AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE E ATIVIDADE

AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE E ATIVIDADE COAGULANTE DE
EXTRATO DE FOLHAS E FLORES DE Asclepias curassavica
Imlau, Carla1; Wentz, Daiane Karen1; Santos, Marina Caus1; Giacomin, Patrícia1;
Scortegagna, Jéssica1; Rafagnin, Letícia Ribeiro1; Teixeira, Mário Lettieri1
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Instituto Federal de Santa Catarina, Concórdia/SC
INTRODUÇÃO
As plantas da família Asclepiadaceae incluem mais de 2.000 espécies classificadas em
280 gêneros e estão distribuídas em todo o mundo, nas regiões tropicais e sub-tropicais. A
maioria dos representantes da família Asclepiadaceae são ervas perenes e seu látex é usado
exclusivamente como um remédio comum para a cicatrização de feridas e para parar o
sangramento em cortes frescos por curandeiros tradicionais (MUEEN e RANA, 2005). A
composição do látex destas plantas, comumente, é uma mistura de várias enzimas hidrolíticas,
em que as proteases são as principais enzimas responsáveis pelas ações farmacológicas e
toxicológicas observadas. Estudos tem demonstrado que cisteína-proteases extraídas de
Calotropis gigantea e as serina-proteases de Synadenium grantii afetam a hemostasia
formando coágulos de fibrina (RAJESH et al., 2006). Semelhante a outras plantas destas
famílias, a Asclepias curassavica, popularmente conhecida como oficial-de-sala, também é
uma boa fonte de enzimas proteolíticas, como cisteína-proteases (LIGGIERI et al., 2004).
As principais atividades econômicas do Oeste Catarinense estão estruturadas em
cadeias produtivas, nas quais as agroindústrias são os atores determinantes de suas trajetórias,
obedecendo a determinações que vêm do mercado e/ou da legislação do setor. Atualmente,
Santa Catarina é o quinto maior produtor de leite do Brasil e o estado ainda registra um
crescimento anual de 10% na produção. Até o final de 2013 os produtores catarinenses devem
chegar à casa dos três bilhões de litros (TESTA et al., 2013).
Desta forma, a ausência de informações sobre a presença de plantas tóxicas no local de
pastoreio, pode acarretar na diminuição da produção leiteira e em casos mais graves a redução
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Curso de Bacharelado em Medicina Veterinária
Trabalho financiado com apoio do IFC
do número de animais. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar, de forma preliminar, as
propriedades citotóxicas dos extratos brutos de folhas (EBF) e flores (EBFL) de A.
curassavica, bem como a interferência destes extratos no processo de coagulação sanguínea.
MATERIAL E MÉTODOS
Exemplares de A. curassavica foram recolhidos da mata da região, sendo realizada a
identificação botânica por meio de excicata. Os extratos foram preparados à base de folhas e
flores. O extrato bruto das folhas (EBF) foi preparado a partir de 200 g de folhas com 320 mL
de água acidificada (pH 5,0) e foi submetido ao processo de extração por maceração no
período de 3 dias. Já, o extrato bruto das flores (EBFL) foi preparado com 50 g das mesmas e
80 mL de água acidificada (pH 5,0), e procedido da mesma forma que o extrato de folhas. A
avaliação da citotoxicidade foi mensurada pela capacidade de lisar eritrócitos bovinos. A
dosagem de hemoglobina livre foi realizada submetendo uma suspensão de hemácias a 2% a
diferentes concentrações dos extratos de A. curassavica (1/1, ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64,
1/128, 1/256, 1/512), por um período de 5 minutos de incubação em temperatura ambiente.
Após esse período, foi verificada a formação de um botão no fundo de cada tubo e, logo em
seguida foi feita a mensuração da fração de hemoglobina livre (Hemoglobina – Labtest,
Minas Gerais, Brasil). Como controle negativo foi utilizado solução fisiológica (NaCl 0,9%) e
como controle positivo solução de KCN 0,01%. Este teste foi realizado em triplicata, da
mesma forma, que o teste de dosagem de hemoglobina. O sobrenadante foi utilizado para a
dosagem de lactato desidrogenase, a este foi adicionado 1 mL do reagente de trabalho do kit
Labtest (Minas Gerais, Brasil) e realizada a leitura da absorbância (A) de cada tubo em 340
nm durante o intervalo de 1 minuto. A concentração de lactato desidrogenase (LDH) foi
calculada de acordo com a equação (LDH (U/L) = [Afinal - Ainicial/ 2] x 8095). Como controle
negativo foi utilizado solução fisiológica (NaCl 0,9%) e como controle positivo sangue
hemolisado de bovino a 1% sendo o teste realizado em triplicata. Para a avaliação da
atividade coagulante, foi coletado 4,5 mL de sangue bovino e colocado em tubos de ensaio,
contendo 100 µL dos extratos de A. curassavica e cronometrado imediatamente o tempo para
a formação do coágulo. O controle negativo utilizado foi solução de citrato de sódio 22,5 mM
e o controle positivo foi solução fisiológica (NaCl 0,9%), sendo realizado em triplicata.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
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A atividade hemolítica dos extratos de A. curassavica foi determinada pela
percentagem de lise de eritrócitos. De acordo com este estudo, houve lise celular a partir da
concentração 1/64 do EBF e 1/32 para o EBFL (Figura 1).
Figura 1. Avaliação da citotoxicidade dos extratos brutos de folhas (EBF) e de flores (EBFL)
de Asclepsia curassavica em relação à percentagem de eritrócitos lisados de acordo com a
quantificação de hemoglobina livre.
