PT 106445

(11) Número de Publicação:
PT 106445
(51) Classificação Internacional:
A61K 9/62 (2006)
(12) FASCÍCULO DE PATENTE DE INVENÇÃO
(22) Data de pedido: 2012.07.15
(73) Titular(es):
(30) Prioridade(s):
UNIVERSIDADE DE LISBOA
ALAMEDA DA UNIVERSIDADE, CIDADE
UNIVERSITÁRIA
1649-004 LISBOA
(43) Data de publicação do pedido: 2014.01.15
PT
(72) Inventor(es):
MAFALDA DE CASTRO ASCENSÃO MARQUES
VIDEIRA
PT
(74) Mandatário:
TERESA MARIA FERREIRA PEREIRA DA SILVA
GARCIA
R SOLDADOS DA INDÍA Nº72 LISBOA
1400-430 LISBOA
PT
(54) Epígrafe: SISTEMA TRANSPORTADOR DE POLIPLEXES PEGUILADO, SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO,
INTERMEDIÁRIOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
(57) Resumo: A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE EM GERAL A UM SISTEMA FARMACÊUTICO
TRANSPORTADOR DE MOLÉCULAS E MAIS EM PARTICULAR A SISTEMAS FARMACÊUTICOS
TRANSPORTADORES DE MOLÉCULAS COMPLEXADAS O QUAL COMPREENDE PELO MENOS UM NÚCLEO
CONSTITUÍDO POR NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS, NÃO POLIMÉRICAS, SUBMICROMÉTRICAS; UMA
ZONA INTERMÉDIA COMPREENDENDO UM POLIPLEX POLIMÉRICO DE QUITOSANO OU UM SEU DERIVADO E
UM OU MAIS ÁCIDOS NUCLEICOS; E UMA CAMADA EXTERIOR DE REVESTIMENTO POLIMÉRICA
COMPREENDENDO UM OU MAIS POLÍMEROS ANFIFÍLICOS. UM SISTEMA DE ACORDO COM A PRESENTE
INVENÇÃO PERMITE SUPRIMIR OS EFEITOS TÓXICOS VERIFICADOS NA ADMINISTRAÇÃO DE POLIPLEXES,
LIPOPLEXES OU NANOTRANSPORTADORES COM CARGA SUPERFICIAL POSITIVA, AUMENTANDO POR SUA
VEZ A EFICÁCIA DE TRANSFECÇÃO E POSSIBILITANDO A ADMINISTRAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS
NUCLEICOS IN VIVO. A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE AINDA A PROCESSOS DE PREPARAÇÃO DO
REFERIDO SISTEMA E A COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO TAIS SISTEMAS BEM COMO À SUA
UTILIZAÇÃO.
RESUMO
“Sistema transportador de poliplexes peguilado, seu processo
de preparação, intermediários e composições farmacêuticas”
A presente invenção refere-se em geral a um sistema
farmacêutico transportador de moléculas e mais em particular
a
sistemas
farmacêuticos
complexadas
o
constituído
por
poliméricas,
qual
transportadores
compreende
nanopartículas
pelo
de
menos
lipídicas
submicrométricas;
uma
moléculas
um
núcleo
sólidas,
zona
não
intermédia
compreendendo um poliplex polimérico de quitosano ou um seu
derivado
e
um
ou
mais
ácidos
nucleicos;
e
uma
camada
exterior de revestimento polimérica compreendendo um ou mais
polímeros anfifílicos. Um sistema de acordo com a presente
invenção permite suprimir os efeitos tóxicos verificados na
administração
de
nanotransportadores
aumentando
por
possibilitando
com
sua
a
poliplexes,
vez
carga
a
lipoplexes
superficial
eficácia
administração
de
de
ou
positiva,
transfecção
sequências
de
e
ácidos
nucleicos in vivo.
A presente invenção refere-se ainda a processos de
preparação do referido sistema e a composições farmacêuticas
contendo tais sistemas bem como à sua utilização.
1 DESCRIÇÃO
“Sistema transportador de poliplexes peguilado, seu processo
de preparação, intermediários e composições farmacêuticas”
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se em geral a um sistema
farmacêutico
particular
transportador
a
sistemas
de
moléculas
farmacêuticos
e
mais
em
transportadores
de
moléculas complexadas. A presente invenção refere-se ainda a
processos de preparação do referido sistema e a composições
farmacêuticas
contendo
tais
sistemas
bem
como
à
sua
utilização.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As moléculas de ácido ribonucleico (RNA) de dupla
cadeia
podem
inibir
a
expressão
organismos eucarióticos, por um
de
genes
processo
homólogos,
em
chamado mecanismo
de interferência de RNA (RNAi) descrito por Fire e Craig
Mello. Este mecanismo é levado a cabo por pequenas moléculas
de RNA de interferência como o pequeno RNA interferência
(siRNA) ou os micro RNA de interferência (miRNA), geradas
intracelularmente através da clivagem de moléculas longas de
RNA de dupla
cadeia. Este
moléculas de siRNA
mediado
pela
processo,
do qual
resultam
ou miRNA com 19 a 25 nucleótidos, é
acção
de
uma
proteína
específica
denominada
Dicer.
As
pequenas
associam-se
a
nuclease
modo
de
um
sequências
complexo
a
formar
de
siRNA
assim
multiproteico
um
complexo
de
formadas
contendo
uma
silenciamento
2 induzido por RNA (RISC). Por acção de uma helicase, este
complexo torna-se activo após perda de uma das cadeias da
molécula
de
antisentido
siRNA
ou
miRNA,
deixando
livre
para
se
ligar
ao
mensageiro
RNA
a
sequência
(RNAm)
complementar, induzindo a clivagem endonucleotídica deste na
sequência
alvo,
bloqueando
desta
forma
a
expressão
da
proteína alvo [Laufer SD, Detzer A, Sczakiel G, Restle T;
Selected strategies for the delivery of siRNA in vitro and
in vivo; RNA technologies and their applications, 2010:2958. Aigner A.; Delivery systems for the direct application
of siRNAs to induce RNA interference (RNAi) in vivo; Journal
of Biomedicine and Biotechnology; 2006:1-15. Kurreck J; RNA
interference:
from
basic
research
to
therapeutic
applications; Angew Chem Int Ed Engl; 2009; 48(8):1378-98.
Lares MR, Rossi JJ, Ouellet DL; RNAi and small interfering
RNAs
in
human
disease
therapeutic
applications;
Trends
Biotechnol; Nov 2010; 28(11): 570-9. Tseng YC, Mozumdar S,
Huang L; Lipid-based systemic delivery of siRNA; Adv Drug
Deliv Rev; 25 Jul 2009; 61(9):721-31].
A
possibilidade
de
desenhar
pequenas
moléculas
sintéticas de siRNA ou miRNA para silenciar a expressão de
genes
envolvidos
angiogénese,
na
proliferação,
metastização,
inibição
resistência a fármacos em células que
das
suas
funções,
terapêutica
torna
promissora
esta
em
sobrevivência,
da
e
apresentam alteração
tecnologia
várias
apoptose
uma
áreas
estratégia
terapêuticas,
especialmente a da oncologia.
Contudo,
nucleases
dos
quer
devido
fluídos
à
degradação
biológicos
quer
a
promovida
uma
pelas
ineficiente
internalização celular das sequências oligonucleotídicas na
sua forma livre, um dos maiores desafios no desenvolvimento
de
terapias
relacionado com
baseadas
em
siRNA
ou
miRNA
está
3 o problema da distribuição
sistémica
após administração
e, posteriormente, com a passagem destes através da membrana
celular das células alvo. Após a internalização celular, que
ocorre maioritariamente por endocitose, os siRNA ou os miRNA
são incluídos nos endossomas a partir dos quais se escapam
para
o
citoplasma,
exercendo
aí
a
sua
actividade
de
silenciamento pós-transcricional. O escape endossómico é um
dos passos mais importantes relacionados com
a eficiência de
transfecção
de
um
sistema
de
veiculação
para
material
genético. Durante o percurso intracelular as nanopartículas
permanecem
sequestradas
em
vesículas
endossómicas
onde
a
matriz do veículo é degradada progressivamente e o
material
genético é libertado por ruptura da vesícula endóssomica. No
entanto, a permanência dos oligonucleótidos
no interior da
vesícula, até à formação do lisossoma, provoca a degradação
das sequências nucleotídicas [de Martimprey H, Vauthier C,
Malvy C, Couvreur P; Polymer nanocarriers for the delivery
of
small
fragments
of
nucleic
acids:
oligonucleotides
and
siRNA; Eur J Pharm Biopharm; 2009; 71(3):490-504. Gary DJ,
Puri
N,
Won
YY;
perspectives
on
the
distinctions
from
Release;
2007;
Polymer-based
fundamental
polymer-based
121(1-2):64-73.
DNA
Mao
siRNA
and
delivery:
phenomenological
delivery;
S,
Sun
J
W,
Control
Kissel
T;
Chitosan-based formulations for delivery of
DNA and siRNA;
Adv Drug Deliv Rev; 2010;62(1):12-27]. O fenómeno inerente à
ruptura da membrana endossómica com consequente libertação
do
material genético para o citoplasma pode ser induzido
através de um mecanismo normalmente designado por “efeito
esponja
de
protões”.
Este
fenómeno
é
definido
como
a
capacidade de um veículo exercer um efeito tampão sobre o pH
endosomal,
provocado
induzindo
por
osmose
o
intumescimento
devido
protões e iões cloreto [de
C,
Couvreur
P;
Polymer
à
dos
acumulação
endossomas
excessiva
de
Martimprey H, Vauthier C, Malvy
nanocarriers
for
the
delivery
of
4 small fragments of nucleic acids:
oligonucleotides and siRNA;
Eur
J
Pharm
Biopharm;
2009;
71(3):490-504.
Oskuee
RK,
Phillipp A, Dehshahri A, Wagner E, Ramezani M; The impact of
carboxyalkylation
of
branched
polyethylenimine
on
effectiveness in small interfering RNA delivery; The Journal
of Gene Medicine; 2010; 12(9):729-38; Epub 2010/08/05].
À
inclusão
de
material
genético
numa
célula
eucariótica dá-se o nome de transfecção [Kopatz I, Remy JS,
Behr
JP;
A
model
for
non-viral
gene
delivery:
through
syndecan adhesion molecules and powered by actin; J Gene
Med.;
Jul
2004;
6(7):769-76.
