
Análise da expressão protéica do VAChT e outros marcadores
colinérgicos no cérebro dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+................92
5.0
Análise da expressão protéica do VAChT e outros marcadores
colinérgicos no sistema periférico dos camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
.............................................................................................................99
Camundongos com deleção de um dos alelos do VAChT (VAChTWT/Del e
VAChTFlox/Del, cre+)..................................................................................101
1.0
Genotipagem dos camundongos com deleção de um dos alelos do
VAChT (VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+).........................................103
2.0
Características fenotípicas dos camundongos com deleção de um dos
alelos do VAChT (VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+)..........................105
3.0
Análise dos níveis de mRNA do VAChT e de outros marcadores
colinérgicos nos camundongos com deleção de um dos alelos do VAChT
(VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+).......................................................107
4.0
Análise da expressão protéica do VAChT e de outros marcadores
colinérgicos no cérebro dos camundongos com deleção de um dos alelos
do VAChT (VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+)....................................110
5.0
Análise da expressão protéica do VAChT no sistema nervoso periférico
dos camundongos com deleção de um dos alelos do VAChT
(VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+).......................................................120
vii
6.0
Análise da liberação de acetilcolina na junção neuromuscular dos
camundongos com deleção de um dos alelos do VAChT (VAChTWT/Del e
VAChTFlox/Del, cre+)..................................................................................120
7.0
Dosagem da acetilcolina no cérebro dos camundongos com deleção de
um dos alelos do VAChT (VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+).............123
8.0
Atividade da colina acetiltransferase (ChAT) nos camundongos com
deleção de um dos alelos do VAChT (VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del,
cre+
)..........................................................................................................126
V- DISCUSSÃO
Camundongos VAChT “Knockdown”...................................................130
Camundongos nocaute condicionais para o VAChT.............................138
Camundongos VAChTFlox/Flox................................................................140
Camundongos VAChTFlox/Flox, cre+..........................................................143
Camundongos com deleção de um dos alelos do VAChT.....................147
VI- CONCLUSÃO.................................................................................................154
VII- BIBLIOGRAFIA...........................................................................................158
VIII- ANEXO.........................................................................................................173
viii
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1: Neurotransmissão colinérgica.....................................................................3
Figura 2: O loco gênico colinérgico.em camundongo...............................................5
Figura 3: Topologia e seqüência de aminoácidos do VAChT de rato.....................10
Figura 4: Os neurônios colinérgicos no SNC de rato...............................................16
Figura 5: Geração de camundongos nocaute condicional........................................22
Figura 6: Estratégia para VAChT knockdown.........................................................27
Figura 7: Estratégia para VAChT/Flox....................................................................29
Figura 8: Genotipagem dos camundongos mutantes................................................54
Figura 9: Análise dos níveis de RNA mensageiro dos animais VAChT mutantes..56
Figura 10: Quantificação por PCR em tempo real da expressão de mRNA do
VAChT nos camundongos VAChT mutantes......................................59
Figura 11: Quantificação por PCR em tempo real da expressão do mRNA da ChAT
nos camundongos VAChT mutantes ...................................................60
Figura 12: Quantificação por PCR em tempo real da expressão de mRNA do CHT1
dos camundongos VAChT mutantes....................................................61
Figura 13: Análise da expressão protéica do VAChT e outras proteínas présinápticas nos camundongos VAChT knockdown...............................63
Figura14: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 na região do hipocampo dos
camundongos VAChT knockdown ......................................................65
Figura 15: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 na região do córtex cerebral
dos camundongos VAChT knockdown ................................................66
Figura 16: Imunofluorescência para VAChT e CHT1 na região do estriado dos
camundongos VAChT knockdown ......................................................67
Figura 17: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 no núcleo facial (7N) da
região do tronco encefálico dos camundongos VAChT knockdown....69
Figura 18: Microdiálise no cérebro dos camundongos KDHET ...............................70
Figura 19: Dosagem de acetilcolina no cérebro de camundongos knockdown .......72
Figura 20: Atividade da colina acetil-transferase (ChAT) nos camundongos KD...74
Figura 21: Captação de colina em sinaptosomas dos camundongos knockdown.....76
Figura 22: Genotipagem dos camundongos VAChTFlox/Flox.....................................79
Figura 23: Quantificação da expressão de mRNA do VAChT na medula espinal dos
camundongos VAChTFlox/Flox por PCR em tempo real.........................81
ix
Figura 24: Quantificação da expressão de mRNA da ChAT dos camundongos
VAChTFlox/Flox por PCR em tempo real ...............................................83
Figura 25: Quantificação da expressão de mRNA do CHT1 dos camundongos
VAChTFlox/Flox por PCR em tempo real ...............................................84
Figura 26: Liberação de acetilcolina na junção neuromuscular (JNM) dos
camundongos VAChTFlox/Flox ...............................................................85
Figura 27: Dosagem de ACh nos camundongos VAChTFlox/Flox .............................87
Figura 28: Genotipagem dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+...............................89
Figura 29: Características fenotípicas dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+..........91
Figura 30: Avaliação da coordenação motora e da força muscular nos camundongos
VAChTFlox/Flox, cre+.................................................................................93
Figura 31: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 na região do estriado dos
camundongos VAChTFlox/Flox, cre+..........................................................94
Figura 32: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 na região do hipocampo dos
camundongos VAChTFlox/Flox, cre+..........................................................96
Figura 33: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 na região do córtex motor
dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+...................................................97
Figura 34: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 no núcleo facial 7N da
região do tronco encefálico dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+......98
Figura 35: Imunofluorescência para o VAChT em diafragmas dos camundongos
VAChTFlox/Flox, cre+...............................................................................100
Figura 36: Imunoflorescência para o CHT1 em diafragmas dos camundongos
VAChTFlox/Flox, cre+...............................................................................102
Figura 37: Genotipagem dos camundongos VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+....104
Figura 38: Caracterização fenotípica dos camundongos VAChTFlox/Del, cre+..........106
Figura 39: Teste para avaliar a coordenação motora nos camundongos
VAChTFlox/Del,
cre+
.......................................................................................................108
Figura 40: Gráfico da quantificação da expressão de mRNA do VAChT nos
VAChTFlox/Del, cre+ por PCR em tempo real ........................................109
Figura 41: Gráfico da quantificação da expressão de mRNA da ChAT dos
camundongos VAChTFlox/Del Cre+ por PCR em tempo real..................111
Figura 42: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 na região do hipocampo
dos camundongos VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del ........................113
x
Figura 43: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 na região do córtex dos
camundongos VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del ..............................114
Figura 44: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 na região do estriado dos
camundongos VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del ..............................115
Figura 45: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 no núcleo facial 7N dos
camundongos VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del ..............................116
Figura
46:
Imunofluorescência
pedunculopontino
para
dos
o
VAChT
camundongos
e
CHT1
no
núcleo
VAChTFlox/Del,
cre+
e
VAChTWT/Del.......................................................................................117
Figura 47: Imunorreatividade para VAChT, ChAT e CHT1 nos camundongos
VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del .....................................................119
Figura 48: Imunofluorescência para o VAChT em diafragma dos camundongos
VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del ..........................................................................121
Figura 49: Imunofluorescência para o CHT1 em diafragma dos camundongos
VAChTFlox/Del, cre+.e VAChTWT/Del .....................................................122
Figura 50: Liberação de acetilcolina na junção neuromuscular (JNM) dos
camundongos VAChTFlox/Del, cre+.e VAChTWT/Del ..............................124
Figura 51: Dosagem de ACh no cérebro dos camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
e
VAChTWT/Del ......................................................................................125
Figura 52: Atividade da enzima colina acetiltransferase (ChAT) nos camundongos
VAChTFlox/Del, cre+................................................................................127
Figura 53:Expressão de RNA do VAChT, ChAT e CHT1 no cérebro de
camundongos por hibridização in situ................................................133
Tabela 1: Iniciadores para genotipagem dos camundongos knockdown.................36
Tabela
2:
Iniciadores
para
genotipagem
dos
camundongos
nocaute
condicionais..........................................................................................37
Tabela 3: Iniciadores para PCR em tempo real........................................................43
xi
Listra de abreviaturas
Aβ
peptídeo amilóide beta
ACh
acetilcolina
AChE
acetilcolinesterase
acetil-CoA
acetil coenzima A
AD
Doença de Alzheimer
ALS
esclerose lateral amiotrófica
BSA
albumina bovina
C. elegans
Caenohabidits elegans
cDNA
acido desoxirribonucléico complementar
ChAT
colina acetiltransferase
CHT1
transportador de colina de alta afinidade
DEPC
dietilpirocarbonato
D. melanogaster
Drosophila melanogaster
dNTP
desoxirribonucleotídeos
DTT
ditiotreitol
GR
receptor de glicocorticóide
HC-3
hemicolinium 3
HD
doença de Huntington
JNM
junção neuromuscular
Kb
kilo base
KD
knockdown
KDHET
knockdown heterozigoto
KDHOM
knockdown homozigoto
LTP
Potenciação de longa duração
mEPP
potencial miniatura de placa motora
mRNA
ácido ribonucléico mensageiro
Neo
neomicina
NGFr
receptor do fator de crescimento neuronal
Pb
par de base
PBS
tampão fosfato
xii
PET
Tomografia de emissão de pósitron
PCR
reação em cadeia da polimerase
PFA
paraformaldeído
PSP
Paralisia supranuclear progressiva
PKA
proteína cinase A
PKC
proteína cinase C
RNA
ácido ribonucléico
RT-PCR
reação em cadeia da polimerase reversa
SNC
sistema nervoso central
SNP
sistema nervoso periférico
TBP
Tetrafenilboro
TBS
tampão tris base
TCA
ácido tricloroacético
Tk
timidina cinase
VAChT
transportador vesicular de acetilcolina
VAChTFlox/Del
camundongos que perderam um alelo do VAChT e o outro alelo é
flanqueado por LoxP
VAChTFlox/Del, cre+
camundongos que perderam um alelo do VAChT, o outro alelo é
flanqueado por LoxP e expressam a Cre.
VAChTFlox/Del, cre-
camundongos que perderam um alelo do VAChT, o outro alelo é
flanqueado por LoxP e não expressam a Cre.
VAChTFlox/Flox
camundongos com os dois alelos do VAChT flanqueados por
seqüências LoxP
VAChTFlox/Flox,Cre+
camundongos com os dois alelos do VAChT flanqueados por
seqüências LoxP que expressam a Cre
VAChTFlox/Flox,Cre-
camundongos com os dois alelos do VAChT flanqueados por
seqüências LoxP que não expressam a Cre
VAChT
Flox/WT
camundongos com um alelo do VAChT selvagem e o outro
flanqueado por seqüências LoxP
VAChTWT/Del
camundongos que perderam um alelo do VAChT e o outro alelo é
selvagem
VAChTWT/WT
camundongos com os dois alelos do VAChT selvagens
VMAT
transportador vesicular de monoaminas
WT
wild type (selvagem)
xiii
RESUMO
O transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) é responsável por
armazenar acetilcolina em vesículas sinápticas, passo importante para a manutenção da
transmissão colinérgica. Com o objetivo de estudar o papel do VAChT na manutenção
do tônus colinérgico, geramos diferentes linhagens de animais em que esse gene foi
alterado através de recombinação homóloga.
Uma estratégia para interferir com a expressão do gene do VAChT foi a
inserção de um cassete contendo o gene de resistência a neomicina na região 5’ não
traduzida do VAChT. Esta modificação genética gerou camundongos com diminuição
da expressão do VAChT (VAChT Knockdown). Os animais KDHET e KDHOM
apresentam redução de aproximadamente 45 e 65% da expressão de VAChT,
respectivamente. Observamos acúmulo de acetilcolina não liberada no cérebro dos
camundongos KD e isso não parece ser devido a alterações de expressão da choline
acetyltransferase ou do transportador de alta afinidade de colina. Ensaios de
eletrofisiologia na junção neuromuscular mostraram que existe uma diminuição no
tamanho do quanta nos camundongos KDHET e KDHOM sendo a diminuição maior nos
camundongos KDHOM que nos KDHET .
Nós também produzimos camundongos em que o gene do VAChT foi
flanqueado por seqüências LoxP (camundongos VAChTFlox/Flox) a fim de utilizá-los para
o acasalamento com camundongos que expressam a enzima Cre em diferentes regiões
do cérebro. Os camundongos gerados, portanto, poderiam apresentar deleção do gene do
VAChT em tecidos espeficos. Nossa caracterização inicial dos camundongos
VAChTFlox/Flox mostrou que eles apresentam redução em torno de 50% na expressão do
mRNA de VAChT, além de um aumento em torno de 100% na expressão do mRNA da
enzima ChAT e um aumento de 6 vezes nos níveis de acetilcolina no cérebro quando
comparados com os animais VAChTWT/WT. A amplitude dos potencias miniatura
(MEEPs) de placa motora está aumentada nos camundongos VAChTFlox/Flox, sem
alterações na freqüência. Apesar dessas alterações, os camundongos VAChTFlox/Flox são
fenotipicamente normais.
Camundongos VAChTFlox/WT ou VAChTFlox/Flox foram acasalados com
camundongos que expressam Cre sob o controle do promotor CAMKIIα. Os
camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ gerados são morfologicamente normais ao nascimento,
entretanto, após cinco dias de vida tornam-se menos ativos e exibem menor crescimento
que os animais controle da mesma ninhada. Além disso, os camundongos
VAChTFlox/Flox apresentam fraqueza muscular generalizada, desenvolvimento anormal
da coluna espinhal acarretando em cifose e sobrevivem apenas cerca de 8 semanas. Nós
também geramos uma linhagem de camundongos com a deleção de um dos alelos do
VAChT. Os camundongos VAChTFlox/Del, cre+ , apresentaram os mesmos fenótipos dos
camundongos VAChTFlox/Flox, cre+, porem os camundongos VAChTFlox/Del, cre+ sobrevivem
apenas cerca de 20 dias.
Surpreendentemente, os animais VAChTFlox/Flox,cre- e VAChTFlox/Del, cre- embora
não expressem a Cre, apresentam ausência de VAChT em diversas regiões do SNC.
Além disso, os níveis teciduais de acetilcolina também estão aumentados em torno de
doze vezes nos camundongos VAChTFlox/Del, cre-. Interessantemente, nenhum dos estudos
comportamentais e eletrofisiológicos realizados sugerem que o VAChT esteja alterado ,
já que os animais são fenotipicamente normais. Como os camundongos
VAChTFlox/Flox,cre- e VAChTFlox/Del, cre- apresentam mRNA para o VAChT, é possível que
exista um mecanismo regulatório da expressão do transportador ainda desconhecido.
xiv
Nossos resultados confirmam a importância de VAChT na regulação da
liberação de acetilcolina e, consequentemente, na manutenção das funções fisiológicas
normais do sistema nervoso central e periférico.
xv
ABSTRACT
The vesicular acetylcholine transporter (VACht) is responsible for acetylcholine
(Ach) storage in synaptic vesicles, an important step for cholinergic transmission. Our
goal was to study the role of VAChT in cholinergic tonus maintenance through the
generation of mice presenting alterations in VAChT gene by homologous
recombination..
One of used strategies was the insertion of a neomycin resistance cassette in
untranslated 5’ region of VAChT gene. This genetic modification generated mice
presenting reduced expression of VAChT (VAChT Knockdown). KDHET and KDHOM
present a 45% and 65% decrease in VAChT protein expression, respectively.
Accumulation of not released Ach in brain of KD was observed and it is not related
with increased expression or activity of ChAT (choline acetyltransferase) or CHT1
(High affinity choline transporter). Electrophysiological analysis at neuromuscular
junction showed a decrease in quantal size distribution for both, KDHET and KDHOM
specially in the second one.
We produced mice in which VAChT gene was flanqued by LoxP sites to
generate VAChTFlox/Flox mice. These mice were bred with mice expressing Cre enzyme
in different regions of brain. The lineage generated would present deletion of VAChT
gene in specific tissues. Our initial characterization of VAChT Flox/Flox mice showed that
they presented decrease of 50% in VAChT mRNA expression, an increase of 100% in
ChAT mRNA expression and an increase around 6 fold in brain Ach when compared to
VAChTWT/WT animals. The amplitude, but not frequency, of miniature potentials
(MEEPs) in neuromuscular junction is increased in VAChTFlox/Flox mice. However,
VAChTFlox/Flox mice are phenotipically normals.
VAChTFlox/WT or VAChTFlox/Flox animals were bred with mice expressing Cre
under CAMKIIα promoter control. The generated VAChTFlox/Flox,cre+ are
morphologicaly normals in birth, however, after five days of live they look smaller and
not as active as the control littermates animals . Besides this, the VAChTFlox/Flox,cre+
mice present general muscular weakness, anormal development of spinal cord
represented by a kyphosis and survive just 8 weeks.
Another mice lineage was generated due to VAChT allele deletion:
VAChTFlox/Del, cre+. These mice present similar phenotype to VAChTFlox/Flox, cre+ mice;
however this genotype present a reducted time life to approximately 20 days.
Even not shown Cre, VAChTFlox/Flox,cre- and VAChTFlox/Del,cre- animals surprisely,
present abolishment of VAChT in different regions of CNS. Besides this, ACh tissue
content in VAChTFlox/Del, cre- is 12 fold higher than in VAChTWT/WT animals.
Interestingly, comportamental and eletrophisiological studies, do not suggest alteration
of VAChT, since the Cre- animals are phenotypically normals. Similarly to
VAChTFlox/Del, cre+ animals, VAChTFlox/Flox,cre- and VAChTFlox/Del, cre- mice present
VAChT mRNA, suggesting an unknown regulatory mechanism of VAChT expression.
Our results confirm the important role of VAChT in cholinergic transmission
through Ach releasing regulation and, in consequence, in maintaining normal
physiological function of central and peripheral nervous system.
xvi
INTRODUÇÃO
1. Acetilcolina e o Sistema colinérgico
Desde o início do século passado, já era conhecida a atividade vaso
depressora da acetilcolina (ACh) e a capacidade desta molécula em estimular nervos
parassimpáticos (Dale e cols., 1914; revisto por Brown, 2006). Entretanto, foi
somente em 1921 que a acetilcolina foi identificada como neurotransmissor (Loewi,
1921; revisto por Bennett., 2000).
A ACh é o neurotransmissor das junções neuromusculares, sistema
nervoso autônomo e alguns neurônios do sistema nervoso central. No sistema
nervoso autônomo, é o transmissor das fibras pré e pós-ganglionares
parassimpáticas e fibras pré-ganglionares simpáticas, controlando inúmeras funções
mantenedoras da homeostase como a contração da musculatura gástrica, ritmo
cardíaco e secreção de alguns hormônios. No sistema nervoso central, a acetilcolina
parece estar envolvida em processos cognitivos como atenção, memória,
aprendizado e vigília (Pepeu e Giovaninni, 2004).
A biossíntese da acetilcolina ocorre no citosol do terminal dos
neurônios colinérgicos onde a colina é acetilada pela enzima colina acetiltransferase
(ChAT) utilizando acetil-CoA como doador de grupo acetil (Figura 1). O substrato
Acetil-CoA é uma substância presente em todas as células, por outro lado, a colina não
pode ser sintetizada “de novo” pelos tecidos nervosos. A colina para as células
neuronais vem principalmente da dieta e é entregue às células nervosas pela corrente
sanguínea (Scagnelli e cols., 1991). A outra fonte de colina é a fosfatidilcolina presente
na membrana celular, porém a utilização deste fosfolípide pelas células neuronais é
baixa (Blusztajn e cols., 1987). Depois de sintetizada, a acetilcolina é armazenada em
2
Cholinergic
synapse
Na+
CHOLINE
ACETYL-CoA + CHOLINE
ACETATE
Choline
acetyltransferase
ACh
VAChT
ACh
ATP
PG
AChE
ACh
ATP
2 H+
Ca2+
ACh
ATP
Post-synaptic
receptors
Ca2+
Channel
ChT1
Endosome
Pre-synaptic
receptor
Figura 1: Desenho esquemático da neurotransmissão colinérgica.
A acetilcolina (ACh) é sintetizada pela enzima colina acetiltransferase (ChAT) e
armazenada em vesículas sinápticas pelo transportador vesicular de acetilcolina
(VAChT). Com a exocitose, o neurotransmissor pode se ligar a receptores pré e pós
sinápticos. Após ser rapidamente degradada pela acetilcolinesterase (AChE), a colina é
novamente recaptada para o terminal pré-sináptico pelo transportador de colina de alta
afinidade (CHT1).
3
vesículas sinápticas pela ação do transportador vesicular de acetilcolina (VAChT). Este
transporte depende de um gradiente eletroquímico vesicular gerado pela ATPase
vacuolar do tipo V e é inibido pela droga vesamicol (Parsons e cols., 1993).
2. O Loco Colinérgico
Vários estudos de genética molecular mostraram que a organização
gênica da ChAT e do VAChT é peculiar em metazoários, pois o gene do VAChT reside
dentro do primeiro íntron do gene da ChAT (Alfonso e cols., 1994; Erickson e cols.,
1994; Bejanin e cols., 1994; Roghani e cols., 1994; revisto por Eiden,1998) (Figura 2).
A janela aberta de leitura do VAChT não é interrompida por íntrons em Drosophila,
camundongo, rato e humano, porém existem dois íntrons interrompendo a seqüência do
transportador em C. elegans (Alfonso e cols., 1994). Várias espécies de RNA
mensageiro para VAChT e ChAT já foram identificados e as diferentes espécies de
mRNA variam pela seqüência de suas regiões 5’ não traduzidas (Misawa e cols., 1992;
Chireux e cols., 1995; Misawa e cols., 1997). Alguns cDNAs do VAChT apresentam a
seqüência do exons R da ChAT, sugerindo a existência de um RNA mensageiro
precursor comum e que o VAChT e a ChAT poderiam compartilhar alguns promotores
(Bejanin e cols., 1994). De fato, Berse e Blusztajn (1995) mostraram que os níveis de
expressão de RNA mensageiro da ChAT e VAChT estão aumentados quando células
SN56 são incubadas com retinóides, AMPc e fatores de crescimento da família
CNTF/LIF (fator neurotrófico ciliar/fator inibidor de leucemia), sugerindo um controle
coordenado na expressão desses dois genes.
4
Genomic
DNA
ChAT
Exon R
P
VAChT
Exon
P P
ChAT
Exon N
ChAT
Exon M
ChAT
Exon # 4
P
R1
ChAT
mRNA
R2
R3
R4
N1
N2
M
VAChT
mRNA
R1
R2
V1
V2
V3
P Promoter
Non-coding regions of ChAT or
VAChT
Coding regions of VAChT
Coding regions of ChAT
Figura 2: Desenho representativo do loco gênico colinérgico de
camundongo: O esquema resume a transcrição e o processamento alternativo dos
RNAs mensageiros que codificam a proteína da ChAT e do VAChT. A primeira linha
representa o loco gênico: as caixas brancas representam os exons R, N e M da ChAT e a
caixa azul indica os outros 13 exons da enzima. A caixa vermelha representa a janela
aberta de leitura do VAChT que não é interrompida por íntrons e P indica os promotores
destes genes. São descritos 7 transcritos para a ChAT indicados como R1-R4, N1, N2 e
M e 5 transcritos para o VAChT indicados como R1 e R2, V1-V3. Modificado de Oda,
1999.
5
Entretanto, VAChT e ChAT possuem também promotores distintos
que geram múltiplas espécies de RNA mensageiro que são expressas diferentemente
durante o desenvolvimento (Holler e cols., 1996; Cervini e cols., 1995; Loureiro-dosSantos e cols., 2002) (Figura 2). Em Drosophila melanogaster existem evidências que
indicam que o controle da expressão dos mRNA da ChAT e VAChT pode ser
independente. Utilizando moscas mutantes que diminuem a expressão da ChAT com o
aumento da temperatura (Chats), foi observado que os níveis de RNA mensageiro para o
VAChT mantiveram-se inalterados (Kitamoto, T.; Wang, W.; e Salvaterra, P.,1998).
Deste modo, em determinadas circunstâncias VAChT e ChAT podem ser regulados
concomitantemente ou de forma independente.
2.1. A enzima colina acetiltransferase (ChAT)
A colina acetiltransferase (ChAT) é a enzima responsável pela
síntese da acetilcolina. Os estudos sobre a estrutura desta enzima tornaram-se possíveis
a partir da geração de anticorpos monoclonais específicos para a ChAT e pela
purificação da enzima através de cromatografia de imunoafinidade (Eckenstein e
Thoenen, 1982; Bruce e cols., 1985). Itoh e colaboradores (1986), utilizando uma
biblioteca de cDNA de cérebro de D. melanogaster foram os primeiros a identificar o
cDNA da enzima. Este cDNA ao ser utilizado como sonda se ligou especificamente ao
cromossomo de Drosophila e identificou o sítio do gene da ChAT (Cha) que havia sido
predito por análises citogenéticas. (Itoh e cols., 1986; revisto por Wu e Hersh;. 1994).
6
Com as informações sobre a seqüência protéica da ChAT, Berrard e
colaboradores (1987) clonaram o primeiro cDNA funcional de mamífero a partir da
medula espinal de porco. Posteriormente, foram identificados os homólogos de rato
(Brice e cols., 1989; Ishii e cols., 1990), camundongo (Ishii e cols., 1990), humano (Oda
e cols., 1992) e C. elegans (Alfonso e cols., 1994). Alinhamentos entre as seqüências de
DNA mostraram um alto grau de similaridade entre a seqüência de aminoácidos de
mamífero e em menor grau entre mamíferos e invertebrados (revisto por Wu e Hersh,
1994).
Triagens em bibliotecas de cDNA de cérebro e medula espinal de
rato e humano mostraram que a combinação de diferentes regiões promotoras além de
processamento alternativo produzem múltiplas espécies de RNA mensageiro para a
ChAT, denominadas R, N1, N2 e M. Recentemente, foram relatadas mais duas
isoformas S e H (Gill e cols., 2003). Estes RNAs possuem regiões codificadoras
idênticas diferindo em suas regiões 5’ não traduzidas (Kengaku, M., Misawa, H.,
Deguchi, T., 1993; Misawa e cols., 1997).
Apesar de apresentar diversos transcritos, a maioria das formas de
RNA codificam a mesma proteína com aproximadamente 68 kDa. Os transcritos M e S
codificam uma outra espécie com peso molecular aparente de 82 kDa. Grande parte da
ChAT de 68 kDa está presente predominantemente no citosol enquanto cerca de 20%
está ligada à membrana (revisto por Oda, 1999; Sha e cols., 2004). Estudos de
fracionamento sub-celular e co-imunoprecipitação sugerem que a ChAT ligada à
membrana associa-se com vesículas sinápticas (Carroll, 1994). Já a isoforma de 82kDa
possui localização nuclear (Gill e cols., 2003; Resendes e cols., 1999). Esta isoforma da
7
ChAT apresenta 118 aminoácidos adicionais e contém dois sinais de localização nuclear
(NLS) necessários para enviar esta proteína ao núcleo (Resendes e cols., 1999).
Acredita-se que a atividade da ChAT de 68 kDa está restrita ao
citoplasma enquanto a atividade da ChAT de 82 kDa está distribuída entre o citoplasma
e o núcleo (Resendes e cols., 1999). Foi demonstrado que a ativação da ChAT associada
à membrana e solúvel depende de fosforilação e é acentuada por ATP (Sha e cols.,
2004). Entretanto, a ativação da ChAT associada à membrana por ATP é dependente da
integridade do gradiente eletroquímico das vesículas sinápticas, sugerindo que há um
acoplamento funcional entre a síntese de ACh pela ChAT associada à membrana e o
armazenamento deste neurotransmissor em vesículas sinápticas pelo VAChT (Hsu e
cols., 1999; Sha e cols., 2004).
Os mecanismos que controlam a síntese de acetilcolina pela ChAT
não são conhecidos em detalhes. Dados experimentais sugerem que a atividade da
ChAT não é o passo limitante para a síntese de ACh. Nos experimentos em que o
transporte de ACh para as vesículas sinápticas foi inibido pelo vesamicol, não foi
observada alteração da síntese de ACh nem na captação de colina, apesar de haver um
grande acúmulo do neurotransmissor no citosol (Collier e cols., 1986), sugerindo
ausência de controle de retro alimentação pelo substrato.
2.2 O Transportador vesicular de Acetilcolina (VAChT)
O VAChT é uma glicoproteína de vesículas sinápticas que apresenta 12 domínios
transmembrana e possui homologia com os transportadores vesiculares de monoaminas
8
(VMATs) (Alfonso e cols., 1993) (Figura 3). Assim como o VMAT e outros
transportadores vesiculares, o VAChT troca dois prótons vesiculares por acetilcolina
citoplasmática, sendo por conseguinte dependente de um gradiente eletroquímico.
Entretanto, estes transportadores dependem mais do gradiente químico (ΔpH) do que do
gradiente elétrico (ΔΨ), ou seja, requerem mais prótons do que movimentos de cargas
(revisto por Edwards, R., 2007). Estudos utilizando vesículas sinápticas de Torpedo
californica, mostraram a presença de uma ATPase vacuolar do tipo V que acidifica as
vesículas, gerando o gradiente eletroquímico necessário para o VAChT transportar a
ACh para dentro das vesículas (Anderson e cols., 1982; Anderson e cols., 1983; Parsons
e cols., 1993 e Nguyen e cols., 1998).
O gene do VAChT de C. elegans (unc-17) foi inicialmente clonado
por Alfonso e colaboradores (1993). E o alinhamento da seqüência de nematódeo com a
seqüência dos transportadores vesiculares de monoaminas de mamíferos mostrou uma
grande similaridade. Os estudos de localização demonstraram a presença do
transportador em vesículas sinápticas de neurônios colinérgicos do nematódeo e
confirmaram os dados anteriores que descreveram que mutações em unc-17 afetavam a
função neuromuscular.
Posteriormente, foram identificados os homólogos de unc-17 no
órgão elétrico de Torpedo e rato (Erickson e cols., 1994; Roghani e cols., 1994). Nosso
grupo de pesquisa identificou e caracterizou o gene do VAChT de camundongo e
mostrou uma alta homologia à seqüência do transportador de rato (98%) e humano
(95%) (Barbosa e cols., 1999). O nosso grupo demonstrou que o VAChT é fosforilado
por PKC. Sinaptosomas incubados com
32
P e expostos ao PMA (éster de forbol)
mostraram um
9
Figura 3: Topologia e a seqüência de aminoácidos do transportador vesicular de
acetilcolina de rato. A proteína do VAChT contém doze domínios transmembranas (IXII) sendo a porção amino e carboxi-terminal voltada para o citoplasma dos neurônios.
Em vermelho estão destacados os aminoácidos conservados entre os transportadores
vesiculares, em azul são apresentados os resíduos exclusivos da proteína do VAChT. Os
resíduos destacados em preto indicam os resíduos de ácido aspártico que são comuns a
todos os transportadores vesiculares. Entre os domínios transmembranas I e II, observadestaca-se o sítio de fosforilação. Modificado de Roghani e cols., 1994.
10
aumento da fosforilação do VAChT. Esse aumento na fosforilação não foi observado
quando os sinaptosomas foram expostos ao isômero não ativo α-PMA (Barbosa e cols.,
1997). Subsequentemente, foi também mostrada a fosforilação do transportador, pela
PKC, em células PC12 expressando estavelmente o VAChT (Cho e cols., 2000). Ao
substituir o VAChT selvagem por um transportador mutante sem o provável sítio de
fosforilação (S480A), a fosforilação dependente de PKC não foi observada. Estudos
utilizando fracionamento subcelular indicaram que o VAChT mutante contendo um
resíduo de glutamato na posição 480 (para mimetizar a fosforilação) se localizava mais
em vesículas de centro denso do que em vesículas sinápticas, sugerindo, deste modo,
que a fosforilação do VAChT influencia seu tráfego intracelular (Krantz e cols., 2000).
Um segundo grupo sugeriu que a fosforilação do VAChT seria necessária para o tráfego
do transportador para vesículas sinápticas (Cho e cols., 2000). No entanto, esses dados
não foram confirmados pelo nosso grupo (Barbosa J, tese de doutorado, 2003).
Nosso grupo, também demonstrou que alterações na atividade da
PKC influenciam a sensibilidade dos neurônios colinérgicos ao vesamicol (Barbosa e
cols., 1997; Clarizia e cols., 1999). A liberação de
3H
ACh em fatias de hipocampo sob
estimulação elétrica é fortemente inibida em presença de vesamicol. Entretanto, foi
observado que a inibição da liberação de 3HACh pelo vesamicol foi revertida quando as
fatias de hipocampo foram expostas ao PMA. Esses resultados sugerem que a
fosforilação do transportador poderia regular a interação do mesmo com o vesamicol
(Barbosa e cols., 1997; Clarizia e cols., 1999).
2.3 O Transportador de colina de alta afinidade (CHT1)
11
Após um estímulo despolarizante, ocorre a exocitose das vesículas
preenchidas com acetilcolina na fenda sináptica e o neurotransmissor pode se ligar a
receptores nicotínicos e muscarínicos. As moléculas de ACh permanecem ligadas a seus
receptores durante um período médio de 2 milissegundos sendo, em seguida,
degradadas na fenda sináptica. A inativação da acetilcolina é realizada pela ação da
enzima acetilcolinesterase (AChE). Esta enzima catalisa a conversão da molécula de
acetilcolina em acetato e colina. A colina presente na fenda sináptica é então recaptada
para o terminal pré-sináptico através de um transporte ativo realizado pelo transportador
de colina de alta afinidade, CHT1, que depende dos íons Na+ e Cl- (Yamamura e
Snyder,1973; Collier e Ilson, 1977). Este transporte de alta afinidade da colina é
específico de neurônios colinérgicos e inibido por baixas concentrações da droga
hemicolinium-3 (HC-3). Existe também um transporte de colina que está presente em
todas as células e é inibido por altas doses de HC-3 (Yamamura e Snyder,1973).
Há algumas décadas, o transporte de colina de alta afinidade foi
caracterizado, entretanto, é recente a identificação da molécula responsável por este
transporte. Okuda e colaboradores (2000) foram os primeiros a clonar o gene do CHT1
e posteriormente, foram clonados os homólogos de rato, humano, Limulus, camundongo
e Torpedo (Okuda e Haga, 2000, Apparsudaran e cols., 2000 e 2001, Wang e cols., 2001
e Guermonprez e cols., 2002). O CHT1 pertence à família de transportadores de glicose
(família SLC5) cujo transporte é dependente do íon sódio. Interessantemente, o CHT1
não apresenta similaridade com outros transportadores de neurotransmissores
(Apparsudaran e cols., 2000; Okuda e Haga, 2000; Okuda e cols., 2000 e revisto por
Ribeiro e cols, 2006).
12
Os trabalhos clássicos de caracterização do transporte de colina de
alta afinidade mostraram que um aumento da atividade de neurônios colinérgicos leva a
um aumento no transporte de colina e síntese de ACh (Collier e Katz, 1974; Simon e
Kuhar, 1975; Simon e cols., 1976; Kuhar e Murrin, 1978; o’Regan e Collier 1981;
Saltarelli e cols., 1987). Assim como o VAChT, o transportador de colina de alta
afinidade apresenta sítios de fosforilação para PKC e PKA. Experimentos in vitro
mostraram que a atividade de cinases e fosfatases afeta tanto o tráfego intracelular
quanto a atividade do CHT1 (Issa e cols., 1996; Cooke e Rylett, 1997; Ivy e cols.,
2001).
