Ferramenta Multiplataforma para Construção Automática de

Ferramenta Multiplataforma para Construção Automática
de Dendogramas a partir de Imagens de Eletroforese
Marco Antonio da Rosa1, André Luiz Brun2, Greicy Kiel3
1
Acadêmico de Ciência da Computação
Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOSTE)
2
Departamento de Ciência da Computação
Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOSTE)
3
Departamento de Biologia
Faculdade Assis Gurgacz (FAG)
[email protected], [email protected], [email protected]
Abstract: The image analysis process of electrophoresis gels is a costly and
thorough process, which makes this a complex task due the subjectivity of the
human perception. An alternative is the application of digital analysis of
images. This paper presents a computational tool multiplatform capable of
analyzing digital images of electrophoresis, identifying the tracks that
compose using projection histograms. Based on this, the software performs the
dendrogram construction of individuals under study, whose genetic material
identified in image form. The system obtained proved to be very fast and
efficient, allowing image analysis with high accuracy.
Resumo: O processo de análise de imagens de géis de eletroforese é um
processo oneroso e minucioso, o que torna tal tarefa complexa dada à
subjetividade da percepção humana. Uma alternativa é aplicação de análise
digital das imagens. Este trabalho apresenta uma ferramenta computacional
multiplataforma capaz de analisar imagens digitais de eletroforese,
identificando as trilhas que a compõe através de histogramas de projeção.
Com base nisto, o software realiza a construção do dendograma dos
indivíduos em estudo, cujos materiais genéticos formam identificados na
imagem. O sistema obtido mostrou-se bastante rápido e eficiente, propiciando
a análise das imagens com alta precisão.
1. Introdução
O desenvolvimento de técnicas para o estudo do DNA propiciou um avanço no estudo
da biossistemática, evolução e genética de animais e plantas. A grande sensibilidade
dessas técnicas, associada à descoberta de regiões com alto grau de variabilidade, tem
permitido grandes progressos nos estudos de genética de populações, biogeografia e
polimorfismo em populações humanas, visto que têm sido desenvolvidas aplicações na
medicina forense, na determinação de paternidade e no diagnóstico de doenças
hereditárias [Arias e Infante-Malachias 2001].
Foi o surgimento dos marcadores moleculares que possibilitou o estudo em nível
de DNA. O principal avanço que essas técnicas trazem é a possibilidade de acessar
diretamente o genótipo de um indivíduo, evitando assim, a expressão do fenótipo e
conseqüentemente a influência do ambiente sobre este [Milach 1998].
O princípio básico envolvido na obtenção e detecção dos marcadores
moleculares reside no uso de eletroforese em gel, a qual consiste na separação
eletroquímica de moléculas. Essa por sua vez, é baseada na migração diferencial de
moléculas com cargas e tamanhos diferentes, quando submetidas a um campo elétrico.
Um exemplo de imagem de gel de eletroforese é apresentado na Figura 1. Os
corredores verticais são chamados de trilhas ou canaletas (cada trilha avalia uma
amostra). O material nelas contido, influenciado pela corrente elétrica na qual é
submetido, migram através do gel em direção ao pólo positivo, parando em algumas
regiões conforme o tamanho do seu fragmento. Tais posições são chamadas de bandas.
Figura 1. Imagem de um gel de eletroforese.
Fonte: Paulino et al. (2002).
A análise do resultado da eletroforese é feita comparando-se as trilhas entre si.
No entanto, esta comparação é geralmente um processo complexo devido à
subjetividade da percepção visual humana. Baseados no mesmo material duas pessoas
podem chegar a conclusões diferentes [Machado et al. 1997; Paulino et al. 2007].
Atualmente os pesquisadores analisam as imagens de eletroforese visualmente,
e constroem uma matriz de presença (também chamada de matriz de similaridade). Esta
matriz serve como entrada para softwares estatísticos, tais como o GENES [Cruz,
2008], o STATISTICA [StatSoft, 2011], o NTSYS [Rohlf, 1998], o GGMOL [Cruz e
Shuster, 2008], o SPSS [IBM Corporation, 2010] e o SAS [SAS Institute Inc., 1999], os
quais realizam então as análises de agrupamento e de dispersão dos dados [Faleiro,
2007].
De acordo com [Ye et al. 1999], a análise digital de imagens de eletroforese
emerge como uma importante aplicação, para reduzir erros humanos e melhorar a
velocidade da avaliação dos dados. Também segundo [Machado et al. 1997], a análise
automática do padrão das bandas de uma trilha poderia permitir a avaliação de muitos
parâmetros que geralmente são ignorados por analistas humanos.