I
Mortimer,
P
Tam,
I
MacLachlan, RW Graham, EG Saravolac e PB Joshi; Cationic
lipid-mediated
transfection
of
cells
in
culture
requires
mitotic activity; Gene Therapy; 1999; 6:403–411].
A
baixa
taxa
de
sucesso
das
estratégias
de
administração local de ácidos nucleicos não complexados e a
ausência
de
intracelular
vista
à
sua
transportadores
selectiva
de
aplicação
eficazes
siRNA
ou
terapêutica
para
miRNA
a
entrega
sintéticos
demonstram
a
com
enorme
necessidade de desenvolver sistemas eficazes de transporte
in
vivo
de
vários
sequências
sistemas
de
oligonucleotídicas.
veiculação
de
São
moléculas
conhecidos
que
visam
ultrapassar ou limitar tais problemas.
Relativamente à administração de siRNAs ou miRNAs, a
ligação destas sequências a um vector de transfecção, viral
ou
não
viral,
promove
uma
melhor
estabilidade
após
administração in vivo, protegendo simultaneamente os ácidos
nucleicos
da
degradação
pelas
nucleases.
Atualmente,
os
sistemas virais de veiculação de ácidos nucleicos originam
habitualmente
entanto,
elevadas
apresentam
eficiências
de
transfecção.
No
problemas relacionados com toxicidade,
imunogenicidade, humoral e celular, e potencial inflamatório
[de
5 Martimprey
H,
Vauthier
C,
Malvy
C,
Couvreur
P;
Polymer nanocarriers for the delivery of small fragments of
nucleic
acids:
oligonucleotides
and
siRNA;
Eur
J
Pharm
Biopharm; 2009; 71(3):490-504. Xiong XB, Falamarzian A, Garg
SM,
Lavasanifar
A;
Engineering
of
amphiphilic
block
copolymers for polymeric micellar drug and gene delivery; J
Control Release; 2011; 155(2):248-61. Ozpolat B, Sood AK,
Lopez-Berestein
G;
Nanomedicine
based
approaches
for
the
delivery of siRNA in cancer; Journal of internal medicine;
2010; 267(1):44-53; Epub 2010/01/1]. A estes vectores está
também
associado
recombinações
o
e
perigo
efeitos
de
ocorrência
carcinogéneos.
de
mutações,
Também
tem
sido
intensamente proposta como alternativa à administração de
sequências
de
ácidos
nucleicos
simples,
a
utilização
de
vectores não virais, sintéticos, que envolvem a complexação
do RNA com lípidos (lipoplexes) ou polímeros (poliplexes)
catiónicos, como o quitosano, ou ainda a incorporação destas
sequências em nanopartículas poliméricas ou lipídicas [Xiong
XB, Falamarzian A, Garg SM, Lavasanifar A; Engineering of
amphiphilic block copolymers for polymeric micellar drug and
gene
delivery;
J
Control
Release;
2011;
155(2):248-61.
Ozpolat B, Sood AK, Lopez-Berestein G; Nanomedicine based
approaches for the delivery of siRNA in cancer; Journal of
internal medicine; 2010; 267(1):44-53; Epub 2010/01/12].
De
entre
estes,
o
quitosano
é
um
polissacarídeo
catiónico natural que tem demonstrado ser biocompatível, não
inflamatório,
termos
de
não
tóxico
veiculação
e
biodegradável.
selectiva,
Vantagens
internalização
em
celular
e
tráfico intracelular têm sido demonstradas para os complexos
formados
entre
este
polímero,
ou
os
seus
derivados,
e
sequências nucleotídicas de carga fortemente negativa, como
são
os
ácidos
nucleicos.
Contudo,
apesar
da
sua
já
reconhecida capacidade para formar poliplexes e proteger o
material
genético
da
acção
das
nucleases,
a
sua
6 administração
sistémica
está
igualmente
comprometida
pelo
carácter catiónico dos complexos formados [de Martimprey H,
Vauthier C, Malvy C, Couvreur P; Polymer
nanocarriers for
the
delivery
of
small
acids:
oligonucleotides
and
fragments
siRNA;
Eur
J
of
nucleic
Pharm
Biopharm;
2009; 71(3):490-504, Mao S, Sun W, Kissel T; Chitosan-based
formulations for delivery of DNA and siRNA; Adv Drug Deliv
Rev. 2010; 62(1):12-27]. Tais sistemas catiónicos apresentam
forte
toxicidade
sistémica
uma
vez
que
desencadeiam
processos de inflamação devidos maioritariamente à formação
de agregados em presença das proteínas séricas, opsoninas e
proteínas do complemento [Alexis, F, Pridgen, E, Molnar, LK
e
Farokhzad,
OC;
Factors
affecting
the
clearance
and
biodistribution of polymeric nanoparticles; Mol Pharm; 2008;
5:505–515].
Em
particular,
a
US
2011/0287547
(Cory
J.
Berkland, L.) divulga composições e processos de libertação
de
ácidos
nucleicos
compreendendo
um
polímero
catiónico
(HIV-péptido transativador de transfecção (TAT)), um ácido
nucleico e um ião metálico (cálcio) [US 2011/0287547]. Estes
transportadores permitem uma veiculação do ácido nucleico
direcionada
às
células
alvo.
Crê-se
que
a
utilização
do
péptido TAT contribui para aumentar a seletividade para as
células alvo e promover a internalização celular através de
uma endocitose ativa. Contudo, o sistema final apresenta uma
carga positiva o que antecipa que a sua administração in
vivo está comprometida por episódios de toxicidade.
Recentemente têm surgido outras abordagens visando
limitar a formação de agregados que traduzem um nível de
toxicidade
que
impede
a
utilização
clínica
daqueles
sistemas. Entre estas abordagens, destaca-se o revestimento
dos
complexos
polímero-
ou
lípido-RNA
com
poli(etileno-
glicol) (PEG) ou com os seus derivados processo este também
conhecido por peguilação. Foi demonstrado que a peguilação
de
poliplexes
anula
a
carga
positiva
e
em
consequência
7 diminui
a
formação
toxicidade
associada
Kircheis,
R,
complexes:
extended
de
agregados
[Ogris,
Wagner,
reduced
M,
E;
in
consequentemente
Brunner,
PEGylated
interaction
circulation
e
blood
Schuller,
S,
DNA/transferrin-PEI
with
and
S,
a
blood
potential
components,
for
systemic
gene delivery; Gene Ther; 1999; 6:595−605]. Tais complexos
peguilados,
contudo,
desvantagens,
como
celular
transportadores
dos
genético,
por
podem
apresentar
exemplo
dificultando
retardar
que
ainda
a
múltiplas
internalização
veiculam
o
processo
o
material
de
digestão
endo/lisossómica durante o percurso intracelular.
Um problema comum aos sistemas transportadores nãovirais
baixa
recentemente
taxa
de
desenvolvidos
eficiência
na
está
relacionado
transfecção
de
com
a
sequências
oligonucleotídicas. A ausência de sistemas de administração
eficazes
e
seguros
é
confirmada
pelo
número
reduzido
de
ensaios clínicos de fase III [http://clinicaltrials.gov].
Existe assim a necessidade de desenvolver um sistema
farmacêutico transportador de sequências de ácidos nucleicos
suprimindo
os
efeitos
administração
de
nanotransportadores
aumentando
por
possibilitando
tóxicos
a
poliplexes,
com
sua
verificados
carga
vez
a
lipoplexes
superficial
eficácia
administração
de
com
de
ou
positiva,
transfecção
sequências
a
de
e
ácidos
nucleicos in vivo.
Na descrição e reivindicações a palavra “compreender”
e variações desta palavra não se destinam a excluir outras
características técnicas, aditivos, excipientes, componentes
ou passos.
Objectivos,
tornar-se-ão
matéria
pela
vantagens
evidentes
análise
para
da
e
as
características
pessoas
descrição
ou
adicionais
competentes
pela
prática
na
da
8 invenção. Os exemplos seguintes são apresentados a título
ilustrativo e não se destinam a limitar a presente invenção.
Além
disto,
combinações
a
possíveis
presente
da
invenção
abrange
concretizações
toda
as
particulares
e
preferidas aqui descritas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A
presente
invenção
foi
realizada
tendo
em
vista
superar as desvantagens referidas no estado da técnica e é
objecto
da
presente
farmacêutico
invenção
transportador
de
proporcionar
moléculas
ou
um
sistema
sequência
de
ácidos nucleicos que compreende, pelo menos:
a) um
núcleo
lipídicas
constituído
sólidas
por
(SLN),
nanopartículas
não
poliméricas,
submicrométricas;
b) uma zona intermédia compreendendo um poliplex
polimérico de quitosano ou um seu derivado e um
ou mais ácidos nucleicos; e
c) uma camada exterior de revestimento polimérica
compreendendo um ou mais polímeros anfifílicos.
Em
outros
nanopartículas
(m/mtotal
de SLN
aspectos
compreendem
da
pelo
presente
menos
invenção
entre
1,0
e
3,0
as
%
) de um lípido sólido e pelo menos 12,5 a 50 %
(m/mlípido)
de
um
utilizado
pode
agente
tensioactivo.
compreender
pelo
menos
O
lípido
um
sólido
acilglicerol
selecionado de entre um mono, um di ou um triacilglicerol de
cadeia carbonada entre C16 e C22 ou uma sua mistura e de
preferência é um palmitoestearato de glicerilo com cadeia
carbonada
de
C16,
composto
por
cerca
palmítico mono, di e tri-esterificado.
de
80%
de
ácido
9 O tensioativo é um tensioativo não iónico que pode
ser
selecionado
de
preferência
de
entre
o
grupo
dos
monoestearatos de sorbitano (polisorbato 60 ou 80).
Numa concretização preferida do sistema da presente
invenção as nanopartículas lipídicas sólidas podem conter um
ou mais ingredientes farmaceuticamente ativos permitindo uma
terapia
conjugada;
farmaceuticamente
agentes
de
entre
ativo
os
múltiplos
utilizáveis
antineoplásicos;
podem
antineoplásicos
ingredientes
referir-se
preferidos
os
que
podem ser usados são por exemplo o paclitaxel, o docetaxel
ou a doxorubicina; concentrações especialmente adequadas de
paclitaxel estão entre 80 e 200 µg por ml de produto.