Nosso grupo de pesquisa, foi o primeiro a demonstrar, utilizando
técnicas de imunofluorescência e microscopia confocal, que o CHT1 está presente,
predominantemente, em estruturas intracelulares e colocaliza-se com as proteínas
vesiculares VAChT e VAMPII. Utilizando fracionamento subcelular e imunoisolamento
de vesículas, nós demonstramos que o CHT1 está presente em vesículas sinápticas
(Ribeiro e cols., 2003). Ferguson e colaboradores (2003) demonstraram de maneira
independente a presença do CHT1 em vesículas sinápticas imunoisoladas e estudos de
imunogold também mostraram que grande parte do CHT1 está presente em vesículas
sinápticas, enquanto apenas uma pequena porção do transportador de colina está
associada à membrana plasmática (Nakata e cols., 2004). Estes dados sugerem que o
aumento da atividade neuronal leva a um aumento da fusão de vesículas sinápticas e um
maior fluxo de CHT1 em direção à membrana plasmática. O aumento da concentração
do CHT1 na membrana pré-sináptica proporciona então uma maior captação de colina o
que favorece a síntese de acetilcolina (Ribeiro e cols., 2003; Fergunson e cols., 2003).
13
Por conseguinte, a presença do CHT1 em vesículas sinápticas pode servir como um
“pool” de reserva intracelular (revisto por Ribeiro e cols., 2006).
3. Classificação dos neurônios colinérgicos no sistema nervoso
central
Técnicas histoquímicas para detectar neurônios contendo a enzima
acetilcolinesterase foram inicialmente utilizadas para identificar os neurônios
colinérgicos. Entretanto, com a produção de anticorpos para a ChAT foi possível
observar que nem todos os neurônios positivos para a AChase eram colinérgicos (Levey
e cols., 1983). VAChT e ChAT são proteínas características de neurônios colinérgicos e
portanto, foram utilizadas para mapear a rede colinérgica no sistema nervoso. Vários
trabalhos empregando técnicas de imunohistoquímica foram realizados a fim de definir
a população de neurônios colinérgicos no cérebro e suas projeções (Roghani e cols.,
1996; Schäfer e cols., 1998). Recentemente, com a identificação do CHT1, foi possível
obter mais um marcador na identificação dos neurônios colinérgicos. (Okuda e Haga,
2000; Misawa e cols., 2001; Kobayashi e cols., 2002).
Existem alguns dados controversos sobre a presença de neurônios
colinérgicos no córtex cerebral de mamíferos. Os estudos imunohistoquímicos iniciais
apontam a ausência de neurônios colinérgicos no córtex cerebral (Kimura e cols., 1980;
Kimura e cols.,1981; Sofroniew e cols., 1982; Armstrong e cols., 1983). Contudo, dados
atuais mostram reatividade para ChAT em neurônios corticais de rato, gato, embriões de
macacos e humanos (revisto por Oda, 1999).
14
Mesulam e colaboradores (1983) classificaram os neurônios
colinérgicos do sistema nervoso central em seis grupos (Figura 4). Os neurônios de cada
grupo foram divididos em setores de acordo com as semelhanças em suas características
celulares e na topografia das projeções nervosas (Mesulan e cols., 1983B).
O primeiro setor, Ch1, é composto de neurônios colinérgicos da
região do septo medial. No geral, são os menores neurônios dentro do grupo Ch1-Ch6.
Não há uma delimitação precisa entre os neurônios que pertencem aos setores Ch1 e
Ch2. Neurônios pertencentes ao setor Ch2 estão situados na extremidade vertical da
área de Broca. Estes dois grupos neuronais fornecem a principal fonte de projeções
colinérgicas para inervar o hipocampo. Neurônios pertencentes ao setor Ch3 estão
situados na extremidade horizontal da área de Broca e grande parte de suas projeções
inervam o bulbo olfatório. Já os neurônios do setor Ch4, localizam-se no Núcleo basal,
núcleo magnocelular pré-optico e algumas partes da extremidade horizontal da banda de
Broca e projetam para o neocórtex e a amídala. Os neurônios dos setores Ch1-4 atuam
modulando a excitabilidade cortical e memória (Sarter e Bruno, 1997). A região do
prosencéfalo basal contém estes quatro setores e é a principal responsável pelas
projeções colinérgicas enviadas para o córtex e hipocampo (Schafer e cols., 1998).
A formação reticular pontomesencefálica contém dois grupos de
neurônios colinérgicos de tamanho médio dos setores Ch5 e Ch6. Eles constituem o
núcleo pedunculopontino e núcleo tegmental laterodorsal, respectivamente e fazem
projeção para o mesencéfalo, diencéfalo e bulbo. São importantes para processos como
vigília e iniciação do sono (Mesulam e cols., 1983; Mesulan e cols., 1989 e Manaye e
cols., 1999).
15
Figura 4: Figura representativa da distribuição dos neurônios colinérgicos no
sistema nervoso central de ratos. Os neurônios Ch1 estão na região do septo medial,
Ch2 e Ch3 localizam-se na extremidade vertical e horizontal da área de Broca,
respectivamente. Neurônios Ch4 estão no núcleo basalis de Meynert. Neurônios Ch1Ch4 situam-se na região do prosencéfalo basal. Ch5 e Ch6 localizam-se na região do
mesencéfalo Abreviações: (AMG) amigdala; (CB) cerebelo; (HC) hipocampo; (NC)
neocórtex; (OB) bulbo olfatório; (TH) tálamo; Modificado de Mesulan e cols., 1983.
16
Não constam desta classificação, mas são observados grandes grupos
de neurônios motores (motoneurônios) na região do tronco encefálico e medula espinal.
No tronco foram encontradas populações de motoneurônios colinérgicos de tamanho
médio próximos ao tegmento mesopontino e núcleo pedunculopontino. Na medula
espinal, são observados motoneurônios colinérgicos no corno ventral desde a região
cervical até a sacral (Vanderhost e Ulfhake, 2006).
4. Sistema Colinérgico e doenças neurodegenerativas
Um grande número de evidências aponta o envolvimento do sistema
colinérgico com algumas doenças neurodegenerativas. A esclerose lateral amiotrófica
(ALS) é uma doença que pode ou não ter origem genética. Ela afeta seletivamente
neurônios motores do cérebro e da medula espinal o que acarreta uma atrofia muscular
progressiva e fatal (Corcia e Meininger, 2008). Os estudos bioquímicos mostraram que
a atividade da colina acetiltransferase está reduzida em amostras de tecidos de pacientes
de ALS (Kato T., 1989), além de uma redução marcante na expressão gênica da ChAT
(Virgo e cols., 1992). O tratamento para ALS envolve o uso de drogas que minimizam
os sintomas da doença. Uma das drogas amplamente utilizadas é o medicamento
“riluzole”, um antagonista glutamatérgico (Jahn e cols., 2008). Entretanto, vem sendo
proposto o uso do inibidor de colinesterase neostigmina para o tratamento da
constipação que é uma complicação comumente observada na progressão da doença
(Fu, 2005).
17
A doença de Huntington (HD) é uma desordem neurodegenerativa
caracterizada por diversas disfunções cognitivas e motoras. Mutações na proteína
huntingtina levam à agregação desta proteína em neurônios da região estriatal, onde há
morte de neurônios GABAérgicos e atrofia. (Adam e Jankovic, 2008). A região do
estriado possui uma rede de interneurônios colinérgicos (Mesulan e cols., 1983).
Estudos realizados em camundongos modelo de HD mostraram que nesses animais não
há perda de neurônios colinérgicos, no entanto, foram observados níveis reduzidos da
proteína do VAChT e da ChAT (Smith e cols., 2006).
Os experimentos de autoradiografia realizados em cérebro postmortem de pacientes que sofriam de paralisia supranuclear progressiva (PSP) também
mostram o envolvimento dos neurônios colinérgicos da região estriatal em desordens
motoras (Suzuki e cols., 2002). Esta doença é caracterizada por comprometer várias
funções centrais: controle do equilíbrio e da marcha; controle dos movimentos oculares;
articulação da fala e deglutição; e certas funções cognitivas (Esper e cols., 2007). Nesta
patologia além da redução da atividade da ChAT e da expressão da proteína do VAChT
foi detectada grande perda de neurônios colinérgicos estriatais (Suzuki e cols., 2002),
Nos últimos anos, vem se tornando crescente o número de estudos
sobre a doença de Alzheimer em decorrência do aumento da expectativa de vida da
população e da crescente incidência desta patologia em pessoas com mais de 60 anos. A
doença de Alzheimer (AD) é uma patologia que afeta, principalmente, a memória e
cognição (McKhann e cols., 1984). Nesta doença, três processos vitais para a
manutenção dos neurônios são afetados: comunicação, metabolismo e reparo. O
diagnóstico desta neuropatologia se dá pela detecção de placas β-amilóides e
18
emaranhados neurofibrilares em áreas límbicas e neocorticais do cérebro (Hyman e
Trojanowski, 1997).
Na doença de Alzheimer há uma proeminente redução nas
concentrações de ChAT no córtex e hipocampo (Bowen e cols., 1976; Bartus e cols.,
1982; revisto por Bartus e cols., 2000) e estudos postmortem realizados em pessoas
diagnosticadas com AD mostraram alterações na captação de colina de alta afinidade
(Slotkin e cols., 1990). Ensaios de PET, usando a ligação do [123I]benzovesamicol,
demostraram que a proteína do VAChT está reduzida na região do córtex cerebral e
hipocampo (Koeppe e cols., 1996). Adicionalmente, alguns estudos mostraram a perda
da memória recente em indivíduos normais quando recebiam doses de escopolamina,
um bloqueador muscarínico. Esses estudos mostraram também que a escopolamina
exacerbava a perda de memória quando ministrada a pacientes com AD (revisto por
Mesulam, 2004; Fu e cols., 2005).
A administração de inibidores de colinesterases melhora alguns dos
déficits cognitivos em pessoas no estágio inicial da doença de Alzheimer (Parihar e
Hemnani, 2004; Zimmermann e cols., 2005). Entretanto, não se sabe exatamente se a
degeneração dos neurônios colinérgicos é um evento recente ou se é uma conseqüência
do avanço da doença (revisto por Mesulam, 2004).
Foi relatado que o uso de agonistas parcialmente seletivos para o
receptor muscarínico M1, elevou os níveis da proteína precursora não amiloidogênica αAPP e diminuíram os níveis da β-amilóide (Aβ). (Muller e cols., 1997; Fisher e cols.,
2002). O tratamento agudo com o agonista seletivo do receptor M1 (AF267B) em
animais modelo de AD mostrou uma redução efetiva nos níveis de agregados Aβ nas
regiões do córtex e hipocampo. Consequentemente, o tratamento com o agonista
19
melhorou alguns dos déficits cognitivos apresentados por estes animais (Caccamo e
cols., 2006).
Outros trabalhos também procuram avaliar a influência dos peptídeos
Aβ sobre os mecanismos responsáveis pela manutenção da neurotransmissão
colinérgica. Nos experimentos em que fatias de hipocampo de ratos foram incubadas
com os peptídeos Aβ foi observada uma redução da liberação de acetilcolina após
estímulo despolarizante. Ao incubar sinaptosomas com
3H
colina e peptídeos Aβ foi
possível demonstrar que a redução da liberação de ACh foi em decorrência da
diminuição da captação de colina pelo CHT1 e não por alterações na atividade da ChAT
(Kar e cols., 1998).
Portanto, estudar detalhadamente a fisiologia do sistema colinérgico
poderia auxiliar no entendimento destas e outras doenças neurodegenerativas em que o
sistema colinérgico esteja envolvido.
5. O sistema Cre/LoxP
Nos últimos anos, vem se tornando crescente a utilização de
camundongos nocaute para avaliar a função biológica de uma proteína. Nestes animais,
é possível alterar ou mesmo abolir a expressão de um gene de interesse (Morozov e
cols., 2003). A geração de animais nocaute é obtida por recombinação homóloga em
células embrionárias (Hols e cols., 1994; revisto por Ghosh e Duyne, 2002). Nesta
técnica é necessária a construção de um vetor contendo duas regiões homólogas (braços
homólogos) à região onde está o gene de interesse e a presença de um marcador seletivo
20
de recombinação, geralmente um gene de resistência a antibiótico. O vetor de
recombinação homóloga é transfectado em células tronco embrionárias e, caso ocorra a
recombinação, as células crescem em meio contendo antibiótico. Posteriormente, estas
células tronco embrionárias são injetadas em blastocistos, os quais são implantadas no
útero de camundongos fêmea (Heck e cols., 2004; Liu e cols., 2000).
Embora a utilização de animais nocaute venha se tornando rotineira,
a técnica contém algumas limitações. Numa delas, a falta do gene pode levar a uma
inviabilidade gestacional por problemas durante o desenvolvimento embrionário, já que
não é possível ter um controle temporal da inativação gênica. Atualmente, com o
desenvolvimento do sistema Cre/loxP é possível a geração de camundongos nocaute
condicionais em que se tem controle temporal e espacial da expressão de um gene alvo,
permitindo assim que sejam obtidos animais que sobrevivem mesmo quando genes
importantes são inativados (Morozov e cols., 2003).
A enzima Cre é uma recombinase utilizada pelo vírus bacteriofago P1
para inserir seu DNA no genoma das bactérias. Esta recombinase atua como uma
tesoura, clivando uma seqüência específica de 34 pares de bases chamada loxP. Esta
seqüência loxP está presente no DNA de fago e não é encontrada no genoma de animais
e plantas. Portanto, esta pequena seqüência pode ser artificialmente inserida no genoma
de mamíferos e ser usada para excisão precisa do DNA. Quando um gene alvo é
flanqueado por dois sítios de loxP, a recombinase pode retirar ou inverter o gene
dependendo da orientação dos sítios de loxP (Figura 5A). Nesta técnica, portanto, devese gerar um animal que contenha o gene de interesse flanqueado por dois sítios de loxP
que podem então ser acasalados com animais que expressam a enzima Cre sob o
controle de promotores específicos.
21
A
B
Figura 5: Esquema representativo da tecnologia da Cre recombinase na
geração de camundongos nocaute condicionais. A. Desenho esquemático mostrando
o flanqueamento de um gene por sítios de loxP. Quando uma seqüência gênica é
flanqueada por dois sítios de loxP com a mesma orientação, a Cre recombinase remove
este gene, já quando os sítios de loxP estão em orientação oposta, a recombinase irá
inverter o gene. B. Desenho esquematizando a obtenção de camundongos nocaute
condicionais. Camundongos cujo gene alvo foi flanqueado por sítios loxP são cruzados
com camundongos que expressam a Cre sob comando de um promotor tecido
específico. A prole deste cruzamento não expressará a proteína de interesse apenas no
tecido onde esteja sendo expressa a recombinase.
22
A prole gerada (nocaute condicionais) terá abolida a expressão da proteína de interesse
apenas no tecido onde a Cre estiver sendo expressa (Figura 5B). Atualmente é possível
adquirir camundongos que expressam a Cre especificamente em diferentes órgãos.
Animais nocaute para o receptor de glicocorticóide (GR) são um dos bons exemplos
sobre as vantagens da tecnologia Cre/loxP. Os animais nocaute clássicos, ou seja, que
não expressam o receptor de glicocorticóide desde o início do desenvolvimento
embrionário em nenhuma região do organismo, morrem logo após o nascimento devido
a problemas no trato respiratório. Entretanto, animais nocaute condicionais que não
produzem o receptor em neurônios e células da glia sobrevivem e apresentam fenótipo
similar ao visto em pacientes com síndrome de Cushing (Tronce e cols., 1998;
Reichardt e cols., 2000).
O primeiro animal nocaute condicional de uma proteína expressa no
cérebro foi desenvolvido por Tsien e cols., 1996. Camundongos que possuíam o gene do
receptor NMDA 1 flanqueado por sítios de lox/P foram cruzados com camundongos que
expressavam a Cre recombinase sob o controle específico do promotor da CaMKIIα, o
qual permite a expressão da enzima apenas no hipocampo. Assim, a prole gerada não
expressava o receptor apenas na região CA1 do hipocampo. Os estudos analisando a
potenciação de longa duração (LTP) dependente de NMDA mostraram que a falta da
expressão do receptor no hipocampo levou os animais nocaute a apresentarem
deficiências em tarefas que avaliam memória e aprendizado.
6. Modelos animais para estudos da disfunção colinérgica
23
A plasticidade sináptica em áreas específicas do cérebro vem sendo
estudada com o emprego de ferramentas farmacológicas e genéticas. Toxinas e drogas
foram inicialmente utilizadas, na tentativa de se lesar áreas específicas do cérebro. Há
diversos estudos que empregam imunotoxinas que lesam neurônios colinérgicos
(Miyagawa e cols., 2007; Quinlivan e cols., 2007; Ricceri e cols., 2004). A imunotoxina
192 IgG-Saporina vem sendo amplamente utilizada para analisar a importância dos
neurônios colinérgicos em funções de memória e aprendizado em ratos. Ela consiste de
um anticorpo monoclonal para o receptor do fator de crescimento neuronal NGFr (p75)
acoplado à proteína inativadora de ribossomo saporina. Os neurônios colinérgicos são
alvo desta toxina, pois expressam altos níveis de p75 (Yan e Johnson, 1988),
conseqüentemente a injeção intracerebroventricular da 192 IgG-Saporina induz
depleção colinérgica (Book e cols., 1994). Os trabalhos que avaliam funções cognitivas
do sistema colinérgico com o uso desta toxina mostram ligeiras alterações em tarefas
que envolvem memória espacial e aprendizado (Baxter e Gallagher, 1996; BergerSweeney e cols., 1994) e um déficit mais proeminente em tarefas não espaciais baseadas
no olfato como a transmissão social da preferência alimentar (Berger-Sweeney e cols.,
2000; Ricceri e cols., 2004).
Apesar de eficiente em lesar os neurônios colinérgicos, esta
imunotoxina é efetiva apenas para ratos e não se liga em células murinas. BergerSweeney e colaboradores em 2001 desenvolveram uma 192 IgG-Saporina para
camundongos. Os experimentos demonstraram que esta toxina não possui a mesma
potência da toxina de rato e altas doses reduziram quase 90% da atividade da ChAT,
mas perdeu-se a especificidade celular da lesão. Portanto, esta ferramenta deixa de ser
24
vantajosa pela falta de especificidade, já que estas drogas podem afetar também outros
grupos neuronais e tornar errônea a interpretação dos resultados.
Nos últimos anos, camundongos nocaute para componentes do
sistema colinérgico vêm sendo utilizados para estudar os mecanismos celulares que
mantêm a transmissão nervosa e influenciam funções superiores como memória e
aprendizado. Animais nocaute para a enzima colina acetiltransferase (ChAT) foram
gerados (Misgeld e cols., 2002; Brandon e cols., 2003). Os animais nocaute
homozigotos para a ChAT morrem ao nascer, provavelmente devido a uma ausência na
transmissão sináptica no músculo do diafragma. Os animais heterozigotos apresentam
uma redução em torno de 50% da atividade da ChAT nas diversas regiões cerebrais
(Brandon e cols., 2004). Na análise comportamental, observou-se que os animais
heterozigotos são aparentemente normais e não foram vistas alterações em tarefas que
envolvem funções motoras e cognitivas. Entretanto, foi demonstrado que a expressão do
CHT1 e concomitantemente, a captação de colina está aumentada nestes animais,
evidenciando um mecanismo compensatório que contribui para a manutenção da
neurotransmissão colinérgica nos animais heterozigotos para a ChAT (Brandon e cols.,
2004).
Animais nocaute para o transportador de colina de alta afinidade
(CHT1) também foram gerados (Fergunson e cols., 2004). Animais homozigotos
nascem morfologicamente normais, porém minutos após o nascimento tornam-se
imóveis e apresentam-se cianóticos, não sobrevivendo por mais de uma hora. Como os
camundongos homozigotos para a ChAT, os homozigotos para o CHT1 também
morrem de hipóxia por uma falha na neurotransmissão no diafragma e nos músculos
intercostais. Já os camundongos heterozigotos são viáveis e férteis, mesmo expressando
25
apenas 50% do transportador. A caracterização neuroquímica não apontou alterações na
atividade da ChAT nem na expressão do VAChT. Interessantemente, a captação de
colina foi similar entre heterozigotos e selvagens e análises cinéticas não apontaram
alteração no Km e Vmax do CHT1. Acredita-se que ocorra uma mobilização do pool
vesicular de CHT1 para a membrana a fim de sustentar a neurotransmissão (Fergunson
e cols., 2004).
A geração de camundongos nocaute para o VAChT não é exceção ao
que foi observado para os nocautes da ChAT e CHT1. Estes animais morrem poucos
minutos após o nascimento, possivelmente por asfixia (Castro e cols., dados não
publicados). O VAChT controla o último passo da armazenagem de acetilcolina e seria
um alvo ideal para interferência em neurônios colinérgicos. Embora animais
heterozigotos para a deleção do gene do transportador vesicular de acetilcolina possam
produzir informações importantes, o ideal seria podermos inativar o gene do
transportador de maneira restrita, temporal e espacialmente. Para isso o uso de técnicas
de recombinação genômica acoplados à tecnologia Cre/loxP são de grande importância.
Interessados em entender melhor o papel da ACh no cérebro, nosso
grupo vem se dedicando ao desenvolvimento de modelos animais com disfunção
colinérgica. Duas estratégias diferentes foram utilizadas: 1) interromper a região 5’ não
traduzida do VAChT para tentar interferir com a expressão do gene; 2) eliminar a
expressão do VAChT apenas em regiões específicas do cérebro (nocaute condicional).
Na primeira estratégia, um cassete de 3.8 Kb, contendo o gene de resistência ao
antibiótico neomicina e da enzima timidina cinase, foi inserido na região 5’ não
traduzida do gene do VAChT (Figura 6).
26
Figura 6: Esquema representativo da primeira estratégia utilizada na
geração de camundongos mutantes para o transportador vesicular de Acetilcolina
(VAChT). A) Organização gênica do VAChT com a janela aberta de leitura do
transportador “downstream” ao exon R da ChAT. B) Representação esquemática do
loco do VAChT nos animais selvagens (WT), o vetor construído para a recombinação
homóloga e o loco do VAChT após recombinação. A região 5’ não traduzida do
VAChT foi interrompida por uma seqüência de 3.8Kb. Este cassete contém o gene da
enzima timidina cinase (tk) e o gene de resistência ao antibiótico neomicina (neo). Sítios
de restrição relevantes são indicados (B: BamHI, X: XhoI, H: HindIII, N: NotI,).
Cabeças de setas indicam P1, P2 e P3 mostram as posições dos iniciadores usados para
genotipagem e as barras (probe) mostram a localização das sondas utilizadas no
Southern. A caixa DT mostra o cassete para o gene da toxina diftérica. Modificado de
Prado e cols., 2006.
27
Na segunda estratégia, o gene do VAChT foi flanqueado por dois
sítios de loxP (Figura 7). Os camundongos VAChTFlox/Flox (gene do VAChT flanqueado
por LoxP) foram cruzados com camundongos que expressam a Cre sob o controle do
promotor da cálcio calmodulina cinase IIα (Dragatsis e Zeitlin, 2000). Um fator
importante a ser considerado nos animais descendentes deste cruzamento é que a
expressão da Cre recombinase começa após o quinto dia de nascimento. Esta tática
poderia permitir que os animais possam ter um desenvolvimento embrionário normal
excluindo aberrações genéticas, mudanças adaptativas ou mesmo inviabilidade fetal.
Portanto, o gene do VAChT somente será inativado nos tecidos que expressam a Cre
após o nascimento. A caracterização bioquímica e comportamental desta segunda
linhagem permitirá uma análise refinada da importância da ACh no sistema nervoso
central.
28
pVATFLOX
probe
X H
B
A.
E B
H H
Alelo selvagem
do VAChT
H
VAChT
R
tk
VAChT
R
loxP
loxP
Long arm 3800bp
VAT2DET2S
floxed arm 3300bp
neo
PGK-DT
loxP
FseI
NdeI
PmeI
E B
AscI
X
Sse8387II
H
SpeI
X
NheI/Spe
Primer VTESGR
NotI
B.
X
Vetor
pVATFLOX
Short arm 1000 bp
VAT2DET1AS
Figura 7: Esquema representativo da segunda estratégia utilizada na
geração de camundongos mutantes para o VAChT. A) Organização gênica do
VAChT. B) Vetor construído para recombinação homóloga. O gene do transportador foi
flanqueado por sítios de loxP e o cassete contendo o gene de neomicina e timidina
cinase foi introduzido “downstream” ao gene do VAChT.
29
OBJETIVOS
Objetivo Geral
O objetivo principal deste projeto é o de compreender como alterações
na expressão do VAChT afetam a função colinérgica.
A) Objetivos específicos para os camundongos alterações na região 5’ não traduzida
1. Determinar se os animais gerados por recombinação homóloga apresentam a
expressão do gene do VAChT alterado;
2. Avaliar os níveis de expressão do VAChT, ChAT e CHT1 para determinar o grau
de disfunção colinérgica nestes animais;
3. Avaliar funcionalmente o sistema colinérgico desses animais;
B) Objetivos específicos para os camundongos nocaute condicionais
1. Investigar o sistema colinérgico nos animais que possuem o gene do VAChT
flanqueado por sítios de lox/P (VAChTFlox/Flox);
2. Cruzar os camundongos VAChTFlox/Flox com camundongos que expressam a Cre sob
controle do promotor da cálcio calmodulina cinase II (CaMKII) a fim de obter a
deleção do VAChT, preferencialmente, no cérebro;
31
3. Determinar se os animais VAChTFlox/Flox
CAMKIICre
tiveram o gene do VAChT
deletado;
4. Determinar em que regiões do sistema nervoso central a expressão do VAChT foi
alterada nos camundongos VAChTFlox/Flox CAMKIICre
32
MATERIAL E MÉTODOS
As técnicas de recombinação homóloga e geração dos camundongos
fundadores foram feitas pelo laboratório de animais transgênicos da Universidade Duke
pela professora Vânia Prado. Os protocolos foram realizados observando-se as normas
internacionais contidas no “GUIDE FOR THE CARE AND USE OF LABORATORY
ANIMALS” editado por “US NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (NIH
publication n:85 –23, revised 1996). Os estudos realizados com os camundongos
knockdown (KD) e nocaute condicional para o transportador vesicular de acetilcolina
(VAChT) foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da
Universidade Federal de Minas Gerais. Os animais utilizados pertenciam à terceira
geração de retrocruzamentos com C57BL/6 (N3).
1. Genotipagem dos camundongos
1.1) Extração de DNA genômico
Fragmentos da cauda ou da orelha dos camundongos foram
colocados em solução de lise (50mM Tris.HCl pH 8.0, 5mM EDTA; SDS 1%; NaCl
0,25M; proteinase K 0,125mg) e incubados a 55°C por 16 horas. Posteriormente, as
amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 10 minutos e realizou-se uma extração
com fenol: clorofórmio: álcool isoamínico. O DNA foi precipitado com 550μL de
isopropanol, ressuspendido em 200μL de água deionizada e deixado em banho-maria a
37°C até completa dissolução.
34
1.2) Southern Blotting e PCR
O DNA extraído foi utilizado para genotipagem dos camundongos
através de análise por Southern blotting e reação em cadeia da polimerase (PCR) para
confirmar a recombinação homóloga. As PCR foram feitas em um volume final de 20
μL por tubo, utilizando-se 2.5μL tampão Promega 10X (100mM KCl; 100mM
(NH4)2SO4; 200mM Tris-Cl, pH 8.75; 20mM MgSO4; 1% Triton X-100®; 1000μg/mL
BSA), 250 μM de dNTP, 2,5mM MgCl2, 0.6 μM dos iniciadores (Tabela 1 e 2), 0.4 U
de Taq polimerase (PROMEGA), 10% DMSO e 0.5 μL de DNA genômico.
Foram realizados 35 ciclos, sendo que cada ciclo consistiu-se de
desnaturação a 94°C por 3 minutos, anelamento dos iniciadores a 55°C por 45
segundos, seguido de extensão do DNA a 72°C por 1 minuto. Após os ciclos, fez-se
uma extensão final por 10 minutos a 72°C e os produtos amplificados foram colocados
a 4°C. As amostras amplificadas foram corridas em gel de agarose 0.7%.
Para as análises de Southern, 40 μL do DNA genômico foram
digeridos com 1μL da enzima de restrição BamH1(100u/μL) ou NdeI (20u/μL),
BSA1X, num volume total de 50 μL por 24 horas. Após a digestão, o DNA foi corrido
em gel de agarose 0,7% por 20 horas. Em seguida, o gel foi lavado 2x com solução A
(1.5M NaCl; 0.5M NaOH) por 30 minutos cada e 2x com solução B (1M acetato de
amônio; 20mM NaOH) por 30 minutos cada. O DNA foi transferido para uma
membrana de nylon (Gibco) por 16 horas e fixado à membrana através de exposição à
luz ultravioleta. A membrana foi bloqueada com solução de hibridização [6x SSC (NaCl
0,1M; 0,1M citrato trissódico), 5x solução Denhardt (0,01% Ficoll; 0,01%
polivinilpirrolidona; 0,01% albumina bovina) 0.5% SDS, 50% formamida e 100 µg/ml
35
Tabela 1: Iniciadores utilizados para genotipagem dos camundongos VAChT knockdown
Iniciador
Sequência
Tm
P1
5’ TCATAGCCCCAAGTGGAGGGAGA 3’
55°C
P2
5’-GGAACTTCCTGACTAGGGGAGGAG-3’
55°C
P3
5´-GGTTCATATCCCCGAGCTCAGGAG 3’
55°C
36
Tabela 2: Iniciadores utilizados para genotipagem dos camundongos nocaute condicionais
PCR
PCR1
Iniciador
Sequência
Tm
P2F
5’-ATTCGCCAATGACAAGACGCTGGG-3’
62.0ºC
P3F
5’-AAGGAGTTGGTTGGCCACAGTAAG-3’
59.3 ºC
P1F
5’-GTGTCTGTCTGTCCTTGTTTGAGT-3’
56.9 ºC
P4F
5’-TCATAGCCCCAAGTGGAGGGAGA-3’
58.2 ºC
CRE1
5’-GTCCAATTTACTGACCGTACACC-3’
55.5 ºC
CRER2
5’-CGACCGGCAAACGGACAGAAGC-3’
63.1 ºC
PCR2
37
de DNA de esperma de salmão] e hibridizada a 42°C com a sonda (fragmento XhoIHindIII-Ver tabela 1) marcado com
32
P, por 16 horas Em seguida, a membrana foi
lavada com solução 2x SSC; 0,1% SDS a temperatura ambiente por 15 minutos, lavada
com solução 0,2x SSC; 0,1%SDS a 60°C por 20 minutos e exposta em auto-radiografia
(Bio-Max KODAK) a -80°C por 4 a 7 dias.
Para a genotipagem por Southern-blot dos animais nocaute
condicionais, a sonda foi marcada com o kit AlkPhos DIRECT Labelling (Amersham).
Em suma, 40 μg do DNA genômico foram digeridos com 1μL da enzima de restrição
BamH1 (100u/μL) e 3 μL da enzima SacI (20 u/μL) em um volume total de 50μL por
24 horas. Ao término da digestão, as amostras foram transferidas para membrana de
nylon como descrito para os camundongos KD. Para a sonda, foi utilizado o fragmento
Nde/PmeI (ver tabela 2) que foi marcado de acordo com as recomendações do
fabricante.
2. Expressão de RNA mensageiro
2.1) Extração de RNA total
Medula espinal, estriado, tronco encefálico e rim dos camundongos
foram utilizados para a extração de RNA. Os tecidos foram triturados em nitrogênio
líquido e o RNA total extraído com Trizol (Invitrogene) de acordo com as instruções
do fabricante. Em suma, os tecidos foram solubilizados em trizol (1mL/100mg de
tecido) com o uso de um homogeneizador elétrico por 30 segundos e o homogenato
centrifugado a 12.000 xg por 15 minutos a 4°C. Ao sobrenadante, foi adicionado
clorofórmio (200μL/100mg tecido), misturado por inversão por 15 segundos e
38
incubado a temperatura ambiente por 3 minutos. A mistura foi então centrifugada a
12.000xg por 20 minutos a 4°C. Recuperou-se a fase aquosa e a esta adicionou-se
isopropanol (500μL/100mg tecido) para a precipitação do RNA. Centrifugou-se a
12.000xg por 15 minutos e o precipitado foi lavado com etanol 75% (1mL/100mg
tecido) e centrifugado a 7500xg por 5 minutos. O RNA foi ressuspendido em 60 μL
de água deionizada, previamente tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). Alíquotas
dos RNAs foram dosadas por espectrofotometria.
2.2) Purificação de RNA mensageiro
A purificação do RNA mensageiro foi realizada usando o kit Poly(A)
Purist™ mRNA Purification (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante.
Resumidamente, 500 μg de RNA total foram precipitados com 0,1volumes de acetato
de amônio 5M, 1μL de glicogênio (5mg/mL) e 2,5volumes de etanol 100%, incubados a
-80°C por 30 minutos e centrifugados a 12.000xg por 30 minutos a 4°C. Em seguida,
adicionou-se 1mL de etanol 75% ao precipitado e centrifugou-se a 12.000xg por 10
minutos a 4°C. O precipitado foi então ressuspendido em 250 μL de água e adicionouse o mesmo volume de “binding solution”, misturando vigorosamente. À cada solução,
foi adicionado a resina ligada com oligo-dT, e incubou-se a mistura a 65°C por 5
minutos, sendo em seguida, mantida sob agitação constante a temperatura ambiente. Ao
término da incubação, centrifugou-se a mistura a 4000xg por 3 minutos. A resina oligodT foi ressuspendida com 500μL de “wash solution 1”, transferida para uma coluna e
centrifugada a 4000xg por 3 minutos. O processo de lavagem com esta solução foi
realizado 2 vezes. Este mesmo procedimento de lavagem foi realizado com o “wash
solution 2”. A coluna foi então transferida para um tubo de 1.5mL, adicionou-se 100μL
39
de “storage solution” aquecida a 65°C e centrifugou-se a 5000xg por 2 minutos para
eluir o RNA mensageiro, sendo o passo de eluição realizado duas vezes. Em seguida, o
RNA mensageiro foi precipitado e lavado de acordo com o procedimento descrito
inicialmente. O RNA mensageiro foi ressuspendido em 11μL de água e dosado por
espectrofotometria.
Dez microgramas do RNA mensageiro foram corridos em gel
desnaturante de agarose 1% (Lehrach e cols., 1977) e transferidos para membrana de
Nylon por 4 horas em tampão de transferência seguindo as recomendações do kit
NorthernMax (Ambion).