No entanto, tarefas simples como identificar as trilhas em uma imagem de
eletroforese, facilmente feito por especialistas humanos, surge como um problema que
pode ser difícil de automatizar [Machado et al. 1997].
Uma abordagem para identificação das trilhas utilizando-se de técnicas de
Processamento de Imagens Digitais (PID) foi proposta por [Brun e Kiel 2010]. Nesta
abordagem são aplicados histogramas de projeção na segmentação de imagens de
eletroforese. Outra abordagem para resolução do problema foi proposta por [Machado et
al. 1997], a qual utiliza um algoritmo iterativo para identificar a posição das trilhas.
O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma ferramenta computacional para
realizar a construção automática de dendogramas com base em imagens digitais de géis
provenientes do processo de eletroforese. Durante o desenvolvimento da pesquisa,
buscou-se a aplicação de tecnologias que não criassem dependências com o sistema
operacional, permitindo aos pesquisadores sua aplicação em diferentes ambientes.
Tendo em vista que a análise manual de imagens de eletroforese é um processo
subjetivo e tedioso para os pesquisadores, a análise automatizada de imagens de
eletroforese é interessante porque reduz erros humanos e torna o processo de
interpretação mais rápido, podendo inclusive ser utilizada para estudar grandes bancos
de dados de amostras. Portanto, uma ferramenta capaz de realizar a análise
automatizada de forma precisa e eficiente seria de grande valia para as áreas de Biologia
Molecular e Genética pois, poderia reduzir o tempo das pesquisas e seus custos.
2. Eletroforese
O princípio básico envolvido na obtenção e detecção de cada classe de marcador
molecular reside no uso de eletroforese em gel. A análise de DNA por tal técnica é
fundamental nos laboratórios de pesquisa e de diagnóstico [Naoum, 1990].
A idéia fundamental da eletroforese está no fato da molécula de DNA possuir
carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e conseqüentemente, quando
aplicado ou imerso em uma matriz de gel (que pode ser de agarose ou poliacrilamida)
submetida a um campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo (cátodo). O gel
forma uma malha fina por onde as moléculas de DNA migram de acordo com a carga e
o tamanho dos fragmentos. Fragmentos menores migram mais facilmente por essa
malha do que os maiores, por isso em um dado momento da eletroforese moléculas de
tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos do gel [Arias e Infante-Malachias
2001; Corrêa e Possik 2011]. A Figura 2 ilustra o sistema de eletroforese em gel.
Figura 2. Ilustração do funcionamento da eletroforese em gel.
Fonte: http://edu.glogster.com/media/5/18/37/24/18372460.gif
Para a execução da eletroforese em gel, as amostras de DNA são inseridas em
cavidades no gel, feitas durante a sua polimerização. Aplica-se então a diferença de
potencial e a “corrida eletroforética” se inicia. Após um período de tempo a corrente
elétrica é interrompida.
O passo seguinte é a visualização dos fragmentos, o que geralmente ocorre por
métodos químicos. O brometo de etídeo é um dos agentes utilizados, o qual se intercala
com as moléculas de DNA e se torna fluorescente quando exposto à luz ultravioleta.
Porém, o brometo etídeo é um agente mutagênico, e por isso deve ser manuseado com
muito cuidado. A coloração por prata também tem sido empregada e, apesar de envolver
várias etapas, é um método mais sensível, possibilitando a detecção de pequenas
quantidades de DNA. Um terceiro método para a visualização das bandas no gel
consiste na utilização de material radioativo. Fósforo ou enxofre radioativos são
utilizados para marcar as moléculas de DNA antes da corrida eletroforética, e a detecção
dos fragmentos é feita pela exposição do gel a um filme de raio X. Esse tipo de
marcação é muito eficaz na detecção de fragmentos pequenos [Arias e InfanteMalachias, 2001]. Por último o gel é fotografado para que possa ser realizada a análise
estatística dos marcadores gerados.
Quanto ao tipo de substrato (agarose ou poliacrilamida) usado para a preparação
do gel depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar, devido à
diferença no tamanho dos poros desses géis. O gel de agarose é indicado para a
separação de fragmentos grandes que variam de 300 a 20000 pb (pares de bases), e o gel
de poliacrilamida para separação de fragmentos pequenos, de 10 a 100 pb [Arias e
Infante-Malachias 2001].