Em
um
modo
de
realização
preferido
o
sistema
farmacêutico de acordo com a invenção compreende 25 a 50%
(v/v)
de
quitosano
realização
o
ou
seus
quitosano
derivados.
é
Em
selecionado
outro
do
modo
grupo
de
dos
glicolquitosanos com um peso molecular entre 20 e 150 kD.
Quando o sistema de acordo com a presente invenção
compreende
ácidos
nucleicos
estes
podem
compreender
DNA
(ácido desoxirribonucleico), ou RNA, em especial siRNA ou
miRNA.
O
sequência
siRNA
ou
o
específica
miRNA
de
podem
RNA
ser
seletivos
mensageiro
que
para
controla
uma
a
síntese de uma proteína.
O polímero anfifílico que constitui a camada exterior
de revestimento pode compreender poloxâmeros com a seguinte
estrutura:
EO-xPO-EO
em que EO significa óxido de etileno, PO significa óxido de
propileno
e
x
alternativamente
estrutura:
é
um
número
compreender
inteiro
um
entre
polímero
com
1
e
a
20
ou
seguinte
10 PEG-PE
em que PEG significa polietilenoglicol com peso molecular
compreendido
entre
1000
e
2000
e
PE
significa
fosfatildiletanolamina.
Em
invenção,
uma
a
variante
camada
funcionalizada
fragmentos
de
por
preferida
exterior
ligação
de
de
anticorpos,
do
um
sistema
cobertura
ou
para
mais
da
presente
pode
estar
anticorpos
receptores
ou
celulares
específicos.
Opcionalmente, o sistema de acordo com a presente
invenção pode compreender um ligando selecionado de entre o
grupo constituído por péptidos,
de
anticorpo,
em
anticorpos ou um fragmento
particular
cetuximab,
anti-CD44,
bevacizumab ou o transtuzumab.
Em uma concretização preferida, o sistema objecto da
presente invenção pode ser representado por:
XCH-YSLN-Z-W
em que
XCH
representa
um
complexo
quitosano
(CH)
ou
um
seu
derivado e X é DNA ou RNA, ou um seu derivado, porção ou
fragmento;
Y representa um ingrediente activo de natureza hidrófoba,
que pode estar presente ou ausente;
SLN representa uma nanopartícula lipídica sólida;
Z representa um polímero anfifílico, selecionado de entre
o grupo dos polímeros contendo PEG (polietileno glicol)
ou PEO (polióxido de propileno); e
W representa um ligando de natureza peptídica, anticorpos
ou fragmentos de anticorpos.
11 Constitui um outro objecto da presente invenção o
conjugado
intermediário
transportador
de
de
poliplexes
sistema
peguilado
farmacêutico
que
compreende
um
núcleo constituído por nanopartículas lipídicas sólidas, não
poliméricas,
poliplex
de
submicrométricas,
quitosano,
ou
rodeado
um
seu
por
unidades
derivado
e
um
ou
de
mais
ácidos nucleicos, seus derivados, porções ou fragmentos.
Num outro aspecto a presente invenção tem por objecto
um
processo
transportador
de
de
preparação
de
um
sistema
moléculas
da
presente
farmacêutico
invenção
que
compreende os passos de:
a) mistura de uma nanopartícula lipídica contendo pelo
menos
um
fármaco,
estabilizada
pela
adição
de
um
agente tensioactivo, com um complexo ácido nucleicopolímero para formar um conjugado SLN-poliplex; e
b) revestimento do complexo SLN-poliplex obtido no passo
a) com pelo menos um polímero anfifílico.
A
forma
de
fracção
hidrófila
concretização
do
polímero
preferida,
é
anfifílico,
funcionalizada
numa
com
péptidos, anticorpos ou um fragmento de anticorpo.
Igualmente
a
presente
invenção
tem
por
objecto
o
processo de preparação de um complexo intermediário segundo
o qual o poliplex é incorporado em nanopartículas lipídicas
sólidas, não poliméricas, submicrométricas de modo que as
nanopartículas ficam cobertas de unidades de poliplex com
diâmetros médios da ordem dos 200 nm.
Adicionalmente a invenção tem por objecto composições
farmacêuticas
farmaceuticamente
que
eficaz
compreendem
de
pelo
uma
menos
quantidade
um
sistema
12 transportador de ácidos nucleicos da presente invenção.
O sistema e composições de acordo com a invenção
podem ser utilizados por exemplo no tratamento de tumores
sólidos, primários ou resultantes da fixação de metástases,
doenças do sistema nervoso central, doenças auto-imunes ou
de doenças crónicas por terapia génica, combinada ou não com
fármacos convencionais. Tais sistemas e composições podem
ser adequadas para
qualquer via de administração, incluindo
tópica, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal.
Nanopartículas lipídicas sólidas, para transporte e
entrega intracelular de siRNA ou miRNA, caracterizadas pela
sequência de siRNA ou miRNA selecionada ser específica para
um RNA mensageiro que controla a síntese de uma qualquer
proteína.
Ainda em outro aspecto a presente invenção refere-se
a uma composição farmacêutica
Estas e outras vantagens da presente invenção ficarão
mais evidentes e serão melhor compreendidas com recurso às
figuras, descrição e reivindicações anexas que se seguem.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
As Figuras 1 a) e 1 b) são gráficos de fluorescência
que
representam
siRNA-GFP
FITC
a
(proteína
internalização
de
(isotiocianato
das
fluorescência
de
nanopartículas
verde)
fluoresceína)
marcadas
determinada
com
com
por
citometria de fluxo. No eixo das abcissas da Figura 1a)
representa-se a detecção da dispersão frontal e no eixo das
ordenadas
abcissas
a
das
detecção
Figuras
da
1b)
dispersão
lateral. No
representa-se
a
eixo das
detecção
por
fluorescência e no eixo das ordenadas a contagem de células.
13 A Figura 1 a) corresponde ao controlo negativo (células não
incubadas
com
partículas).
Este
controlo
negativo
está
representado na Figura 1 b) pela curva i, representando as
curvas ii e iii a internalização completa no interior das
células
de
tumor
maligno
da
mama
MDA-MB-231/GFP
das
partículas, ao fim de 2 horas e 4 horas, respectivamente.
É possível verificar um ligeiro aumento no número de
células GFP negativas nas células que foram incubadas com as
nanopartículas
com
siRNA-GFP,
mostrando
a
actividade
de
silenciamento das partículas.
As Figuras 2 a), 2 b) e 2 c) são fotografias obtidas
por microscopia confocal de células de tumor maligno da mama
MDA-MB-231, após duas horas de incubação com o transportador
de
poliplexes
correspondem
(CO305);
às
y
as
partículas
marcadas
com
reagente
vermelho
manchas
marcadas
correspondem
aos
Lysotracker®,
assinaladas
com
FITC,
lisossomas
a
mancha
as
com
x
manchas
marcados
marcada
com
com
z
corresponde aos núcleos das células marcados com um marcador
fluorescente
de
DNA
nuclear
como
o
marcador
azul
fluorescente de ácidos nucleicos (DAPI), as manchas marcadas
com w representam a co-localização das nanopartículas nos
lisossomas. A linha branca é a escala e marca os 10 µm.
Os gráficos das Figuras 3 a) e 3 b) correspondem à
formulação sem siRNA e os gráficos das Figuras 3 c) e 3 d)
às partículas com siRNA.
No
eixo
das
abcissas
das
Figuras
3
a)
e
3
c)
representa-se a detecção da dispersão frontal e no eixo das
ordenadas
a
detecção
da
dispersão
lateral.
No
eixo
das
abcissas das Figuras 3b) e 3 d) representa-se a detecção por
fluorescência verde e no eixo das ordenadas a contagem de
células.
14 As figuras 3 a) e 3 b) correspondem ao grupo controlo
em que as células foram incubadas nas mesmas condições com
nanopartículas sem o siRNA-GFP.
As Figuras 3 c) e 3 d) são gráficos relativos à
eficácia de silenciamento da proteína GFP, após incubação
com
15,0
nM
poliplexes
de
siRNA-GFP
CO254
por
um
incluído
no
transportador
período
de
6h.
As
de
curvas
representam a população de células de tumor maligno da mama
MDA-MB-231/GFP viáveis.
As Figuras 4 a) e 4 b) são gráficos de fluorescência
relativos
à
eficácia
de
silenciamento
da
proteína
GFP,
representando o eixo das ordenadas a contagem de células, o
eixo das abcissas a emissão de fluorescência, o pico i as
células com GFP, positivas, e todas as células incluídas no
intervalo considerado para as células sem GFP, negativas.
As Figuras 4 a) e 4 b) são gráficos de fluorescência
que
representam
a
internalização
das
nanopartículas
com
miRNA marcadas com FITC por citometria de fluxo em MDA-MB231/GFP. No eixo das abcissas da Figura 4 a) representa-se a
detecção da dispersão frontal e no eixo das ordenadas a
detecção
da
dispersão
lateral.
No
eixo
das
abcissas
das
Figuras 4 b) representa-se a detecção por fluorescência e no
eixo das ordenadas a contagem de células. A Figura 4 a)
corresponde ao controlo negativo (células não incubadas com
partículas).
Este
controlo
negativo
está
representado
na
Figura 4 b) pela curva i, representando as curvas ii e iii a
internalização
completa
no
interior
das
células
de
tumor
maligno da mama MDA-MB-231/GFP das partículas, ao fim de 2
horas e 4 horas, respectivamente.
As Figuras 5 a), 5 b) e 5 c) são fotografias obtidas
por
microscopia
nanopartículas
confocal
com
pDNA
relativas
marcadas
à
com
internalização
FITC
de
células
das
de
15 tumor
maligno
da
mama
MDA-MB-231,
após
duas
horas
de
incubação com as nanopartículas; as manchas assinaladas com
x correspondem às partículas marcadas com FITC, as manchas
marcadas
com
y
correspondem
aos
lisossomas
marcados
com
reagente vermelho Lysotracker®, a mancha marcada com z são
os núcleos das células marcados com um marcador fluorescente
de
DNA
nuclear
representam
a
como
o
DAPI,
as
co-localização
manchas
das
marcadas
com
nanopartículas
w
nos
lisossomas. A linha branca é a escala e marca os 10 µm.