2.3) Northern Blotting
Para os experimentos de northern-blotting, foi utilizado o kit
NorthernMax (Ambion). A membrana foi incubada com a solução de hibridização
(ultrahyb) por 30 minutos a 42°C e incubada com a sonda de interesse (VAChT, CHT1,
ChAT ou actina) marcada com
32
P por 16 horas a 42°C. Em seguida, a membrana foi
lavada 2 vezes com solução 2x SSC; 0,1% SDS a temperatura ambiente e 2 vezes com
solução 0,1X SSC; 0,1% SDS a 42°C por 15 minutos. Após as lavagens, a membrana
foi exposta em auto-radiografia a -80°C. As auto-radiografias foram digitalizadas com o
uso do densitômetro GS-700 (Bio-Rad) e a intensidade da marcação quantificada com o
uso do programa Multi-Analyst (Bio-Rad). Para a análise estatística, utilizou-se
ANOVA de uma via com post-hoc de Bonferroni, sendo considerados valores
significativos aqueles com p<0.05.
40
2.4) PCR em tempo real
2.4.1) Tratamento com Dnase I
Amostras de RNA total foram tratadas com DNAse I (Ambion). As
amostras foram diluídas para uma concentração de 10μg/50μL, adicionou-se
0.1volumes de tampão da DNAse 10X e 0.5μL da enzima. Após 30 minutos de
incubação a 37°C adicionou-se mais 0.5μL da DNase I e, novamente, incubou-se
por 30 minutos a 37°C. Ao término da incubação, foram adicionados 0.1 volumes de
reagente inativador de DNase e manteve-se a reação por 2 minutos a temperatura
ambiente. As amostras foram centrifugadas a 10.000xg por 2 minutos a temperatura
ambiente, recolheu-se o sobrenadante e o RNA foi novamente quantificado.
2.4.2) Síntese de cDNA
A síntese de cDNA foi realizada com o kit SuperScriptTM III FirstStrand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogene) de acordo com as especificações do
fabricante. Resumidamente, cerca de 1 μg de RNA foi misturado a 1μL de oligo-dT e
1μL de dNTPs em um volume total de 10 μL, incubados a 65°C por 5 minutos e
resfriado no gelo por cerca de 2 minutos. Seguiu-se à incubação das amostras em uma
mistura contendo tampão da transcriptase reversa 1X, 0,01M DTT, 5mM MgCl2 e 40
unidades do inibidor da ribonuclease recombinante Rnase OUTTM(40u/μL). Esta reação
foi mantida em banho-maria a 42°C por 2 minutos e posteriormente, colocada no gelo.
Adicionou-se 200 unidades da transcriptase reversa (200u/ μL) às amostras e estas
foram incubadas a 42°C por 50 minutos, em seguida a 70°C por 15 minutos. Ao final da
reação de transcrição reversa, adicionou-se 20 unidades de Rnase H (2u/μL) e as
41
amostras foram mantidas em banho-maria a 37°C por 20 minutos. Em toda a reação de
síntese de cDNA foi realizado um controle negativo em que a transcriptase reversa não
foi adicionada.
2.4.3) Reação de PCR em tempo real
Foram desenhados iniciadores para analisar a expressão de RNA
mensageiro do VAChT, ChAT e CHT1. Sempre que possível, os iniciadores foram
desenhados a partir de diferentes exons a fim de evitar amplificação de DNA genômico.
No caso do VAChT, isso não foi possível pois a janela aberta de leitura do transportador
está contida em um único exon. As reações de PCR em tempo real foram corridas em
termociclador da Applied Biosystem modelo7500 usando o corante fluorescente SYBR
Green I. As reações foram realizadas em volume final de 20 μL em que se adicionou
10,0 μL de SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystem), 0,5μM de cada
iniciador e 1μL da amostra de cDNA original diluída quatro vezes. Foram realizados 40
ciclos, consistindo de desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento dos iniciadores
(TABELA 3) por 30 segundos e extensão a 72°C por 30 segundos. A fluorescência foi
medida em cada ciclo. Após o último ciclo, a especificidade da PCR foi checada pela
análise da curva de “melting” para todas as amostras. Em todas as corridas, foram
utilizados controles negativos com amostras em que não foi adicionada a transcriptase
reversa. Adicionalmente, os produtos de amplificação foram corridos em gel de
acrilamida 6.5% e corados com nitrato de prata. Para a confirmação da especificidade
da amplificação os produtos foram clonados em vetor TOPO (TOPO TA Cloning–
Iinvitrogen) e seqüenciados.
42
Tabela 3: Iniciadores desenhados para PCR em tempo real
Gene
Par de Iniciadores
Tm °C
ChATF2 5’-CATCTTCTGGCACTGAGGGAGCTG-3’
68
ChATR2 5’-CGTGAAAGCTGGAGATGCAGAAGG-3’
69
Actin F 5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGA-3’
68
ChAT
Fragmento pb
240
Actina
120
Actin R 5’-AATGCCTGGGTACATGGTGGTA-3’
SUPERVACHT F : 5’ - GGC ATT GCC ATG ATC GCC GAC AAG - 3’
VAChT
SUPERVACHT R: 5’ - GTC GAA GAG CGA CAC GGC GGC GAG - 3’
CHT1RTF 5’-CGGCGAGTTCTATGTTTGCTCGG-3’
63
75
180
65
69
CHT1
191
CHT1RTR 5’-GATGATGATGTAGACAAGGTCAG-3’
56
43
3. Expressão Protéica
3.1) Western Blotting
Após dissecação, os tecidos dos camundongos foram congelados
rapidamente em gelo seco/etanol e mantidos a -80°C até a utilização. Para preparar o
extrato bruto protéico, os tecidos foram homogeneizados em tampão de lise (10 mM
Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% triton e coquetel de inibidores de
protease (Sigma) e mantidos no gelo por 15 minutos. Após centrifugação a 10.000xg
por 20 minutos a 4°C, o sobrenadante foi recolhido e o conteúdo protéico dosado pelo
método de Bradford (Bradford, 1976). Em cada dosagem, uma curva padrão de
calibração com BSA (1 a 30 μg) foi utilizada.
Amostras de 50 a 100 microgramas de extrato bruto foram resolvidas
em gel de SDS-PAGE de acordo com Laemmli e cols., 1970. As amostras foram
misturadas ao tampão de amostra 2X (SDS 0,2% (p/v), glicerol 0,2% (v/v), 2mercaptoetanol 0,32% (v/v), azul de bromofenol 0,0001% (p/v) e Tris-HCl 12,5mM, pH
6.8, aquecidas a 37°C por 15 minutos e aplicadas em gel SDS-PAGE 4-12%
(Invitrogene).
O Western blotting foi realizado como descrito por Towbin e cols.,
1979. Ao término da eletroforese, o gel foi lavado em tampão de transferência (48mM
Tris; 39mM glicina; 20% metanol (v/v); 0,13mM SDS) e montado um sanduíche com
papéis Watmamm 1 e membrana de PVDF (Amersham) previamente molhada em
metanol. A transferência foi realizada a 24V, 300mA, por 2 horas e em seguida, a
membrana foi incubada por uma hora com TBS (137mM NaCl; 20mM Tris.HCl; pH
7.6); Tween 0,1% (v/v) e 5% de leite desnatado (Molico). Adicionou-se o anticorpo e
44
incubou-se por 1 hora. A membrana foi então lavada 3 vezes, 10 minutos cada lavagem,
com TBS/Tween e incubada 1 hora com o anticorpo secundário conjugado com
peroxidase diluído em TBS/Tween e leite. Ao término da incubação, o processo de
lavagem foi repetido. Os anticorpos utilizados foram anti-VAChT 1:1000 (Phoenix
Pharmaceuticals, Belmont California), anti-sinaptofisina 1:3000 (Sigma Chemical Co.,
SP, Brazil), anti-Sinaptotagmina 1:30.000 (Synaptic Systems Gottingen, Germany),
anti-actina 1:10.000 (Chemicon, California, USA) e Anti-Sintaxina 1:30.000 (Sigma).
A detecção foi realizada pelo processo de quimioluminescência,
utilizando o kit ECLTM (Amersham). Após sensibilização do filme de raio X, este foi
revelado com o revelador e fixador GBX-KODAK. As auto-radiografias foram
digitalizadas com o uso do densitômetro (Bio-Rad) e analisadas com o software MultiAnalyst (Bio-Rad). As análises foram realizadas utilizando a actina para normalizar os
dados. Para alguns resultados, a detecção da quimioluminescência foi realizada com o
aparelho ImageQuant (GE Helthcare).
3.2) Imunofluorescência
Os experimentos de imunofluorescência foram realizados em animais
KD e controles adultos e em animais nocaute condicionais e controles com 18 dias de
vida ou 8 semanas.
Os camundongos foram anestesiados com ketamina/xilazina (70/10
mg/kg) i.p., uma cânula introduzida no ventrículo esquerdo e perfundiu-se PBS pH 7.4
gelado por 10 minutos. Em seguida, perfundiu-se 4% de paraformaldeído em PBS pH
7.4 (PFA) durante mais 10 minutos. Cérebro, medula espinal, diafragma e os músculos
soleus, gastrocnêmio e tibialis foram imediatamente pós-fixados em 4% PFA por 24
45
horas a 4°C. Os tecidos foram crioprotegidos em solução 4% de paraformaldeído com
10% de sacarose por 6 horas a 4°C, rapidamente congelados em isopentano/gelo seco e
armazenados a -80 °C. Fatias seriais de 40 µm de espessura foram cortadas usando um
criostato (Micron) e armazenadas em PBS gelado até a utilização.
Para a imunodetecção no cérebro, as fatias foram permeabilizadas em
solução 1,2% de Triton/PBS por 20 minutos, lavadas em PBS e em seguida bloqueadas
por 1 hora em PBS contendo 10% de soro normal de cabra. Os tecidos foram em
seguida incubados com os respectivos anticorpos primários em tampão de incubação
(2% soro normal de cabra; 0.2% Triton em PBS) por 48 horas a 4°C. Os anticorpos
primários utilizados foram: VAChT (rabbit polyclonal, 1:250, Sigma Chem. Co., São
Paulo, Brazil) e CHT1 (rabbit polyclonal 1:250, gentilmente fornecido por R. Jane
Rylett, University of Western Ontario, London, Canada).
Após lavar os tecidos 3 vezes com PBS, 20 minutos cada, as fatias
foram incubadas com Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit (1:500, Molecular Probes) em
tampão de incubação por 1 hora a temperatura ambiente. Os tecidos foram novamente
lavados e incubados com o marcador de núcleo DAPI (1:1000) por 10 minutos a
temperatura ambiente. As fatias foram montadas em lâminas carregadas e cobertas com
ProLong® Gold antifade reagent (Invitrogen, SP, Brazil) e lamínula.
A imunofluorescência do músculo diafragma foi realizada de acordo
com o protocolo descrito por Brandon e cols., 2003. Em suma, os diafragmas inteiros
foram lavados em PBS e incubados por 1 hora em solução 0,1M de glicina em PBS pH
7.4. Após a lavagem em PBS, os músculos foram incubados por 30 minutos em PBS
contendo 0.5% de Triton X-100 e bloqueados por 18 horas em solução de bloqueio
(0,15M NaCl; 0,01M tampão fosfato; 3% albumina bovina; 5% soro normal de cabra;
5% soro de burro e 0,01% de timerosal). Ao término do bloqueio, os tecidos foram
46
incubados com os anticorpos primários em solução de bloqueio por 48 horas a 4°C. Os
músculos foram então lavados 3 vezes em PBS contendo 0.5% de Triton uma hora cada,
e incubados por 18 horas em solução de bloqueio contendo α-bungarotoxina conjugada
com Alexa Flúor 555 e Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit (Molecular Probes) a 4°C.
Novamente, os tecidos foram lavados, incubados com DAPI por 10 minutos e montados
em lâminas carregadas.
As imagens foram adquiridas em microscópio Axiovert 200M
usando o sistema ApoTome para obter as seções ópticas de cada tecido. As objetivas
utilizadas foram 20x seca, 40X imersão em água (1.2 NA) e 63x de imersão em óleo
(1.4 NA). Alternativamente, algumas imagens foram feitas com microscópio confocal
Leica SP5.
A análise da intensidade de fluorescência foi realizada o programa
Image J (NIH image tool). As imagens foram convertidas para “grayscale” e um limiar
(threshold) de intensidade de fluorescência foi aplicado em cada imagem baseado na
média dos limiares automaticamente obtidos para cada imagem.
A intensidade total da fluorescência no campo foi detectada
automaticamente pelo programa e normalizada pela intensidade da fluorescência de
fatias seriadas imunomarcadas com o anticorpo anti-CHT1. A fluorescência
normalizada foi dividida pela área da imagem. Posteriormente, realizou-se a análise
estatística ANOVA de uma via com post-hoc Bonferroni.
4 Dosagem de Acetilcolina nos tecidos
47
A dosagem de acetilcolina nos tecidos foi realizada de acordo com o
método descrito por Israel e Lesbats (1980). O córtex cerebral, estriado e hipocampo
foram rapidamente dissecados e a ACh contida no tecido foi extraída com ácido
tricloroacético (TCA) 5%. Os homogenatos foram centrifugados a 10.000xg por 10
minutos a 4°C e os sobrenadantes congelados a -80°C até o uso. A determinação da
acetilcolina foi realizada essencialmente como foi descrito por Prado e cols., 1990. Em
resumo, o TCA da amostra foi removido com 5 volumes de uma solução de éter
saturada com água e o éter residual evaporado em Speed vac (Eppendorf). Adicionou-se
10μL de metaperiodato 0,5% para cada 100μL de amostra. A quantificação da
acetilcolina foi realizada em luminômetro (Bio-Orbit 1250), em que 40 a 50 microlitros
da amostra foram incubados em solução contendo (7,5μL de colina oxidase (200u/mL),
11μL de microperoxidase (1mg/mL), 20μL luminol 1mM e 0.94mL tampão glicina
67mM,
pH
8.6).
Após
estabilização
do
aparelho,
adicionou-se
a
enzima
acetilcolinesterase (80u/mL) e o pico de luz obtido foi medido pelo luminômetro.
As dosagens foram feitas em quadruplicatas e, para cada replicata, foi
feita uma curva padrão com concentrações conhecidas de acetilcolina. Os valores foram
corrigidos pelo conteúdo protéico.
5 Liberação de ACh
Os experimentos de eletrofisiologia para avaliar a liberação de acetilcolina
na junção neuromuscular dos camundongos foram realizados em colaboração com
Ricardo de Freitas do Laboratório de Eletrofisiologia da UFMG. Já os ensaios de
microdiálise in vivo para medir a liberação de acetilcolina no cérebro foram realizados
48
por Raul Gainetdinov na Universidade Duke. Para detalhes dos protocolos vide Prado e
cols., 2006.
6 Medida da atividade da colina acetiltransferase (ChAT) in vitro
A atividade da ChAT foi medida de acordo com a metodologia
descrita anteriormente por (Issa e cols., 1996; Fonnum, 1966). Os tecidos das regiões do
córtex, hipocampo e estriado, após a dissecação, foram homogeneizados 10% (p/v) em
40 mM de tampão fosfato (pH 7.4), 200 mM NaCl, 0.5 % Triton X-100. 15μL dos
extratos foram incubados com 35μL de tampão de incubação (300mM NaCl; 28mM
PO4, pH 7.4; 0,2mM Neostigmina, 12.5mM cloreto de colina; 0.5mg/mL BSA; 0.35%
Triton X-100; 0.25 mM [acetil-1-C14] acetil-CoA) (GE Healthcare, SP, Brazil) por 10
minutos a 37°C. Ao término da incubação, as amostras foram colocadas no gelo e
adicionou-se 350 μL de solução 10mM PO4, pH 7.4; 0.2mM acetilcolina. A
14C
acetilcolina formada foi recuperada pela extração com tetrafenilboro em butirilnitrila
(10mg/mL) e a radioatividade foi medida em contador de cintiliação líquida (Packard –
PerkinElmer Life Science, Boston, MA, USA).
7 Transporte de colina in vitro
Para se determinar a captação de colina de alta afinidade realizada
pelo CHT1, a região do córtex cerebral foi homogeneizada 10% (p/v) em solução
0,32M de sacarose; 10mM Hepes, pH 7.4 e o homogenato centrifugado a 900xg por 10
49
minutos a 4°C. O sobrenadante (S1) foi centrifugado a 12.000xg por 20 minutos a 4°C e
o sinaptosoma (P2) foi lavado com sacarose e centrifugado novamente a 12.000xg por
20 minutos a 4°C. O conteúdo protéico foi determinado pelo método de Lorry (1951).
400 microgramas de sinaptosomas foram incubados em solução Krebs-HEPES (100nM
3H
colina (Amersham), NaCl 124mM, KCl 4mM, MgSO4 1.2mM, CaCl2 1.0mM, glicose
10mM, HEPES 25mM) previamente aquecida a 30°C e incubadas por 3 minutos para
promover a captação de colina. Para determinação do transporte de colina de baixa
afinidade trocou-se Na+ por Li+, ou adicionou-se 1μM de hemicolinium-3 (Sigma).
Ao término da incubação, as amostras foram colocadas no gelo e
adicionou-se 2mL de sacarose 0,32M gelada. Posteriormente, as amostras foram
filtradas em filtros GF/A (Whatman) em rampa de filtração a vácuo e lavadas com
sacarose 0,32M e cloreto de colina 50μM gelada. Ao término de 4 lavagens, os filtros
foram deixados secar a temperatura ambiente e adicionou-se 3mL de líquido de
cintilação para a medida da radioatividade. Os resultados foram expressos em
porcentagem de captação de colina em relação ao controle WT.
8 Testes comportamentais
Os testes comportamentais foram realizados em colaboração com
Bráulio Marcone de Castro e Xavier de Jaeger.
8.1) Wire Hang
Os experimentos de “wire-hang” foram realizados conforme descrito
por Sango e cols. em 1996. Os animais foram habituados à sala de experimentação e
manipulados pelo experimentador pelos menos duas horas antes do experimento. Como
50
aparato, foi utilizada uma grade metálica com espaçamento de 1 cm entre barras de 0,8
mm de diâmetro. Inicialmente, o animal foi colocado sobre a grade, a qual foi
brevemente agitada para que o animal a agarrasse. A grade foi então invertida e mantida
20 cm acima de uma caixa preenchida com maravalha. Uma altura suficiente para fazer
com que o animal se mantenha agarrado à grade, mas incapaz de feri-lo durante a
queda.
8.2) Footprint
O teste do perfil de pegada foi realizado de acordo com o protocolo
descrito por Brandon e cols., 1998). As patas traseiras dos camundongos foram
molhadas com tinta nanquim e estes animais submetidos a uma caminhada em um túnel
(9,2 x 6,3 x 35,5 cm). Os passos executados no percurso foram registrados em uma
cartolina branca colocada no chão do túnel. A largura das passadas foi determinada
medindo-se a distância entre as pegadas consecutivas de uma mesma perna.
51
RESULTADOS
Camundongos VAChT com recombinação na região
5’ não traduzida
1) Genotipagem dos camundongos
A técnica de recombinação homóloga foi utilizada pelo nosso grupo
de pesquisa com o objetivo de gerar animais com disfunção colinérgica. Os animais
com loco gênico recombinado possuem um cassete de 3.8Kb com os genes para
resistência ao antibiótico neomicina (neo) e para a enzima timidina cinase (tk) inserido
na região 5’ não traduzida do gene do VAChT (Figura 6). A genotipagem inicial dos
camundongos foi feita por Southern blotting. O DNA genômico extraído de um
fragmento da cauda dos animais foi digerido com a enzima de restrição Bam HI,
corrido em gel de agarose 0,7% e transferido para membrana de nylon. Utilizou-se o
fragmento XhoI/HindIII marcado com 32P como sonda (ver figura 6 para detalhes sobre
região de anelamento da sonda). Como pode ser observado na Figura 8A o alelo
recombinante apresentou uma banda de aproximadamente 8.8Kb enquanto o alelo
selvagem (WT) apresentou uma banda de 10Kb, confirmando a alteração gênica nessa
linhagem de animais.
Rotineiramente, os animais utilizados nos experimentos foram
genotipados por PCR. Para a reação de PCR da genotipagem são empregados 3
iniciadores (tabela 1). Os iniciadores P1 e P3 anelam-se na região do gene do VAChT
que flanqueia o local de inserção do cassete de neomicina (Figura 6). No alelo selvagem
esse par de iniciadores permite a amplificação de um fragmento de DNA de 330 pares
de base. Esses dois pares de iniciadores podem também se anelar no alelo mutado,
53
A)
B)
Figura 8: Genotipagem dos camundongos VAChT mutantes. A) Análise de
Southern. O alelo selvagem do VAChT não sofreu recombinação (WT) gera uma
banda de 10Kb enquanto o alelo mutante gera uma banda de 8.8Kb. Coluna 1
(Camundongo homozigoto), coluna 2 (Camundongo heterozigoto) e coluna 3
(Camundongo selvagem). B) PCR para genotipagem dos camundongos. Utilizando
uma amplificação com 3 iniciadores foi possível distinguir o alelo selvagem do alelo
recombinado do VAChT. Animais selvagens geram um fragmento de 330pb, ao passo
que os animais mutantes produzem uma banda de 530pb. Coluna 1 (Heterozigoto),
coluna 2 (WT), coluna 3 (Homozigoto) e coluna 4 controle negativo.
54
entretanto nesse alelo nenhum produto de amplificação é gerado pois os iniciadores
estão separados em mais de 4,0 Kb devido à presença do cassete de neomicina e as
condições da reação de PCR inviabilizam a amplificação de fragmentos maiores que
1Kb. O alelo mutado é amplificado pelos iniciadores P1 e P2 (anela-se no cassete de
neomicina) gerando um fragmento de 530 pares de base (Figura 6). Portanto, quando
utilizamos esses 3 iniciadores na reação de PCR, os animais selvagens (WT) amplificam
um fragmento de 330 pb, os camundongos mutados homozigotos amplificam uma
banda de 530pb e os heterozigotos amplificam as duas bandas (Figura 8B).
2) Análise dos níveis de transcrição do VAChT e outros
marcadores colinérgicos
2.1) Análise por Northern-blot
Para avaliar os níveis de expressão dos RNAs mensageiros (mRNA)
do VAChT no cérebro dos camundongos modificados geneticamente uma das
metodologias utilizadas foi a de Northern-blot. As análises foram feitas utilizando-se
como sonda um fragmento de 900pb correpondente à sequência 5’ do cDNA do
transportador. Esta sonda identificou duas espécies mais abundantes de mRNA do
VAChT previamente descritas (Bejanin e cols., 1994), uma de 2.6Kb (V1) e outra de
3.0Kb (V2). A principal espécie de mRNA, V1, mostrou-se reduzida em torno de 40%
nos camundongos heterozigotos enquanto nos animais homozigotos a redução foi em
torno de 70% (Figura 9). Esta redução foi observada em todas as regiões do SNC
analisadas. Interessantemente, a espécie V2 de mRNA do VAChT, apresentou aumento
em seus níveis transcricionais, principalmente nos animais homozigotos. Estes
55
Medula espinal
Tronco encefálico
Estriado
Rim
Actina
Figura 9: Análise dos níveis de RNA mensageiro dos animais VAChT mutantes: A) Membranas de PVDF contendo 5 a 10 microgramas de
RNA mensageiro das regiões da medula espinal, tronco encefálico, estriado e rim foram hibridizadas sequencialmente com sondas radioativas
para VAChT, CHT1, ChAT e actina, respectivamente. Foi observado um decréscimo em torno de 40% no RNA mensageiro V1 nos animais
heterozigotos (canaletas 2) e 70% nos animais homozigotos (canaletas 3), respectivamente. Canaletas 1 (WT).
56
resultados sugerem a existência de um provável mecanismo transcricional
compensatório. Já as outras espécies de mRNA para o VAChT identificadas por RTPCR (Bejanin e cols., 1994) não foram detectadas, provavelmente por serem pouco
abundantes.
A expressão de RNA mensageiro de outros componentes do sistema
colinérgico também foi testada. Como pode ser observado (Figura 9), a sonda para a
ChAT reconheceu uma banda de aproximadamente 3.8Kb em todas as regiões do
cérebro analisadas, correspondente ao RNA mensageiro para a ChAT (Pedersen e cols.,
1995; Blusztajn e Berse, 1995). Para o CHT1, o resultado observado foi uma banda de
aproximadamente 5.0Kb com tamanho correspondente ao descrito na literatura (Okuda
e cols., 2000). A análise estatística ANOVA de uma via, demonstrou que não houve
diferença significativa nos níveis de expressão de RNA mensageiro para a ChAT
[F(2,21)=1,725] e para o CHT1 [F(2,21)=2,842] entre os genótipos. Esse resultado
sugere que embora a recombinação homóloga tenha alterado a expressão do VAChT, a
expressão da ChAT e CHT1 não foi afetada. Esse dado é relevante devido ao arranjo
genômico entre ChAT e VAChT. A reatividade do mRNA da actina foi usada para
normalizar a quantidade de RNA aplicada no gel.
Como controle da especificidade das sondas, utilizou-se RNA
mensageiro de rim. Como pode ser observado (Figura 9), não houve reatividade para
VAChT, ChAT e CHT1, já que estes componentes colinérgicos não são expressos nos
rins. Diferentemente, observa-se reatividade para actina que é ubiquamente expressa em
todos os tecidos.
2.2) Análise da expressão gênica por PCR em tempo real
57
Adicionalmente à análise dos níveis de expressão de mRNA por
Northern blotting, utilizou-se também uma quantificação da expressão gênica pela
amplificação em cadeia da polimerase em tempo real. Esta técnica é mais sensível e
possibilita a detecção de variações sutis na expressão gênica (Bustin., 2002).
A análise quantitativa comparativa (delta-delta) (Pfaffl e cols., 2002)
mostrou uma redução significativa na expressão do mRNA do VAChT na medula
espinal nos animais modificados geneticamente. A expressão do mRNA do VAChT nos
animais heterozigotos foi reduzida em 45% enquanto a expressão do VAChT nos
animais homozigotos foi reduzida em torno de 70% quando comparada à expressão dos
camundongos selvagens (WT) (Figura 10).
A quantificação da expressão de mRNA da enzima ChAT foi
realizada nas regiões da medula espinal, tronco encefálico e estriado. A análise não
apontou alteração na expressão gênica da enzima ChAT (Figura 11) dos animais
VAChT mutantes em relação aos camundongos selvagens (WT). Foi realizada também
a quantificação da expressão de mRNA do CHT1 na região do tronco encefálico e não
foram observadas modificações na expressão gênica do transportador de colina entre os
genótipos (Figura 12) confirmando os dados anteriormente obtidos com Northern
blotting.
A especificidade da reação foi confirmada pela análise da curva de
“melting”. Houve a presença de um pico único, em torno de 85°C, demonstrando que a
reação de PCR gerou apenas um produto e este resultado foi confirmado com a corrida
dos produtos amplificados em gel de acrilamida.
3) Análise da expressão protéica do VAChT no cérebro
3.1- Análise por Western Blot
58
Expressão de RNA mensageiro doVAChT (% do controlel)
120
100
80
60
40
***
***
20
0
Figura 10: Quantificação por PCR em tempo real da expressão de mRNA do
VAChT nos camundongos VAChT mutantes. Amostras de RNA extraídas da região
da medula espinal dos camundongos mutantes e controles selvagem foram submetidas à
transcrição reversa para a produção de cDNA. Para a reação de PCR em tempo real
foram utilizados iniciadores específicos para o gene do VAChT que produziu um
fragmento de aproximadamente 200 pb. O gráfico representa a média de 5 experimentos
±erro padrão da média. A análise ANOVA de uma via com post hoc Bonferroni
apontou diferença estatisticamente significativa nos níveis transcricionais do mRNA do
transportador nos animais mutantes [F(2,11) = 31,48]. *** Estatisticamente
significativo em relação ao WT. ***p<0,0001. Barra branca (Selvagem), barra cinza
(Heterozigoto) e barra preta (Homozigoto).
59
Medula
espinal
Tronco
encefálico
estriado
Figura 11: Quantificação por PCR em tempo real da expressão do mRNA
da ChAT nos camundongos VAChT mutantes. Amostras de RNA extraídas das
regiões da medula espinal, tronco encefálico e estriado dos camundongos mutantes e
controles selvagem foram submetidas à transcrição reversa para a produção de cDNA.
Para a reação de PCR em tempo real foram utilizados iniciadores específicos para o
gene da colina acetiltransferase (ChAT) que produziu um fragmento esperado de
aproximadamente 200 pb. O gráfico representa a média de 4 experimentos ±erro padrão
da média. A análise ANOVA de uma via com post hoc Bonferroni não apontou
diferenças estatisticamente significativas nos níveis transcricionais desta enzima nos
animais mutantes [F(2,12)= 0,9847] para medula espinal, [F(2,6)=1,161] para tronco
encefálico e [F(2,6)=1,561] para estriado, respectivamente. Barra branca (Selvagem),
barra cinza (Heterozigoto) e barra preta (Homozigoto).
60
Expressão de RNA mensageiro para CHT1 (% do controle)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Figura 12: Quantificação por PCR em tempo real da expressão de mRNA do
CHT1 dos camundongos VAChT mutantes. Amostras de RNA extraídas da região da
medula espinal dos camundongos modificados geneticamente e controles selvagem
foram submetidas à transcrição reversa para a produção de cDNA. Para a reação de
PCR foram utilizados iniciadores específicos para o gene do transportador de colina de
alta afinidade (CHT1) que produziu um fragmento esperado de aproximadamente 200
pb. O gráfico representa a média de 3 experimentos ±erro padrão da média. A análise
ANOVA de uma via com post hoc Bonferroni não apontou diferenças estatisticamente
significativas nos níveis transcricionais desta enzima nos animais mutantes [F(2,6)=
0,01787]. Barra branca (Selvagem), barra cinza (Heterozigoto) e barra preta
(Homozigoto).
61
Para analisar as conseqüências da alteração na expressão do mRNA
do VAChT, nós investigamos a expressão da proteína do transportador por imunoblot.
O anticorpo anti-VAChT reconheceu especificamente uma banda de aproximadamente
70 Kda, massa molecular esperada para o transportador (Figura 13).
A análise densitométrica mostrou que os animais heterozigotos
expressam aproximadamente 56 ± 4% do VAChT, sendo esta redução observada em
todas as regiões analisadas, indicando uma deficiência significativa da proteína do
VAChT nestes animais. Já os animais homozigotos possuem uma redução ainda maior
na expressão protéica e a análise quantitativa demonstrou que estes camundongos
expressam apenas 35% do VAChT. Esses resultados nos indicam que a inserção do
cassete de 3.8 Kb (contendo o gene de resistência à neomicina e o gene da enzima
timidina cinase) na região 5’ não traduzida do gene do VAChT provocou uma redução
da expressão do transportador em todos os tecidos dos animais, nós portanto
denominamos esses camundongos VAChT knockdown (KD).
Para investigar se a redução da expressão do VAChT foi específica, nós
avaliamos também a expressão protéica de outras proteínas do terminal pré-sináptico. O
imunoblot para sinaptofisina, uma proteína de vesícula sináptica, não apontou nenhuma
alteração nos níveis protéicos entre os genótipos. O mesmo resultado foi obtido quando
se analisou a expressão protéica da sintaxina, uma proteína do complexo SNARE
presente na membrana pré-sináptica. Em todas as análises, a imunorreatividade da
actina foi utilizada para normalizar as quantidades de extrato aplicadas no gel.
3.2) Análise por Imunofluorescência em fatia
62
Figura 13: Análise da expressão protéica do VAChT e outras proteínas pré-sinápticas nos camundongos mutantes. Análise por
imunoblot de VAChT, Sinaptofisina, Sintaxina e actina nas regiões do córtex cerebral (A), estriado (B), medula espinal (C) e hipocampo (D) dos
animais WT (1), KDHET (2) e KDHOM (3). E) Análise densitométrica de 4-8 membranas de cada região reveladas com o anticorpo contra o VAChT,
mostrando a redução da expressão da proteína do transportador entre os animais KD em relação aos animais controle. (*) Estatisticamente
significativo em relação ao WT. (#) KDHOM é estatisticamente diferente do KDHET.
63
Adicionalmente, investigamos a expressão protéica do VAChT em
fatias de cérebro utilizando a técnica de imunofluorescência. Fatias seriais foram
incubadas com os anticorpos anti-VAChT e anti-CHT1. As regiões do hipocampo e
córtex cerebral não possuem corpos de neurônios colinérgicos, entretanto recebem
várias projeções colinérgicas oriundas do prosencéfalo basal (Mesulan, 1993). A figura
14A nos mostra a imunorreatividade do VAChT na região CA1 do hipocampo, onde
podemos observar uma forte marcação das terminações nervosas colinérgicas nos
camundongos selvagens. No entanto, foi observada uma redução da imunorreatividade
do VAChT nas terminações colinérgicas dos camundongos KDHET e esta redução foi
mais pronunciada nos camundongos KDHOM (Figura 14A). A figura 14B mostra que não
houve alterações aparentes na expressão do CHT1 no hipocampo nas fatias seriais.
A quantificação da fluorescência nas fatias de hipocampo foi
realizada utilizando o programa Image J (NIH image tool). A intensidade de
fluorescência foi detectada automaticamente pelo programa e normalizada pela
intensidade de fluorescência do CHT1. A quantificação mostrou que a expressão do
VAChT estava diminuída em torno de 40% nos animais KDHET e 70% nos animais
KDHOM (figura 14C). Resultados semelhantes foram observados quando examinamos a
imunorreatividade do VAChT em fatias de córtex cerebral (Figura 15). Esses resultados
sugerem que a redução da expressão da proteína do transportador afetou os níveis do
mesmo em terminais nervosos colinérgicos.
Na região do estriado dos animais selvagens (WT) (Figura 16A),
pode-se observar a imunorreatividade para o VAChT em interneurônios e esta marcação
se expande à uma grande rede de terminações nervosas colinérgicas. Já nos animais
mutantes, esta marcação foi reduzida nos camundongos KDHET e KDHOM. A
imunorreatividade para o CHT1 se mostrou inalterada nas fatias serias nos três
64
KDHET
Selvagem
KDHOM
A.
B.
C.
Selvagem
KDHET
KDHOM
Figura 14: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 na região do hipocampo dos
camundongos VAChT knockdown. Fatias seriais de hipocampo dos animais KD e controles foram
imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e CHT1. (A) imunorreatividade para o VAChT na região
CA1 do hipocampo (B) imunorreatividade para o CHT1 na região CA1 do hipocampo. O núcleo das
células foi corado com o marcador nuclear DAPI. (C) Gráfico da quantificação da fluorescência na
região do hipocampo. A imunorreatividade para o CHT1 foi utilizada para normalização. Os resultados
foram expressos com média ± SEM. (*) Indica que a imunorreatividade para o VAChT dos
camundongos KD é estatísticamente diferente dos controles (Anova de uma via com post hoc Bonferroni
F(2,12)=33.19, * p<0.0001).
65
Selvagem
KDHET
KDHOM
A.
B.
Figura 15: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 na região do córtex cerebral dos camundongos VAChT knockdown. Fatias
seriais de cérebro dos animais KD e controles foram imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e CHT1. A figura exibe seções ópticas
representativas do Córtex motor (região M1). (A) imunorreatividade para o VAChT (B) imunorreatividade para o CHT1. O núcleo das
células foi corado com o marcador nuclear DAPI.
66
Selvagem
KDHET
KDHOM
A.
B.