Embora a o gel de poliacrilamida seja mais efetivo para separar fragmentos
pequenos, a poliacrilamida quando não polimerizada, é neurotóxica. Assim, a
preparação do gel exige certa cautela. Além disso, a preparação é mais custosa, requer a
mistura de componentes adicionais à poliacrilamida para ajudar na polimerização, e esta
ainda é mais demorada. Já o gel de agarose é feito apenas através da mistura de um
tampão e agarose, não apresentando toxicidade. A polimerização é mais rápida e o gel
pode ser reciclado após o uso, isto é, pode ser reutilizado na elaboração de outros géis
[Corrêa e Possik 2011].
Segundo [Solferini e Selivon 2001], a eletroforese em gel tem como uma de suas
vantagens a possibilidade de se amostrar vários indivíduos por vez e também ter
diversos locos analisados para cada um.
O princípio de análise é o mesmo para todos os tipos de marcadores
moleculares. Marcadores comuns entre as amostras significam semelhança genética e
marcadores não-comuns significam diferenças genéticas [Ferreira e Grattapaglia 1998].
O primeiro passo para a análise é a codificação dos fragmentos moleculares em dados
binários, onde normalmente são codificados como 1 (um) na presença do marcador e 0
(zero) na ausência do marcador. Em seguida os dados codificados são utilizados para a
estimativa de índices de similaridade ou de distância genética entre cada par de
amostras. Com base nos índices é estabelecida uma matriz de similaridade ou de
distâncias entre os acessos a qual vai servir de base para as análises de agrupamento e
de dispersão das amostras. As análises de agrupamento normalmente são baseadas em
métodos hierárquicos que podem utilizar diferentes critérios de agrupamento, como por
exemplo: vizinho mais próximo (Single Linkage), vizinho mais distante (Complete
Linkage) e baseado na média das distâncias (Unweighted Pair-Group Method Using
Arithmetic Average) [Faleiro 2007].
3. Metodologia
A implementação da ferramenta foi realizada em Java utilizando a IDE Netbeans 6.9.1.
A escolha desta linguagem deve-se ao fato de permitir a execução independente de
sistema operacional, necessitando apenas da instalação da Máquina Virtual Java (JVM),
além de possibilitar a construção de interfaces ergonômicas aos usuários. Foi utilizada,
durante a implementação, a Interface de Programação de Aplicações JAI (Java
Advanced Imaging) visto que esta oferece uma série de recursos de processamento de
imagens já implementados.
Para que o sistema processe uma imagem de entrada e reconheça nesta as
informações necessárias para a aplicação, essa abordagem deve ser seguida respeitando
suas etapas, e mantendo a interligação entre os módulos. Tal estrutura de projeto é
composta pelos seguintes passos:
Figura 2. Fluxograma dos processos realizados
A etapa de aquisição de imagens não faz parte do escopo do trabalho, deixando a
cargo do usuário do sistema obter a imagem digitalizada a ser analisada da maneira que
desejar (seja por meio de scanner, câmera fotográfica, etc.).
Para o desenvolvimento, calibrações e testes visando verificar a eficiência e a
acurácia do sistema foram utilizadas imagens disponíveis na internet, de trabalhos já
realizados e junto a pesquisadores que atuam na área de Biologia Molecular e Genética.
A Figura 3a apresenta um exemplo básico de imagem obtida com a aplicação do
processo de eletroforese.
Figura 3. a) Exemplo de uma imagem gel de gel de eletroforese; b) Imagem de
eletroforese após etapa de limiarização.
Fonte: Lopes et al. (2002).
A primeira operação realizada no pré-processamento é a quantização da imagem
para 256 tons de cinza. Este processo é realizado com intuito de reduzir o número de
cores da imagem (de 224 para 28), para que operações envolvendo o processamento de
histogramas sejam simplificadas. Partindo da afirmação que uma cor é composta de três
canais de cores primárias R (vermelho), G (verde) e B (azul), a quantização de uma cor
em um ponto (x, y) para seu tom de cinza correspondente é realizada, utilizando a
seguinte Equação 1 [Gonzalez e Woods, 2000].