As Figuras 6 a), 6 b) e 6 c) são fotografias obtidas
por
microscopia
confocal
relativas
à
internalização
das
nanopartículas com pDNA marcadas com FITC, em células de
tumor
maligno
da
mama
MDA-MB-231,
após
duas
horas
de
incubação com as nanopartículas; as manchas assinaladas com
x correspondem às partículas marcadas com FITC, as manchas
marcadas
com
y
correspondem
aos
lisossomas
marcados
com
reagente vermelho Lysotracker®, a mancha marcada com z são
os núcleos das células marcados com um marcador fluorescente
de
DNA
nuclear
representam
a
como
o
DAPI,
co-localização
as
manchas
das
marcadas
com
nanopartículas
w
nos
lisossomas. A linha branca é a escala e marca os 10 µm.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENÇÃO
De modo a alcançar a aplicabilidade biomédica para a
terapia
génica
ultrapassadas.
as
Os
barreiras
ácidos
biológicas
nucleicos
têm
“nus”
que
ser
apresentam
frequentemente uma biodisponibilidade comprometida, que se
relaciona
ulterior
geralmente
com
a
localização
clearance/eliminação
rápida,
entrega
sistémica
intracelular,
fraca
absorção
in
vivo
e
nomeadamente
celular
e
degradação mediada por nuclease. Assim, têm sido procuradas
estratégias para permitir obter sistemas de entrega de genes
16 eficientes, prevenindo a perda de actividade e melhorando a
eficiência de transfecção.
As soluções da arte anterior mais recente envolvem a
utilização
de
poliméricos,
ou
coloidais,
complexos
ainda,
virais
ou
a
catiónicos,
produção
não
virais,
de
lipídicos
ou
nanotransportadores
para
a
veiculação
de
sequências de ácidos nucleicos. As limitações reportadas são
maioritariamente relacionadas com a administração in vivo, a
internalização
celular
nucleotídicas
no
e
a
citoplasma
libertação
da
das
célula
sequências
alvo
[ref,
US
2011/0287547]. A patente US 2011/0287547, por exemplo não
representa uma solução uma vez que configura um complexo
positivo
em
que
os
valores
de
toxicidade
relatados
se
apresentam mantidos.
Para obviar as limitações associadas à terapêutica
com base em ácidos nucleicos, nomeadamente com siRNA e com
miRNA,
proporciona-se
transportador
de
pela
presente
poliplexes
ou
invenção
conjugado
um
sistema
utilizando
como
polímero catiónico o quitosano ou um seu derivado, como por
exemplo o glicolquitosano, que é capaz de promover o escape
endossomal
do
material
genético
através
do
já
definido
“efeito esponja”. O poliplex é incorporado em nanopartículas
lipídicas
com
particularmente
vista
a
obter
adequadas
à
composições
maximização
da
terapêuticas
internalização
celular do sistema que transporta o material genético. A
composição farmacêutica da presente invenção está protegida
por
um
revestimento
nanopartícula
permitindo
No
invenção,
hidrófilo,
lipídica
obtido
transportadora
por
de
peguilação
da
poliplexes,
a sua administração sistémica.
sistema
lipídico,
ou
conjugado
para
o
peguilado
transporte
de
da
presente
um
ou
mais
complexos ácido nucleico-quitosano, os referidos complexos
17 estão
posicionados
lipídico
e
derivado.
o
A
intermediariamente
revestimento
capacidade
hidrófilo
de
polímeros
entre
com
o
PEG
ou
catiónicos,
núcleo
um
seu
como
o
quitosano ou os seus derivados para complexar com polianiões
como
os
ácidos
nucleicos
(poliplex)
está
sobejamente
comprovada [Ogris M, Wagner E.; Targeting tumors with nonviral
gene
delivery
systems;
Drug
Discovery
Today;
2002;
7(8):479-485].
O conjugado peguilado transportador de um ou mais
poliplexes,
permite
a
administração
in
vivo
de
ácidos
nucleicos, obviando os problemas de toxicidade verificados
com os poliplexes catiónicos recorrentemente descritos na
literatura
[Kapoor,
Diane
J.
Burgess,
Siddhesh
D.
Patil;
Physicochemical characterization techniques for lipid based
delivery
systems
for
siRNA;
International
Journal
of
Pharmaceutics; 2012; 427:35–57] por ser capaz de ultrapassar
as barreiras biológicas devido à carga neutra e ao efeito de
nuvem hidrófila conferidos pelo revestimento com PEG ou um
seu derivado.
O sistema da presente invenção compreende pelo menos
um
ligando
de
superfície,
compreendendo
o
ligando
um
anticorpo ou um fragmento de anticorpo capaz de reconhecer
receptores
de
membrana
caracteristicamente
sobre-expressos
nas células neoplásicas, como por exemplo, o anti-CD44 ou o
anti-VEGF.
Adicionalmente a conhecida avidez sinérgica presente
na
ligação
entre
este
polímero
catiónico
e
compostos
lipídicos foi considerada na presente invenção para promover
a adsorção do esqueleto positivamente protonado de quitosano
complexado
com
os
ácidos
nucleicos–poliplex,
às
nanopartículas lipídicas as quais podem conter na sua matriz
um fármaco ou estar vazias.
18 As abordagens terapêuticas que permitem direcionar os
ácidos nucleicos têm sido alvo de extensa investigação, como
forma
de
ultrapassar
transportadores
a
ausência
coloidais
em
de
seletividade
geral.
O
dos
aumento
de
permeabilidade da vasculatura do tumor é, juntamente com o
bloqueio da drenagem linfática, o factor que mais contribui
para a acumulação de nanopartículas nos tecidos tumorais, um
mecanismo que é conhecido por efeito de permeabilidade e
retenção (EPR). A peguilação que caracteriza a composição
farmacêutica
da
presente
invenção
proporciona
um
sistema
transportador de poliplexes do tipo conjugado-camada externa
revestido com uma ou mais camadas de polímeros anfifílicos
com
a
fracção
protegendo
fluidos
hidrófila
deste
modo
biológicos
o
após
disposta
para
sistema
das
administração
a
zona
exterior,
interações
local
ou
com
por
os
via
sistémica. Tal revestimento permite ainda o aumento do tempo
de circulação do sistema [Pecot CV, Calin GA, Coleman RL,
Lopez-Berestein G, Sood AK; RNA interference in the clinic:
challenges
and
future
directions;
Nat
Rev
Cancer;
2011
Jan;11(1):59–67].
Com as vantagens de ser não reconhecível pelo sistema
do complemento, de ser específico para células neoplásicas,
caracterizadas por conter pelo menos um receptor de membrana
sobre-expresso, de promover via efeito esponja a
do ácido nucleico no
permitir
em
ingredientes
farmacêutica
certos
citoplasma
modos
de
objecto
da
da célula alvo e, de
realização
farmaceuticamente
presente
libertação
combinações
ativos,
invenção
a
com
composição
configura
uma
solução única que ultrapassa todas as limitações da arte
anterior acima descritas.
Outras vantagens
e
características
da invenção
tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada da
mesma
que
se
segue
e
pode
ser
realizada
por
meio
dos
19 elementos
e
combinações
particularmente
reivindicados
nas
reivindicações anexas.
A
presente
transportador
invenção
de
poliplexes
proporciona
peguilado
um
sob
sistema
a
forma
de
conjugado poliplex-lípido ligados entre si por interações
electrostáticas, transportador de ácidos nucleicos, com a
estrutura
XCH-YSLN-Z-W
em que
XCH representa um complexo quitosano (CH) ou um seu
derivado e X é DNA ou
RNA, um seus derivados, partes
ou fragmentos;
Y
representa
um
ingrediente
activo
de
natureza
hidrófoba, que pode estar presente ou ausente;
SLN representa uma nanopartícula
lipídica sólida;
Z representa um polímero anfifílico, selecionado de
entre o grupo dos polímeros contendo PEG (polietileno
glicol) ou PEO (polióxido de propileno); e
W
representa
um
ligando
de
natureza
peptídica,
anticorpos ou fragmentos de anticorpos.
O lípido presente nas SLN é de preferência pelo menos
um acilglicerol, selecionado de entre um mono, um di ou um
triacilglicerol
de
cadeia
carbonada
C16
a
C22
ou
uma
sua
mistura, em especial um palmitoestearato de glicerido com
cadeia carbonada C16, composto por cerca de 80% de ácido
palmítico mono, di ou triesterificado.
As nanopartículas lipídicas usadas são
selecionadas
de entre as adequadas para qualquer via de administração,
20 incluindo
pulmonar,
tópica,
intravenosa,
subcutânea
e
intraperitoneal.
As
nanopartículas
lipídicas
podem
estar
vazias
ou
compreender quaisquer ingredientes farmaceuticamente ativos
isolados ou em combinação. Exemplos de ingredientes ativos
farmaceuticamente activos particularmente adequados são os
agentes antineoplásicos como, por exemplo, o paclitaxel, o
docetaxel ou a doxorubicina.
Exemplos
de
nanopartículas
adequadas
contendo
paclitaxel são as que compreendem entre 1,0 e 3,0% de lípido
sólido (m/m total de SLN), 25 a 50 % de agente tensioactivo
(m/m de lípido) e entre 80 a 200 µg de paclitaxel por ml de
composição final.
O
conjugado
poliplex-SLN
resulta
interações electrostáticas do quitosano ou
da
ligação
um seu
por
derivado
às nanopartículas lipídicas negativas. O quitosano ou um seu
derivado é
selecionado
entre o grupo dos glicolquitosanos,
de preferência entre 10 e 250 kDa.
O
sistema
da
presente
invenção
permite
direcionar
ácidos nucleicos incorporados em transportadores coloidais
seletivamente
para
células
neoplásicas
uma vez
que os
ligandos de superfície podem, por ligação aos receptores da
membrana celular, modular a entrada seletiva na célula alvo,
em qualquer estádio da doença.
Após entrada na célula e durante a permanência nas
vesículas
endossómicas,
o
polímero
anfifílico
é
lisado
libertando a nanopartícula lipídica coberta com o complexo
quitosano-siRNA
libertando
o
que
material
promove
genético
a
no
ruptura
endossomal,
citoplasma
e
simultaneamente o processo de digestão que
no
endossoma
maduro e a exposição
poderia
evitando
ocorrer
dos ácidos nucleicos a
um
21 ambiente
de
PH
muito
baixo.