Figura 16: Imunofluorescência para VAChT e CHT1 na região do estriado dos camundongos VAChT knockdown. Fatias seriais
de cérebro dos animais KD e controles foram imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e CHT1. A figura exibe seções ópticas
representativas da região do estriado. (A) imunorreatividade para o VAChT (B) imunorreatividade para o CHT1. O núcleo das células
foi corado com o marcador nuclear DAPI
67
genótipos (Figura 16B). A região do tronco encefálico possui grupos de neurônios
colinérgicos que inervam a região talâmica (Mesulan e cols., 1983) e grupos de
neurônios motores grandes (motoneurônios) responsáveis pela movimentação dos
músculos da face (Veronique e cols., 2006). A imunorreatividade para o VAChT nos
motoneurônios do núcleo facial 7N dos animais selvagens (WT) (Figura 17A-coluna 1)
mostrou a marcação destes neurônios grandes, além das terminações nervosas
colinérgicas que rodeiam os corpos neuronais. É possível observar a redução da
imunorreatividade para o VAChT no corpo celular destes motoneurônios nos
camundongos KD (17A). A imunorreatividade do CHT1 não sofreu alterações nas fatias
serias dos animais KD quando comparada aos animais selvagens (WT) (17B).
Corroborando
os
dados
de
immunoblot,
as
análises
de
imunofluorescência mostraram redução da expressão do VAChT em diferentes regiões
do cérebro e não apontaram alteração detectável da expressão protéica do CHT1.
4) Efeito da diminuição da expressão do VAChT na liberação de
acetilcolina
Os dados de imunoblot mostraram uma grande redução na expressão
protéica do VAChT nos animais knockdown. Para investigar as conseqüências
fisiológicas da redução da expressão do transportador no cérebro, utilizou-se a técnica
de microdiálise para medir os níveis extracelulares de ACh no córtex pré-frontal e
estriado de animais vivos. Esses experimentos foram realizados por nossos
colaboradores na Duke University e os resultados obtidos (Figura 18A) demonstram
uma redução em torno de 35% e 31%, respectivamente nos níveis basais extracelulares
68
Selvagem
KDHET
KDHOM
A.
B.
Figura 17: Imunofluorescência para o VAChT e CHT1 no núcleo facial (7N) da região do tronco encefálico dos camundongos
VAChT knockdown. Fatias seriais de cérebro dos animais KD e controles foram imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e CHT1. A
figura exibe seções ópticas representativas do núcleo facial 7N. (A) imunorreatividade para o VAChT (B) imunorreatividade para o CHT1.
O núcleo das células foi corado com o marcador nuclear DAPI.
69
A.
B.
Figura 18: Microdiálise no cérebro dos camundongos KDHET: A) Medida dos níveis
extracelulares basais de acetilcolina nas regiões do córtex pré-frontal (FC) e estriado
(ST). B) Liberação de ACh sob estímulo de KCl na região do estriado. Após 40
minutos, uma solução contendo KCl 60mM foi perfundida durante 40 minutos. A
acetilcolina no perfusado foi dosada por HPLC. * estatisticamente significativo em
relação ao controle WT, p<0,05. (para maiores detalhes experimentais ver Prado e cols.,
2006, em anexo).
70
de ACh nos animais KDHET (Prado e cols., 2006). Também com o uso da microdiálise
foi possível avaliar a liberação evocada de acetilcolina na região do estriado dos animais
KDHET. Este experimento in vivo mostrou que os animais KDHET assim como os animais
controle (WT) respondem ao estímulo despolarizante do KCl, liberando acetilcolina na
fenda sináptica. No entanto, a dosagem por HPLC do neurotransmissor liberado
apontou uma redução significativa da liberação vesicular de ACh nos animais KDHET
(Figura 18B) (Prado e cols., 2006). Animais homozigotos não foram utilizados nesses
experimentos devido à sua maior sensibilidade ao anestésico, necessário para a
implantação da cânula.
Adicionalmente, analisou-se o efeito da expressão reduzida do
VAChT na liberação de acetilcolina na junção neuromuscular pelo registro de
potenciais miniatura de placa motora espontâneos (MEPPs) e cálculos de tamanho e
conteúdo do quanta. Os resultados mostram uma redução no tamanho do quanta e
acentuada queda da freqüência de MEEPs nos animais KDHOM em relação ao controle
WT e estas alterações não foram observadas nos animais KDHET (Prado e cols., 2006).
5) Efeito da diminuição da expressão do VAChT na
concentração de acetilcolina no cérebro
A função fundamental do VAChT é seqüestrar ACh do citosol do
terminal nervoso e estocar este neurotransmissor em vesículas sinápticas. Portanto, nós
analisamos o efeito da redução da expressão do VAChT nos níveis de acetilcolina em
diferentes áreas do cérebro. Através de um ensaio de quimioluminescência foi medido
os níveis teciduais de ACh no hipocampo e estriado dos camundongos knockdown.
Como podemos observar no gráfico (Figura 19), os animais KDHET possuem quase o
71
A.
B.
Figura 19: Dosagem de acetilcolina no cérebro de camundongos knockdown.
A) Medida do conteúdo tecidual de acetilcolina por HPLC nas regiões do córtex préfrontal (FC) e estriado (ST) dos animais WT (barra branca) e KDHET (barra cinza),
respectivamente. O gráfico representa a média de 6-14 animais de cada genótipo ±erro
padrão da média. A análise estatística foi realizada com teste T não pareado e *
representa valor de p<0.05. B) Dosagem de acetilcolina na região do hipocampo dos
animais WT (barra branca), KDHET (barra cinza) e KDHOM (barra preta) por
quimioluminescência. As barras representam a média de 4-6 experimentos ±erro padrão
da média. A análise estatística utilizando One-Way Anova com post-hoc Bonferroni
mostrou diferença estatisticamente significativa entre os grupos. [F(2,17)= 61,133]. #
mostra que o conteúdo do KDHOM foi significativamente diferente do KDHET.
72
dobro de acetilcolina tecidual, enquanto os animais KDHOM contêm quase o triplo da
acetilcolina nos tecidos em relação aos animais controle WT. As concentrações de ACh
no estriado dos animais KDHET foram também dosadas por HPLC e os resultados
mostram um aumento significativo no conteúdo tecidual de ACh nos animais KDHET em
relação ao controle. As dosagens em HPLC foram realizadas pelo grupo do Dr. Marc
Caron da Duke University e confirmam os nossos dados obtidos com o uso do
luminômetro (Prado e cols., 2006).
6) Efeito da diminuição da expressão do VAChT na atividade da
enzima colina acetiltransferase (ChAT)
Apesar de a análise de Northern-blot não ter apontado mudanças no
nível de expressão de mRNA da ChAT, seria importante determinar se alterações na
expressão gênica do VAChT afetariam os mecanismos de síntese da acetilcolina, o que
poderia explicar o aumento surpreendente do conteúdo tecidual de acetilcolina
observado nos animais knockdown. Portanto, nós investigamos a atividade enzimática
da ChAT nos animais knockdown. Realizou-se um ensaio in vitro em que extratos de
hipocampo e medula espinal foram incubados com colina e acetil CoA marcada com
14
C. Ao término da incubação, a
14C
acetilcolina formada foi recuperada pela extração
com tetrafenilboro em butirilnitrila e a radioatividade mensurada. Como pode ser
observado no gráfico da figura 20, não houve alteração estatisticamente significativa na
atividade da ChAT entre os genótipos (WT, KDHET e KDHOM) nos dois tecidos
analisados. Portanto, este resultado sugere que o aumento do conteúdo tecidual de
acetilcolina não ocorreu por alterações na atividade da colina acetiltransferase.
73
Hipocampo
Medula espinal
Figura 20: Atividade da colina acetil-transferase (ChAT) nos camundongos
KD. Extratos de hipocampo e medula espinal de animais WT (barras brancas) e KDHET
(barras cinza) foram incubados com colina e
14C
acetil-CoA. A acetilcolina formada foi
recuperada e a radioatividade foi medida. Os dados expressam a média de 4
experimentos ± erro padrão da média. A análise estatística utilizando ANOVA de uma
via não mostrou diferença estatisticamente significativa entre os grupos [F(2, 20)=
2,278] para o hipocampo e [F(2, 3)= 0,9003] para medula spinal.
74
7) Efeito da diminuição da expressão do VAChT na captação
de colina pelo CHT1
Acredita-se que a captação de colina com alta afinidade realizada
pelo CHT1 seja o passo limitante para a síntese de acetilcolina (Simon e Kuhar, 1975),
portanto a expressão reduzida do VAChT nos animais knockdown poderia interferir na
captação de colina, o que poderia também explicar o aumento da ACh tecidual. Com o
objetivo de avaliar a captação de colina nos animais knockdown, sinaptosomas foram
incubados com
3H
colina na concentração não saturante de 100nM e mantidos por três
minutos a 30°C para promover a captação. Todas as células, inclusive os neurônios,
possuem um transporte de colina de baixa afinidade. A fim de analisar apenas o
transporte de alta afinidade foram realizados controles em que o sódio foi substituído
por lítio ou foi adicionado 1μM de hemicolinium-3.
Para expressar os valores da captação de colina realizada pelo CHT1,
as leituras obtidas dos sinaptosomas incubados em solução contendo o íon sódio foram
subtraídas das leituras obtidas quando os sinaptosomas foram incubados em solução
contendo lítio ou hemicolinium-3. A análise estatística foi realizada com os valores
obtidos em dpm/μg de proteínas.
O gráfico (Figura 21) representa a porcentagem da captação de colina
pelo CHT1 em relação ao controle WT e mostra que não houve diferença
estatisticamente significativa na captação de colina pelo CHT1 nos animais KDHET e
KDHOM. Nossos resultados sugerem que o aumento dos níveis teciduais de ACh
observado nos animais knockdown não é conseqüência de um aumento da captação de
colina pelo CHT1.
75
Figura 21: Captação de colina em sinaptosomas dos camundongos KD.
Sinaptosomas foram incubados a 30°C com 100nM
3H
colina para captação de colina
pelo CHT1. O gráfico expressa a % de captação de colina pelos animais KD em relação
ao animal selvagem WT. O gráfico representa a média de 4 experimentos ±erro padrão
da média A análise estatística utilizando ANOVA de uma via não mostrou diferença
estatisticamente significativa entre os grupos.
76
Camundongos VAChT nocaute condicionais
A segunda estratégia utilizada para produzir camundongos com
disfunção colinérgica foi a geração de animais nocaute condicionais para o gene do
VAChT utilizando a metodologia Cre-loxP. Para isso, utilizou-se a recombinação
homóloga para gerar camundongos que apresentam o gene do VAChT flanqueado por
dois sítios de loxP (Figura 7). Nesta estratégia, o cassete de 3.8 Kb foi inserido 3’ do
gene do VAChT (Figura 7). Esses camundongos, denominados VAChTFlox/Flox, foram
produzidos pela Prof. Vania Prado e Prof. Marco Prado em colaboração com o Dr. Marc
Caron na Duke University, EUA. Assim como os camundongos KD, os camundongos
VAChTFlox/Flox foram trazidos para a UFMG onde foram caracterizados.
A geração dos camundongos nocaute condicionais para o VAChT
depende do cruzamento dos camundongos VAChTFlox/Flox com camundongos
transgênicos que expressam a recombinase Cre sob o controle de um promotor
específico. Utilizando-se esta metodologia espera-se que a prole gerada (nocaute
condicionais) apresente a expressão do VAChT abolida apenas no tecido onde a Cre
estiver sendo expressa (Figura 5B).
Camundongos VAChTFlox/Flox
1) Genotipagem dos camundongos VAChTFlox/Flox
A genotipagem inicial dos camundongos VAChTFlox/Flox foi feita por Southern blotting.
O DNA genômico extraído de um fragmento da cauda dos animais foi digerido com as
enzimas de restrição NdeI e corrido em gel de agarose 0,7% e transferido para
membrana de nylon. Utilizou-se o fragmento NdeI/PmeI marcado com fosfatase
77
alcalina como sonda (Figura 22A). Como pode ser observado na figura 22B, o alelo
recombinante apresentou uma banda de aproximadamente 6,5Kb enquanto o alelo
selvagem (WT) apresentou uma banda de 5,7 Kb, confirmando a alteração gênica nessa
linhagem de animais.
Rotineiramente,
os
animais
VAChTFlox/Flox
utilizados
nos
experimentos, foram genotipados por PCR. A reação de PCR utilizava 3 iniciadores
(tabela 2-PCR1) para a detecção dos alelos do VAChT (estratégia semelhante à
detecção dos alelos do VAChT nos animais VAChT-KD). Os iniciadores P1F e P3F
amplificam um fragmento de DNA de 304 pares de base no alelo selvagem e os
iniciadores P1F e P2F (anela-se no cassete) amplificam um fragmento de 464 pares de
base no alelo mutado (Figura 22C). Portanto, quando utilizamos esses 3 iniciadores na
reação de PCR, os animais selvagens (VAChTWT/WT) amplificam um fragmento de 304
pb, os camundongos homozigotos (VAChTFlox/Flox) amplificam uma banda de 464pb e
os heterozigotos (VAChTWT/Flox) amplificam as duas bandas (Figura 22C).
2) Análise dos níveis de mRNAs do VAChT e outros marcadores
colinérgicos nos camundongos VAChTFlox/Flox
A análise da expressão gênica do VAChT e de outros marcadores
colinérgicos no cérebro e medula espinal foi realizada através de PCR em tempo real.
Realizamos, inicialmente, a análise da expressão gênica do VAChT
na região da medula espinal dos camundongos VAChT Flox/Flox. O gráfico da figura 23
mostra que, nesse tecido, os camundongos VAChT Flox/Flox apresentam uma redução em
78
X
E B
H H
VAChT
R
304bp
VAChT WT- Chrom 14
X
E B
3800bp
tk
VAChT
R
HH
H
neo
loxP
loxP
Long arm 3800bp
P3F
Sse83
H
Nhe/Spe
SpeI
NotI
P1F
X
H
NdeI
X H
AscI
NotI
B
Nhe/Spe
A.
pVATFLOX
probe
Sonda
loxP
Short arm 1000 bp
floxed arm 3300bp
VATFLOX
464bp
P1F
P2F
P3F
B.
C.
500 pb
400 pb
300 pb
Figura 22: Genotipagem dos camundongos VAChTFlox/Flox. A) Esquema do
loco gênico colinérgico selvagem (VAChT WT) e após recombinação homóloga
(VATFLOX) do gene do VAChT. A caixa com o símbolo R representa o primeiro exon
do gene da ChAT. O gene do transportador foi flanqueado por seqüências LoxP
(cabeças de seta negras) e o cassete de 3.8 Kb foi inserido downstream. Sítios de
restrição relevantes são indicados (B: Bam H1, X: XhoI, H: HindIII, E: Eco R1, Not,
79
Nhe/Spe, Sse83, AscI e NdeI). Os iniciadores utilizados nas genotipagens estão
destacados em azul e verde (Para detalhes ver tabela 2). B) Análise de Southern. O
alelo selvagem apresenta uma banda de 5722 pb e o alelo que sofreu recombinação
(gene do VAChT flanqueado por sítios de LoxP) (alelo Flox) apresenta uma banda de
6568 pb. C) PCR para genotipagem dos camundongos VAChTFlox/Flox. Através da
amplificação com 3 primers foi possível distinguir o alelo selvagem e o alelo Flox. Os
camundongos VAChTWT/WT (selvagens) amplificam uma banda de 304 pb, os
camundongos VAChTFlox/Flox amplificam um fragmento de 464 pb e os camundongos
VAChTFlox/WT amplificam as duas bandas. Coluna 1 (VAChTWT/WT), coluna 2
(VAChTFlox/WT), coluna 3 (VAChTFlox/Flox) e coluna 4 (controle negativo).
80
Figura 23: Quantificação da expressão de mRNA do VAChT na medula espinal
dos camundongos VAChTFlox/Flox por PCR em tempo real. Amostras de RNA
extraídas da região da medula espinal dos camundongos (VAChTFlox/Flox) e controles
(VAChTWT/WT) foram submetidas a transcrição reversa para a geração de cDNA. Para a
reação de PCR foram utilizados iniciadores específicos para o gene do VAChT que
produziu um fragmento esperado de aproximadamente 200 pb. O gráfico representa a
média de 4 experimentos ±erro padrão da média. A análise por teste Student não
pareado apontou diferença estatisticamente significativa nos níveis transcricionais do
transportador nos animais mutantes (VAChTFlox/Flox) (barra cinza quadriculada). ***
Estatisticamente significativo em relação ao selvagem (VAChTWT/WT) (barra branca);
p<0,0001.
81
torno de 50% na expressão do mRNA do VAChT quando comparados aos
camundongos VAChT WT/WT.
Os níveis de expressão do mRNA para a enzima ChAT apresentaram
uma aumento em torno de 100% (Figura 24) enquanto a expressão do CHT1 mostrou
uma tendência à redução, entretanto essa tendência não foi estatisticamente significativa
(Figura 25).
3) Análise da liberação de acetilcolina na junção neuromuscular
dos camundongos VAChTFlox/Flox .
Avaliamos a liberação de acetilcolina na junção neuromuscular dos
camundongos VAChTFlox/Flox pelo registro de MEPPs e cálculos de tamanho e conteúdo
do quanta. Nossos resultados preliminares sugerem que a amplitude dos MEEPs dos
camundongos VAChTFlox/Flox está aumentada quando comparada com a amplitude do
quanta dos animais controle (VAChT
WT/WT
) (Figura 26A). Este dado sugere um
aumento na quantidade de neurotransmissor na vesícula dos camundongos
VAChTFlox/Flox. Entretanto, não observamos alteração significativa na freqüência destes
MEEPs entre os genótipos (Figura 26B), indicando não haver alterações na
probabilidade de liberação vesicular ou no pool prontamente liberável (readly releasable
pool).
4) Dosagem de acetilcolina no cérebro dos camundongos
VAChTFlox/Flox
82
Figura 24: Quantificação da expressão de mRNA da ChAT dos
camundongos VAChTFlox/Flox por PCR em tempo real. Amostras de RNA extraídas
da região da medula espinal dos camundongos (VAChTFlox/Flox) e controles
(VAChTWT/WT) foram submetidas a transcrição reversa para a geração de cDNA. Para a
reação de PCR foram utilizados iniciadores específicos para o gene da ChAT que
produziu um fragmento esperado de aproximadamente 200 pb. O gráfico representa a
média de 4 experimentos ±erro padrão da média. A análise por teste Student não
pareado apontou diferença estatisticamente significativa nos níveis transcricionais da
ChAT nos animais mutantes (VAChTFlox/Flox) (barra cinza quadriculada). *
Estatisticamente significativo em relação ao WT (VAChTWT/WT) (barra branca); p<0,05.
83
Figura 25: Quantificação da expressão de mRNA do CHT1 dos
camundongos VAChTFlox/Flox por PCR em tempo real. Amostras de RNA extraídas
da região da medula espinal dos camundongos (VAChTFlox/Flox) e controles
(VAChTWT/WT) foram submetidas a transcrição reversa para a geração de cDNA. Para a
reação de PCR foram utilizados iniciadores específicos para o gene do CHT1 que
produziu um fragmento esperado de aproximadamente 200 pb. O gráfico representa a
média de 4 experimentos ±erro padrão da média. A análise por teste Student não
pareado não apontou diferença estatisticamente significativa nos níveis transcricionais
do transportador de colina de alta afinidade nos animais mutantes (VAChTFlox/Flox)
(barra cinza quadriculada) em relação ao WT (VAChTWT/WT) (barra branca).
84
1.0
A.
Freq. Cumulativa
0.8
0.6
0.4
WT/WT
FLOX/FLOX
0.2
0.0
0
2
4
6
8
10
Área (mV/ms)
1.0
B.
WT/WT
FLOX/FLOX
MEPPs/Seg
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Figura 26: Liberação de acetilcolina na junção neuromuscular (JNM) dos
camundongos VAChTFlox/Flox. A) Distribuição cumulativa dos MEEPs mostrando um
aumento do conteúdo quantal na JNM dos camundongos VAChTFlox/Flox (linha
vermelha) em relação ao animal controle VAChTWT/WT (linha negra). B) Freqüência dos
MEEPs. A análise estatística não mostrou diferenças significativas entre os genótipos.
85
Nós avaliamos o conteúdo de acetilcolina no cérebro nos
camundongos VAChTFlox/Flox. Os animais VAChTFlox/Flox
apresentaram níveis
elevados de ACh tecidual (Figura 27). Nossos resultados indicam que os animais
VAChTFlox/Flox apresentam, aproximadamente, seis vezes mais acetilcolina tecidual
em relação aos animais selvagens VAChTWT/WT (Figura 27). Esses resultados
sugerem que a alteração no gene do VAChT (inserção de seqüências LoxP e o
cassete de neomicina e timidina cinse) levou à alterações na expressão do VAChT
com
conseqüente
aumento
da
acetilcolina
tecidual.
Fenotipicamente,
os
camundongos VAChTFlox/Flox aparentam ser normais e não apresentam anormalidade
pronunciada.
Camundongos VAChTFlox/Flox, cre +
Com o objetivo de testar se os animais VAChTFlox/Flox poderiam ser
usados para gerar os camundongos com deleção do VAChT em tecidos específicos, nós
cruzamos os camundongos VAChTFlox/Flox (ou camundongos VAChTFlox/WT) com
camundongos que expressam a Cre sob o controle do promotor da cálcio calmodulina
cinase IIα (Dragatsis e Zeitlin., 2000). Nosso objetivo, cruzando camundongos
transgênicos que expressam a cre-recombinase sob o controle do promotor da cálcio
calmodulina cinase IIα com os camundongos VAChTFlox/Flox foi obter camundongos em
que o gene do VAChT é removido no cérebro, sendo preservado nos tecidos periféricos.
Existem vários camundongos Cre que expressam a enzima sob controle do promotor da
CAMKIIα . A linhagem de animais escolhida deveria expressar essa enzima apenas no
prosencéfalo. No entanto, poucas linhagens Cre foram bem caracterizadas até o
momento.
86
Acetilcolina (pmols/mg de proteina)
800
600
400
200
0
Figura 27: Dosagem de ACh nos camundongos VAChTFlox/Flox. Medida do conteúdo
tecidual de acetilcolina na região do estriado dos animais VAChTWT/WT (barra branca) e
VAChTFlox/Flox (barra cinza quadriculada), respectivamente. O gráfico apresenta a média
de 2 experimentos.
87
1) Estratégia de cruzamento para a geração de camundongos
VAChTFlox/Flox, cre+
Para a geração dos camundongos VAChTFlox/Flox,Cre+ camundongos
VAChTFlox heterozigotos (VAChTFlox/WT) foram cruzados com camundongos CreCamKII (cre+/0). Como o gene Cre é um alelo transgênico, o seu sítio de integração ou
a sua expressão pode interferir com expressão de genes nos camundongos homozigotos
(cre +/+) e levar a fenótipos indesejados, os cruzamentos foram sempre mantidos entre
animais hemizigotos cre (+/0) e selvagem (0/0) para a Cre. Para simplificação, os
camundongos Cre hemizigotos são referidos como (cre+) e os camundongos que não
expressam a cre como (cre-). Os camundongos VAChT Flox/WT, cre+ gerados na primeira
geração foram cruzados com camundongos VAChT Flox/WT, cre- a fim de gerar os animais
VAChT Flox/Flox, cre+.
2) Genotipagem dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+
Rotineiramente os animais VAChTFlox/Flox, cre+ foram genotipados por
PCR. Para a genotipagem dos animais VAChTFlox/Flox,
cre+
foram necessárias duas
reações de PCR, uma reação de 3 iniciadores (ver tabela 2-PCR1) para a detecção dos
alelos do VAChT (mesma reação utilizada para genotipar os camundongos
VAChTFlox/Flox) e uma segunda reação de 2 iniciadores (tabela 2-PCR2) para a detecção
do gene da Cre (Figura 28). O alelo cre foi detectado com iniciadores específicos
(CRE1 e CRER2-tabela 2) que amplificam um fragmento de aproximadamente 200
pares de bases (pb) (Figura 28).
88
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
1
2
3
4
5
Figura 28: Genotipagem dos camundongos VAChTFlox/Flox,
6
cre+
. Através de
duas amplificações foi possível distinguir o alelo selvagem e o alelo Flox do VAChT,
além do gene da Cre. Na amplificação dos alelos do VAChT, o alelo selvagem
amplifica uma banda de 304 pb e o alelo Flox amplifica um fragmento de 464 pb. Uma
segunda reação foi utilizada para identificar a presença do gene para a Cre, o qual
amplifica um fragmento de aproximadamente 200 pb. Na figura estão representados 6
animais cujos genótipos são: animal 1 (VAChTWT/WT Cre-), animal 2 (VAChTWT/WT Cre+),
animal 3 (VAChTFlox/WT Cre-), animal 4 (VAChTFlox/WT Cre+), animal 5 (VAChTFlox/Flox Cre) e animal 6 (VAChTFlox/Flox Cre+).
89
3) Características fenotípicas dos animais VAChTFlox/Flox, cre+
Os camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ desenvolvem-se normalmente e
ao nascer apresentam-se morfologicamente idênticos aos animais VAChT
WT/WT
da
mesma ninhada (Figura 29 A.1). À medida que desenvolvem, apresentam, no entanto,
dificuldade para se alimentar e movimentam-se menos, sugerindo dificuldade de
coordenação motora e/ou fraqueza muscular generalizada. Outra característica marcante
destes animais é o desenvolvimento anormal da coluna espinhal, o que leva os
camundongos a desenvolverem cifose, tornando-se corcundas (Figura 29 A.2). Na
tentativa de aumentar o período de vida desses animais, foi realizada a suplementação
alimentar com Nutela e maçã, além de administração de soro fisiológico diariamente
para evitar desidratação. Entretanto, mesmo com esses cuidados adicionais, esses
camundongos não adquirem o mesmo peso dos camundongos VAChTWT/WT de mesma
ninhada que não receberam esses cuidados. O gráfico da figura 29B representa a média
dos pesos dos animais com 8 semanas, em gramas, em que é possível observar que os
camundongos VAChTFlox/Flox, cre+, possuem metade do peso dos animais VAChTFlox/Flox,
cre-
e VAChTWT/WT. Enquanto a média de peso dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre- e
VAChTWT/WT nesta idade gira em torno de 23 gramas, os camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
adquirem um peso médio de 13 gramas. Mesmo com os cuidados diários para evitar
desnutrição e desidratação, os camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
sobrevivem apenas 8
semanas.
O curto tempo de vida desses animais torna inviável a realização de
testes comportamentais complexos. Entretanto, para avaliar se as alterações moleculares
detectadas poderiam afetar a função neuromuscular e a coordenação motora, acessou-se
o desempenho dos camundongos através de 2 testes: o teste de força (Wire Hang) e o
perfil de pegada (footprint pattern).
90
A.
A. 1
A. 2
VAChTWT/WT
30
B.
VAChTFlox/Flox, creVAChTFlox/Flox, cre+
Peso (gramas)
25
20
15
*
10
5
0
Figura 29: Características fenotípicas dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+. (A.1)
Os camundongos nascem normais e até o quinto dia de vida são indistinguíveis dos
animais selvagens. (A.2) Camundongo VAChTFlox/Flox, cre+ com 8 semanas. É possível
ver com maior detalhe a corcunda que estes animais desenvolvem neste período. (B)
Gráfico da média de peso de 3 animais de cada genótipo ±erro padrão da média
mostrando que os camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
(Barra negra) possuem uma
diferença de peso em relação aos camundongos VAChTWT/WT (Barra branca) e
VAChTFlox/Flox, cre- (Barra cinza). Anova de uma via com post hoc Bonferroni mostrou
diferença estatisticamente significativa entre os camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
em
relação aos animais VAChTWT/WT e VAChTFlox/Flox, cre- [F(2,5) = 11.10] * p<0,05.
91
O teste (wire hang) avalia a capacidade inata dos murinos em
sustentar o peso do próprio corpo quando mantidos de cabeça para baixo. Os
camundongos são colocados de cabeça para baixo em uma grade e o tempo que estes
animais ficam agarrados é cronometrado. Os camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
apresentaram dificuldade para sustentar o próprio peso na grade. Enquanto os animais
VAChTFlox/Flox,
cre-
e VAChTWT/WT mantiveram-se agarrados à grade durante o tempo
máximo estipulado (Figura 30A), os camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ conseguiram ficar
na grade, em média, no máximo 15 segundos, sugerindo fraqueza muscular. Já os
animais VAChTFlox/Flox,
cre-
apresentaram o tempo de latência de queda similar ao
observado para os animais VAChTWT/WT (Figura 30A). Esses resultados sugerem que os
animais VAChTFlox/Flox não apresentam alterações neuromusculares graves.
O teste para avaliar a coordenação motora (footprint) mostra que
padrão de caminhada dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ está alterado. A largura das
passadas foi menor e pouco uniforme em relação ao observado para os camundongos
VAChTWT/WT e VAChTFlox/Flox, cre-(Figura 30B).
4) Análise da expressão protéica do VAChT e outros marcadores
colinérgicos no cérebro dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+
Para avaliar as regiões onde a expressão do VAChT foi alterada nos
camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
foi realizada uma imunofluorescência em fatias de
cérebro. Pode-se observar a marcação característica dos neurônios colinérgicos e da
extensa rede de terminações nervosas colinérgicas em fatias de estriado dos
92
Tempo despendido pelo camundongo
sustentando seu próprio corpo (s)
A.
B.
70
60
50
40
30
*
20
10
0
WT/WT
VAChT
Flox/Flox, creVAChT
Flox/Flox, cre+
VAChT
VAChTWT/WT.
VAChTFlox/Flox, cre+
Figura 30: Avaliação da força muscular e coordenação motora nos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+. A) Teste de latência de queda (wire hang). Os
camundongos foram colocados de cabeça para baixo, suspensos em uma grade e o tempo que estes animais conseguiram sustentar o seu peso no ar foi cronometrado,
sendo estipulado um tempo máximo de 60s. Os camundongos VAChTFlox/Flox,
Flox/Flox, cre-
VAChT
e VAChT
cre+
apresentam uma latência de queda bastante reduzida em relação ao animas
WT/WT
. Anova com post hoc Bonferroni mostrou diferença estatisticamente significativa dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ em relação
aos VAChTFlox/Flox, cre- e VAChTWT/WT. [F(2,5) = 11.10] * p<0,05. B) Perfil de passada (footprint). Figura representativa do caminhar dos camundongos VAChTWTWT
e VAChTFlox/Flox, cre+. Os camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ e VAChTWT/WT foram submetidos a uma caminhada sobre papel branco com as patas traseiras molhadas em
tinta preta. Os animais VAChTFlox/Flox, cre+ não conseguem caminhar em linha reta como os camundongos VAChTWT/WT e apresentam uma redução da largura destas
passadas. A seta indica o sentido da caminhada.
93
VAChTWT/WT
VAChTFlox/Flox, cre-
VAChTFlox/Flox, cre+
A.
B.
Figura 31: Imunofluorescência na região do estriado dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+. Fatias seriais de cérebro dos animais
VAChTFlox/Flox, cre+. VAChTFlox/Flox, cre- e controles VAChTWT/WT foram imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e CHT1. A figura
exibe seções ópticas representativas da região do estriado. (A) imunorreatividade para o VAChT (B) imunorreatividade para o CHT1. O
núcleo das células foi corado com o marcador nuclear DAPI. Coluna 1: (VAChTWT/WT), coluna 2 (VAChTFlox/Flox,
(VAChTFlox/Flox, cre+).
cre-
) e coluna 3
94
camundongos VAChTWT/WT (Coluna 1-Figura 31A). Nos camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
(Coluna 3-Figura 31A) não foi observada imunorreatividade para o VAChT nos
interneurônios estriatais (31A). Surpreendentemente, resultado semelhante foi obtido
quando examinamos a imunorreatividade para o VAChT no estriado dos camundongos
VAChTFlox/Flox,
cre-
(Coluna 2, Figura 31A). A imunorreatividade do CHT1 em fatias
adjacentes foi utilizada para avaliar se houve alterações no número de neurônios
colinérgicos ou na expressão do transportador de colina. Não observamos alterações
aparentes na imunorreatividade para o CHT1 no estriado dos três genótipos analisados
(Figura 31B).
A região do hipocampo possui terminações nervosas colinérgicas
(Coluna 1-Figura 32A). Não observamos imunorreatividade para o VAChT no
hipocampo dos camundongos VAChTFlox/Flox,
VAChTFlox/Flox,
cre-
cre+
(Coluna 3-Figura 32A) e
(Coluna 2-Figura 32A) e a imunorreatividade para o CHT1 foi
similar entre os genótipos (Figura 32B). A região do córtex cerebral também possui
uma rede de terminações nervosas colinérgicas. A imunorreatividade para VAChT
(Figura 33A) e CHT1 (Figura 33B) para os camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
e
VAChTFlox/Flox, cre- foi similar à apresentada para a região do hipocampo e estriado.
Foi observada uma grande redução da imunorreatividade para o
VAChT nos terminais nervosos colinérgicos que inervam os corpos celulares dos
motoneurônios do núcleo facial 7N dos camundongos VAChTFlox/Flox,
Figura 34A) e VAChTFlox/Flox,
cre-
cre+
(Coluna 3-
(Coluna 2-Figura 34A) quando comparados aos
camundongos VAChTWT/WT (Coluna 1-Figura 34A). Fatias adjacentes foram incubadas
com o anti-CHT1 e não foram observadas alterações aparentes na expressão do
transportador de colina no núcleo facial (34B) entre os três genótipos.
95
VAChTWT/WT
VAChTFlox/Flox, cre-
VAChTFlox/Flox, cre+
A.
B.
Figura 32: Imunofluorescência na região do hipocampo dos camundongos VAChTFlox/Flox,
animais VAChTFlox/Flox,
cre+
. VAChTFlox/Flox,
cre-
cre+
. Fatias seriais de cérebro dos
e controles VAChTWT/WT foram imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e
CHT1. A figura exibe seções ópticas representativas da região CA1 do hipocampo. (A) imunorreatividade para o VAChT (B)
imunorreatividade para o CHT1. O núcleo das células foi corado com o marcador nuclear DAPI. Coluna 1: (VAChTWT/WT), coluna 2
(VAChTFlox/Flox, cre-) e coluna 3 (VAChTFlox/Flox, cre+).
96
VAChTWT/WT
VAChTFlox/Flox, cre-
VAChTFlox/Flox, cre+
A.
B.
Figura 33: Imunofluorescência na região do córtex dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+. Fatias seriais de cérebro dos animais
VAChTFlox/Flox,
cre+
. VAChTFlox/Flox,
cre-
e controles VAChTWT/WT foram imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e CHT1. A
figura exibe seções ópticas representativas da região M1 do córtex cerebral motor. (A) imunorreatividade para o VAChT (B)
imunorreatividade para o CHT1. O núcleo das células foi corado com o marcador nuclear DAPI. Coluna 1: (VAChTWT/WT), coluna 2
(VAChTFlox/Flox, cre-) e coluna 3 (VAChTFlox/Flox, cre+).
97
VAChTWT/WT
VAChTFlox/Flox, cre-
VAChTFlox/Flox, cre+
A.
B.
Figura 34: Imunofluorescência no tronco encefálico dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+. Fatias seriais de cérebro dos animais
VAChTFlox/Flox,
cre+
. VAChTFlox/Flox,
cre-
e controles VAChTWT/WT foram imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e CHT1. A
figura exibe seções ópticas representativas de motoneurônios do núcleo facial 7N da região do tronco encefálico. (A)
imunorreatividade para o VAChT (B) imunorreatividade para o CHT1. O núcleo das células foi corado com o marcador nuclear DAPI.