Fonte: próprio autor
As células tratadas com as diferentes concentrações dos extratos de A. curassavica
resultaram no aumento dos níveis de liberação de LDH. Na concentração 1/64 do EBF, a
concentração extracelular de LDH foi de 15,27 % e para a concentração de 1/32 do EBFL foi
de 4,63%, em relação ao padrão positivo (Figura 2).
Figura 2. Avaliação da citotoxicidade dos extratos brutos de folhas (EBF) e de flores (EBFL)
de Asclepsia curassavica em relação à percentagem de eritrócitos lisados de acordo com a
quantificação de lactato desidrogenase liberada (LDH).
Fonte: próprio autor
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A perda da integridade da membrana celular está intimamente relacionada com a
concentração dos extratos (EBF e EBFL). O tubo controle demorou 3'40'' para coagular,
enquanto o tubo EBFL 3'07'' e o tubo EBF 2'09''. Em relação à atividade anticoagulante, o
tubo controle levou 2'36'' enquanto o tubo EBFL demorou 1'45'' e o tubo EBF 1'38'',
respectivamente. Diante destes resultados, observou-se a rápida coagulação do sangue em
contato com o extrato bruto da planta. O tubo EBF foi o que apresentou o maior potencial de
coagulação. A perda da integridade da membrana celular está intimamente relacionada com a
concentração dos extratos (EBF e EBFL). O tubo controle demorou 3'40'' para coagular,
enquanto o tubo EBFL 3'07'' e o tubo EBF 2'09''. Em relação à atividade anticoagulante, o
tubo controle levou 2'36'' enquanto o tubo EBFL demorou 1'45'' e o tubo EBF 1'38'',
respectivamente. Diante destes resultados, observou-se a rápida coagulação do sangue em
contato com o extrato bruto da planta. O tubo EBF foi o que apresentou o maior potencial de
coagulação.
A análise preliminar da citotoxicidade dos extratos brutos de A.curassavica foi
investigada em eritrócitos de bovinos. As células tratadas com os EBF e EBFL mostraram
resultados semelhantes neste estudo, em que a extensão do dano celular foi proporcional à
concentração dos respectivos extratos. Desta forma, a viabilidade celular diminui
progressivamente com o aumento da concentração dos extratos. Diferentes níveis de
citotoxicidade podem ser relacionados com os parâmetros bioquímicos das células envolvidas,
como a composição da membrana do plasma e a atividade metabólica, do tempo de exposição
ao agente tóxico, e também o ensaio de toxicidade usado. Um dos indicadores de morte
celular é a liberação de conteúdos intracelulares para o meio extracelular, e a quantificação da
LDH no sobrenadante do meio de cultura de células, indica lesão da membrana celular e
consequente morte celular (PAPO e SHAI, 2005).
As espécies que pertencem à família Asclepiadaceae geralmente contêm enzimas
proteolíticas no seu látex, o qual apresenta na sua composição, uma mistura complexa de
componentes, como proteínas, vitaminas, carboidratos, lipídios, terpenos, alcalóides e
aminoácidos livres. A presença de certas enzimas como, quitinases e proteases, em vacúolos
de látex sugere que estas podem ser responsáveis por mecanismos de defesa da planta, quando
a célula vegetal for lisada (VIERSTRA, 1996).
CONCLUSÕES
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Ao término desta pesquisa, constatou-se que os EBF e EBFL da A. curassavica
apresentam um potencial efeito citotóxico e atividade coagulante. A ingestão desta planta por
animais pode oferecer riscos à saúde dos mesmos de acordo com este estudo de avaliação
preliminar de citotoxicidade. As perspectivas deste trabalho remetem a identificação e
caracterização físico-química deste(s) composto(s) presentes nas folhas e flores da planta
A.curassavica. Portanto, mais estudos devem ser realizados a fim de compreender a
complexidade do mecanismo de ação, bem como a relação estrutura-atividade dos compostos
ativos presentes nos extratos. Estes estudos devem envolver a caracterização molecular e a
interação dos compostos químicos presentes nos extratos com os receptores de membrana celular.
REFERÊNCIAS
LIGGIERI. C.; ARRIBERE, M. C.; TREJO, A. S.; CANALS, F.; AVILES, F. X.; PRIOLO,
N. S. Purification and biochemical characterization of asclepain c I from the latex of
Asclepias curassavica. Protein Journal, v. 23, p. 403-411, 2004.
MUEEN, K.; AHMED, K.; RANA, A. C. Calotropis species (Ascelpediaceae) - A
comprehensive review. Pharmacognosy Magazine, v. 1, p. 48-52, 2005.
PAPO, N.; SHAI, Y. Host defense peptides as new weapons in cancer treatment. Cellular
and Molecular Life Sciences, v. 62, p. 784-790, 2005.
RAJESH, R.; NATARAJU, A.; RAGHAVENDRAGOWDA, C. D.; FREY, B. M.; FREY, F.
J.; VISHWANATH, B. S. Purification and characterization of a 34-kDa, heat stable
glycoprotein from Synadenium grantii latex: action on human fibrinogen and fibrin clot.
Biochimie. v. 88, p. 1313-1322, 2006.
TESTA, V. M.; MELLO, M. A.; FERRARI, D. L.; SILVESTRO, M. L.; DORIGON, C. A
escolha da trajetória da produção de leite como estratégia de desenvolvimento do Oeste
Catarinense. Epagri. Florianópolis. 2013. 120 pp.
VIERSTRA, R. D. Proteolysis in plants: mechanisms and functions. Plant Molecular
Biology, v. 32, p. 275-302, 1996.
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