Ao
mesmo
tempo
que
a
nanopartícula lipídica se apresenta às enzimas endossómicas
para
ser
digerida.
Após
digestão
do
lípido,
o
fármaco
activo é libertado igualmente no citoplasma.
A invenção tem por objecto adicional o processo de
preparação do sistema de transporte de poliplex da presente
invenção, conjugado poliplex-SLN peguilado que compreende o
revestimento do referido conjugado por meio da re-hidratação
de um filme de polímero anfifílico, compreendendo pelo menos
entre 1 a 2 mg/ml
entre
o
grupo
(total da
dos
formulação), selecionado de
polímeros
contendo
PEG
(poli
etilenoglicol), como por exemplo, PEG-PE (PM=1000 e PM=2000)
ou
copolímeros
tribloco
PEO-PPO-PEO,
na
qual
PPO
é
poli(óxido de propileno), com diferentes graus que dependem
de
parâmetros
como
o
peso
molecular,
nomeadamente
os
poloxâmeros com grau 68, 108, 124, 237, 338 e 407.
Os
poliplexes
particularmente
preparados
adequados
com
para
glicolquitosano
permitir
pelo
são
referido
“efeito esponja” a ruptura precoce do endossoma, libertando,
assim, o ácido nucleico no citoplasma. O quitosano e os seus
derivados, por exemplo os glicolquitosanos, são conhecidos
pela sua afinidade para
compostos
refere para formas farmacêuticas
lipídicos.
A literatura
orais destes compostos uma
actividade de absorção de gorduras compatível com perda de
peso [Lang Guenther, Wendel Harald, Konrad Eugen; Quaternary
hydroxy-propyl-substituted
chitosan
derivatives,
cosmetic
compositions based thereon and processes for the production
thereof; US 4772689].
O
processo
de
preparação
do
conjugado
peguilado
submicrométrico, contendo pelo menos um complexo polimérico
de quitosano ligado a um transportador lipídico compreende:
22 (i) preparação de nanopartículas lipídicas (SLN) com
diferentes percentagens de lípido, diferentes percentagens
de polisorbato 80 e diferentes concentrações de ingrediente
activo,
de
modo
a
obter
nanopartículas
com
um
diâmetro
compreendido entre 20 e 250 nanómetros (nm),
(ii)
preparação de um poliplex, ou seja um complexo
polimérico entre o quitosano ou um seu derivado e um ácido
nucleico, por incubação dos dois componentes durante 15 a 30
minutos, entre os 20 e 23º C,
(iii)
incorporação
do
poliplex
no
sistema
transportador lipídico (SLN), de modo a obter um conjugado
intermediário onde o sistema SLN transporta pelo menos um
ácido nucleico, ou seja, SLN-poliplex,
(iv) peguilação do conjugado intermediário obtido no
passo (iii) por re-hidratação de um filme seco obtido com
pelo menos um polímero anfifílico do grupo dos polímeros
polioxietilenos com a dispersão constituída pelo conjugado
SLN-poliplex,
(v)
peguilado,
funcionalização
obtendo-se
um
da
sistema
superfície
do
conjugado
nanoparticulado,
com
um
diâmetro médio entre os 20 e os 250 nm e com uma carga de
superfície com valores entre os 0,185 e + 2,153 (mV), de
fórmula
XCH-YSLN-Z-W
em que XCH, Y, SLN, Z e W são como anteriormente definidos.
As
composições
farmacêuticas
da
presente
invenção
compreendem um sistema farmacêutico transportador lipídico
de complexos quitosano-sequência nucleotídica isoladas ou em
combinação
aceitáveis.
com
veículos
ou
excipientes
farmaceuticamente
23 As composições farmacêuticas da presente invenção,
são
sistemas
coloidais
classificação
aspecto
constituindo
galénica,
esbranquiçado,
formas
de
acordo
farmacêuticas
pouco
viscosas,
com
a
líquidas
em
que
a
de
fase
dispersa sólida se encontra dispersa no interior da fase
externa aquosa. Podem ser utilizadas como base na preparação
de outras formas farmacêuticas como por exemplo, cápsulas,
geles, colírios, xaropes, aerossoles, cremes, etc. Quando
presentes,
os
diluentes,
lubrificantes
e
semelhantes
são
seleccionados de entre os disponíveis na arte farmacêutica.
Um
perito
na
especialidade
compreenderá
que
a
presente invenção não está limitada à libertação de drogas
ou
agentes
ocorrência
farmacêuticos.
natural
ou
Quaisquer
sintéticas,
substâncias
incluindo
de
agentes
de
diagnóstico e materiais terapêuticos podem ser libertados de
acordo com a presente invenção. Estas substâncias incluem,
mas
não
estão
a
elas
antiartríticos,
esteróides,
limitadas
agentes
vacinas,
anoréticos,
bloqueadores
péptidos,
analgésicos,
adrenérgicos,
hormonas,
anticorpos,
antibióticos, agentes antivirais, vitaminas, enzimas, genes,
material
genético,
citotoxinas,
bactérias,
micróbios,
agentes virais e semelhantes.
A dose a ser administrada, do fármaco citostático e
do
ácido
nucleico,
é
ajustada
à
posologia
clinicamente
determinada. A concentração de fármaco incorporado nas SLN é
determinada por HPLC, enquanto que a concentração de ácido
nucleico é determinada por espectrofotómetro NanoDrop™.
Além disto o perito na especialidade compreenderá que
a quantidade de produto ou substância farmacêutica usada na
presente
invenção
do
dependerá
administrada
e
especialidade
compreenderá
da
tratamento
que
dose
necessária
desejado.
“tratamento”
O
a
ser
perito
se
refere
na
a
24 qualquer
finalidade
ingrediente
controlo,
desejada
com
farmaceuticamente
cura,
manutenção
a
ativo
ou
administração
incluindo
melhoramento
do
prevenção,
da
saúde
e
semelhantes. Igualmente um perito na especialidade saberá
que a presente invenção não está limitada à libertação de um
único agentes farmaceuticamente ativo. Efetivamente mais do
que
um
agente
farmacêutico
pode
ser
libertado
usando
o
sistema de libertação da presente invenção.
O sistema farmacêutico e as composições farmacêuticas
que
o
contêm
seletivo
de
são
especialmente
células
tumorais.
funcionalizado
por
conjugado
péptidos,
de
aptos
adsorção
O
à
para
o
conjugado
superfície
anticorpos
tratamento
peguilado
peguilada
ou
fragmentos
é
do
de
anticorpos selecionados de preferência entre o cetuximab,
anti-CD44, bevacizumab ou transtuzumab.
A
composição
presente
invenção
neoplásica
terapêutica
uma
provoca
vez
o
contendo
o
internalizada
silenciamento
conjugado
em
uma
específico
da
célula
de
uma
proteína codificada pelo mRNA alvo.
Um
acumulação
tecidos
do
de
conjugado
os
peguilado,
células
administração
sistema
lesados,
conjugado
para
regime
cujos
ligandos
permitem
os
da
sistémica
presente
ligados
um
receptores
à
permite
a
invenção
nos
superfície
do
direcionamento
seletivo
membranais
ligandos
dos
acima referidos se apresentem sobre-expressos.
No contexto da presente descrição e reivindicações
entende-se por “poliplex” um complexo formado por polímeros
catiónicos
e
ácidos
nucleicos
por
interações
electrostáticas.
Qualquer
alterado,
gama
diminuído
ou
ou
valor
aqui
aumentado
apresentado
sem
perda
dos
pode
ser
efeitos
25 pretendidos,
como
será
evidente
para
o
perito
na
especialidade a partir das explicações aqui apresentadas.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Preparação de nanopartículas de lípidos sólidos (SLN)
Prepararam-se nanopartículas de lípidos sólidos (SLN)
de
acordo
com
o
método
de
emulsificação/solidificação
descrito na Patente de Invenção Portuguesa n.º 104.693, que
se considera aqui incorporada por referência. Os materiais
de
partida,
suas
quantidades
e
características
das
SLN
obtidas constam das Tabelas I a), I b) e I c), que se
seguem.
Como será facilmente compreensível para um perito na
especialidade, qualquer método de obtenção de nanopartículas
de lípidos sólidos que originem partículas inferiores a 250
nm pode ser igualmente utilizado.
26 TABELA I a)
Composições do transportador de poliplexes peguilado sem fármaco
e sem ácido nucleico com 12,5% (p/p lípido) de Tween 80
Palmistoestearato de glicerido C16
1% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)
2
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
Palmistoestearato de glicerido C16
PEG-PE (mg/ml)
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
Palmistoestearato de glicerido C16
PEG-PE mg/ml
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
Palmistoestearato de glicerido C16
PEG-PE (mg/ml)
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
4
6
SLN 101 SLN 102 SLN 103
274
253
204
0,223
0,204
0,194
1,5% (p/p total SLN)
2
4
6
SLN 201 SLN 202 SLN 203
283
264
256
0,252
0,239
0,220
2,0% (p/p total SLN)
2
4
6
SLN 301 SLN 302 SLN 303
292
303
320
0,282
0,271
0,259
3,0% (p/p total SLN)
2
4
6
SLN 401 SLN 402 SLN 403
298
300
310
0,302
0,299
0,275
27 TABELA I b)
Composições do transportador de poliplexes peguilado sem fármaco
e sem ácido nucleico com 25% (p/p lípido) de Tween 80
Palmistoestearato de glicerido C16
1% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)
2
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
Palmistoestearato de glicerido C16
PEG-PE (mg/ml)
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
Palmistoestearato de glicerido C16
PEG-PE mg/ml
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
Palmistoestearato de glicerido C16
PEG-PE (mg/ml)
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
4
6
SLN 104 SLN 105 SLN 106
135
120
110
0,216
0,186
0,153
1,5% (p/p total SLN)
2
4
6
SLN 204 SLN 205 SLN 206
139
142
150
0,231
0,204
0,198
2,0% (p/p total SLN)
2
4
6
SLN 304 SLN 305 SLN 306
159
170
185
0,235
0,218
0,201
3,0% (p/p total SLN)
2
4
6
SLN 404 SLN 405 SLN 406
127
140
161
0,258
0,248
0,251
28 TABELA I c)
Composições do transportador de poliplexes peguilado sem fármaco
e sem ácido nucleico com 50% (p/p lípido) de Tween 80
Palmistoestearato de glicerido C16
1% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)
2
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
Palmistoestearato de glicerido C16
PEG-PE (mg/ml)
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
Palmistoestearato de glicerido C16
PEG-PE mg/ml
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
Palmistoestearato de glicerido C16
PEG-PE (mg/ml)
Produto
Diâmetro médio (nm)
Índice de Polidispersão
4
6
SLN 107 SLN 108 SLN 109
86
92
30
0,103
0,176
0,149
1,5% (p/p total SLN)
2
4
6
SLN 207 SLN 208 SLN 209
112
118
124
0,203
0,181
0,170
2,0% (p/p total SLN)
2
4
6
SLN 307 SLN 308 SLN 309
129
140
148
0,239
0,201
0,196
3,0% (p/p total SLN)
2
4
6
SLN 407 SLN 408 SLN 409
110
118
131
0,231
0,224
0,220
29 Os resultados obtidos indicados nas Tabelas I a), I b) e I
c), demonstram que o diâmetro médio do sistema transportador
peguilado
diminui
com
o
aumento
da
percentagem
de
tensioactivo (p/p total de SLN). O efeito do aumento de PEGPE não é significativo. A partir de estes dados selecionouse
o
transportador
SLN
105
para
ensaio
subsequente
no
transporte de fármacos e ácidos nucleicos.