Coluna 1: (VAChTWT/WT), coluna 2 (VAChTFlox/Flox, cre-) e coluna 3 (VAChTFlox/Flox, cre+).
98
Observa-se que a expressão da proteína do VAChT foi bastante
diminuída no SNC dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre- (Coluna 2-Figuras 31A, 32A,
33A, e34A). Este dado se mostra controverso, pois os animais VAChTFlox/Flox,
cre-
desenvolvem-se normalmente e não apresentam nenhuma das características fenotípicas
observadas para os camundongos VAChTFlox/Flox,
VAChTFlox/Flox,
cre-
cre+
. Além disso, os camundongos
não apresentam alterações na liberação da acetilcolina na junção
neuromuscular (Figura 26) e mostraram apenas 50% de redução na expressão de mRNA
do VAChT.
5) Análise da expressão protéica do VAChT e outros marcadores
colinérgicos no sistema periférico dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+
Para testar se a expressão do VAChT foi alterada em outras regiões
do sistema nervoso, nós analisamos se houve alteração na expressão do VAChT no
diafragma dos camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
. A imunofluorescência foi realizada
com hemidiafragmas inteiros incubados com anti-VAChT. A figura 35 mostra a
imunorreatividade característica para o VAChT na placa motora dos camundongos
VAChTWT/WT (Figura 35-coluna 1, linha A) e a marcação dos receptores nicotínicos
pela bungarotoxina acoplada ao fluoróforo AlexaFluor 555 (Molecular Probes) (Figura
35-coluna 1, linha B).
O experimento de imunofluorescência não mostrou alterações
aparentes na imunorreatividade para o VAChT na junção neuromuscular nos
camundongos VAChTFlox/Flox, cre+(Figura 35-coluna 3, linha A) quando comparados aos
animais VAChTWT/WT. Não foram detectadas também modificações visíveis na
expressão
dos
receptores
nicotínicos
(Figura
35-coluna
3,
linha
B)..
99
VAChTWT/WT
VAChTFlox/Flox, cre-
VAChTFlox/Flox, cre+
A.
B.
C.
Figura 35: Imunofluorescência para o VAChT em diafragma dos camundongos
VAChTFlox/Flox,
cre+
. Hemidiafragmas foram incubados com anticorpo anti-VAChT e
posteriormente com marcador de receptor nicotínico, a toxina α-bungarotoxina. A
figura exibe seções ópticas representativas de 2 experimentos distintos. Coluna 1:
VAChTWT/WT
Cre-
, coluna 2: AChTFlox/Flox
Cre-
e coluna 3 VAChTFlox/Flox
Cre+
. Linha A.
imunorreatividade para VAChT (verde), linha B: imunorreatividade para a toxina αbungarotoxina (vermelho) e linha C: sobreposição das imagens A e B. O núcleo das
células musculares foi marcado com o corante nuclear DAPI. Barra de escala 100
micrômetros.
100
Os camundongos VAChTFlox/Flox, cre- também não apresentaram alterações na expressão
do VAChT (Figura 35-coluna 2, linha A) e dos receptores nicotínicos (Figura 35-coluna
2, linha B) em relação aos animais VAChTWT/WT. Os outros hemidiafragmas foram
incubados com o anti-CHT1. Este anticorpo também mostrou imunorreatividade típica
de placas motoras na junção neuromuscular dos camundongos VAChTWT/WT (Figura 36Coluna 1-linha A). Os diafragma dos camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
(Figura 36-
Coluna 3-linha A) e VAChTFlox/Flox, cre- (Figura 36-Coluna 2-linha A) não apresentaram
diferença na imunorreatividade para o CHT1 na junção neuromuscular em relação ao
controle VAChTWT/WT.
Camundongos com deleção de um dos alelos do VAChT (VAChT WT/Del e
VAChT Flox/Del, cre+)
Durante os cruzamentos para a geração dos camundongos
VAChTFlox/Flox,Cre+ foi observado, inesperadamente, que os camundongos transgênicos
Cre-CamKIIα apresentavam expressão ectópica da cre nos testículos, o que acarretava
na deleção do gene do VAChT nas células germinativas. Portanto, nos cruzamentos
entre machos VAChT
WT/Flox, cre+
com fêmeas VAChT
WT/Flox, cre-
foram gerados
camundongos que apresentavam um alelo selvagem (ou um alelo Flox) para o VAChT e
um outro alelo deletado (camundongos VAChTWT/Del ou camundongos VAChTFlox/Del)
(Figura 37A). O cruzamento entre camundongos VAChTWT/Del, cre- permitiu a geração de
animais nocaute tradicionais para o VAChT (VAChT-KO), ou seja, animais nos quais o
gene do VAChT apresenta-se ausente em todos os tecidos do animal (trabalho de tese
de doutorado de Braulio Marcone de Castro). Nesse trabalho, entretanto será
101
VAChTWT/WT
VAChTFlox/Flox, cre-
VAChTFlox/Flox, cre+
A.
B.
C.
Figura 36: Imunofluorescência para o CHT1 em diafragma dos camundongos
VAChTFlox/Flox,
cre+
. Hemidiafragmas foram incubados com anticorpo anti-CHT1 e
posteriormente com marcador de receptor nicotínico, a toxina α-bungarotoxina. A
figura exibe seções ópticas representativas de 2 experimentos distintos. Coluna 1:
VAChTWT/WT
Cre-
, coluna 2: AChTFlox/Flox
Cre-
e coluna 3 VAChTFlox/Flox
Cre+
. Linha A.
imunorreatividade para CHT1 (verde), linha B: imunorreatividade para a toxina αbungarotoxina (vermelho) e linha C: sobreposição das imagens A e B. O núcleo das
células musculares foi marcado com o corante nuclear DAPI. Barra de escala 100
micrômetros.
102
apresentada
a
caracterização
bioquímica
dos
camundongos
VAChTWT/Del e
camundongos VAChTFlox/Del, cre+ .
1) Genotipagem dos camundongos com deleção de um dos alelos
do VAChT (VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+).
A genotipagem inicial dos camundongos VAChTWT/Del e dos
camundongos VAChTFlox/Del foi feita por Southern blotting. O DNA genômico extraído
de um fragmento da cauda dos animais foi digerido com a enzima de restrição NdeI,
corrido em gel de agarose 0,7% e transferido para membrana de nylon. Utilizou-se o
fragmento NdeI/PmeI marcado com fosfatase alcalina como sonda (Figura 37B). Como
pode ser observado na figura 37B o alelo deletado apresentou uma banda de
aproximadamente 9,0 Kb enquanto os alelos selvagem (WT) e (Flox) apresentaram
bandas de 5,7 Kb e 6,5 Kb respectivamente, confirmando a alteração gênica nessa
linhagem de animais.
Rotineiramente, os camundongos VAChTWT/Del e camundongos
VAChTFlox/Del,
cre+
utilizados nos experimentos foram genotipados por PCR. Para a
genotipagem eram realizadas duas reações de PCR, uma reação de 3 iniciadores (tabela
2-PCR1) para detectar os alelos WT ou Flox do VAChT (reação idêntica à detecção dos
alelos do VAChT nos animais VAChTFlox/Flox) e uma segunda reação de 4 iniciadores
(tabela 2-PCR2) para a detecção do gene da Cre e do alelo deletado do VAChT (Figura
37C). Na segunda reação de PCR cre foi detectada com iniciadores específicos (tabela
2) que amplificam um fragmento de aproximadamente 200 pares de bases (pb) e o alelo
deletado do VAChT foi detectado com os iniciadores P4F e P3F que amplificam um
103
H H
NdeI
H
Nhe/Spe
AscI
NotI
X
H
R
A.
VATDEL
loxP
P4F
P3F
329bp
10.0 Kb
B.
6.6 Kb
5.7 Kb
C.
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
1
2
3
4
Figura 37: Genotipagem dos camundongos VAChTWT/Del
e VAChTFlox/Del. A.
Desenho esquemático do loco colinérgico após perder o gene do VAChT e o cassete
(VATDEL). B. Análise de Southern. O alelo que não sofreu recombinação apresenta
uma banda de 5722 pb e o alelo Flox do VAChT apresenta uma banda de 6568 pb. O
alelo Del apresenta uma banda de 9,0 Kb. Coluna 1 (VAChTWT/WT), coluna 2
(VAChTFlox/Flox), coluna 3 (VAChTWT/Del) e coluna 4 (VAChTFlox/Del). C. Através de
duas amplificações foi possível distinguir os alelos do VAChT e o gene da Cre. Para a
primeira reação de amplificação (PCR1), o alelo selvagem amplifica uma banda de 304
pb e o alelo flanqueado por loxP amplifica um fragmento de 464 pb. Numa segunda
amplificação (PCR2) é possível identificar o alelo deletado, que amplifica uma banda de
329 pb e o gene da Cre que amplifica um fragmento de aproximadamente 200 pb. Na
figura estão representados 4 animais cujos genótipos são: animal 1 (VAChTWT/Del Cre-),
animal 2 (VAChTWT/Del
Cre+
), animal 3 (VAChTFlox/Del
Cre-
) e animal 4 (VAChTFlox/Del
Cre+
).
104
fragmento de 329 bp (Figura 37C).
2) Características fenotípicas dos camundongos com deleção de um
dos alelos do VAChT (VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+).
Os camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
desenvolvem-se normalmente e
ao nascer apresentam-se morfologicamente idênticos aos animais VAChT WT/WT, cre- da
mesma ninhada. Após o quinto dia de vida, os camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
apresentam dificuldade para se alimentar e movimentam-se pouco, indicando
dificuldade de coordenação motora e/ou fraqueza muscular generalizada. Esses
camundongos chegam a ser três vezes menores que os camundongos selvagens. A
média de peso dos camundongos VAChTFlox/Del
Cre+
aos 18 dias de vida é de
aproximadamente 4 gramas enquanto a média de peso dos camundongos VAChTWT/WT,
VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del,
cre-
é de 7.5 gramas (Figura 38B). Outra característica
marcante destes animais é o desenvolvimento anormal da coluna espinhal, o que leva os
camundongos a desenvolverem cifose e se tornarem corcundas (Figura 38A). O tempo
médio de vida dos camundongos VAChTFlox/Del, cre+ é de apenas 20 dias, indicando que
este genótipo diminuiu consideravelmente o tempo de vida destes animais, comparada à
média de 2 anos de vida de camundongos selvagens (WT) e de 8 semanas dos
camundongos VAChTFlox/Flox, cre+.
Assim como os camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
, os camundongos
VAChTFlox/Del, cre+passaram a receber suplementação alimentar com Nutela e maçã, além
de receberem soro fisiológico diariamente para evitar desidratação. A expectativa de
vida extremamente reduzida dos camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
, além da grande
debilidade física apresentada, tornou inviável a realização de testes comportamentais,
105
A.
VAChTWT/WT
VAChTWT/Del
12
B.
VAChTFlox/Del, creVAChTFlox/Del, cre+
Peso (gramas)
10
8
6
***
4
2
0
Figura 38: Caracterização fenotípica dos camundongos VAChTFlox/Del,
A) A seta mostra o animais VAChTFlox/Del
mostra o camundongo VAChTFlox/Del
Cre+
Cre+
cre+
.
com 10 dias de vida. A foto ao lado
com 18 dias ao lado de uma animal
VAChTWT/WT. A seta mostra a cifose desenvolvida pelos camundongos VAChTFlox/Del
Cre+
. B) Gráfico da média de peso dos camundongos em gramas ±erro padrão da média
mostrando que os camundongos VAChTFlox/Del, cre+ (Barra cinza quadriculada) possuem
uma grande diferença de peso em relação aos camundongos VAChTWT/WT (Barra
branca), VAChTWT/Del (barra negra) e VAChTFlox/Del, cre- (Barra cinza). Anova de uma
via com post hoc Bonferroni mostrou diferença estatisticamente significativa entre os
camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
em relação aos animais dos outros 3 genótipos.
[F(3,36) = 17,41] *** p<0,001.
106
complexos, ou mesmo testes de força. Entretanto a coordenação motora dos
camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
foi analisada através do teste de perfil de pegada
(footprint pattern). O teste para avaliar a coordenação motora (footprint) mostra que os
animais VAChTFlox/Del cre+ foram capazes de andar, mas com dificuldade em percorrer o
trajeto em linha reta em relação aos camundongos VAChTWT/WT (Figura 39A). Os
camundongos VAChTFlox/Del cre+ apresentaram também uma grande redução no tamanho
das passadas. Enquanto a média da largura das passadas nos camundongos
VAChTFlox/Del
cre+
foi de 2,5 cm, a média exibida pelos animais VAChTWT/WT,
VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre- foi de 5,0 cm (Figura 39B).
3) Análise dos níveis de mRNA do VAChT e de outros
marcadores colinérgicos nos camundongos com deleção de um dos
alelos do VAChT (VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del,cre+).
A análise da expressão gênica do VAChT nas regiões da medula
espinal e estriado foi realizada através de PCR em tempo real. O gráfico da figura 40
apresenta uma grande redução na expressão de RNA mensageiro para o VAChT nos
animais VAChTFlox/Del,cre+ em relação aos camundongos VAChTWT/WT na região da
medula espinal. A redução da expressão foi em torno de 83% nos camundongo
VAChTFlox/Del cre+, 25% nos animais VAChTWT/Del e 40% nos animais VAChTFlox/Del Cre-,
respectivamente (Figura 40A).
Foi avaliada também a expressão de RNA mensageiro do VAChT na região do
estriado. O resultado da figura 40B mostra que na região do estriado também houve
uma redução, em torno de 82%, nos níveis de RNA mensageiro para o VAChT para os
camundongos VAChTFlox/Del Cre+ em relação aos animais VAChTWT/WT.
107
A.
VAChTWT/WT
VAChTWT/Del
VAChTFlox/Del, cre-
B.
VAChTFlox/Del, cre+
Largura das pegadas (cm)
6
VAChTWT/WT
VAChTFlox/Del, cre+
5
4
3
***
2
1
0
Figura 39: Teste para avaliar a coordenação motora nos camundongos VAChTFlox/Del, cre+ (footprint): A). Figura representativa do caminhar
dos camundongos VAChTWTWT e VAChTFlox/Del,
cre+
. Os camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
e VAChTWT/WT foram submetidos a uma caminhada sobre
papel branco com as patas traseiras molhadas em tinta preta. Os animais VAChTFlox/Del,
cre+
não conseguem caminhar em linha reta como os
camundongos VAChTWT/WT. A seta indica o sentido da caminhada. B) Gráfico da largura das passadas. A largura das passadas (em centímetros) foi
medida entre dois passos de uma mesma perna. Anova de uma via com post hoc Bonferroni mostrou que a largura das passadas dos camundongos
VAChTFlox/Del, cre+ é menor em relação aos animais VAChTWT/WT, VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre-. [F(3,33)=21,48].
108
A.
B.
Figura 40: Gráfico da quantificação da expressão de mRNA do VAChT nos
camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
por PCR em tempo real. Para a reação de PCR
foram utilizados iniciadores específicos para o gene do VAChT que produziu um
fragmento esperado de aproximadamente 200 pb. O gráfico representa a média de 4-6
experimentos ±erro padrão da média. A análise ANOVA de uma via com post hoc
Bonferroni apontou diferença estatisticamente significativa nos níveis transcricionais do
transportador nos animais VAChTWT/Del, VAChTFlox/Del, cre- e VAChTFlox/Del, cre+ [F(3,18)
=45,91] na região da medula espinal e [F(3,12)=28,48] na região do estriado ** e *
estatisticamente significativo em relação ao WT; # estatisticamente significativo em
relação ao animais VAChTWT/Del.
109
Observou-se que a redução da expressão de RNA mensageiro para o
VAChT no estriado foi diferente à observada na medula espinal para os animais
VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del,
cre-
. Os camundongos VAChTWT/Del apresentam uma
redução em torno de 50% da expressão do VAChT no estriado. Já os animais
VAChTFlox/Del,
cre-
apresentaram uma redução ainda maior da expressão do VAChT,
aproximadamente 80%, e este nível de redução foi próximo ao obtido pelos
camundongos VAChTFlox/Del Cre+.
Os níveis de expressão de RNA mensageiro para a enzima ChAT na
medula espinal também foram medidos. O gráfico da figura 41 mostra que há uma
tendência ao aumento da expressão da ChAT em todos os genótipos. (Figura 41),
embora estatisticamente não significativo.
4) Análise da expressão protéica do VAChT e de outros
marcadores colinérgicos no cérebro dos camundongos com deleção de
um dos alelos do VAChT (VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+).
A análise dos níveis protéicos do VAChT no cérebro dos animais
VAChTFlox/Del, cre+ é importante para que possamos identificar as regiões do cérebro onde
foi
abolida
a
expressão
do
VAChT.
Nossa
primeira
avaliação
foi
por
imunofluorescência no cérebro que nos permite uma visualização espacial da presença
ou ausência de imunorreatividade para o transportador no sistema nervoso central e
periférico destes animais.
110
Figura 41: Gráfico da quantificação da expressão de mRNA da ChAT dos
camundongos VAChTFlox/Del
Cre+
por PCR em tempo real. Amostras de RNA
extraídas da região da medula espinal dos camundongos (VAChTFlox/Del, cre+) e controles
VAChTWT/WT, VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre- foram submetidas a transcrição reversa
para a geração de cDNA. Para a reação de PCR foram utilizados iniciadores específicos
para o gene da ChAT que produziu um fragmento esperado de aproximadamente 200
pb. O gráfico representa a média de 4 experimentos ±erro padrão da média A análise
ANOVA de uma via não apontou diferença estatisticamente significativa nos níveis
transcricionais da ChAT entre os genótipos [F(3,12) = 3,163].
111
Os
camundongos
VAChTFlox/Del,cre+
não
apresentam
imunorreatividade para o VAChT em diversas regiões do SNC, além de importantes
áreas do prosencéfalo basal como septo medial e extremidades vertical e horizontal da
banda de Broca. Não foi observada a marcação das terminações nervosas colinérgicas
nas regiões do hipocampo (Figuras 42A-coluna 4), córtex (Figuras 43A-coluna 4) e
ausência de imunorreatividade para o VAChT nos interneurônios colinérgicos estriatais
(Figuras 44A-coluna 4).
No tronco encefálico, a imunorreatividade para o VAChT estava
presente, entretanto foi observada uma redução da expressão do VAChT principalmente
nas terminações nervosas colinérgicas na região do núcleo facial (7N) nos camundongos
VAChTFLox/Del Cre+ (Figura 45, coluna 4). Detectamos também imunorreatividade para o
VAChT nos neurônios colinérgicos do núcleo pedunculopontino dos camundongos
VAChTFlox/Del,
cre+
(Figura 46A, coluna 4), embora com uma redução da
imunorreatividade para o transportador.
Interessantemente, os animais VAChTFlox/Del,
cre-
apresentaram
imunorreatividade para VAChT muito semelhante aos animais VAChTFlox/Del, cre+. Não
foi detectada imunorreatividade para o VAChT nas regiões do hipocampo (Figura 42Acoluna 3) e córtex (Figura 43A-coluna 3). Na região do estriado foi possível observar
alguns interneurônios positivos (Figura 44A, coluna 3). A imunorreatividade para o
VAChT na região do tronco encefálico dos camundongos VAChTFlox/Del,
semelhante à observada para o animal VAChTFlox/Del,
cre+
cre+
foi
. Este dado de
imunofluorescência se mostra intrigante, pois os camundongos VAChTFlox/Del,
apresentam o fenótipo típico do animal VAChTFlox/Del,
cre-
cre-
não
: não desenvolvem cifose,
conseguem sobreviver até a idade adulta e são férteis.
112
VAChTWT/WT
VAChTWT/Del
VAChTFlox/Del, cre-
VAChTFlox/Del, cre+
A.
B.
Figura 42: Imunofluorescência na região do hipocampo dos camundongos VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del. Fatias seriais de cérebro
dos animais VAChTFlox/Del, cre+. VAChTFlox/Del, cre-, VAChTWT/Del e VAChTWT/WT foram imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e CHT1.
A figura exibe seções ópticas representativas da região CA1 do hipocampo. (A) imunorreatividade para o VAChT (B) imunorreatividade para
o CHT1. O núcleo das células foi corado com o marcador nuclear DAPI. Coluna 1: (VAChTWT/WT), coluna 2 (VAChTWT/Del-), coluna 3
(VAChTFlox/Del, cre-). e coluna 4 (VAChTFlox/Del, cre+).
113
VAChTWT/WT
VAChTWT/Del
VAChTFlox/Del, cre-
VAChTFlox/Del, cre+
A.
B.
Figura 43: Imunofluorescência na região do córtex dos camundongos VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del. Fatias seriais de cérebro dos
animais VAChTFlox/Del,
cre+
. VAChTFlox/Del,
cre-
, VAChTWT/Del e VAChTWT/WT foram imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e
CHT1. A figura exibe seções ópticas representativas de terminações nervosas da região M1 do córtex cerebral. (A) imunorreatividade
para o VAChT (B) imunorreatividade para o CHT1. O núcleo das células foi corado com o marcador nuclear DAPI. Coluna 1:
(VAChTWT/WT), coluna 2 (VAChTWT/Del-), coluna 3 (VAChTFlox/Del, cre-). e coluna 4 (VAChTFlox/Del, cre+).
114
VAChTWT/WT
VAChTWT/Del
VAChTFlox/Del, cre-
VAChTFlox/Del, cre+
A.
B.
Figura 44: Imunofluorescência na região do estriado dos camundongos VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del. Fatias seriais de cérebro
dos animais VAChTFlox/Del, cre+. VAChTFlox/Del, cre-, VAChTWT/Del e VAChTWT/WT foram imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e
CHT1. A figura exibe seções ópticas representativas de interneurônios da região do estriado. (A) imunorreatividade para o VAChT (B)
imunorreatividade para o CHT1. O núcleo das células foi corado com o marcador nuclear DAPI. Coluna 1: (VAChTWT/WT), coluna 2
(VAChTWT/Del-), coluna 3 (VAChTFlox/Del, cre-). e coluna 4 (VAChTFlox/Del, cre+).
115
VAChTWT/WT
VAChTWT/Del
VAChTFlox/Del, cre-
VAChTFlox/Del, cre+
A.
B.
Figura 45: Imunofluorescência no núcleo facial 7N dos camundongos VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del. Fatias seriais de cérebro
dos animais VAChTFlox/Del, cre+. VAChTFlox/Del, cre-, VAChTWT/Del e VAChTWT/WT foram imunomarcadas com os anticorpos do VAChT e
CHT1. A figura exibe seções ópticas representativas de motoneurônios do núcleo facial 7N da região do tronco encefálico. (A)
imunorreatividade para o VAChT (B) imunorreatividade para o CHT1. O núcleo das células foi corado com o marcador nuclear DAPI.
Coluna 1: (VAChTWT/WT), coluna 2 (VAChTWT/Del-), coluna 3 (VAChTFlox/Del, cre-). e coluna 4 (VAChTFlox/Del, cre+).
116
VAChTWT/WT
VAChTWT/Del
VAChTFlox/Del, cre-
VAChTFlox/Del, cre+
A.
B.
Figura 46: Imunofluorescência no núcleo pedunculopontino dos camundongos VAChTFlox/Del,
cérebro dos animais VAChTFlox/Del,
cre+
. VAChTFlox/Del,
cre+
e VAChTWT/Del. Fatias seriais de
cre-
, VAChTWT/Del e VAChTWT/WT foram imunomarcadas com os anticorpos do
VAChT e CHT1. A figura exibe seções ópticas representativas de neurônios do núcleo pedunculopontino da região do tronco encefálico. (A)
imunorreatividade para o VAChT (B) imunorreatividade para o CHT1. O núcleo das células foi corado com o marcador nuclear DAPI.
Coluna 1: (VAChTWT/WT), coluna 2 (VAChTWT/Del-), coluna 3 (VAChTFlox/Del, cre-). e coluna 4 (VAChTFlox/Del, cre+)
117
Os animais VAChTWT/Del apresentaram imunorreatividade para o
VAChT nas diversas regiões do SNC. Entretanto, foi observada uma redução da
imunorreatividade do transportador nas terminações colinérgicas das regiões do córtex
(Figura 42A-coluna 2) e hipocampo (Figura 43A-coluna 2), além dos neurônios
colinérgicos estriatais (Figura 44A-coluna 2) e do tronco encefálico (Figura 45 e 46Acoluna 2). A redução da imunorreatividade para o VAChT apresentada pelos
camundongos VAChTWT/Del foi semelhante à observada para os camundongos KDHET.
Fatias
VAChTFlox/Del,
seriais
do
cérebro
dos
animais
VAChTFlox/Del,
cre+
,
cre-
, VAChTWT/Del e VAChTWT/WT foram também incubadas com
anticorpo anti-CHT1. As figuras 42 a 46 (painel B) ilustram a imunorreatividade para o
CHT1 nas regiões do estriado, hipocampo, córtex, tronco encefálico e núcleo
pedunculopontino onde podemos verificar que não houve alterações aparentes na
expressão do transportador de colina de alta afinidade entre os genótipos.
A expressão do VAChT foi analisada também por imunoblot. Foram
utilizados tecidos de diferentes regiões do SNC dos animais VAChTWT/Del,
VAChTFlox/Del, cre- e VAChTFlox/Del, cre+. O resultado da figura 47 mostra que houve uma
grande redução na expressão protéica do VAChT nas regiões do tronco encefálico e
medula espinal dos animais VAChTFlox/Del Cre+ (Coluna 3). No entanto, nas regiões do
córtex cerebral e hipocampo foi verificada total ausência da expressão da proteína do
transportador.
A expressão protéica da ChAT e CHT1 (Figura 47) dos animais
VAChTWT/Del, VAChTFlox/Del
Cre-
e VAChTFlox/Del
Cre+
foi também analisada por
imunoblot. A quantificação da expressão não apontou alterações da expressão destas
duas proteínas nos três genótipos analisados. Entretanto, houve grande variação entre as
amostras, tornando este dado preliminar pouco conclusivo.
118
E.
Figura
47:
Imunorreatividade para
VAChT,
ChAT
e
CHT1
nos
camundongos VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del. Análise por imunoblot de VAChT,
ChAT, CHT1 e actina nas regiões do tronco encefálico (A), medula espinal (B), córtex
cerebral (C) e hipocampo (D) dos animais VAChTWT/Del (coluna 1), VAChTFlox/Del Cre(coluna 2) e VAChTFlox/Del Cre+ (coluna 3). (E) Quantificação da expressão do VAChT,
ChAT e CHT1, respectivamente. O gráfico mostra que houve uma grande redução na
expressão do VAChT nas regiões do tronco e medula espinal para os camundongs
VAChTFlox/Del, cre- e VAChTFlox/Del, cre+ em relação aos animais VAChTWT/Del, enquanto a
expressão do VAChT foi totalmente abolida no córtex e hipocampo. (***).
Estatisticamente significativo em relação ao VAChTWT/Del.
119
5) Análise da expressão protéica do VAChT no sistema nervoso
periférico dos camundongos com deleção de um dos alelos do VAChT
(VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+).
Nós também analisamos se houve alteração na expressão do VAChT
no sistema nervoso periférico dos camundongos VAChTFlox/Del, cre+. Com este objetivo,
foi realizada imunofluorescência em diafragmas. Os hemidiafragmas foram incubados
com anticorpos anti-VAChT e anti-CHT1. Posteriormente, adicionamos a αbungarotoxina conjugada com Alexa 555 para identificar receptores nicotínicos.
Os resultados obtidos (Figura 48) nos mostram uma pequena redução
na imunorreatividade para o VAChT nos animais VAChTWT/Del, VAChTFlox/Del
Cre-
e
VAChTFlox/Del Cre+ em relação ao animal VAChTWT/WT (linha A). Não foi verificada uma
redução aparente da marcação dos receptores nicotínicos, pela α-bungarotoxina, nos
camundongos VAChTWT/Del, VAChTFlox/Del,
cre-
e VAChTFlox/Del,
cre+
em relação ao
animal VAChTWT/WT (linha B).
O fragmento contralateral do diafragma foi incubado com anticorpo
anti-CHT1 e o resultado da figura 49 (linha A) nos sugere ausência de alterações
visíveis na imunorreatividade para o CHT1 para os camundongos VAChTWT/Del,
VAChTFlox/Del Cre- e VAChTFlox/Del Cre+ em relação ao animal VAChTWT/WT.
6) Análise da liberação de acetilcolina na junção neuromuscular
dos camundongos com deleção de um dos alelos do VAChT
(VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+).
.
120
VAChTWT/WT
VAChTWT/Del
VAChTFlox/Del, cre-
VAChTFlox/Del, cre+
A)
B)
C)
Figura 48: Imunofluorescência para o VAChT em diafragma dos camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
e VAChTWT/Del Hemidiafragmas
foram incubados com anticorpos anti-VAChT e posteriormente com marcador de receptor nicotínico, a toxina α-bungarotoxina acoplada ao fluoróforo
AlexaFluor 555. A figura exibe seções ópticas representativas de 4 experimentos distintos. Coluna 1: VAChTWT/WT Cre-, coluna 2: VAChTWT/Del, coluna
3: VAChTFlox/Del, cre- e coluna 4: VAChTFlox/Del, cre+. Linha (A): imunorreatividade para VAChT (verde), linha (B): imunorreatividade para a toxina αbungarotoxina (vermelho) e linha (C): (sobreposição das imagens). O núcleo das células musculares foi marcado com o corante nuclear DAPI.
121
VAChTWT/WT
VAChTWT/Del
VAChTFlox/Del, cre-
VAChTFlox/Del, cre+
A)
B)
C)
Figura 49: Imunofluorescência para o CHT1 em diafragma dos camundongos VAChTFlox/Del, cre+ e VAChTWT/Del Hemidiafragmas
foram incubados com anticorpos anti-CHT1 e posteriormente com marcador de receptor nicotínico, a toxina α-bungarotoxina acoplada ao
fluoróforo AlexaFluor 555. A figura exibe seções ópticas representativas de 4 experimentos distintos. Coluna 1: VAChTWT/WT
VAChTWT/Del, coluna 3: VAChTFlox/Del,
cre-
e coluna 4: VAChTFlox/Del,
Cre-
, coluna 2:
cre+
. Linha (A): imunorreatividade para VAChT (verde), linha (B):
imunorreatividade para a toxina α-bungarotoxina (vermelho) e linha (C): (sobreposição das imagens). O núcleo das células musculares foi
marcado com o corante nuclear DAPI
122
A
liberação
de
acetilcolina
na
junção
neuromuscular
dos
camundongos com deleção de um dos alelos do VAChT, na idade de 18 dias, foi
analisada pelo registro de MEPPs e cálculos de tamanho e conteúdo do quanta. A
análise cumulativa da amplitude dos MEEPs mostrou um aumento no tamanho do
quanta dos animais VAChTFlox/Del
VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del,
cre-
Cre+
quando comparado aos animais VAChTWT/WT,
(Figura 50A). Este dado sugere um aumento na
quantidade de neurotransmissor na vesícula dos VAChTFlox/Del
Cre+
. Entretanto, não
observamos alteração na freqüência destes mEEPs entre os 4 genótipos analisados
(Figura 50B), indicando não haver alterações na probabilidade de liberação vesicular ou
no pool prontamente liberável (readly releasable pool).
7) Dosagem de acetilcolina no cérebro dos camundongos com deleção
de um dos alelos do VAChT (VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del, cre+)
Para avaliar as conseqüências da diminuição da expressão do
VAChT, investigamos o conteúdo de acetilcolina cerebral nos camundongos
VAChTFlox/Del, cre+. Os animais VAChTFlox/Del, cre+ apresentaram níveis elevados de Ach
tecidual (Figura 51). Nossos resultados indicam que os animais VAChTFlox/Del,
cre+
apresentam, aproximadamente, 12 vezes mais acetilcolina tecidual em relação aos
animais selvagens VAChTWT/WT (Figura 51). Aumento semelhante na concentração de
ACh foi observado nos camundongos VAChTFlox/Del,
cre-
, enquanto os camundongos
VAChTWT/Del exibiram o dobro de acetilcolina observada nos animais selvagens
(VAChTWT/WT Cre-).
123
1.0
A.
Freq. Cumulativa
0.8
0.6
0.4
WT/WT
WT/DEL
FLOX/DEL
FLOX/DEL CRE+
0.2
0.0
0
1
2
3
4
5
Amplitude (mV)
B.
WT/WT
WT/DEL
FLOX/DEL
FLOX/DEL CRE+
1.0
MEPPs/seg
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Figura 50: Liberação de acetilcolina na junção neuromuscular (JNM) dos
camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
e VAChTWT/Del. A) Gráfico da distribuição
cumulativa dos MEEPs mostrando um aumento do conteúdo quantal na JNM dos
camundongos VAChTFlox/Del, cre+ (linha azul) em relação as animais VAChTWT/WT (linha
negra), VAChTWT/Del (linha vermelha) e VAChTFlox/Del, cre- (linha verde). B) Gráfico da
freqüência dos MEEPS. A análise estatística não mostrou diferenças significativas entre
os genótipos.
124
WT/WT
WT/Del
Flox/Del Cre-
Acetilcolina (pmols/mg de proteina)
2500
Flox/Del Cre+
2000
#
#
***
***
1500
1000
500
*
0
Figura 51: Dosagem de ACh no cérebro dos camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
e
VAChTWT/Del. Medida do conteúdo tecidual de acetilcolina na região do estriado dos
animais VAChTWT/WT (barra branca), VAChTWT/Del (barra preta), VAChTFlox/Del,
cre-
(barra cinza) e VAChTFlox/Del, cre+ (barra cinza com listras diagonais), respectivamente. O
gráfico apresenta a média de 4 a 9 experimentos ± erro padrão da média. A análise
estatística utilizando Anova de uma via com post hoc Bonferroni mostrou diferença
estatisticamente significativa entre os grupos. [F(2,14)=21,98]; * p<0,05 e ***
p<0,0001, estatisticamente significativo em relação aos animais VAChTWT/WT;
#estatisticamente significativo em relação aos animais VAChTWT/Del.
125
8)
Atividade
da
colina
acetiltransferase
(ChAT)
nos
camundongos com deleção de um dos alelos do VAChT (VAChTWT/Del e
VAChTFlox/Del, cre+).
Como foi observado um aumento muito grande do conteúdo tecidual
de acetilcolina nos camundongos VAChTFlox/Del, cre- e VAChTFlox/Del, cre+, investigamos se
a atividade da ChAT estava alterada nesses animais. Nenhuma alteração
estatisticamente significativa foi observada na atividade da ChAT quando comparada à
atividade enzimática apresentada pelos camundongos VAChTWT/WT, VAChTWT/Del e
VAChTFlox/Del, cre- (Figura 52), sugerindo que o aumento do conteúdo de acetilcolina no
cérebro dos camundongos VAChTWT/Del, VAChTFlox/Del, cre- e VAChTFlox/Del, cre+ não se
deve a alterações na atividade da colina acetiltransferase.