Exemplo 2
Preparação do intermediário poliplex-complexo siRNA
quitosano.
a. Preparação do poliplex
Mistura-se
p.ex.
siRNA,
quitosano
uma
diluída
(1000
solução
aquosa
(25.000nM)
µg/ml)
ou
de
de
numa
um
ácido
solução
seu
nucleico,
aquosa
derivado
como
de
o
glicolquitosano. A mistura obtida é agitada vigorosamente
(vortex) durante o tempo necessário para obter uma mistura
homogénea,
homogénea
habitualmente
é
deixada
alguns
incubar
segundos.
até
obtenção
A
mistura
do
poliplex
desejado sob a forma de solução homogénea a uma temperatura
adequada, normalmente entre 15 e 20º C, normalmente 18º C,
durante alguns minutos, habitualmente 25 a 30 minutos.
Seguindo o procedimento acima indicado, prepararam-se
vários outros poliplexes variando a concentração de material
genético
formulação
de
forma
final
adequada
entre
100
para
e
uma
1000
nM
concentração
e
variando
na
a
concentração da solução aquosa de quitosano entre 22 e 1000
µg/ml e que constam das Tabelas II a), II b) e II c),
seguem.
que se
b.
30 Preparação
do
produto
intermédio
SLN-poliplex
por
incorporação do poliplex nas nanopartículas lipídicas
Após
arrefecimento
temperaturas
entre
os
das
18º
C
nanopartículas
e
os
25º
C,
o
lipídicas
a
poliplex
é
incorporado sob agitação magnética suave, até obtenção de um
intermediário
de
sistema
poliplexes
peguilhado,
homogéneo
constituído
farmacêutico
líquido
por
transportador
esbranquiçado
nanopartículas
com
de
aspecto
cobertas
de
unidades de poliplex com diâmetros médios da ordem dos 200
nanómetros, habitualmente durante 4 horas.
Semelhantemente,
peguilados
variando
prepararam-se
a
proporção
vários
o
conjugados
intermediário
poliplex:nanopartículas entre 1:1 a 1:3 (volume/volume) como
descrito nas Tabelas II a), II b) e II c), e nos exemplos
seguintes, tendo como base o produto SLN 105 (Tabela I b)).
Como se observa pelos dados das Tabelas II a), II b)
e II c), o silenciamento aumenta para razões SLN:poliplex de
1:2 (v/v).
31 TABELA II a)
Eficácia de silenciamento da proteína GFP de diferentes
conjugados peguilados com base no produto SLN 105, em
células de tumor maligno da mama MDA-MB-231/GFP em cultura,
para concentrações finais de 100 nM de siRNA
20 µg/ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 21
CO 22
CO 23
2%
3%
5%
250 µg /ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 251
CO 252
CO 253
6%
12%
10%
500 µg /ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 301
CO 302
CO 303
5%
10%
8%
1000 µg /ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 1001
CO 1002
CO 1003
25%
34%
30%
32 TABELA II b)
Eficácia de silenciamento da proteína GFP de diferentes
conjugados peguilados com base no produto SLN 105, em
células de tumor maligno da mama MDA-MB-231/GFP em cultura,
para concentrações finais de 300 nM de siRNA
20 µg/ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 24
CO 25
CO 26
7%
9%
8%
250 µg /ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 254
CO 255
CO 256
15%
23%
20%
500 µg /ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 304
CO 305
CO 306
15%
25%
21%
1000 µg /ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 1004
CO 1005
CO 1006
36%
45%
40%
33 TABELA II c)
Eficácia de silenciamento da proteína GFP de diferentes
conjugados peguilados com base no produto SLN 105, em
células de tumor maligno da mama MDA-MB-231/GFP em cultura,
para concentrações finais de 1000 nM de siRNA
20 µg/ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 27
CO 28
CO 29
10%
12%
11%
250 µg /ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 257
CO 258
CO 259
40%
54%
49%
500 µg /ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 307
CO 308
CO 309
40%
54%
49%
1000 µg /ml
Quitosano
SLN:poliplex
Conjugado
peguilado
Silenciamento
1:1
1:2
1:3
CO 1007
CO 1008
CO 1009
60%
86%
79%
34 Exemplo 3
Preparação do conjugado CO305
Preparou-se
um
poliplex
quitosano-siRNA-GFP
a
partir de 491 µl de uma solução aquosa de glicolquitosano a
500 µg/ml de água e de 9 µl de uma solução aquosa siRNA-GFP
50000 nM à temperatura de 23º C sob forte agitação (vortex)
durante 1 minuto. Incorporaram-se 500 µl de poliplex obtido
em 1000 µl do produto SLN 105 (Tabela I b)) na proporção 1:2
(v/v),
resultando
concentração
magnética
no
final
durante
de
4
conjugado
siRNA
horas,
de
à
desejado
300
nM.
temperatura
com
Após
uma
agitação
ambiente
do
conjugado obtido, o mesmo foi peguilado por re-hidratação de
um
filme
de
PEG-PE
preparado
por
evaporação
a
pressão
reduzida a partir de 600 µl de uma solução de PEG-PE a 10
mg/ml produzindo o conjugado peguilado CO305 (Tabela II b)).
A superfície do conjugado CO305 foi funcionalizada
por adsorção do anticorpo Cetuximab marcado com FITC, por
agitação durante 2 min à temperatura ambiente, ao abrigo da
luz, para uma concentração final de anticorpo de 14 nM.
Exemplo 4
Preparação do conjugado CO254
Usou-se o procedimento descrito no exemplo 1, com a
exceção
da
glicolquitosano
utilização
a
250
de
µg/ml
uma
solução
para
formar
aquosa
o
de
poliplex.
Misturaram-se 500 µl de poliplex em 500 µl do produto SLN 105
(Tabela I b)) na proporção 1:1 (v/v), obtendo-se o conjugado
peguilado
desejado
CO254
siRNA 300 nM (Tabela II b)).
com
uma
concentração
final
de
35 Exemplo 5
Preparação do conjugado com um ácido nucleico siRNA-ErbB3
Usou-se o procedimento descrito no exemplo 1, com a
exceção da preparação do poliplex
em que foram utilizados
241 µl de uma solução aquosa de glicolquitosano a 20 µg/ml
para formar o poliplex com 9 µl de uma solução aquosa de
siRNA-ErbB3 25000 nM. Misturaram-se 250 µl do poliplex em 500
µl do produto SLN 105
obtendo-se
o
(Tabela I b)) na proporção 1:2 (v/v),
conjugado
peguilado
desejado
com
uma
concentração final de siRNA-ErbB3 300 nM.
Exemplo 6
Preparação do conjugado CO254 com um ácido nucleico miRNA
hsa-miR-29a
Usou-se o procedimento descrito no exemplo 1, com a
exceção da preparação do poliplex em que foram utilizadas
480 µl de uma solução aquosa de glicolquitosano a 20 µg/ml
para formar o poliplex com 20 µl de uma solução miRNAhsa-miR29a com 20.000 nM. Os 500 µl de poliplex foram incorporados
em 1000 µl do produto SLN 105 (Tabela I b)) na proporção 1:2
(v/v), obtendo-se o conjugado peguilado desejado
com uma
concentração final de miRNA hsa-miR-29a 300 nM.
Exemplo 7
Preparação de um conjugado contendo um pDNA
Usou-se o procedimento descrito no exemplo 1, com a
exceção da preparação do poliplex
onde foi utilizada 241 µl
de uma solução aquosa de glicolquitosano a 20 µg/ml para
formar o poliplex com 9 µl de uma solução pDNA com 25000 nM.
Misturaram-se 250 µl de poliplex em 500 µl da formulação SLN
105
(Tabela I b)) na proporção 1:2 (v/v), obtendo-se o
36 conjugado peguilado desejado com uma concentração final de
pDNA de 300 nM.
Exemplo 8
Eficácia de transfecção do conjugado CO305 obtido no
exemplo 1
A eficácia de transfecção do conjugado CO305 (Tabela
II
b)),
obtida
no
exemplo
1,
foi
avaliada
in
vitro
por
citometria de fluxo e microscopia confocal em células de
tumor maligno da mama MDA-MB-231. Para tal, 100.000 células
de tumor maligno da mama MDA-MB-231 foram incubadas com 100
µl de amostra de conjugado C0505 diluída em meio de cultura
RPMI 1640, a 1:20 (v/v). A amostra de células aderentes
incubadas com o conjugado CO305 foi dividida em dois lotes,
sendo o primeiro lote A incubado durante duas horas (ii) e o
segundo lote B incubado durante quatro horas (iii). Após
incubação, o meio de cultura com a amostra foi retirado, e
as células aderentes lavadas com meio fresco. As células
lavadas
foram
fosfato
(PBS).
tripsinizadas
A
e
internalização
ressuspendidas
celular
foi
em
tampão
medida
por
análise por citometria de fluorescência (FACS) (figuras 1 a)
e 1 b)) e microscopia confocal (figuras 2 a), 2 b) e 2 c)),
revelando uma eficiência de internalização superior a 90%.
Exemplo 9
Eficácia
de
silenciamento
e
internalização
do
conjugado
CO254 do exemplo 2
A eficácia de silenciamento produzido por 15,0 nM
siRNA-GFP transportado pelo conjugado CO254 (Tabela II b)),
foi avaliada in vitro por análise por citometria de fluxo
(FACS) (figuras 3 a), 3 b), 3 c) e 3d)) em células de tumor
maligno da mama MDA-MB-231/GFP em cultura. Cerca de 100.000
células
37 estiveram
transportado
em
pelo
incubação de 2 h
contacto
conjugado
com
CO254
15,0
por
nM
um
siRNA-GFP
período
de
ou 4 h a 37º C com 5% de humidade relativa
(HR). Após incubação, o meio de cultura com a amostra foi
retirado, e as células aderentes lavadas com meio fresco.
Após
lavagem,
ressuspendidas
as
em
células
tampão
foram
fosfato
tripsinizadas
(PBS).
Os
e
resultados
obtidos mostram uma eficiência de silenciamento em 15 % das
células
(Figura
3
c)
e
3
d))
frente
a
5,3%
de
células
negativas obtidos no grupo controlo (células incubadas nas
mesmas condições com conjugados sem siRNA, Figuras 3 a) e 3
b)).
Exemplo 10
Eficácia de transfecção do conjugado do exemplo 3
A eficácia de transfecção do conjugado produzido no
exemplo 3, foi avaliada in vitro por análise por citometria
de fluxo (FACS) em células do cancro do pulmão A549-GFP em
cultura. Cerca de 100.000 células estiveram em contacto com
15,0 nM siRNA-ErbB3 transportado pelo conjugado obtido no
exemplo 3, por um período de incubação de 6 h a 37º C com 5%
HR. Após incubação, o meio de cultura com a amostra foi
retirado, e as células aderentes lavadas com meio fresco.
Após
lavagem,
ressuspendidas
as
em
células
tampão
foram
fosfato
tripsinizadas
(PBS).
Os
e
resultados
obtidos mostram uma eficiência de internalização superior a
75%.
Exemplo 11
Eficácia de transfecção do conjugado do exemplo 4
A eficácia de transfecção do conjugado, obtido no
exemplo 4, foi avaliada in vitro por análise por citometria
de fluxo (FACS) e por microscopia confocal em células de
38 tumor maligno da mama MDA-MB-231. Cerca de 100.000 células
estiveram
em
contacto
com
15,0
nM
de
miRNA
hsa-miR-29a
transportado pelo conjugado peguilado preparado no exemplo
4,
por um período de incubação de 2 h e um grupo incubado
por 4 h a 37º C com 5% HR. Após incubação, o meio de cultura
com a amostra foi retirado, e as células aderentes lavadas
com
meio
fresco.
Após
lavagem,
as
células
foram
tripsinizadas e ressuspendidas em tampão fosfato (PBS). A
internalização celular foi medida por análise por citometria
de fluorescência (FACS) (figuras 4 a) e 4 b)) e microscopia
confocal
(figuras
5
a),
5
b)
e
5
c)),
revelando
uma
eficiência de internalização superior a 90%.
Exemplo 12
Eficácia de transfecção do conjugado do exemplo 5
A eficácia de transfecção do conjugado, obtido no
exemplo 5, foi avaliada in vitro por microscopia confocal em
100.000 células de tumor maligno da mama MDA-MB-231 (Figura
6 a), 6 b) e 6 c)). Cerca de 100.000 células estiveram em
contacto com
15,0 nM de pDNA transportado pelo conjugado
por um período de incubação de 6 h a 37º C com 5% HR. Após
incubação, o meio de cultura com a amostra foi retirado, e
as células aderentes lavadas com meio fresco. Após lavagem,
as células foram tripsinizadas e ressuspendidas em tampão
fosfato (PBS). A internalização celular foi observada por
microscopia confocal (figuras 6 a), 6 b) e 6 c)), revelando
um elevado grau de internalização.
Lisboa, 26 de Novembro de 2013
1/7
REIVINDICAÇÕES
1.
Sistema
farmacêutico
transportador
de
moléculas
caracterizado por compreender pelo menos:
a) um núcleo constituído por nanopartículas lipídicas
sólidas, não poliméricas, submicrométricas;
b)
uma
zona
intermédia
compreendendo
um
poliplex
polimérico de quitosano ou um seu derivado e um ou mais
ácidos nucleicos; e
c)
uma
camada
exterior
de
revestimento
polimérica
compreendendo um ou mais polímeros anfifílicos.
2.
Sistema
de
acordo
com
a
reivindicação
1,
caracterizado por as nanopartículas compreenderem pelo menos
entre 1,0 e 3,0 % (m/mtotal
de SLN
) de um lípido sólido e pelo
menos 12,5 a 50 % (m/mlípido) de um agente tensioactivo.
3.
Sistema
de
acordo
com
qualquer
uma
das
reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o lípido sólido
compreender pelo menos um acilglicerol selecionado de entre
um mono, um di ou um triacilglicerol de cadeia carbonada
entre C16 e C22 ou uma sua mistura.
4.
Sistema
de
acordo
com
qualquer
uma
das
reivindicações 1 a 3, caracterizado por o lípido sólido ser
palmitoestearato de glicerilo com cadeia carbonada de C16,
composto por cerca de 80% de ácido palmítico mono, di e
triesterificado.
5.
Sistema
de
acordo
com
qualquer
uma
das
2/7
reivindicações 1 a 8, caracterizado por o tensioativo ser um
tensioativo não iónico selecionado de preferência de entre o
grupo dos monoestearatos de sorbitano (polisorbato 60 ou 80).
6.
Sistema
de
acordo
com
qualquer
uma
das
reivindicações 1 a 5, caracterizado por as nanopartículas
compreenderem
um
ou
Sistema
de
mais
ingredientes
farmaceuticamente
ativos.
7.
acordo
com
a
reivindicação
6,
caracterizado por o ingrediente farmaceuticamente ativo ser
um agente antineoplásico.
8.
Sistema
de
acordo
com
a
reivindicação
7,
caracterizado por o agente antineoplásico ser selecionado de
entre o paclitaxel, o docetaxel ou a doxorubicina.
9.
Sistema
de
acordo
com
a
reivindicação
8,
caracterizado por o ingrediente farmaceuticamente ativo ser
paclitaxel numa concentração de 80 a 200 µg por ml de produto.
10.
Sistema
reivindicações
1
de
a
acordo
9,
com
qualquer
caracterizado
por
uma
o
das
poliplex
compreender 25 a 50% (v/v) de quitosano, e por este ser
selecionado
do
grupo
dos
glicolquitosanos
com
um
peso
uma
das
molecular entre 20 e 150 kD.
11.
Sistema
de
acordo
com
qualquer
reivindicações 1 a 10, caracterizado por os ácidos nucleicos
compreenderem DNA.
12.
Sistema
de
acordo
com
qualquer
uma
das
reivindicações 1 a 10, caracterizado por os ácidos nucleicos
3/7
compreenderem RNA.
13.
Sistema
de
acordo
com
a
reivindicação
12,
caracterizado por os ácidos nucleicos compreenderem siRNA ou
miRNA.
14.
Sistema
de
acordo
com
a
reivindicação
13,
caracterizado por o siRNA ou o miRNA ser seletivo para uma
sequência
específica
de
RNA
mensageiro
que
controla
a
síntese de uma proteína.
15. Sistema farmacêutico transportador de moléculas de
acordo
com
qualquer
uma
das
reivindicações
1
a
14,
caracterizado por o polímero anfífilico da camada exterior
compreender poloxâmeros com a seguinte estrutura:
EO-xPO-EO
em que EO significa óxido de etileno, PO significa óxido de
propileno e x é um número inteiro entre 1 e 20.
16. Sistema farmacêutico transportador de moléculas de
acordo
com
caracterizado
qualquer
por
uma
o
das
polímero
reivindicações
anfífilico
1
a
14,
compreender
um
polímero com a seguinte estrutura:
PEG-PE
em que PEG significa polietilenoglicol com peso molecular
compreendido
entre
1000
e
2000
e
PE
significa
fosfatildiletanolamina.
17. Sistema farmacêutico transportador de moléculas de
acordo
com
caracterizado
qualquer
por
a
uma
camada
das
reivindicações
exterior
de
1
cobertura
a
16,
estar
4/7
funcionalizada
fragmentos
por
de
ligação
de
anticorpos,
um
ou
para
mais
anticorpos
receptores
ou
celulares
específicos.
18.
Sistema
de
acordo
com
qualquer
uma
das
reivindicações 1 a 17 caracterizado por compreender ainda um
ligando
selecionado
péptidos,
de
anticorpos
particular
ou
cetuximab,
entre
um
o
grupo
fragmento
anti-CD44,
constituído
de
por
anticorpo,
bevacizumab
em
ou
o
transtuzumab.
19. Sistema transportador de poliplexes peguilado de
acordo
com
qualquer
uma
das
reivindicações
1-18
caracterizado por ser representado pela seguinte fórmula:
XCH-YSLN-Z-W
em que
XCH representa um complexo quitosano (CH) ou um seu
derivado e X é DNA ou RNA, um seu derivado, porção ou
fragmento;
Y
representa
um
ingrediente
activo
de
natureza
hidrófoba, que pode estar presente ou ausente;
SLN representa uma nanopartícula lipídica sólida,
Z
representa
entre
o
um
grupo
polímero
dos
anfifílico,
selecionado
polímeros
contendo
de
PEG
(polietilenoglicol) ou PEO (polióxido de propileno); e
W
representa
um
ligando
de
natureza
anticorpos ou fragmentos de anticorpos.
peptídica,
5/7
20. Intermediário de sistema farmacêutico transportador
de
poliplexes
reivindicações
peguilado
de
1
caracterizado
a
19,
acordo
com
qualquer
por
uma
das
compreender
um
núcleo constituído por nanopartículas lipídicas sólidas, não
poliméricas,
poliplex
de
submicrométricas,
quitosano,
ou
um
rodeado
seu
por
derivado
unidades
e
um
ou
de
mais
ácidos nucleicos.