126
Atividade da ChAT (nmols/mg proteina/hora)
WT/WT
WT/Del
80
Flox/Del CreFlox/Del Cre+
60
40
20
0
Figura 52: Atividade da enzima colina acetiltransferase (ChAT) nos
camundongos VAChTFlox/Del,
VAChTFlox/Del,
cre-
cre+
. Extratos de hipocampo dos animaisVAChTWT/WT,
e VAChTFlox/Del,
cre+
foram incubados com
14C
acetil-CoA e colina, a
acetilcolina formada recuperada e a radioatividade contada em cintilador líquido. Os
dados expressam a média de 3 experimentos ± erro padrão da média. A análise
estatística foi realizada utilizando análise de variância Anova de uma via não mostrou
diferença estatisticamente significativa entre os grupos. [F(3,16)=0,5427]. VAChTWT/WT
Cre-
(barra branca), VAChTWT/Del
Cre-
(barra preta), VAChTFlox/Del
Cre-
(barra cinza) e
VAChTFlox/Del Cre+ (barra cinza com listras diagonais), respectivamente.
127
DISCUSSÃO
A estratégia de manipulação molecular de genes de mamíferos vem
trazendo importantes avanços nos estudos da função de proteínas específicas in vivo. Ao
abolir ou reduzir a expressão de uma proteína de interesse, é possível avaliar o papel
fisiológico desta proteína, bem como os fatores adaptativos decorrentes. Esta
metodologia vem trazendo também novas e importantes informações a respeito das
proteínas responsáveis pela manutenção da neurotransmissão colinérgica. Os diversos
estudos anteriores com o uso de drogas, toxinas ou lesões mecânicas no cérebro de
roedores mostraram a relevância do sistema colinérgico em funções cognitivas
complexas como memória espacial e aprendizado (Chambon e cols., 2007; Kim e cols.,
2004; Berger-Sweeney e cols., 1994). Entretanto, estas ferramentas, embora seletivas,
não afetam exclusivamente o sistema colinérgico e podem afetar outros grupos de
neurônios.
A homeostase colinérgica foi profundamente afetada quando a
expressão de dois genes essenciais foi abolida: a enzima colina acetiltransferase (ChAT)
e o transportador de colina de alta afinidade (CHT1). Os camundongos nocaute para a
ChAT morrem logo após o nascimento devido à ausência de transmissão nervosa na
junção neuromuscular (Misgeld e cols., 2002; Brandon e cols., 2003). A ChAT é a
enzima responsável pela síntese de ACh. Nos camundongos nocaute para a ChAT foi
observado que a ausência da acetilcolina leva a um desenvolvimento aberrante das
junções neuromusculares, prejudicando a sinaptogênese e a centralização das junções
(Misgeld e cols., 2002). Entretanto, os animais que expressam apenas 50% da ChAT
(heterozigotos) não apresentam alterações musculares e cognitivas aparentes (Brandon e
cols., 2004). Apesar da atividade enzimática muito reduzida, a análise neuroquímica
mostrou que estes camundongos sintetizam acetilcolina normalmente. Além disso, foi
observado um aumento significativo na expressão do CHT1. Esta adaptação favorece a
129
captação de uma quantidade maior de colina disponível para a ChAT remanescente, já
que esta enzima trabalha em excesso cinético (Brandon e cols., 2004).
Os animais nocaute para o CHT1 também morrem logo após o
nascimento e apresentam as mesmas anomalias no desenvolvimento da junção
neuromuscular (Fergunson e cols., 2003). Já os animais heterozigotos apresentam um
desenvolvimento normal mantendo uma taxa de transporte de colina similar à observada
nos controles. Acredita-se que os neurônios colinérgicos monitorem a disponibilidade
do CHT1 na membrana pré-sináptica e mobilizem seu pool intracelular de reserva. Esta
adaptação poderia manter a captação do precursor da acetilcolina apesar da expressão
reduzida do CHT1 (Fergunson e cols., 2003).
A ChAT e o CHT1 têm papel importante na síntese de acetilcolina,
no entanto a armazenagem do neurotransmissor em vesículas sinápticas parece depender
especificamente da atividade do VAChT. O papel desse transportador “in vivo” para
manter a liberação de ACh e sua influência no tônus colinérgico são ainda pouco
compreendidos. Com o objetivo de estudar o papel do VAChT na manutenção do tônus
colinérgico, geramos diferentes linhagens de animais em que o gene do VAChT foi
alterado, utilizando a tecnologia da recombinação homóloga.
Camundongos VAChT “Knockdown”
Animais que não expressam o VAChT (nocautes-KO) morrem 5
minutos após o nascimento (Castro e colaboradores, comunicação pessoal). A
inviabilidade dos camundongos nocaute para o VAChT dificulta a realização de estudos
mais complexos. Nosso foco principal foi desenvolver animais com alteração na
expressão do VAChT. Porém, o ideal é que estes camundongos sobrevivam para que as
130
conseqüências da alteração do VAChT para o tônus colinérgico fosse estudados em
animais adultos.
Nossa estratégia inicial, foi inserir um cassete contendo o gene de
resistência da neomicina na região 5’ não traduzida do gene do VAChT. A organização
gênica do VAChT é bem peculiar em metazoários: o seu gene está dentro do primeiro
intron do gene da ChAT (Bejanin e cols., 1994; Cervini e cols., 1995 ). Já foi
demonstrada a existência de diversas espécies de RNA mensageiro para o VAChT sob
controle de promotores distintos ou compartilhados com a ChAT (Oda., 1999). Para
murinos são conhecidas 5 espécies de RNA mensageiro. Experimentos de RT-PCR
conseguiram identificar 3 destes RNAs, chamados V1, V2 e V3 (Benjanim e cols., 1994
). Nós conseguimos identificar duas espécies de RNA mensageiro para o VAChT por
Northern blot: V1 e V2. A inserção do cassete de neomicina na região 5’ do gene do
VAChT levou a uma grande redução na expressão da espécie de RNA mensageiro mais
abundante V1. Os animais heterozigotos apresentaram uma redução de 40% na
expressão do RNA mensageiro do VAChT, enquanto os camundongos homozigotos
mostraram uma redução ainda mais acentuada, em torno de 70%. Este perfil de redução
foi observado em todas as regiões analisadas do SNC destes animais mutantes.
Interessantemente, foi observado um aumento da expressão do RNA mensageiro V2 nos
camundongos mutantes. É provável que mecanismos transcricionais compensatórios
estejam atuando para minimizar os efeitos da redução de V1 (Prado e cols., 2006).
Entretanto, os mecanismos responsáveis pelo controle da expressão gênica do VAChT
são ainda pouco esclarecidos.
Existem evidências que indicam que a expressão do VAChT e da
ChAT pode ser regulada tanto de maneira coordenada quanto de maneira independente
(Loreiro dos Santos et al., 2002; revisto por Eiden; 1998). Ao interferirmos na
131
expressão gênica do transportador poderíamos afetar a expressão da colina
acetiltransferase, entretanto, a análise por Northern-blot não mostrou diferenças na
expressão da ChAT nos animais mutantes em nenhuma das regiões analisadas.
O CHT1 é um outro membro importante na manutenção da
homeostase colinérgica e sua expressão poderia ter sido alterada com a diminuição da
expressão do VAChT. Porém, nossos resultados mostraram que os níveis de RNA
mensageiro para o CHT1 estão normais nos mutantes. Esses dados indicam que a
inserção do cassete de neomicina na região 5’ não traduzida do gene do VAChT
diminuiu a expressão do VAChT e que outros marcadores colinérgicos (ChAT e CHT1)
não foram alterados.
Para o ensaio de Northern blotting foi necessário utilizar uma grande
quantidade de RNA mensageiro purificado, em torno de 10μg, para que pudéssemos
detectar os RNAs mensageiros do VAChT, uma vez que eles são pouco expressos. Para
obtermos essa grande quantidade de mRNA foi necessário extrair RNA total a partir de
um “pool” de tecido de aproximadamente 15 animais de cada genótipo. A baixa
expressão do mRNA para o VAChT pode ser observada também nos experimentos de
hibridização in situ do “Allen Brain Atlas” que mostram a expressão reduzida do
VAChT em comparação à expressão de RNA mensageiro da ChAT e CHT1 (Figura
53). Era possível que não detectássemos alterações mais sutis na expressão do VAChT
no momento em que reunimos o RNA de um grande número de animais de mesmo
genótipo. Assim, analisamos a expressão gênica do VAChT, ChAT e CHT1 através da
PCR em tempo real. Como esta técnica é bem sensível (Bustin., 2002) e utiliza
quantidades pequenas de amostra, foi possível analisar a expressão gênica de cada
animal individualmente, e assim, avaliar melhor as alterações na expressão de cada
gene.
132
Figura 53: Expressão de RNA do VAChT, ChAT e CHT1 no cérebro de camundongos por hibridização in situ. A figura representa fatias
sagitais de cérebro de camundongos incubadas com seqüências “antisense” para os genes do VAChT, ChAT e CHT1, respectivamente. É
possível observar que a expressão do VAChT é bem menor em relação à ChAT e CHT1. Modificado de Allen Brain Atlas (http://www.brainmap.org).
133
A utilização de iniciadores específicos para a região interna do gene
do VAChT, que amplifica todas as espécies de RNA do transportador, mostrou que
houve uma redução geral nos níveis de expressão do RNA mensageiro do VAChT nos
camundongos mutantes. A redução da expressão do VAChT foi em torno de 40% nos
animais heterozigotos e de aproximadamente 70% nos camundongos homozigotos.
Portanto, os resultados do PCR quantitativo confirmaram a redução da expressão do
VAChT nestes animais e nos indicaram que conseguimos gerar uma linhagem de
camundongos em que a expressão gênica do VAChT foi reduzida, mas que no entanto
essa redução permitiu a sobrevivência desses animais.
Nós utilizamos a metodologia de PCR em tempo real para avaliar
também a expressão da ChAT e do CHT1. Confirmando os resultados obtidos por
Northern, não foram observadas alterações na expressão da ChAT nas regiões da
medula espinal, tronco encefálico e estriado. A análise do CHT1 também não apontou
modificações na expressão do transportador no tronco encefálico. Assim, passamos a
fazer todas as análises de expressão gênica utilizando a técnica de PCR quantitativo.
A expressão reduzida do RNA do VAChT nos camundongos
mutantes levou a uma redução da expressão da proteína do VAChT. Os animais
heterozigotos apresentaram uma redução de aproximadamente 40% na expressão do
VAChT enquanto esta redução foi mais pronunciada nos camundongos homozigotos,
em torno de 65%. Esta redução da expressão do VAChT foi observada em diferentes
regiões do sistema nervoso central nos camundongos mutantes. Dessa forma, foram
gerados camundongos que apresentam redução geral da expressão do VAChT (VAChT
Knockdown).
A alteração genética para o gene do VAChT não afetou o
desenvolvimento dos animais. Os camundongos VAChT KD nascem na proporção
134
Mendeliana e não são observadas alterações morfológicas grosseiras. São utilizados
rotineiramente para cruzamentos e atingem a expectativa de vida esperada para
roedores. Uma vez identificado que a introdução do cassete de neomicina na região 5’
não traduzida do VAChT gerou animais com expressão diminuída do VAChT, nós
passamos a investigar se a expressão reduzida do VAChT afeta a
liberação de
acetilcolina. Os estudos eletrofisiológicos obtidos na junção neuromuscular do
diafragma dos camundongos indicaram que os animais KDHET apresentaram uma
alteração moderada no tamanho do quantum sem alterações significativas na freqüência
de potenciais de placa motora em miniatura (MEPPs). Entretanto, os camundongos
KDHOM demonstraram uma redução marcante na freqüência e amplitude do quantum em
relação aos animais controle (WT) (Prado e cols., 2006). Outros experimentos,
utilizando o corante FM1-53, excluíram prováveis falhas na exocitose e endocitose nos
animais mutantes e indicaram não haver diferença no número de vesículas presentes nas
terminações nervosas dos animais nos diferentes genótipos. Embora os mecanismos não
estejam completamente elucidados, é sabido que o VAChT possui papel importante na
regulação do tamanho quântico (Parsons, 1993; Naves e Van Der Kloot., 2001; e revisto
por Van Der Kloot., 2003). Nossa hipótese é que os camundongos VAChT KDHOM
apresentam um preenchimento vesicular ineficiente gerado pela grande redução da
expressão do transportador (Prado e cols., 2006). Nesse caso, a freqüência reduzida dos
MEPPs nestes animais pode ser explicada pela existência de vesículas sem
neurotransmissor ou existência de vesículas com pequenas quantidades de acetilcolina
que estejam abaixo do nível de detecção da técnica (revisto por Van Der Kloot., 1991;
Prado e cols., 2006).
Nossa próxima pergunta foi: As alterações eletrofisiológicas
observadas nos camundongos KD alteram a função motora? Foram realizados vários
135
testes para avaliar a função motora dos camundongos (força de agarre, wire hang,
rotarod e esteira), e em todos eles os camundongos KDHET obtiveram desempenho
semelhante ao dos animais selvagens (Prado e cols., 2006). Estes dados indicam que
uma redução em 40% na expressão do VAChT não é suficiente para superar a margem
de segurança da junção neuromuscular. Diferentemente, os camundongos KDHOM
apresentaram redução pronunciada da força muscular além de apresentarem fadiga nos
testes utilizados. Este resultado nos indica que a redução do VAChT em torno de 70% é
suficiente para ultrapassar a margem de segurança da junção e gerar déficits motores
(Prado e cols., 2006).
Avaliamos também os efeitos da redução da expressão do VAChT na
liberação de ACh no cérebro dos camundongos. Para isso utilizamos a técnica de
microdiálise em camundongos vivos. Esses experimentos foram feitos em colaboração
com Raul Gainetdinov e Marc Caron da Universidade Duke, EUA. A técnica de
microdiálise in vivo é extremamente sensível e muito utilizada nos estudos de liberação
de neurotransmissores em modelos animais geneticamente modificados, a exemplo do
VMAT2 (Wang e cols., 1997), NET (Xu e cols., 2000) e DAT (Gainetdinov e cols.,
1997). Para os camundongos KDHET foi observada uma redução significativa da
liberação de acetilcolina no estriado e córtex pré-frontal. A redução da liberação da
acetilcolina no cérebro dos camundongos KDHET foi suficiente para gerar déficits
cognitivos. Foi observado prejuízo na memória de reconhecimento social e de objetos
nesses animais (Prado e cols., 2006).
O VAChT é responsável por estocar acetilcolina citoplasmática
trocando dois prótons vesiculares para cada molécula de neurotransmissor (revisto por
Nguyen e cols., 1998). Como menos ACh está sendo estocada nas vesículas, e
consequentemente, menos ACh está sendo liberada na fenda sináptica, uma pergunta
136
importante a se responder é: Como estão os níveis deste neurotransmissor no cérebro
destes mutantes? Utilizando um ensaio de quimioluminescência, observamos um
aumento significativo da ACh no tecido dos animais KD. Os animais KDHET possuem
duas vezes mais acetilcolina tecidual enquanto o KDHOM possui quase três vezes mais,
sugerindo que o aumento da concentração de ACh tecidual é proporcional à diminuição
da expressão do VAChT. Nos experimentos de PCR em tempo real e Northern, não
observamos alterações aparentes na expressão de RNA mensageiro para ChAT.
Mecanismos compensatórios poderiam alterar a atividade da enzima e assim justificar o
aumento de ACh observado. Todavia, o ensaio enzimático não mostrou alterações na
capacidade da ChAT em sintetizar acetilcolina, sugerindo dessa forma, que a enzima
parece não ser a responsável pelo acúmulo tecidual de neurotransmissor nos
camundongos com expressão reduzida do VAChT (Prado e cols., 2006).
Outra possibilidade a ser levantada seria uma alteração na capacidade
do CHT1 em captar colina para o terminal nervoso para explicar esse excesso de
acetilcolina tecidual. A captação de colina é considerada o passo limitante para a síntese
de ACh, portanto foi avaliada se a captação de colina estaria afetada nestes animais. O
resultado dos experimentos indicam que não há diferença estatisticamente significativa
entre a captação de colina dos animais VAChT-KDHET e VAChT-KDHOM em relação
aos animais selvagens. É interessante notar que os camundongos nocaute heterozigotos
tanto para a ChAT quanto para CHT1 apresentam mecanismos compensatórios présinápticos. Estes animais conseguem manter níveis normais de liberação de acetilcolina
aumentando a expressão do CHT1 ou mobilizando o transportador dos pools
intracelulares para a membrana pré-sináptica, respectivamente (Brandon e cols., 2004;
Ferguson e cols., 2003). Entretanto, no caso dos camundongos VAChT KD, a liberação
reduzida de acetilcolina não foi compensada por um aumento em nenhum dos outros
137
dois componentes colinérgicos. Porém, houve um acúmulo do neurotransmissor nas
células. Este dado se mostra intrigante, pois apesar de não serem conhecidos com
detalhes os fatores que regulam a síntese de ACh, alguns dados na literatura sugerem
que a síntese está acoplada à liberação (Tucek, 1984; 1985). Nossos dados, ao contrário,
indicam que o neurotransmissor que não está sendo liberado, acumula-se no citosol,
sugerindo que a ChAT não sofre regulação retro-inibitória pelo excesso de
neurotransmissor e que as enzimas responsáveis pela degradação do neurotransmissor
(acetil-colinesterase e butiril-colinesterase) parecem estar pouco ativas/presentes no
citosol. De fato, resultados semelhantes foram observados em estudos in situ utilizando
gânglios cervicais simpáticos de gato. Na presença de vesamicol, um inibidor do
VAChT, a liberação de acetilcolina nos gânglios sob estímulo despolarizante foi
diminuída e a acetilcolina não liberada ficou acumulada no tecido, entretanto a síntese
de ACh manteve-se normal (Collier e cols., 1986). Seria importante em experimentos
futuros avaliar a expressão e atividade de diferentes esterases intracelulares que
poderiam ter sua atividade alterada nos animais mutantes para o VAChT.
Camundongos nocaute condicionais para o VAChT
O papel da acetilcolina na contração da musculatura esquelética é
bem estudado e conhecido já que este neurotransmissor é predominante na junção
neuromuscular. No entanto, o papel exato da ACh no cérebro ainda é pouco conhecido.
Sabe-se que este neurotransmissor contribui para diferentes funções cognitivas como
memória, aprendizado e regulação do sono (Pepeu e Giovaninni, 2004). Além disso, são
conhecidas diversas doenças neurodegenerativas associadas a déficits colinérgicos como
esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington e doença de Alzheimer (Oda., 1999;
138
Amenta e Tayebati, 2008). Porém, de que forma o tônus colinérgico regula circuitos
neuronais, plasticidade sináptica e contribui para diferentes formas de alterações
comportamentais ainda é pouco entendido. Dado o papel fundamental da ACh no
sistema nervoso periférico, seria importante podermos interferir com a expressão do
VAChT apenas em regiões definidas do cérebro Portanto, com o objetivo de
desenvolver camundongos geneticamente modificados com ausência de expressão do
VAChT restrita ao sistema nervoso central (camundongos VAChT nocaute
condicionais), nós utilizamos o sistema Cre/LoxP. O VAChT é um bom candidato para
gerar esses modelos, já que ele participa do último passo colinérgico específico na
liberação de ACh.
Inicialmente foram gerados camundongos contendo o gene do
VAChT flanqueado por sequências loxP (camundongos VAChTFlox/Flox - Figura 7).
Escolheu-se não tratar as células tronco embrionárias com a enzima Cre para a remoção
do cassete de neomicina uma vez que esse procedimento aumenta a probabilidade de
introdução de alterações genéticas. Portanto os camundongos VAChTFlox/Flox apresentam
também o cassete de neomicina que foi inserido a 3’ do gene do VAChT (Figura 7).
Essa posição foi escolhida na expectativa de que o cassete não interferisse com a
expressão do VAChT e nem da ChAT. É importante ressaltar que vários modelos de
animais Flox já foram produzidos sem a remoção do cassete de neomicina (Bohn e
cols., 1999; Gainetdinov e cols., 1999) e que os camundongos gerados mostraram-se
fenotipicamente idênticos aos filhotes selvagens da mesma linhagem. Além disso, caso
o cassete de neomicina interfira com a expressão de genes nos camundongos Flox ele
pode ser removido através do cruzamento com camundongos transgênicos que
expressam cre nas células germinativas, por exemplo, camundongos CMV-Cre (Moeller
e cols., 2005).
139
Camundongos VAChTFlox/Flox
O nosso objetivo inicial foi caracterizar os animais VAChTFlox/Flox. A
análise da expressão de RNA mensageiro do VAChT por PCR em tempo real mostrou
que os animais VAChTFlox/Flox apresentaram uma redução, em torno de 50%, na
expressão de RNA do VAChT na medula espinal em relação aos animais VAChTWT/WT.
Observou-se também que a expressão da ChAT foi aumentada em 100%, sem alterações
aparentes na expressão do CHT1.
O cassete contendo os genes da neomicina e timidina cinase foi
inserido na região 3’ do gene do VAChT, entretanto ele está na região 5’ não traduzida
do gene da ChAT. O cassete, que é controlado por promotores fortes, está próximo a
promotores para a ChAT, portanto é possível que o promotor do cassete esteja alterando
o controle da expressão da ChAT e favorecendo o aumento da transcrição da enzima.
Além disso, a queda da expressão do VAChT sugere que o cassete possa também
interferir com a transcrição do transportador.
Procuramos avaliar a conseqüência da alteração genética do VAChT
na expressão do transportador no sistema nervoso central dos camundongos
VAChTFlox/Flox. Inusitadamente, observamos pouca imunorreatividade para o VAChT
em diversas regiões do cérebro, além de uma expressão reduzida do transportador no
tronco encefálico e medula espinal. Este dado é intrigante, pois sugere que há pouca
expressão da proteína do VAChT no prosencéfalo dos camundongos VAChTFlox/Flox.
Fatias seriais de cérebro foram também imunomarcadas com o anti-CHT1 que é um
outro marcador de neurônios colinérgicos. A imunorreatividade do transportador de
colina foi semelhante entre os camundongos VAChTWT/WT e VAChTFlox/Flox, sugerindo
não haver modificações na morfologia e/ou desenvolvimento dos neurônios
colinérgicos.
140
Analisamos também se houve alguma alteração para o VAChT no
sistema nervoso periférico dos camundongos VAChTFlox/Flox. A imunofluorescência em
diafragma não apontou alterações aparentes na expressão do VAChT nas placas motoras
dos camundongos VAChTFlox/Flox em relação aos animais controles VAChTWT/WT. Esses
resultados corroboram os nossos resultados de imunofluorescência da região do tronco e
medula espinal onde nós observamos pequena ou nenhuma diminuição do VAChT nos
corpos celulares dos neurônios motores.
O desenvolvimento da placa motora na junção neuromuscular
depende de um desenvolvimento sinérgico entre a terminação nervosa pré-sináptica e
pós-sinápticas (revisto por Witzemann., 2006). Para avaliar se a modificação do
VAChT, que reside no terminal pré-sináptico, afetou a expressão dos receptores póssinápticos, realizamos a marcação dos receptores nicotínicos com a bungarotoxina. O
resultado não sugere alterações na expressão dos receptores nicotínicos nos
camundongos VAChTFlox/Flox. Adicionalmente, os hemidiafragmas contralaterais foram
imunomarcados com o anti-CHT1. A imunomarcação foi semelhante entre os
genótipos, demonstrando que a expressão do CHT1 também não foi afetada no sistema
nervoso periférico.
Os níveis de acetilcolina tecidual no cérebro dos camundongos
VAChTFlox/Flox também foram medidos. Os resultados mostraram que a concentração de
acetilcolina no cérebro dos camundongos VAChTFlox/Flox foi seis vezes superior ao que
foi observado nos animais controle VAChTWT/WT. Este acúmulo de acetilcolina no
cérebro dos camundongos VAChTFlox/Flox foi muito superior aos níveis de ACh tecidual
apresentados pelos animais VAChT KD. Os animais KDHET apresentaram quase duas
vezes mais ACh enquanto os camundongos KDHOM apresentaram três vezes mais
acetilcolina tecidual em relação aos camundongos selvagens (WT). Entretanto, nós
141
observamos um aumento de 100% na expressão da ChAT nos camundongos
VAChTFlox/Flox o que não havia sido observado para os VAChT KD. Provavelmente, o
acúmulo exacerbado de ACh nos camundongos VAChTFlox/Flox possa ser decorrente de
uma síntese aumentada do neurotransmissor pela ChAT.
A liberação de acetilcolina na junção neuromuscular também foi
avaliada nos camundongos VAChTFlox/Flox. Foi observado um aumento significativo no
tamanho do quanta em relação aos camundongos VAChTWT/WT. Este aumento de
amplitude observado pode refletir uma quantidade maior de neurotransmissor na
vesícula, ou uma maior sensibilidade dos receptores nicotínicos. Experimentos de
iontoforese, com aplicação de acetilcolina sobre a placa motora, serão importantes para
verificar se existe uma maior sensibilidade dos receptores nicotínicos (Reid e cols.,
1999). É importante ressaltar que foi observada uma maior expressão da ChAT nos
camundongos VAChTFlox/Flox o que aumentou significativamente o conteúdo de
acetilcolina na célula. Alterações na atividade e expressão de transportadores
vesiculares podem representar uma fonte de variação no conteúdo quantal, e
consequentemente na transmissão sináptica (Reimer e cols., 1998). É possível que o
aumento do quanta observado para os camundongos VAChTFlox/Flox seja decorrente da
maior disponibilidade de acetilcolina no citosol para ser captada pelo VAChT.
Não foi verificada alteração na freqüência dos MEEPs dos
camundongos VAChTFlox/Flox em relação aos animais controles VAChTWT/WT. Este
mesmo resultado foi demonstrado para os camundongos KDHET. Tanto os camundongos
VAChTFlox/Flox quanto os camundongos KDHET apresentaram uma redução da expressão
de RNA do VAChT próxima a 50%. No entanto, uma redução na expressão do VAChT
em torno de 50% não é suficiente para provocar alterações na probabilidade de
142
liberação ou no número de vesiculas prontas para liberar o neurotransmissor (Prado e
cols., 2006).
Os
camundongos
VAChTFlox/Flox
não
apresentam
alterações
morfológicas aparentes e não é possível distingui-los dos camundongos VAChTWT/WT
em relação ao tamanho e ao peso. A atividade muscular e a coordenação motora dos
camundongos VAChTFlox/Flox foi avaliada nos testes de wire hang e footprint,
respectivamente. Estes camundongos não apresentaram modificações motoras em
relação aos camundongos VAChTWT/WT nos testes executados. Embora os dados
eletrofisiólogicos apontem um aumento da quantidade de acetilcolina nas vesículas, o
desempenho motor dos camundongos VAChTFlox/Flox não foi alterado.
O
dado
mais
intrigante
apresentado
pelos
camundongos
VAChTFlox/Flox foi a diminuição da expressão do VAChT no prosencéfalo e o excessivo
aumento da acetilcolina no cérebro. A análise de PCR em tempo real mostrou que
houve diminuição da expressão do gene do VAChT entretanto, cerca de 50% dos
mRNA para o VAChT ainda estavam sendo expressos, portanto, a grande diminuição
na expressão da proteína observada nos experimentos de imunofluorescência foi
surpreendente. É possível que o excesso de ACh no citosol com aumento do transmissor
nas vesículas possa levar a regulações pós-traducionais do VAChT. Experimentos
futuros serão necessários para elucidar essa possibilidade.
Camundongos VAChTFlox/Flox, cre+
Realizamos o acasalamento dos camundongos VAChTFlox/Flox (ou
camundongos VAChTFlox/WT) com camundongos que expressam a Cre sob o controle do
promotor CAMKIIα para determinar as consequências da remoção do gene do VAChT
no cérebro desses camundongos. Os dados da literatura mostram que a expressão da Cre
143
sob o controle desse promotor inicia-se após o quinto dia de nascimento na região do
presencéfalo basal. Dessa forma, a expressão do gene alvo, flanqueado por seqüências
LoxP, é abolida nesta região do cérebro e preservada na periferia (Dragatsis e Zeitlin.,
2000).
Os camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
nascem normais e não
apresentam alterações morfológicas aparentes em relação aos animais controle
VAChTFlox/Flox, cre- e VAChTWT/WT . Cerca de cinco dias após o nascimento, os animais
VAChTFlox/Flox, cre+ começam a se diferenciar dos camundongos controle VAChTFlox/Flox,
cre-
e VAChTWT/WT, pois são menos ativos e exibem um menor crescimento. Após oito
semanas, os animais VAChTFlox/Flox, cre+ pesam, na média, cerca de 13 gramas. Este peso
é aproximadamente metade do peso médio dos camundongos VAChTFlox/Flox,
cre-
e
VAChTWT/WT. Foi introduzida uma suplementação alimentar para evitar desnutrição e
desidratação e assim aumentar o tempo de vida dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+.
Entretanto, esses cuidados diários não foram suficientes para prolongar o tempo de vida
dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ que sobrevivem apenas 8 semanas.
Utilizamos o teste do wire hang para realizar uma avaliação inicial da
força muscular dos camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
.
Foi observado que os
camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ não conseguem se manter dependurados na grade por
mais de 15 segundos, enquanto os camundongos VAChTWT/WT e VAChTFlox/Flox,
cre-
conseguem suportar o seu peso na grade por 60 segundos ou mais. A característica
fenotípica mais marcante nos camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
é o desenvolvimento
anormal da coluna espinhal acarretando uma cifose. Os estudos sobre cifose em
humanos mostram que o aumento da curvatura anterior da coluna vertebral gera
alterações anatômicas que levam a um encurtamento destas vértebras. Esta deformidade
pode reduzir a capacidade de sustentação da coluna vertebral e alterar a locomoção.
144
Além disso, observa-se uma restrição da expansão da caixa torácica o que gera déficits
respiratórios (Macagno e O’Brien., 2006; Briggs e cols., 2007). Nós também analisamos
os camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ no teste do perfil de pegada (footprint) (Crawley e
Paylor., 1997). O perfil de caminhada dos animais VAChTFlox/Flox,
cre+
está bastante
alterado. Além de exibirem dificuldade em caminhar em linha reta, as passadas foram
mais curtas, irregularmente espaçadas e pouco uniformes em relação ao observado para
os camundongos VAChTWT/WT sugerindo que os camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
apresentam alterações na coordenação motora.
Em função das alterações fenotípicas observada nos camundongos
VAChTFlox/Flox,
cre+
nós resolvemos avaliar a expressão do VAChT nesses animais. A
imunofluorescência em fatias de cérebro dos camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
foi
importante para sabermos as regiões onde a Cre aboliu a expressão do VAChT. O
promotor CAMKIIα é ativo na região do prosencéfalo, ou seja, a expressão da Cre é
abundante nas regiões do neocórtex, hipocampo, amídala, núcleos talâmicos e complexo
caudado-putâmen (Dragatsis e Zeitlin, 2000). Os camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ não
apresentaram imunorreatividade para o VAChT nas regiões que possuem corpos
celulares colinérgicos (prosencéfalo basal e estriado) e terminações nervosas
colinérgicas (córtex, hipocampo e região talâmica). Nós observamos uma redução da
marcação para o VAChT nas terminações colinérgicas que se conectam com os corpos
celulares colinérgicos nas regiões do núcleo pedunculopontino e motoneurônios, na
região do tronco encefálico e medula espinal. É importante observar que a marcação
para o VAChT nos corpos celulares colinérgicos nessas regiões mostrou-se bastante
semelhante nos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ e VAChT WT/WT. Interessantemente, os
dados de immunoblot das regiões do tronco e da medula espinal mostraram uma grande
diminuição da expressão do VAChT. Essa diminuição provavelmente reflete a
145
diminuição da expressão do VAChT nas terminações nervosas observada na
imunofluorescência, uma vez que a concentração do VAChT é muito menor no corpo
celular que nas terminações nervosas. Para excluir a possibilidade de a modificação
genética para o VAChT afetasse a formação e/ou desenvolvimento dos neurônios
colinérgicos, fatias adjacentes de cérebro e medula espinal foram incubadas com o antiCHT1. O resultado demonstrou que a imunorrreatividade para o transportador de colina,
que também é um marcador de neurônios colinérgicos, foi observada em todas as
regiões que contêm neurônios e terminações colinérgicas e esta marcação foi
semelhante entre os camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
, VAChTFlox/Flox,
cre-
e
VAChTWT/WT.
Os neurônios motores cujos corpos celulares residem no tronco
encefálico e medula espinal fazem projeções para os músculos esqueléticos (Schaffer e
cols., 1998). Portanto, analisamos se a expressão do VAChT está alterada na junção
neuromuscular. A imunofluorescência em diafragma não apontou alterações aparentes
na expressão do VAChT nas placas motoras dos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ em
relação aos animais controles VAChTFlox/Flox,
cre-
e VAChTWT/WT. A expressão dos
receptores nicotínicos também foi avaliada nos camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
pela
marcação destes receptores pela bungarotoxina acoplada ao fluoróforo Alexa 555. O
resultado não demonstrou alterações aparentes na expressão dos receptores nicotínicos
nos camundongos. Além disso, a imunomarcação dos hemidiafragmas controlaterais
pelo CHT1 não apontou modificações no desenvolvimento das placas motoras, ou
mesmo alteração da expressão do transportador de colina. Devido a dificuldades
técnicas, dentre elas falta de espaço e biotério moderno, além das dificuldades inerentes
da utilização de animais gerados pelo sistema Cre/LoxP, poucos animais VAChTFlox/Flox,
cre+
foram estudados. Futuramente, a possibilidade de gerar uma quantidade maior
146
desses animais, bem como de acasalar camundongos VAChTFlox/Flox com diferentes
trangênicos Cre, serão importantes para a compreensão do fenótipo observado nos
animais VAChTFlox/Flox, cre+.
Camundongos com deleção de um dos alelos do VAChT
Inicialmente, os cruzamentos para a geração dos camundongos
nocaute condicionais foram realizados entre camundongos VAChTFlox/WT, cre+ machos e
camundongos VAChTFlox/WT,
cre-
fêmeas. Na genotipagem dos descendentes, foi
observado que não havia uma proporcionalidade mendeliana. Esperava-se que a
proporção de camundongos VAChTFlox/WT tanto cre+ quanto cre- fosse 50%, enquanto a
proporção de camundongos VAChTWT/WT e VAChTFlox/Flox ficasse em torno de 25%.
Entretanto, o número de animais selvagens era superior ao esperado para cada ninhada,
enquanto o número de animais heterozigotos estava bem abaixo. A regenotipagem
destes camundongos, utilizando um novo conjunto de iniciadores, mostrou que houve
deleção de um dos alelos do VAChT. Esse fenômeno ocorreu devido à expressão
ectópica da Cre nos testículos, o que levou a remoção do gene do VAChT nas céulas
germinativas (Rempe e cols., 2006). De fato, análises de PCR em tempo real feitas
feitas pela aluna Diane Ramires Fernandes demonstraram que os animais Cre-CamKII
expressam a Cre nos testículos. Já foi relatada a expressão da Cre nos testículos de
camundongos Cre sob o controle do promotor da Sinapsina I em que foi observado que
73% dos descendentes destes camundongos machos carregava apenas um alelo do gene
flanqueado por sítios de LoxP (Rempe e cols., 2006). De forma similar, ocorreu a
recombinação do gene do VAChT, flanqueado por LoxP, dentro dos gametas nos
camundongos VAChTFlox/WT,
cre+
machos pela enzima Cre. Assim, dentre os
147
descendentes gerados, alguns camundongos apresentavam um alelo selvagem (ou Flox)
para o VAChT e um outro alelo deletado (camundongos VAChTWT/Del ou camundongos
VAChTFlox/Del).
Os camundongos VAChTFlox/Del,
observado para os camundongos VAChTFlox/Flox,
cre+
cre+
apresentam o mesmo fenótipo
: crescimento reduzido, fraqueza
muscular e cifose. No entanto, o aparecimento do fenótipo foi muito rápido o que
reduziu drasticamente o tempo de vida dos camundongos VAChTFlox/Del, cre+. Enquanto
os animais VAChTFlox/Flox,
camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
conseguem sobreviver por até 8 semanas, os
cre+
não sobrevivem mais que 20 dias. Mesmo a
suplementação alimentar não foi suficiente para evitar a morte prematura. Em contraste,
os camundongos VAChTFlox/Del,
cre-
camundongos VAChTFlox/Del,
. Conseguem chegar à idade adulta, reproduzem-se
não apresentam os fenótipos observados para os
cre+
normalmente, não apresentam fraqueza muscular e não têm a coordenação motora
afetada como os camundongos VAChTFlox/Del, cre+.
Devido à grande fraqueza e fragilidade apresentada pelos
camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
não foi possível realizar testes de força. Avaliamos
então a coordenação motora destes animais pelo teste de perfil de pegada (footprint). A
análise mostrou o padrão anormal de caminhada dos camundongos VAChTFlox/Del, cre+
em relação aos camundongos VAChTWT/WT, VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del,
cre-
. A
dificuldade em caminhar em linha reta e a redução da largura das passadas observada
nos animais VAChTFlox/Del,
VAChTFlox/Flox,
cre+
cre+
foi semelhante à apresentada pelos camundongos
. Possivelmente, a associação de déficit colinérgico central e
periférico seja a responsável pelo tempo de vida extremamente reduzido dos
camundongos VAChTFlox/Del, cre+ .
148
Em função do fenótipo observado, resolvemos avaliar a expressão do
transportador nesses animais. Os camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
apresentaram uma
acentuada redução da expressão do VAChT tanto no cérebro quanto na medula espinal.
A quantificação da expressão do VAChT mostrou que houve uma redução em torno de
80% na expressão gênica do transportador nas regiões do estriado e medula espinal
quando comparados aos animais VAChTWT/WT. A expressão gênica da enzima ChAT na
medula espinal apontou uma tendência de aumento de expressão nos animais
VAChTWT/Del, VAChTFlox/Del, cre- e VAChTFlox/Del, cre+ quando comparada à expressão da
ChAT nos VAChTWT/WT, entretanto esta tendência não foi estatisticamente significativa.
A alteração da expressão de RNA mensageiro do VAChT foi
refletida na expressão da proteína do transportador no cérebro dos camundongos
VAChTFlox/Del,cre+. A imunofluorescência e o imunoblot mostraram que a expressão
protéica do VAChT foi abolida em diversa regiões do sistema nervoso central como
córtex, estriado, hipocampo e prosencéfalo basal. Foi também detectada uma redução da
imunorreatividade para o VAChT nos neurônios do núcleo pedunculopontino e
motoneurônios colinérgicos das regiões do tronco encefálico e medula espinal dos
camundongos VAChTFlox/Del,cre+.
A análise da expressão protéica do CHT1 nas fatias adjacentes foi
importante para excluir possíveis alterações na morfologia e/ou desenvolvimento dos
neurônios colinérgicos. Os resultados não apontaram modificações na morfologia dos
neurônios e a expressão do CHT1 nos neurônios colinérgicos dos camundongos
VAChTFlox/Del,
cre+
foi similar a dos camundongos VAChTWT/Del, VAChTFlox/Del,
cre-
e
VAChTWT/WT.
A expressão protéica da enzima ChAT foi avaliada por imunoblot
nos animais VAChTFlox/Del,cre+. Os resultados não demonstraram modificações na
149
expressão da enzima nos camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
, VAChTFlox,Del,
cre-
,
VAChTWT/Del em relação aos animais VAChTWT/WT. Entretanto, assim como o
experimento de PCR em tempo real, verificamos uma grande variação na expressão da
ChAT entre os genótipo.
A redução da expressão do VAChT no cérebro dos camundongos
VAChTFlox/Del,
cre+
levou a um acúmulo exagerado de acetilcolina no cérebro. A
dosagem de ACh no cérebro dos camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
foi doze vezes
superior à observada nos camundongos VAChTWT/WT. Apesar da expressão da ChAT
não ter sido afetada, foi verificado se a atividade da ChAT estava alterada nos
camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
. O resultado não apontou modificação aparente na
atividade enzimática da ChAT, embora tenhamos novamente detectado uma tendência
de aumento. Estes dados sugerem, portanto que este aumento exacerbado da acetilcolina
no cérebro dos camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
não seja decorrente de uma síntese
aumentada de acetilcolina pela ChAT, embora não possamos descartar esta
possibilidade.
A expressão do VAChT também foi reduzida no sistema nervoso
periférico dos camundongos VAChTWT/Del, VAChTFlox/Del,
cre-
e VAChTFlox/Del,
cre+
quando comparados aos animais VAChTWT/WT. Não foram observadas alterações na
expressão do CHT1 nem dos receptores nicotínicos da junção neuromuscular,
demonstrando que não houve alterações morfológicas aparentes na junção
neuromuscular. Portanto, enquanto os camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ não apresentam
alterações na expressão do VAChT no sistema nervosos periférico, os camundongos
VAChTFlox/Del, cre+ já apresentam uma redução do tônus colinérgico na periferia.
Procuramos então avaliar a conseqüência do tônus colinérgico
reduzido na liberação de acetilcolina na junção neuromuscular dos animais
150
VAChTFlox/Del
Cre+
. Observamos que os camundongos VAChTFlox/Del
Cre+
apresentaram
um aumento significativo no tamanho do quanta em relação aos genótipos
VAChTWT/WT, VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del,
cre-
. Este resultado é interessante, pois
sugere um aumento na quantidade de acetilcolina vesicular nos camundongos
VAChTFlox/Del Cre+, embora tenha sido demonstrada a redução da expressão do VAChT
na periferia. A avaliação das propriedades passivas da membrana (diâmetro da fibra),
além da medida da sensibilidade dos receptores nicotínicos será importante para
elucidar o aumento do quanta apresentado pelos animais VAChTFlox/Del,
cre+
. Não
verificamos alteração na freqüência dos MEEPs dos camundongos VAChTFlox/Del
Cre+
em relação aos animais controles VAChTWT/WT, VAChTWT/Del e VAChTFlox/Del,
cre-
,
sugerindo que a probabilidade de liberação também não foi afetada nos VAChTFlox/Del
Cre+
.
De forma inesperada, as técnicas de imunoblot e imunofluorescência
em fatias não detectaram a expressão da proteína do VAChT em diversas regiões do
cérebro dos camundongos VAChTFlox/Del, cre-. Além disso, os níveis de acetilcolina no
cérebro destes camundongos estão aumentados cerca de doze vezes, similar ao
observado para os camundongos VAChTFlox/Del,
controverso, pois os camundongos VAChTFlox/Del,
cre+
. Este dado se mostra muito
cre-
não expressam a enzima Cre e,
portanto deveriam expressar a proteína do VAChT no cérebro, mesmo que de forma
reduzida. Esses resultados corroboram aqueles obtidos com os camundongos
VAChTFlox/Flox, cre- e sugerem possíveis mecanismos ainda não conhecidos de regulação
pós-traducional do VAChT. Intesessantemente, nenhum dos estudos comportamentais e
eletrofisiológicos realizados sugerem que o VAChT estivesse alterado, já que os
camundongos VAChTFlox/Flox, cre- são fenotipicamente normais. Ainda não sabemos
exatamente o porquê da ausência da expressão do VAChT no cérebro dos camundongos
151
VAChTFlox/Flox, cre- e VAChTFlox/Del, cre-, embora tenhamos detectado expressão de RNA
mensageiro do transportador, ainda que os níveis de expressão tenham sido reduzidos.
Por conseguinte, serão necessários mais estudos sobre os mecanismos responsáveis pela
regulação da transcrição e da tradução do VAChT.
Redução do tônus muscular e déficits colinérgicos também já foram
relatados em pacientes que sofrem do mal de Huntington. Os pacientes apresentam
desordens motoras como ataxia, distonia e bruxismo, além de distúrbios psiquiátricos e
declínio cognitivo (Adam e Jankovic, 2008). A alteração patológica mais evidente no
cérebro dos pacientes que sofrem da doença de Huntington é a atrofia da região
neostriatal (núcleos caudado e putâmen), onde há morte de neurônios GABAérgicos de
tamanho médio pelo acúmulo da proteína huntingtina mutada. Esta região também
contém uma grande rede de interneurônios colinérgicos, entretanto estes neurônios
colinérgicos são preservados na doença (Paulsen e cols. 2006). Apesar de os neurônios
colinérgicos estriatais não serem afetados, já foram relatadas alterações das funções
colinérgicas. A expressão e a atividade da colina acetiltransferase estão diminuídas no
cérebro e estudos post-mortem realizados em cérebro de pacientes de Huntington
mostram uma grande redução da expressão do VAChT no estriado (Aquilonius e cols.,
1974; Spokes, 1980 e Smith e cols., 2006). Acredita-se que o déficit muscular que estes
pacientes apresentam seja decorrente da degeneração neuronal observada no estriado
(Adam e Jankovic, 2008). Interessantemente, em camundongos transgênicos modelo de
Huntington (R6/1 e R6/2) é observada cifose acentuada (Smith e cols., 2006; Ribchester
e cols., 2004). Os camundongos transgênicos exibem, adicionalmente, um fenótipo
neurológico progressivo que inclui movimentos involuntários (distonia), tremor e queda
acentuada das funções motoras e cognitivas (Mangiarini e cols., 1996). A partir de 12
semanas, os camundongos transgênicos R6/1 apresentam-se mais fracos e menos ativos
152
que os animais selvagens, além de grande incapacidade em realizar testes motores que
necessitem de força muscular. (Ribchester e cols., 2004). Ensaios de PCR em tempo
real e imunoblot mostraram uma redução da expressão da ChAT e do VAChT nos
camundongos transgênicos da linhagem R6/1 nas regiões do estriado, córtex e
hipocampo. Foi detectada também uma grande redução do VAChT na medula espinal
dos camundongos transgênicos com 40 semanas (Smith e cools., 2006). Portanto, é
possível que a disfunção motora observada nos camundongos VAChTFlox/Flox, cre+ tenha
origem central, dado que a expressão do VAChT foi aparentemente normal no
diafragma desses animais.
A inserção do cassete “downstream” ao gene do VAChT foi
escolhida na tentativa de que este cassete não afetasse a expressão do VAChT e da
ChAT nos camundongos VAChTFlox/Flox. Entretanto, os camundongos VAChTFlox/Flox
apresentaram redução da expressão do VAChT e aumento da expressão da ChAT.
Atualmente, nosso laboratório produziu novos animais VAChTFlox/Flox (Flox2) e esta
nova linhagem não possui o cassete de neomicina. A caracterização bioquímica,
observando principalmente a expressão do VAChT, ChAT e CHT1 será fundamental
para que o nocaute do VAChT no SNC seja desenvolvido sem alterações no SNP.
153
CONCLUSÃO
A análise bioquímica realizada nos permitiu concluir que:
•
Camundongos VAChT KD possuem redução da expressão do VAChT tanto no
SNC quanto na periferia;
•
A liberação quântica de acetilcolina foi reduzida nos animais KD;
•
O conteúdo de acetilcolina no cérebro dos KD foi aumentado, não sendo reflexo
nem de um aumento da ChAT ou do CHT1;
•
O grau de redução do VAChT nos KD foi refletida em alterações cognitivas e
motoras;
•
Camundongos VAChTFlox/Flox possuem alteração da expressão de mRNA do
VAChT e da ChAT;
•
A amplitude dos miniaturas de placa motora (MEEPs) foi aumentada nos
camundongos VAChTFlox/Flox, sem alterações na freqüência ;
•
A alteração do quanta na junção neuromuscular não afetou a função motora dos
camundongos VAChTFlox/Flox;
•
Não foi observada expressão da proteína do VAChT no prosencéfalo dos
camundongos VAChTFlox/Flox;
•
Os níveis teciduais de acetilcolina no cérebro foram aumentados em torno de
seis vezes nos animais VAChTFlox/Flox;
•
Os animais VAChTFlox/Flox,
cre+
apresentaram fraqueza muscular e descontrole
motor, morrendo em 8 semanas;
•
A expressão da proteína do VAChT foi abolida em diversas regiões do SNC nos
animais VAChTFlox/Flox, cre+;
•
Não houve alterações aparentes na expressão do CHT1 tanto no SNC quanto na
periferia nos animais VAChTFlox/Flox, cre+;
155
•
A expressão do VAChT se mostrou normal no sistema nervoso periférico dos
camundongos VAChTFlox/Flox, cre+;
•
A deleção de um dos alelos do VAChT nos gametas dos camundongos machos
que expressam a Cre gerou camundongos VAChTFlox/Del, cre+;
•
Os camundongos VAChTFlox/Del, cre+ apresentaram o mesmo fenótipo dos animais
VAChTFlox/Flox, cre+;
•
Os níveis de RNA mensageiro para o VAChT foram reduzidos em 80% nos
animais VAChTFlox/Del Cre+;
•
A expressão do VAChT foi abolida em diversas regiões do SNC nos animais
VAChTFlox/Del Cre+;
•
A expressão do VAChT foi reduzida no sistema nervoso periférico nos animais
VAChTFlox/Del Cre+;
•
Os animais VAChTFlox/Del Cre+ possuem aumento da amplitude dos MEEPs sem
alteração na freqüência;
•
Os camundongos VAChTFlox/Del, cre+ apresentaram níveis até doze vezes maiores
de acetilcolina no cérebro em relação aos camundongos controle selvagem;
•
Não houve alteração na expressão de RNA da ChAT e em sua atividade
enzimática nos camundongos VAChTFlox/Del Cre+;
•
Não foi observada expressão da proteína do VAChT no prosencéfalo dos
camundongos VAChTFlox/Del, cre-;
•
Os níveis de acetilcolina no cérebro dos camundongos VAChTFlox/Del, cre- foram
similares ao dos animais VAChTFlox/Del, cre+;
•
A expressão de RNA mensageiro do VAChT foi reduzida nos animais
VAChTFlox/Del, cre-, ainda que a expressão protéica não tenha sido detectada;
156
•
Os camundongos VAChTWT/Del expressam 50% do VAChT no sistema nervoso
central e periférico;
157
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ANEXO
Neuron 51, 601–612, September 7, 2006 ª2006 Elsevier Inc.
DOI 10.1016/j.neuron.2006.08.005
Mice Deficient for the Vesicular Acetylcholine
Transporter Are Myasthenic and Have
Deficits in Object and Social Recognition
Vania F. Prado,1 Cristina Martins-Silva,2
Braulio M. de Castro,2 Ricardo F. Lima,3
Daniela M. Barros,5 Ernani Amaral,4
Amy J. Ramsey,6 Tatyana D. Sotnikova,6
Maria R. Ramirez,5 Hyung-Gun Kim,7,8
Janine I. Rossato,5 Janaina Koenen,1 Hui Quan,6
Vinicius R. Cota,3 Marcio F.D. Moraes,3
Marcus V. Gomez,2 Cristina Guatimosim,4
William C. Wetsel,7 Christopher Kushmerick,3
Grace S. Pereira,2 Raul R. Gainetdinov,6
Ivan Izquierdo,5 Marc G. Caron,6,*
and Marco A.M. Prado2,*
1
Departamento de Bioquı́mica-Imunologia
2
Departamento de Farmacologia
3
Departamento de Fisiologia-Biofı́sica
4
Departamento de Morfologia
Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
Avenida Antônio Carlos 6627
Belo Horizonte, MG
Brazil, 31270-901
5
Centro de Memória
Instituto de Pesquisas Biomédicas
Pontificia Universidade Católica
de Rio Grande do Sul
Hospital São Lucas da PUC-RS
Av. Ipiranga 6690 2 andar
90610-000 Porto Alegre, RS
Brazil
6
Department of Cell Biology
7
Department of Psychiatry and Behavioral Sciences
Duke University Medical Center
Durham, North Carolina, 27710
Summary
An important step for cholinergic transmission involves the vesicular storage of acetylcholine (ACh), a
process mediated by the vesicular acetylcholine transporter (VAChT). In order to understand the physiological roles of the VAChT, we developed a genetically
altered strain of mice with reduced expression of this
transporter. Heterozygous and homozygous VAChT
knockdown mice have a 45% and 65% decrease in
VAChT protein expression, respectively. VAChT deficiency alters synaptic vesicle filling and affects ACh
release. Whereas VAChT homozygous mutant mice
demonstrate major neuromuscular deficits, VAChT
heterozygous mice appear normal in that respect and
could be used for analysis of central cholinergic function. Behavioral analyses revealed that aversive learning and memory are not altered in mutant mice; however, performance in cognitive tasks involving object
*Correspondence: [email protected] (M.G.C.); mprado@
icb.ufmg.br (M.A.M.P.)
8
Present address: Department of Pharmacology, College of Medicine, Dankook University, San-29, Anseo-dong, Cheonan, Choongnam 330-714, Korea.
and social recognition is severely impaired. These
observations suggest a critical role of VAChT in the
regulation of ACh release and physiological functions
in the peripheral and central nervous system.
Introduction
Acetylcholine (ACh) plays a crucial role in controlling a
number of physiological processes in both the peripheral and central nervous system. Synthesis of ACh
requires efficient uptake of choline by the high-affinity
choline transporter and choline acetylation by the enzyme choline acetyltransferase (ChAT) (Ribeiro et al.,
2006). Efficient release of ACh from nerve endings depends on its storage in synaptic vesicles, a step reliant
on the activity of a vesicular acetylcholine transporter
(VAChT) (Parsons, 2000). VAChT is a twelve-transmembrane domain protein that uses the electrochemical gradient generated by a V-type proton ATPase to accumulate ACh in synaptic vesicles. VAChT and the vesicular
monoamine transporters (VMATs) share a high degree
of homology in their transmembrane domains and belong to the SLC18 (or solute carrier) family of proton/
neurotransmitter antiporters (Erickson et al., 1994; Reimer et al., 1998; Roghani et al., 1994).
The ACh transporter is likely to provide stringent control of the amount of neurotransmitter stored and released by cholinergic nerve endings (Prado et al.,
2002). VAChT trafficking to secretory vesicles appears
to be the target of cellular regulation, and phosphorylation by protein kinase C (PKC) influences delivery of
VAChT to synaptic-like microvesicles in PC12 cells
(Cho et al., 2000; Krantz et al., 2000). However, the consequences of reduced targeting of VAChT to synaptic
vesicles for ACh output in vivo are unknown.
Deficits in central or peripheral ACh neurotransmission have been described in several human disorders,
including Alzheimer’s disease (AD), in which certain behavioral and cognitive abnormalities have been related
to brain cholinergic dysfunction (Bartus et al., 1982;
Mesulam, 2004). However, the relationship between
cholinergic decline and specific behavioral deficits is
still not completely appreciated. Basal forebrain lesions
in rats, with immunotoxins targeting the p75 neurotrophin receptor, indicate that ACh plays an essential role
in attention (Sarter and Parikh, 2005), whereas it seems
to participate, but it is not essential, in hippocampaldependent spatial learning and memory (Parent and
Baxter, 2004).
To investigate the consequences of reduced expression of VAChT on ACh neurotransmission and function,
we genetically modified mice to produce a knockdown
(KD) of VAChT gene expression. We observed a strong
relationship between the levels of VAChT expression
and ACh release in both the peripheral and central nervous systems. A marked reduction of VAChT expression
was necessary to affect neurotransmission at the neuromuscular junction, while even modest deficiency was
sufficient to interfere with brain ACh release and affect
Neuron
602
Figure 1. Schematic Drawing of the Cholinergic Gene Locus and Generation of VAChTDeficient Mice
(A) Boxes represent the different exons of
ChAT or VAChT. The position of the initiation
codon (ATG) for VAChT and ChAT and the
stop codon (stop) of VAChT are indicated.
Potential transcription initiation sites are
indicated for VAChT (filled arrowheads) and
ChAT (open arrowheads). Note that the
VAChT gene is within the first intron of ChAT.
(B) Schematic representation of the VAChT
gene locus, the targeting construct, and the
recombinant DNA. P1, P2, and P3 indicate
position of PCR primers used for genotyping.
Open white circles indicate loxP sites.
(C) PCR analysis of wild-type (lane 1), heterozygous VAChT KD mice (lane 2), and homozygous VAChT KD mice (lane 3). Lane 4 is a negative control without DNA.
(D) Southern analysis of wild-type (lanes 1),
VAChT KDHET (lane 2), and VAChT KDHOM
mice (lane 3).
(E) Northern blot analysis of VAChT, ChAT,
and CHT1 in spinal cord for wild-type (lane
1), VAChT KDHET (lane 2), and VAChT KDHOM
mice (lane 3). Kidney mRNA was isolated,
and Northern analysis detected no signal for
VAChT, ChAT, and CHT1 transcripts.
(F) Quantification of cholinergic transcripts.
Blots were scanned and densitometric analysis was performed using the actin signal to
normalize mRNA levels. Data are presented
as a percentage of wild-type levels. (*) indicates statistical significant differences as
described in the text.
behavior. Moreover, these investigations revealed a role
for cholinergic tone in processing complex cues, which
manifested as cognitive deficits in mutant mice for object and social memory.
Results
Molecular Analysis
To investigate the physiological consequences of altered expression of VAChT as related to vesicle filling
and ACh release, we generated a mouse line with decreased expression rather than complete deletion, of
this transporter, so we could investigate the consequences of reduced cholinergic tone in vivo (Figures
1A and 1B for wild-type and mutant alleles, respectively). PCR and Southern analyses confirmed homologous recombination and targeting of the 50 untranslated
region of the VAChT gene in genetically altered mice
(Figures 1C and 1D). Mutant mice were born at the
expected Mendelian frequency, survived, and exhibited
no gross abnormalities.
Northern analysis of spinal cord indicated that the
major mRNA species for VAChT (V1, 2.6 kb) was significantly reduced by 40% and 62% in VAChT KDHET and
KDHOM mice, respectively [F(2,11) = 11.09, p < 0.005,
one-way ANOVA, Figures 1E and 1F]. Surprisingly, a
second VAChT species of 3.0 kb, which was especially
apparent in spinal cord, was significantly increased in
VAChT KD mice, suggesting that compensatory transcriptional mechanisms operate in response to changes
in VAChT expression. The changes in mRNA were specific for VAChT transcripts, as we detected no significant
changes in mRNA levels for ChAT [F(2,3) = 0.0311, p =
0.970] and CHT1 [F(2,12) = 0.0921, p = 0.9127] in mutant
mice (Figures 1E and 1F). These results agree with the
lack of significant alterations found in ChAT activity
and high-affinity choline transport in mutant mice (see
Figure S1 in the Supplemental Data). Control experiments using kidney mRNA demonstrated the specificity
of the probes (Figure 1E).
We investigated the consequences of altered expression of VAChT mRNA in VAChT KD mice by probing
protein expression by immunoblot analysis. These experiments show a reduction of close to 50% in immunoreactivity for VAChT in the hippocampus [two-way
ANOVA followed by Bonferroni post hoc, F(2,23) = 70.95,
p < 0.001, Figures 2D and 2E] and in other brain regions
(Figures 2A–2E) of VAChT KDHET mice compared to
wild-type control mice. In contrast, levels of other presynaptic proteins were not altered (Figures 2A–2E). Results were similar in all brain regions and in spinal cord
(Figure 2E, overall decrease in all tissues was 56% 6
4% of the wild-type levels, n = 20). These results indicate
a significant reduction in VAChT protein in VAChT KDHET
Mouse Model of Cholinergic Dysfunction
603
Figure 2. Gene Targeting Alters VAChT Protein Levels
Western blot analysis of VAChT, synaptophysin, and syntaxin in the cortex (A), striatum
(B), spinal cord (C), and hippocampus (D) of
wild-type (lane 1), VAChT KDHET (lane 2),
and VAChT KDHOM mice (lane 3). (E) Quantification of protein levels. Actin immunoreactivity was used to correct for protein loading between experiments. Data are presented as a
percentage of wild-type levels. (*) indicates
statistical significant difference (one-way Anova with Bonferroni post hoc [cortex, F(2,9) =
49.11, p < 0.001; striatum, F(2,6) = 27.24, p <
0.001; spinal cord, F(2,9) = 95.75, p < 0.001;
Hippocampus, F(2,23) = 70.95, p < 0.001]).
mice. VAChT KDHOM mice showed further decrease in
VAChT protein levels (65% to 70%, Figures 2A–2E).
Thus, VAChT KDHOM mice present an even larger decrease in levels of transporter than VAChT KDHET mice,
but VAChT expression in homozygous mutant mice is
sufficient for survival.
Electrophysiological Analysis and Neuromuscular
Function
In order to evaluate the impact of reduced VAChT expression on quantal ACh release, we examined neuromuscular transmission. Miniature end-plate potentials
(MEPPs) were readily recorded at neuromuscular junctions from either wild-type, VAChT KDHET, or VAChT
KDHOM mice. To compare quantal size we recorded at
least 100 MEPPs from each of five fibers from five to
seven animals of each genotype. MEPPs from mutant
mice were smaller than those from wild-type, as can
be seen in histograms of MEPP amplitudes (Figure 3A).
To avoid possible histogram binning artifacts, we also
analyzed the cumulative distribution of MEPP amplitudes, which showed a similar shift to smaller MEPPs
in mutant animals (Figure 3B, p< 0.001 for VAChT
KDHOM, p < 0.05 for VAChT KDHET, Kolmogorov-Smirnoff
test). Further statistical analysis using ANOVA on averages of either the peak amplitude or the area of MEPPs
confirmed the statistical significance of the differences
in quantal sizes between wild-type and VAChT KDHOM
animals [F(1,71) = 8.7, p < 0.005]. Therefore, mutant
mice appear to pack less ACh in each synaptic vesicle.
In addition to quantal size, MEPP frequency was also
strongly reduced in VAChT KDHOM animals, as shown in
Figure 3C. The frequency of MEPPs was 0.69 6 0.08 s21
in wild-type animals (40 synapses from seven animals),
0.79 6 0.18 s21 in VAChT KDHET animals (30 synapses
from five animals), and 0.37 6 0.05 s21 in VAChT KDHOM
mice (41 synapses from seven animals). The difference
in MEPP frequency between wild-type and VAChT
KDHOM mice was statistically significant [two-way
ANOVA followed by Bonferroni post hoc, F(1,18) =
10.3, p < 0.005].
The observed decrease in MEPP frequency at junctions from KDHOM mice could be due to a reduction in
the number of synaptic vesicles available for release, a
reduction in vesicle release probability, or a population
of synaptic vesicles whose ACh load is below our detec-
tion limit. To investigate these possibilities, we measured
evoked end-plate potentials (EPPs) during 100 Hz trains
after cutting the muscle fibers to avoid contraction. Under these conditions, EPP amplitudes during a train rapidly fell from their initial level to a depressed steady state
over the course of the first ten stimuli (Figure 3D). Overall,
initial depression of normalized EPPs was similar in recordings from wild-type and KDHOM animals, suggesting
similar release probabilities. Quantal content of each
EPP during a train was calculated based on measured
MEPP amplitudes, thus permitting an estimate of the
size of the readily releasable pool of vesicles as described (Elmqvist and Quastel, 1965). This analysis considered only the first eight responses during a train for
which the relationship between EPP versus cumulative
EPP was linear. With this method, the readily releasable
pool was similar for both genotypes and estimated at
439 6 73 vesicles in synapses from wild-type animals
and 550 6 59 vesicles in VAChT KDHOM synapses (p =
0.52, two-tailed Student’s t test). In contrast, the extent
of steady-state depression of EPPs was significantly
greater in VAChT KDHOM animals compared with wildtype [one-way ANOVA, F(1,70) = 197, p < 0.001].
Assuming constant quantal size, the increase in depression uncovered in the above experiments would
suggest a defect in mobilizing or recycling of ACh-filled
vesicles; however, the assumption of constant quantal
size during the stimulus train may not be valid for mutant
animals. Therefore, we attempted to directly test
whether synaptic vesicle exo- and endocytosis would
be altered in mutant mice. For this we performed experiments with the vital dye FM1-43 (Richards et al., 2000),
which provides the opportunity for optical detection of
both exocytosis and endocytosis of synaptic vesicles.
Labeling of nerve terminals in junctions from both wildtype and KDHOM animals in response to 60 mM KCl
(10 min) was indistinguishable, and no differences were
detected upon quantification of fluorescent spots (Figure 3E), suggesting that endocytosis occurs to the same
extent in both genoytypes. Destaining of fluorescent
spots in response to 60 mM KCl was calcium dependent
(not shown), and was not different between wild-type
and KDHOM animals (Figure 3F), indicating that synaptic
vesicle exocytosis is not changed in VAChT KDHOM
mice. Thus, taken together, our observations would suggest that the alterations in MEPP frequency and EPP
Neuron
604
Figure 3. Neuromuscular Transmission in VAChT KDHET and VAChT
KDHOM Mice
(A) Normalized histogram of MEPP amplitudes for wild-type (black
line, 3302 MEPPs), VAChT KDHET (blue line, 4319 MEPPs), and
VAChT KDHOM (red line, 3690 MEPPs) mice. Data are from five synapses from five to seven animals for each genotype.
(B) Quantal size of the three genotypes quantified by plotting the cumulative frequency of MEPP amplitudes. Black line, wild-type; blue
line, VAChT KDHET; red line, VAChT KDHOM.
(C) Frequency of MEPPs at synapses from the three genotypes. (*)
indicates statistically significant difference from control wild-type
mice (two-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc; F(1,18) =
10.3, p < 0.005).
(D) Normalized EPP amplitude (to the first stimulus) for wild-type
(black line) and VAChT KDHOM (red line) mice in response to a train
of 100 Hz (0.5 s). Data are from ten synapses from three wild-type
animals and 16 synapses from three KDHOM animals.
(E) Nerve terminals from wild-type and VAChT KDHOM mice were labeled with FM1-43 and show similar patterns of staining. Data are
mean 6 SEM of 109 fluorescent spots from 21 nerve terminals of
wild-type mice and 111 fluorescent spots from 26 nerve terminals
from VAChT KDHOM. Scale bar, 10 mm.
(F) Destaining of FM1-43-labeled nerve endings from wild-type
(black line) and VAChT KDHOM (red line). Data are mean 6 SEM of
26 fluorescent spots (wild-type mice) and 21 fluorescent spots
(VAChT KDHOM) from four mice per genotype.
depression in VAChT KDHOM are more than likely a consequence of decreased transport of ACh by synaptic
vesicles.
To evaluate whether the alterations detected in neuromuscular transmission may affect neuromuscular function, we tested the performance of wild-type and mutant
mice in motor tasks (Figure 4). In the wire-hang test
(Figure 4A), wild-type and VAChT KDHET mice show no
differences in performance; however, VAChT KDHOM
mice were significantly impaired [F(2,37) = 28.77, p <
0.001]. This altered performance of VAChT KDHOM animals is likely the result of altered neuromuscular force,
since these mutants were also severely impaired in a
grip strength test when compared with wild-type mice
[Figure 4B, F(3,48) = 9.52, p < 0.001]. By comparison,
VAChT KDHET mice present no deficit in neuromuscular
function as assessed in this test. Importantly, reduced
grip strength in VAChT KDHOM mice was improved by
prior injection of one of three cholinesterase inhibitors:
pyridostigmine (i.p., 1 mg/kg), galantamine (s.c., 1 mg/kg)
or physostigmine (i.p., 0.3 mg/kg) [Figure 4B, F(3,47) =
8.323, p < 0.05]. No change in grip force was observed
in wild-type mice treated similarly with any of the above
cholinesterase inhibitors at the doses used (not shown).
Since pyridostigmine is charged and should not cross
the blood-brain barrier, its efficacy in improving grip
force observed in homozygous mutant mice directly
implicates peripheral cholinergic transmission in this
effect.
To further study neuromuscular output, we examined
performance of VAChT mice on the rotarod. This test depends not only on the ability of mice to learn motor skills,
but also on their ability to maintain prolonged motor
function. Wild-type mice were able to learn this motor
task, and after five trials their performance was significantly better than their performance during the first trial
[Figure 4C, repeated measures ANOVA, F(13,195) = 16.9,
p < 0.05]. The performance of VAChT KDHET mice improved significantly only after 12 trials on the rotarod [repeated measures ANOVA, F(13,117) = 4.63, p < 0.05]. In
contrast, VAChT KDHOM mice never learned this motor
task [Figure 4C, F(13,91) = 0.653] and their performance
was significantly worse than those of wild-type and
VAChT KDHET mice [F(2,434) = 60.16, p < 0.05 on trials
12, 13, and 14, two-way ANOVA followed by Bonferroni
post hoc tests].
The performance of VAChT KDHOM mice may indicate
either motor learning deficits on the rotarod or that mutant mice are incapable of sustained physical activity. To
evaluate the latter possibility, we used a treadmill to
evaluate the performance of wild-type, VAChT KDHET,
and VAChT KDHOM mice in exhaustive physical activity.
Figure 4D shows that VAChT KDHOM mice were not able
to maintain long periods of physical activity and performed poorly compared with wild-type or VAChT KDHET
mice [one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc,
F(2,28) = 22.09, p < 0.001]. Indeed, VAChT KDHOM mice
could run for no more than 5 min on the treadmill,
whereas wild-type or VAChT KDHET mice could usually
run for longer than 60 min. These results indicate that
VAChT KDHOM mice are unable to perform on the rotarod
due to their decreased capacity to maintain physical
activity. They also indicate that VAChT KDHET mice appear as physically fit as wild-type control mice under
the conditions tested.
Neurochemical Analysis
VAChT KDHOM mice display significant neuromuscular
deficiency, which may confound the outcomes of complex behavioral tests aimed at assessing consequences
of central ACh deficiency. In contrast, VAChT KDHET mice
have essentially normal neuromuscular transmission,
thereby indicating their potential usefulness as test subjects for investigating the behavioral consequences of
mild reductions of central cholinergic function.
To investigate the functional consequences of reduced
VAChT expression, we first used brain microdialysis to
Mouse Model of Cholinergic Dysfunction
605
Figure 4. Neuromuscular Function of VAChT
KDHET and VAChT KDHOM Mice
(A) Time spent hanging upside-down from a
cage by wild-type, VAChT KDHET, and VAChT
KDHOM mice. *p < 0.05 from wild-type controls
(one-way ANOVA followed by Bonferroni post
hoc; F[2,37] = 28.77, p < 0.05, n = 20 wild-type,
n = 12 VAChT KDHET, and n = 8 VAChT KDHOM).
(B) Grip force measured for wild-type, VAChT
KDHET, VAChT KDHOM, and VAChT KDHOM
mice treated with pyridostigmine (i.p., 1 mg/kg),
galantamine (s.c., 1 mg/kg) and physostigmine (i.p., 0.3 mg/kg) 30 min prior to the test.