21. Processo de preparação de um sistema farmacêutico
transportador de moléculas de acordo com qualquer uma das
reivindicações
1
a
20
caracterizado
por
compreender
os
passos de:
a)
um
mistura de uma solução aquosa de quitosano ou de
seu
derivado
com
nucleico,
um
seu
incubação
durante
uma
solução
aquosa
derivado,
porção
15
minutos,
a
30
ou
de
um
ácido
fragmento,
para
obter
e
um
poliplex ou complexo polimérico de quitosano, ou um seu
derivado,
e
de
um
ácido
nucleico,
um
seu
derivado,
porção ou fragmento.
b)
incorporação do poliplex obtido no passo (i) em
nanopartículas
lipídicas
(SLN)
estabilizadas,
com
um
diâmetro entre 20 e 250 nm, contendo ou não pelo menos
um
fármaco
ou
ingrediente
activo,
para
obter
um
conjugado intermediário SLN-poliplex;
c)
revestimento
intermediário
polímero
por
obtido
anfifílico
no
peguilação
passo
do
(ii),
grupo
do
conjugado
re-hidratando
dos
um
polímeros
6/7
polioxietilenos
com
a
dispersão
constituída
pelo
conjugado SLN-poliplex, sob a forma de filme seco.
d)
opcionalmente,
funcionalização
da
superfície
do
conjugado peguilado submicrométrico obtido.
22.
Processo
de
acordo
com
a
reivindicação
21,
caracterizado por a fracção hidrófila do polímero anfifílico
ser funcionalizada com péptidos, anticorpos ou um fragmento
de anticorpo.
23. Processo de acordo com a reivindicação 21 ou 22,
caracterizado
ligando
por
compreender
selecionado
péptidos,
de
anticorpos
particular
ou
cetuximab,
ainda
entre
um
o
incorporação
grupo
fragmento
anti-CD44,
de
constituído
de
anticorpo,
bevacizumab
ou
um
por
em
o
transtuzumab.
24. Processo de preparação de conjugado intermediário
de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto
de o poliplex ser incorporado em nanopartículas lipídicas
sólidas, não poliméricas, submicrométricas de modo que as
nanopartículas ficam cobertas de unidades de poliplex com
diâmetros médios da ordem dos 200 nm.
25.
Composição
farmacêutica
caracterizada
por
compreender uma quantidade farmaceuticamente eficaz de pelo
menos um sistema transportador de ácidos nucleicos de acordo
com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20.
26.
Composição
caracterizada
por
de
ser
acordo
adequada
com
a
para
reivindicação
qualquer
via
25,
de
7/7
administração, incluindo tópica, intravenosa, subcutânea e
intraperitoneal.
27.
Utilização
reivindicações
1
a
de
20
um
no
sistema
de
acordo
tratamento
de
tumores
com
as
sólidos,
primários ou resultantes da fixação de metástases, doenças
do
sistema
nervoso
central,
doenças
auto-imunes
ou
de
doenças crónicas por terapia génica, combinada ou não com
fármacos convencionais.
28.
Utilização
caracterizada
por
de
ser
acordo
por
com
qualquer
a
via
reivindicação
de
27,
administração,
incluindo tópica, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal.
Lisboa, 26 de Novembro de 2013
1/7 2/7 3/7 4/7 5/7 6/7 7/7 Ref. do pedido:
106445
Relatório de Pesquisa de Portugal
CLASSIFICAÇÃO DA MATÉRIA
A61K 9/62; A61K 48/00
De acordo com a Classificação Internacional de Patentes
DOCUMENTAÇÃO E BASES DE DADOS ELETRÓNICAS PESQUISADAS
WPI, EPODOC, GOOGLE, XPESP, BIOSIS, EMBASE, MEDLINE
DOMÍNIOS TÉCNICOS PESQUISADOS
A61K
De acordo com a Classificação Internacional de Patentes
DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES
Citação do documento, com indicação, sempre que apropriado, das passagens
relevantes
Relevante para
a reivindicação
Y
PT104693 (UNIVERSIDADE DE LISBOA) 27.01.2011 [Todo o
documento]
1-18, 20-26
Y
EP2460516A2 (UNIVERSIDAD DEL PAIS VASCO) 2011.02.10
[Exemplos, reivindicações, 0025-0043]
Y
GARCIA-FUENTES M., ET AL, A comparative study of the potential of
solid triglyceride nanostructures coated with chitosan or poly(ethylene
glycol) as carriers for oral calcitonin delivery, European Journal of
Pharmaceutical Sciences, 25, 133-143, 17.03.2005
[Material e Métodos; Resultados e Discussão]
Categoria*
1-18, 20-26
1-18, 20-26
A
A
US2008/0020058A1 (SIRNA THERAPEUTICS INC) 24.01.2008
[Todo o documento]
1-18, 20-26
1-18, 20-26
ALMEIDA AJ, ET AL, Solid lipid nanoparticles as a drug delivery
system for peptides and proteins, , Advanced Drug Delivery Reviews,
59, 478-490, 01.05.2007
[Todo o documento]
* Categorias dos documentos citados:
A Estado da técnica;
X Documento de particular relevância quando
considerado isoladamente;
Y Documento de particular relevância quando
combinado com um ou mais deste tipo de
documentos;
E Pedido de patente anterior publicado na mesma
data ou em data posterior à do pedido;
L Documento citado por qualquer outra razão;
Data do termo da pesquisa
2014.01.09
T
&
P
D
O
Princípio ou teoria subjacente à invenção;
Documento membro da mesma família de
documentos de patente;
Documento publicado antes da data de pedido mas
depois da data de prioridade;
Documento citado no pedido;
Documento que se refere a uma divulgação oral,
uso, exibição ou qualquer outro meio.
Técnico examinador:
Nuno Pedroso
Assinatura
Telefone:
Data de elaboração do Relatório de Pesquisa
2014.01.09
INPI, Campo das Cebolas, 1149-035 LISBOA
Fax: 21 886 98 59
Nota: Esta pesquisa refere-se aos elementos apresentados até à data da elaboração deste relatório de pesquisa.
Quaisquer elementos que possam ter sido entregues posteriormente a esta data, não foram objeto de apreciação técnica.
M0589.02
1/5
Ref. do pedido:
Relatório de Pesquisa de Portugal
106445
DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES (Continuação)
Relevante
para a
reivindicação
Categoria*
Citação do documento, com indicação, sempre que apropriado, das passagens relevantes
A
BLASI P, ET AL, Solid lipid nanoparticles for targeted brain drug
delivery, Advanced Drug Delivery Reviews, 59, 454-477, 22.05.2007
[Todo o documento]
1-18, 20-26
DHARMALA K, ET AL, Development of chitosan-SLN microparticles for
chemotherapy: in vitro approach through efflux-transporter modulation,
Journal of Controlled Release, 131, 190-197, 03.08.2008
[Todo o documento]
1-18, 20-26
A
A
A
A
M0589.02
SARMENTO B, Effect of chitosan coating in overcoming the
phagocytosis of insulin loaded solid lipid nanoparticles by monocuclear
phagocyte system, Carbohydrate Polymers, 84, 919-925, 21.12.2010
[Todo o documento]
OH Y, ET AL, siRNA delivery systems for cancer treatment, Advanced
Drug delivery Reviews, 61, 850-862, 05.05.2009
[Todo o documento]
ZHAO Y, ET AL, Repeated injection of PEGylated solid lipid
nanoparticles induces accelerated blood clearance in mice and beagles.
International Journal of Nanomedicine, 7, 2891-2900, 12.06.2012
[Todo o documento]
1-18, 20-26
1-18, 20-26
1-18, 20-26
2/5
Ref. do pedido:
Relatório de Pesquisa de Portugal
106445
UNIDADE DE INVENÇÃO
O pedido não está de acordo com os requisitos de unidade de invenção (art. 71º) e foram
encontradas as seguintes invenções:
1.
Reivindicações nº1-18, 20-26
2.
Reivindicações nº19, 25-26
M0589.02
3/5
Anexo ao Relatório de Pesquisa de Portugal
Ref. do pedido:
106445
Informação sobre os membros da família de documentos de patente
Documento de patente citado no relatório
Data de
publicação
PT104693
2011-01-27
EP2460516A2
US2008/0020058A1
M0589.02
Membro(s) da família
Data de
publicação
2012-06-06
WO2011015701
ES2351756
US2012183589
2011-02-10
2011-02-18
2012-07-19
2008-01-24
WO2006078798
US2006211642
US2006240554
US7514099
WO2006128141
US2006276422
US2006287267
WO2007022369
CA2619876
AU2006279454
AU2006279454B
US2007049543
US2007099858
US2007173473
WO2007086883
WO2007086881
CA2597724
AU2006336384
AU2006336384B
US2007185049
WO2007092059
CA2624418
EP1844147
US7404969
EP1891217
MX2008002369
KR20080036650
NO20081376
EP1922300
EP1931781
EP1951873
US2008188675
US764191
JP2008530215
JP5042863B
US2008249040
WO2008147438
CA2667473
AU2007354321
JP2009504190
US2009048197
US7691405
JP2009509566
US2009176725
2006-07-27
2006-09-21
2006-10-26
2009-04-07
2006-11-30
2006-12-07
2006-12-21
2007-02-22
2007-02-22
2007-02-22
2011-12-15
2007-03-01
2007-05-03
2007-07-26
2007-08-02
2007-08-02
2007-08-02
2007-08-02
2010-12-16
2007-08-09
2007-08-16
2007-08-16
2007-10-17
2008-07-29
2008-02-27
2008-03-18
2008-04-28
2008-05-16
2008-05-21
2008-06-18
2008-08-06
2008-08-07
2010-01-05
2008-08-07
2012-10-03
2008-10-09
2008-12-04
2008-12-04
2008-12-04
2009-02-05
2009-02-19
2010-04-06
2009-03-12
2009-07-09
4/5
BRPI0614407
EP2104740
US2009306184
US7935812
US2010048888
US2010063308
US7893302
JP2010507680
US2010105933
US2011092739
NZ565712
JP2012214474
M0589.02
2009-08-18
2009-09-30
2009-12-10
2011-05-03
2010-02-25
2010-03-11
2011-02-22
2010-03-11
2010-04-29
2011-04-21
2011-09-30
2012-11-08
5/5