(*) indicates statistical difference when compared with VAChT KDHOM mice without cholinesterase treatment.
(C) Performance of wild-type (clear squares),
VAChT KDHET (gray squares), and VAChT
KDHOM mice (black squares) on the rotarod
task. (*) indicates statistically significant differences compared with the first trial for
each genotype (repeated measures ANOVA,
p < 0.05). (#) indicates statistically different
performance when compared with wild-type
mice [two-way ANOVA shows an effect of
genotype; F(2,434) = 60.16, p < 0.05].
(D) Exercise capacity of wild-type, VAChT
KDHET, and VAChT KDHOM mice. Mice were
trained on the treadmill with a protocol that
evaluated physical capacity (see Experimental Procedures). After training mice, were
tested for performance, and the work (in J)
done was calculated.
establish extracellular levels of ACh in freely moving
VAChT KDHET mice. Because all brain regions examined
appeared to show similar reductions in VAChT expression, we chose to determine extracellular ACh levels in
frontal cortex and striatum. Frontal cortex was selected
because this brain region receives innervation from nucleus basalis and substantia innominata, areas known
to be affected in Alzheimer’s disease. Striatum was chosen because it contains the largest concentration of cholinergic nerve endings and is therefore particularly suitable to evaluate possible decreases in extracellular
ACh. The quantitative ‘‘low perfusion rate’’ microdialysis
approach, which allows precise determination of a given
extracellular neurotransmitter (Gainetdinov et al., 2003),
revealed that levels of extracellular ACh were depressed
by more than 35% in frontal cortex [t(1,19) = 2.642, p <
0.016] and by approximately 31% in striatum [t(1,18) =
2.560, p < 0.020] of VAChT KDHET mice (Figure 5A).
Next, by using the conventional microdialysis approach,
we examined the dynamic responses to KCl-stimulated
ACh release in the striatum. After establishing basal extracellular ACh levels, artificial cerebrospinal fluid (CSF)
containing 60 mM [K+] was perfused through the microdialysis probe over the next 40 min, and the probe was
returned to normal artificial CSF for the remaining
40 min of the experiment (Figure 5B). A repeated measures ANOVA revealed a significant main effect of time
[F(5,60) = 31.541, p < 0.001] and a significant time by
genotype interaction [F(5,60) = 7.502, p < 0.001]. Bonferroni-corrected pairwise comparisons showed genotype
effects at 40 (p < 0.044), 60 (p < 0.023), and 80 min (p <
0.026). Hence, both genotypes responded to KCl depolarization; however, stimulated release in KDHET striatum
was reduced relative to that of the wild-type controls.
Since VAChT is responsible for sequestering ACh into
secretory vesicles, we evaluated the effects of decreased VAChT expression on total ACh levels in brain
tissue. When tissue concentrations of ACh were measured by high-performance liquid chromatography
(HPLC) with eletrochemical detection (HPLC-EC), levels
in frontal cortex and striatum of VAChT KDHET mice were
significantly increased by approximately 49% [t(1,25) =
4.082, p < 0.001] and 30% [t(1,10) = 3.408, p < 0.007],
respectively, over that of the wild-type controls (Figure 5C). These data were replicated in a complementary
chemiluminescence assay in a separate group of mice
using both striatum and hippocampus (Figure 5D; p <
0.05). Moreover, VAChT KDHOM mice show an even
larger increase in ACh content in the brain, and this increase was statistically different from that of VAChT
KDHET mice or wild-type mice (Figure S1C; p < 0.05).
This increase in ACh content for mutant mice cannot
be attributed to an increase in ChAT activity (Figure S1A),
high-affinity choline transporter activation (Figure S1D),
or increased levels of expression of ChAT (Figures S1B
and S1E) or CHT1 (Figure 1E). Whereas the mechanism
of such an increase in total tissue ACh content it is not
immediately apparent, it is important to emphasize
that the functional ‘‘releasable’’ ACh pool seems to be
decreased, as evidenced by in vivo microdialysis experiments and quantal analysis at the neuromuscular junction. All together, these results demonstrate that a
reduction of approximately 50% in the levels of VAChT
expression in the brain results in a significant decrease
in the release of ACh in vivo, despite enhanced intracellular content of neurotransmitter. These observations
suggest a complex relationship between the control of
storage and release of ACh in CNS neurons.
Neuron
606
Figure 5. Neurochemical Alterations in VAChT KDHET Mice
(A) Extracellular ACh levels as determined by quantitative low perfusion rate microdialysis in frontal cortex and striatum. n = 10 mice per
genotype per brain region.
(B) KCl-stimulated release of ACh in striatum of freely moving mice.
Following 40 min of baseline collection of ACh, 60 mM [K+] was
infused through the microdialysis probe for 40 min, and artificial
CSF was infused over the last 40 min of the experiment. n = 7 mice
per genotype. *p < 0.05 for wild-type controls.
(C) Tissue ACh contents in frontal cortex (FC) and striatum (ST) of
wild-type and KDHET mice measured by HPLC with electrochemical
detection. FC: n = 14 (wild-type), n = 13 (KDHET); ST: n = 6 mice per
genotype.
(D) Striatal (ST) and hippocampal (HIP) tissue ACh levels assayed by
chemiluminescent detection in wild-type (open bars) and VAChT
KDHET (gray bars) mice (n = 5). In all panes, data are mean 6 SEM.
*p < 0.05 for wild-type controls.
Behavioral Evaluation
After documenting normal performance of VAChT KDHET
mice in tests of neuromuscular strength, despite reduced cholinergic tone in the brain, we proceeded to
evaluate performance of mutants in behavioral tasks
reflecting CNS cholinergic function. VAChT KDHET mice
were tested for performance in the step-down inhibitory
avoidance task, a task that depends upon hippocampal
and amygdala networks and may be sensitive to manipulations in central cholinergic function (Izquierdo and
Medina, 1997). Both genotypes exhibited learning, as latency to step-down from the platform increased from
10 to 15 s to approximately 80 to 100 s after training.
In parallel experiments, we determined in another cohort
of mice that the unconditioned stimulus was essential
for both genotypes to learn the task (data not shown).
VAChT KDHET performed as well as wild-type littermates
on this task on a short-term (1.5 hr after learning) and
long-term (24 hr after learning) memory test, suggesting
that this specific aspect of learning and memory is preserved in animals with a mild decrease in cholinergic
tone (Figure 6A).
A second test for memory, based on the ability to discriminate novel objects, was used to evaluate the performance of mutant mice. In the object recognition
task, mice explore two objects, and after a latency of
1.5 or 24 hr they are presented with one of the familiar
objects and a nonfamiliar object. Initial exploration
time of two objects was identical for both genotypes, indicating that they both show preference for novelty (data
not shown). However, whereas wild-type mice exhibited
a significant increase in the exploration of the unfamiliar
object, mutant mice performed poorly compared to
wild-type mice in their ability to remember the familiar
object both 1.5 and 24 hr after learning (Figure 6B, p <
0.05, Kruskal-Wallis analysis of variance and MannWhitney U tests, n = 12–18). Thus, VAChT KDHET mice
appear to have a cognitive deficit that impacts behavior
in this test.
Recognition of a familiar conspecific is the basis of
several social interactions, including hierarchical social
relationship and mate choice (Winslow and Insel,
2004). There is evidence for the participation of nicotinic
and muscarinic central systems in social recognition in
rodents (Prediger et al., 2006; van Kampen et al., 2004;
Winslow and Camacho, 1995), and social recognition
deficits may relate to cholinergic decline in a mouse
model of AD (Ohno et al., 2004). We evaluated social
interactions of VAChT KDHET mice in a habituation-dishabituation paradigm using a mouse intruder (Choleris
et al., 2003). Wild-type control mice showed extensive
exploration of the intruder (e.g., sniffing) during first contact. This response decreased with subsequent exposure to the same juvenile [F(4,11) = 60.93, p < 0.01], indicating that wild-type control mice readily habituated to
the conspecific (Figure 6C). Hence, after four exposures
to the same juvenile, wild-type mice explored the intruder for only one-third of the length of time of the initial
exploration. Upon changing to an unfamiliar mouse,
wild-type animals showed a renewed interest in investigation, and explored the new mice as much as they explored the original intruder during the first contact (Figure 6C). These results indicate that lack of interest in
exploring the first intruder upon recurring exposure
was not attributable to lack of motivation, but appears
to be due to habituation, i.e., learning. Exploration of
the intruder mice by VAChT KDHET mice on the first contact was slightly less than that observed for wild-type
animals (p < 0.05, two-way ANOVA with Bonferroni
post hoc). Upon subsequent exposures, VAChT KDHET
mice show statistically significant differences in exploration of the intruder mice as compared with wild-type
mice (p < 0.001, two-way ANOVA with Bonferroni post
hoc). In sharp contrast to wild-type littermates, VAChT
KDHET mice failed to habituate to the juvenile intruder
in the subsequent exposures after the initial contact,
and only after the fourth contact was there a significant
difference in exploratory behavior compared with the
first encounter [F(4,10) = 5.293, Figure 6C)]. Introduction
of an unfamiliar mouse led VAChT KDHET mice to increase their exploration, indicating that the decrease
in exploration during the fourth exposure for the first
intruder was not due to nonspecific effects such as
physical exhaustion or motivation.
One possible explanation for the inability of VAChT
KDHET mice to habituate to a conspecific is that mutant
mice have olfactory deficits. In a control experiment,
we evaluated olfactory responses in these mice. However, both wild-type and VAChT KDHET mice showed
similar abilities in finding a hidden food reward (data
not shown), suggesting that the differences observed
Mouse Model of Cholinergic Dysfunction
607
Figure 6. Behavioral Alterations of VAChT
KDHET Mice
(A) Step-down inhibitory avoidance task. Retention test latency measured 90 min after
training (STM) and again at 24 hr (LTM). Ordinates express median (interquartile range)
test session latency, in seconds. Open bars
represent the performance of wild-type mice
and shadowed bars represent that of VAChT
KDHET mice (n = 13–18 per group). *p < 0.05
compared with performance of mice during
training.
(B) Object recognition test. Results are shown
as median (interquartile ranges) recognition
indexes of short-term (STM) and long-term
(LTM) retention test trials. Clear bars represent data from wild-type mice and shadow
bars are the data from VAChT KDHET mice.
(#) indicates a significant difference from
wild-type; p < 0.05, n = 12–18. *p < 0.05 compared with performance of mice during
training.
(C) Social memory of wild-type (open
squares) and KDHET (gray squares) mice was
measured as olfactory investigation during
each of four successive 5 min trials with an
intertrial interval of 15 min. A fifth dishabituation trial depicts the response of mice to the
presentation of a new intruder in a 5 min pairing, 15 min after the fourth trial. *p < 0.05 compared with performance on the first trial within
the genotype, and #p < 0.05 when compared
with wild-type control mice; n = 10–12.
(D) Olfactory function of wild-type and VAChT
KDHET mice. Mice were presented a strawth
berry essence for 1 min in 4 sequential trials with an intertrial interval of 10 min. On the 5 trial, vanilla essence was presented. *p < 0.05 from
the first trial within genotype. No between group differences were observed.
(E) Social preference of wild-type (open bar) and VAChT KDHET mice. Only the percentage of exploration for the social stimulus is shown.
(F) Social memory of wild-type (open bars, n = 14), VAChT KDHET (gray bars, n = 14), and VAChT KDHET mice treated with galantamine (s.c., 1 mg/kg)
30 min prior to the first exposure to an intruder (hatched bars, n = 8). The intruder is presented in each of two 5 min trials with an intertrial interval of
30 min. *p < 0.05 for the first trial within the genotype. Unless otherwise stated, data are mean 6 SEM.
in social recognition do not relate to deficits in olfactory
function. In addition, wild-type and VAChT KDHET mice
habituated to a test odor similarly [wild-type, F(4,6) =
11.35, and VAChT KDHET mice, F(4,6) = 18.11, p < 0.05
by repeated measures ANOVA]. There were no differences between the two genotypes in olfactory habituation or in their ability to discriminate between two test
odors (Figure 6D).
A second possibility to explain the deficit in social habituation is that VAChT KDHET mice are more social than
wild-type mice, i.e., they prefer the company of intruder
mice more than wild-type mice do. This would be the
converse of the autistic-like behavior found in PTEN mutant mice (Kwon et al., 2006). To specifically test this
possibility, we evaluated the choice of wild-type and
VAChT KDHET mice for a social stimulus (an adult mouse
in an acrylic cage that allowed minimum tactile exploration but allowed olfactory exploration) against a nonsocial stimulus (an identical acrylic cage which was never
previously presented to the mice). This experiment
was done in specially designed boxes containing two
separate rooms, each of which the mice had to enter
to explore the social or nonsocial target, respectively
(Kwon et al., 2006). As expected from the previous experiment, both genotypes had a stronger preference
for the social against the nonsocial stimuli (Figure 6F);
however, VAChT KDHET mice expended significantly
less time with the social stimulus and consequently
more time with the nonsocial stimulus than wild-type
control mice did (p < 0.05, Student’s t test). Therefore,
increased social preference of VAChT KDHET mice cannot explain the lack of habituation observed in the social
recognition test. If anything, the data indicate that
VAChT KDHET mice are less social than control mice.
The results above suggest that VAChT KDHET mice
have a deficit in social memory. This deficit could be a
consequence of decreased ACh release, or it could result from adaptative changes in brain neurochemistry
during development in response to the decreased expression levels of VAChT. If the deficits in social recognition are related to decreased acetylcholine output,
acute inhibition of cholinesterase, which preserves
ACh in the synapse, might rescue the phenotype. Therefore, we retested mice in the social memory task using
a paradigm that allowed us to treat mice with a cholinesterase inhibitor prior to the experiment. The social recognition memory lasted at least 30 min, as wild-type
mice exposed to an intruder for 5 min twice, with an
intertrial interval of 30 min, explored the intruder significantly less in the second exposure [F(5,70) = 17.21, p <
0.001] (Figure 6F). In contrast, there was no difference
for VAChT KDHET mice between the first and second
Neuron
608
exposure to intruder mice with this protocol (Figure 6E).
We repeated these experiments after injecting mice with
either saline or galantamine (Figure 6F). The dose of galantamine used (s.c., 1 mg/kg) has been shown to be
effective in improving cholinergic function in mice (Csernansky et al., 2005), and it was sufficient to improve the
performance of VAChT KDHET in this social recognition
task (Figure 6F). Injection of saline had no effect on the
performance of wild-type or VAChT KDHET mice, ruling
out that prior manipulation of mice affected the outcome
of these experiments (data not shown). In addition, galantamine did not alter the response of wild-type mice
(data not shown). It should be noted that the deficit in
social recognition memory was also observed in a small
number of VAChT KDHOM mice studied with an identical
protocol (Figure S2), thus confirming this phenotype for
the two mutant genotypes. Hence, it appears that
VAChT KDHET mice have a deficit in social memory due
to decreased cholinergic tone.
Discussion
To define the role of VAChT and ACh in physiological
functions and behavior, we generated a mouse line
with reduced expression of this transporter. The partial
decrease in VAChT expression is essential in these investigations as complete lack of the vesicular transporter is likely to be incompatible with life, as shown
for other presynaptic cholinergic genes (Brandon et al.,
2004; Ferguson et al., 2004; Misgeld et al., 2002). Thus,
this reduced expression mouse line allowed us to examine the consequences of reduced cholinergic tone in
function, behavior, and cholinergic neurochemistry.
It has been demonstrated that several putative mRNA
species exist for VAChT, although V1 is predominant in
cholinergic tissues (Bejanin et al., 1994). In the present
experiments, we show that VAChT KDHET and KDHOM
mice have reduced levels of this major VAChT mRNA,
whereas an increase in a less common mRNA for VAChT
was detected, suggesting the existence of a compensatory mechanism in mutant mice. The open reading frame
of VAChT is within the first intron of the ChAT gene. Interestingly, we detected no changes in ChAT mRNA levels
in all CNS regions investigated, even though ChAT and
VAChT transcripts might be, under certain conditions,
coregulated (Eiden, 1998). In vertebrates, regulation of
the cholinergic gene locus expression is complex;
ChAT- and VAChT-specific mRNAs can be produced either from different promoters or by alternative RNA
splicing (Oda, 1999).
In addition to the decrease in VAChT transcript, we
detected a 45% reduction in VAChT protein levels in
several CNS regions in VAChT KDHET mice, whereas
the reduction of VAChT protein levels in homozygous
mutant mice was 65%–70% of that found in wild-type littermates. Therefore, the data indicate that protein levels
of VAChT closely follow the reduction of the major
VAChT mRNA species.
To evaluate how a decrease in VAChT levels affects
transmitter release, we examined quantal secretion of
ACh at the neuromuscular junction. Surprisingly, we observed relatively mild alterations in the distribution of
quantal sizes in VAChT KDHET mice. A robust change
in quantal size distribution for VAChT KDHOM mice was
detected; however, a very pronounced decrease in the
frequency of MEPPs was also observed. This decrease
in MEPP frequency is not the result of alterations in the
readily releasable pool of vesicles. It also seems unlikely
that the alteration in MEPP frequency is the result of decreased exocytosis, endocytosis, and total pool of vesicles, as FM1-43 experiments have shown no difference
in these parameters between wild-type and VAChT
KDHOM mice. We hypothesized that, if in synapses, the
number of copies of VAChT per synaptic vesicles is
low (Parsons et al., 1993; Van der Kloot, 2003), a reduction in VAChT abundance could result in electrophysiologically ‘‘silent’’ vesicles, and thus a decrease in MEPP
frequency. Prior experiments have demonstrated that
overexpression of VAChT in immature Xenopus spinal
neurons increases not only the amplitude but also the
frequency of miniature excitatory postsynaptic currents
(Song et al., 1997), indicating that, at least under certain
conditions, VAChT expression levels can affect electrophysiological detection of exocytosis. Similarly, in Drosophila mutants with decreased neuromuscular expression of the vesicular glutamate transporter, there are
major deficits in frequency of miniature end-plate currents, but no alterations in quantal size (Daniels et al.,
2006). Remarkably, VAChT phosphorylation by PKC affects its trafficking to secretory vesicles, suggesting
that alterations in VAChT expression in synaptic vesicles
could occur physiologically (Krantz et al., 2000).
The results herein with VAChT mutant mice also indicate that synaptic vesicle exocytosis is not altered by
decreased levels of the transporter; in this regard, these
results agree with similar observations in VMAT2-deficient mice (Croft et al., 2005), which also present no
deficits in monoaminergic vesicle exocytosis. Nonetheless, the data show that VAChT KDHET mice have mild
changes in ACh release at the neuromuscular junction,
whereas VAChT KDHOM mice have a more profound
deficit in transmitter release.
Analysis of neuromuscular function in the three genotypes corroborated these electrophysiological data.
VAChT KDHET mice performed as well as wild-type
mice in tests of motor function, whereas VAChT KDHOM
mice were significantly impaired in grip strength and
ability to hold their weight. Importantly, the deficit in
grip strength could be ameliorated by prior treatment
of mutant mice with cholinesterase inhibitors. The effect
of pyridostigmine, which is used to treat myasthenia,
is of particular importance, as it indicates that a peripheral cholinergic deficit due to alteration in neuromuscular
transmission is the cause of neuromuscular dysfunction.
Investigation of VAChT KD mice on the rotarod, a task
that depends upon motor learning and physical endurance, reveals that VAChT KDHET are slower to learn
this motor task than wild-type control mice, but the former are able to reach the same level of performance in
time. In contrast, VAChT KDHOM mice are significantly
impaired and never improve their performance. That
VAChT KDHOM mice have limited capacity for exercise
is clearly observed on the treadmill, indicating that performance of the homozygous mutants on the rotarod
also reflects their inability to maintain prolonged physical activity. These results suggest that VAChT KDHOM
mice may provide a model for study of the effects of
markedly reduced ACh release on neuromuscular
Mouse Model of Cholinergic Dysfunction
609
function, such as the ones observed in certain types of
congenital presynaptic myasthenia (Ohno et al., 2001).
In contrast, we were unable to detect any alteration in
neuromuscular function in VAChT KDHET mice. Release
of ACh accompanied the reduction of protein expression in the brain for VAChT KDHET mice, and both basal
and stimulated extracellular levels were affected. This
decrease in ACh release appears to be related to the
reduction of VAChT expression, as ChAT activity was
not decreased in these mutants. Overall, the approximately 45% reduction in VAChT expression appears to
decrease ACh secretion to a similar extent in the brain.
Unexpectedly, tissue ACh was significantly increased
in several brain regions from VAChT KDHET and VAChT
KDHOM mice, indicating a previously unrecognized connection between ACh storage, nonvesicular ACh pools,
and tissue content. Molecular mechanisms responsible
for this increased tissue ACh content have not been uncovered yet, but it does not seem to be due to altered
ChAT activity or high-affinity choline uptake. It is interesting that pharmacological experiments with vesamicol, an inhibitor of VAChT, have revealed a similar relationship, whereby decreased secretion of ACh leads to
accumulation of intracellular transmitter during nerve
stimulation (Collier et al., 1986).
Whereas VAChT KDHET mice present only mild defects
in neuromuscular neurotransmission, there is a relatively
larger deficiency in central ACh release in vivo. Neuromuscular transmission has a high safety margin, and
neuromuscular weakness is not observed until a significant proportion of neuromotor units are compromised
(Paton and Waud, 1967; Waud and Waud, 1975). Therefore, it is reasonable to envision that a partial decrease
in VAChT expression will cause more profound consequences on cholinergic transmission in the brain, where
a relatively small number of synaptic vesicles (100–200
vesicles) need to be constantly recycled and refilled
with neurotransmitter. In contrast, at neuromuscular
synapses, there is a very large population of vesicles;
fast refilling of vesicles may not be as crucial for neurotransmission at the neuromuscular junction as it is for
brain synapses, at least when under low neuromuscular
demand.
The VAChT KDHET mice present a unique opportunity
to investigate the consequences of homogeneous decrease of ACh tone in cognitive tasks, as the results
show that these mice represent a model of moderate,
predominantly central cholinergic dysfunction. We observed no deficits in performance of VAChT KDHET
mice in the step-down inhibitory avoidance test. A number of experiments have demonstrated that inhibition of
nicotinic and muscarinic central receptor activity can affect performance of rats in this paradigm (Barros et al.,
2002), indicating an important cholinergic contribution
toward performance in this test. It is likely that the reduction of cholinergic function in VAChT KDHET mice was
below the threshold for detecting a learning or memory
impairment for this task. This result supports the notion
that ACh participates in, but is not essential for, some
hippocampal-dependent paradigms of learning and
memory (Parent and Baxter, 2004).
Interestingly, VAChT KDHET mice performed worse
than wild-type mice in an object recognition test, suggesting that even mild decline of cholinergic function
can affect cognitive processes required for this task. Indeed, rats treated with 192 IgG-saporin, which leads to
cholinergic degeneration in the basal forebrain, also
present object recognition deficits (Paban et al., 2005),
and object recognition alterations are observed in certain mouse models of AD (Dewachter et al., 2002). It is
likely that VAChT KDHET present such deficits because
they have impairments in their ability to learn or remember the intricate cues necessary for discriminating the
novel object.
Our data also revealed an important role of cholinergic
tone in recognition of mouse conspecifics. In these
experiments, the KDHET mice explore unfamiliar mice;
however, their preference for a social stimuli is somewhat decreased compared with wild-type mice. Nonetheless, the mutant mice are not socially deficient,
but they are clearly impaired in remembering intruder
mice when compared with wild-type mice. Absence of
deficits in olfactory discrimination in VAChT KDHET
mice supports the notion that the decreased social
memory is due to cognitive impairments rather than
a simple incapacity to process olfactory cues. An important role of cholinergic tone in social recognition is supported by reversal of this phenotype in mice treated with
a cholinesterase inhibitor and by the fact that VAChT
KDHOM mice also present a significant deficit in social
recognition.
Social memory in rodents depends upon the activity
of vasopressin on V1A receptors in the lateral septum
(Bielsky et al., 2005) and upon the activity of oxytocin
(Bielsky and Young, 2004; Ferguson et al., 2000; Winslow and Insel, 2004). However, central muscarinic and
a7 nicotinic receptors have also been suggested to
play a role in social memory (Prediger et al., 2006; van
Kampen et al., 2004; Winslow and Camacho, 1995), indicating a potential mechanism for ameliorating social
memory deficits in response to cholinergic decline.
Our observations support the notion that reduced cholinergic tone in AD mouse models can indeed cause
deficits in social memory. However, based on somewhat
similar impairments found in the object and social recognition tasks, it is possible that mild cholinergic deficits
may cause a more general memory deficit for recognizing previously learned complex cues, whether social or
not. Future detailed investigations will be necessary to
further define the specific type of cognitive processing
affected by cholinergic deficits in these mutants. Such
studies in mouse models of reduced cholinergic tone
may be particularly informative for understanding the
contribution of cholinergic decline to specific behavioral
alterations observed in certain pathologies of the CNS,
and may even be helpful in understanding physiological
aging (Cummings, 2004).
In conclusion, we have generated an animal model to
study the impact of decreased VAChT expression on
peripheral and central ACh neurotransmission and
function. The present results illuminate the role of VAChT
in vesicular ACh release and reveal that deficits in
VAChT-mediated filling of synaptic vesicles may have
important behavioral consequences. Furthermore, these
observations indicate an important role for ACh in cognitive processes involved in object and social recognition
and memory. In this respect, a decrease in VAChT
expression is much less tolerated than a decrease in
Neuron
610
ChAT activity, a parameter that is used extensively to
evaluate cholinergic deficits in AD.
Experimental Procedures
Animal Care
Heterozygous mutant VAChT mice were backcrossed with C57BL/
6J animals for three generations; the N3 mice were used in most experiments. Homozygous mutant VAChT mice were obtained by
intercrossing N3 heterozygous animals. Control animals were wildtype age- and sex-matched littermates, and all behavioral and
most of the biochemical studies were conducted with researchers
‘‘blind’’ to the genotypes of the mice. For all behavioral experiments,
male mice were used.
Animals were housed in groups of three to five animals per cage in
a temperature-controlled room with a 12:12 light-dark cycles, and
food and water were provided ad libitum. All studies were conducted in accordance with NIH guidelines for the care and use of
animals and with approved animal protocols from the Institutional
Animal Care and Use Committees at the Federal University of Minas
Gerais in Brazil, Pontificia Universidade Catolica de Rio Grande do
Sul in Brazil, and Duke University in the United States.
Wire-Hang, Grip Force, Rotarod, and Treadmill Tests
The wire-hang experiments were conducted as described (Sango
et al., 1996) and time spent hanging upside down was determined
with a cutoff time of 60 s.
To measure grip force, we used a custom-built force transducer
connected to a small support that could be grasped by the mouse
as described (Fowler et al., 2002). Five tests were performed per
mouse with a maximum period of 50 s for each animal over 2 different days. The force transducer was coupled to a computer and a
routine was developed to record the maximal grip force exerted.
For the rotarod task, we followed the protocol described by Brandon et al. (1998). Mice were placed on the rotarod apparatus (Insight
Equipments, Ribeirão Preto, Brazil) and rotation was increased from
5 to 35 rpm. Latency to fall was recorded automatically. The test was
run within the last 4 hr of the light phase of the 12:12 cycle. Ten trials
were given on the first day and four trials on the second day, with
a 10 min intertrial interval. In the time between trials, mice were
placed in their home cage.
For the treadmill test (Insight Equipments, Ribeirão Preto, Brazil),
mice were trained for 4 days (3 min a day). On the first day, inclination
was set to 5 . The inclination was increased by 5 for each training
day until reaching 20 . The initial training speed was 8 m/min, and
the treadmill was accelerated by 1 m/min. In the second training session, the initial speed was 10 m/min increased to 11 and 12 m/min
in the third and fourth training days, respectively. During testing,
the initial speed was set to 12 m/min, which was increased by
1 m/min at 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, and 60 min after starting the exercise, essentially as described by Pederson et al. (2005). The work
performed (in J) was calculated with the following formula: W(J) =
body weight (kg) 3 cos 20 3 9.8 (J/kg 3 m) 3 distance (m).
Step-Down Inhibitory Avoidance
The step-down inhibitory avoidance apparatus was a 50 3 25 3
25 cm acrylic box which had a floor consisting of a grid of parallel
stainless steel bars 1 mm in diameter spaced 1 cm apart. A 10 cm2
wide, 2 cm high acrylic platform was placed in the center of the floor.
Animals were placed on the platform and their latency to step down
on the grid with all four paws was measured with an automatic
device. In the training session, immediately after stepping down
on the grid, the animals received a 2.0 s, 0.3 mA scrambled footshock. Retention test sessions were procedurally identical, except
that no foot-shock was given. The latency to step down during testing was taken as a measure of retention. A ceiling of 180 s was
imposed in this measure, i.e., animals whose test latency was over
than 180 s were counted as 180 s. Each animal was tested twice,
once at 1.5 hr after training, to measure short-term retention, and
once at 24 hr after training, to measure long-term retention (Izquierdo et al., 2002; Lorenzini et al., 1996). Since the variable being
analyzed (step-down latency) does not follow a normal distribution,
the data were analyzed by Mann-Whitney U or Kruskal-Wallis non-
parametric tests, followed by Dunn’s post hoc comparisons where
appropriated.
Object Recognition
All animals were given a single 5 min habituation session with no objects in the open-field arena (as described above). Twenty-four
hours after habituation, training was conducted by placing individual
mice for 5 min into the field, in which two identical objects (objects
A1 and A2; Duplo Lego toys) were positioned in two adjacent corners, 10 cm from the walls. A minimum of 30 s exploration time for
objects was allowed in this first exposure. In a short-term memory
(STM) test given 1.5 hr after training, the mice explored the open field
for 5 min in the presence of one familiar (A) and one novel (B) object.
All objects presented similar textures, colors, and sizes, but distinctive shapes. A recognition index calculated for each animal was expressed by the ratio TB/(TA + TB) [TA = time spent exploring the familiar object A; TB = time spent exploring the novel object B]. Between
trials the objects were washed with 10% ethanol solution and airdried. In a long-term memory (LTM) test given 24 hr after training,
the same mice explored the field for 5 min in the presence of familiar
object A and a novel object C. Recognition memory was evaluated
as for the short-term memory test. Exploration was defined as sniffing or touching the object with nose and/or forepaws (de Lima et al.,
2005). Data for recognition indexes are expressed as median (interquartile ranges). Comparisons among groups were performed using
a Kruskal-Wallis analysis of variance and Mann-Whitney U tests.
Recognition indexes within individual groups were analyzed with
Wilcoxon tests.
Social Recognition
Mice were housed in individual cages in a quiet room for 4 days to
establish territory dominance. Swiss juvenile male mice were used
as the intruder. To test for social interaction, the intruder was placed
inside a transparent acrylic chamber containing several holes and
introduced into the test cage exactly as described (Choleris et al.,
2003). Time spent sniffing was measured as the amount of time
that VAChT KDHET mice or wild-type littermates spent poking their
noses into the holes of the chamber. Initially, the subject tested
(wild-type or VAChT KDHET mouse) was exposed to an empty acrylic
chamber for 10 min; subsequently, this chamber was exchanged by
one containing the intruder and left for 5 min. The entire procedure
was repeated four times. After the fourth exposure to the same
intruder, a novel intruder was added to the acrylic chamber. The experiment was videotaped and a trained researcher, blind to genotype, evaluated time spent sniffing in each condition.
A second experiment consisted of exposing the subject to the
same intruder twice with an intertrial interval of 30 min. The standard
measure for the statistical analysis in social recognition tests was
the time spent exploring the juvenile intruder. To evaluate the contribution of acute cholinergic deficits, saline or 1 mg/kg galantamine
(s.c.) was injected 30 min before beginning of the tests.
For evaluation of sociability, we followed the protocol described
by Kwon et al. (2006). Testing was done in a three-chambered apparatus (15 3 90 3 18.5 cm divided into three chambers of 15 3 29 cm
and separated by dividers with a central 3.8 3 3.8 cm door) that offers the subject a choice between a social stimulus and an inanimate
target. In the habituation session, mice were allowed to explore the
entire box for 10 min. Subsequently, mice stayed 5 min in the center
and were then allowed to interact for 10 min with an empty cage in
one chamber versus a caged social target in the opposite chamber.
Social and nonsocial stimuli were varied among the chambers and
the box was cleaned between tests. Results are presented as percentage of total exploration time.
Two tests to evaluate the olfactory responses of the mice were
conducted (Bielsky et al., 2005; Ferguson et al., 2000). The first consisted of measuring the time that both genotypes took to find a candy
located on the surface of bedding or hidden within the bedding (Ferguson et al., 2000). The second test investigated whether VAChT
KDHET mice presented olfactory habituation and discrimination. Experiments were performed 7 days after completing the social recognition tests in the same groups of mice. For this test, a microtube,
with a piece of cotton containing 10 ml of strawberry essence, was
presented to mice four times for 1 min with a 10 min intertrial interval.
On the fifth trial, the microtube was exchanged with one containing
Mouse Model of Cholinergic Dysfunction
611
vanilla essence. The significance of differences between the groups
was determined by Student’s t test or two-way ANOVA, and a post
hoc Bonferroni test was performed when appropriate. Changes
across trials were assessed with repeated measures ANOVA with
Bonferroni’s post hoc analysis.
For all other methods, see the Supplemental Data.
regulating social recognition: a study with oxytocin and estrogen receptor-alpha and -beta knockout mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
100, 6192–6197.
Supplemental Data
The Supplemental Data for this article can be found online at http://
www.neuron.org/cgi/content/full/51/5/601/DC1/.
Croft, B.G., Fortin, G.D., Corera, A.T., Edwards, R.H., Beaudet, A.,
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of empty synaptic vesicles in dopamine neurons of vesicular monoamine transporter 2 knockout mice. Mol. Biol. Cell 16, 306–315.
Acknowledgments
We thank W. Roberts and S. Suter (Duke University Medical Center)
as well as D.A. Guimaraes and D.M. Diniz (Universidade Federal de
Minas Gerais) for outstanding help in caring for mouse colonies,
L.F.L. Reis and E. Abrantes (Ludwig Institute, Sao Paulo) for help
with genomic library screening, A.M. Carneiro for initial help with
the targeting construct, C. Bock for transgenic service (Duke University Medical Center), B. Collier (McGill University), W. Van der Kloot
(SUNY) and S. Parsons (UCSB) for discussions, and R.M. Rodriguiz
(Duke University Medical Center) for assisting with the statistical
analyses of the neurochemistry experiments. This work was partially
supported by CAPES Fellowships for a sabbatical period at Duke
University (M.A.M.P., V.F.P.), an IBRO grant (M.A.M.P.), a Center
for excellence grant (FAPEMIG, CNPq, and PRONEX-MG to
M.A.M.P. and V.F.P.), the Millenium Institute (M.V.G.), a Fogarty
International Collaboration Award (FIC-NIH, R03 TW007025-01A1
to M.G.C., M.A.M.P., and V.F.P.), and NIH grants DA13551,
NS19576 and MH60451 to M.G.C. Establishment of mouse colonies
in Brazil received support from a pilot grant from the Alzheimer’s
Program of the American Health Assistance Foundation (M.A.M.P.).
Received: March 29, 2006
Revised: June 27, 2006
Accepted: August 3, 2006
Published: September 6, 2006
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