G(x, y) = 0.114R(x, y) + 0.587G(x, y) + 0.299B(x, y)
(1)
O segundo passo aplicada foi a remoção de ruídos, com o objetivo de eliminar
pixels indesejados que poderiam atrapalhar o processo de segmentação e interpretação
da imagem. Nesta fase empregaram-se os filtros da média e mediana, com máscara de
dimensão 3x3. A opção por esta máscara deve-se ao intuito de eliminar apenas
perturbações pequenas e não inserir borramento na imagem. O usuário era responsável
por escolher entre o primeiro ou segundo filtros.
Depois que a imagem se apresentava “limpa”, era submetida ao processo de
limiarização, buscando-se separar os objetos de interesse do restante da figura. O
usuário poderia se utilizar de dois métodos distintos: a limiarização clássica, onde é
apenas informado o valor do limiar a ser aplicado e a limiarização Otsu [Otsu 1979] que
utiliza as características da própria imagem para propor um limiar ótimo, ou seja, é uma
abordagem adaptativa. O usuário poderia também utilizar o método Otsu para obter um
limiar prévio e ir variando este (com uma ferramenta em tela) até encontrar o limiar que
considerasse ideal. A Figura 3b apresenta o resultado desta etapa aplicada à Figura 3a.
Após a binarização da imagem o passo subseqüente foi o de localizar as canaletas
na imagem. O objetivo da fase de segmentação é extrair os objetos de interesse do
restante da imagem. No caso deste trabalho, o objetivo foi identificar e separar as trilhas
do restante da imagem. Nesta etapa foi aplicada a técnica dos histogramas de projeção,
conforme proposto por [Brun e Kiel 2010].
Este método leva em consideração o fato de que as trilhas são geralmente
corredores verticais no gel. Para segmentar a imagem aplica-se então o histograma de
projeção vertical, que consiste na contagem dos pixels brancos (pixels estes que
representam o material genético) em cada coluna da imagem limiarizada.
A Figura 4 demonstra o resultado da aplicação do histograma de projeção vertical
na imagem da Figura 3b. Observando o histograma de projeção gerado, pode-se
perceber que este é formado por “picos”, que correspondem às canaletas, e “vales” que
correspondem às regiões sem material genético entre as trilhas. Desta forma
identificando os pontos iniciais e finais de cada “pico” tem-se a localização de cada
trilha. Para tanto, basta identificar os pontos de descontinuidade na projeção. Além
disso, atribui-se rótulos a cada trilha visando posterior identificação.
Figura 4. Histograma de projeção vertical
A presença de ruído na imagem (mesmo após a aplicação dos filtros da media ou
mediana) pode resultar na contagem dos pixels nas regiões de vale maior que zero, por
isso, é necessário estabelecer um limiar para fazer o descarte destas colunas. Este limiar
é escolhido pelo usuário do sistema.
Após a segmentação das trilhas é procedida a comparação entre aquelas que foram
localizadas. Faz-se tal procedimento combinando-as de duas em duas, onde cada pixel
(x, y) da primeira trilha é comparado com o pixel (x, y) da segunda trilha: caso os dois
pixels possuem o mesmo valor o índice de similaridade entre essas duas trilhas é
acrescentado em uma unidade. Repete-se até realizar todas as combinações possíveis.
Para efetuar esta comparação é importante que todas as trilhas possuam a mesma
largura. No caso do primeiro método de segmentação, será necessário encontrar a trilha
com a menor largura e então “podar” as laterais das trilhas maiores para que todas
tenham a mesma largura da trilha mais estreita.
O resultado desta etapa é a geração de uma matriz de similaridade, a qual possui o
número de pixels coincidentes para cada par de trilhas. A Figura 5 apresentada a matriz
de similaridade gerada com base nas trilhas da imagem da Figura 3b localizadas na
etapa anterior. Os valores contidos na matriz apresentam o número de pixels similares
entre as canaletas, por exemplo, a posição [2,2] indica que a primeira e a segunda trilhas
têm 6461 pixels em comum. A partir da matriz de similaridade é construído então o
dendograma.
Figura 5. Matriz de similaridade obtida.
O dendograma é uma representação gráfica em forma de árvore que expressa a
estrutura dos agrupamentos. Nos métodos de agrupamentos de dados hierárquicos
aglomerativos, o dendograma representa a ordem em que os dados foram agrupados
[Vale, 2005]. Segundo o autor, os dendogramas também refletem o grau de similaridade
entre os grupos.
A construção do dendograma é realizada utilizando-se seguinte processo:
Inicialmente, se seleciona os dois elementos com maior similaridade. Caso estes
elementos ainda não façam parte de nenhum grupamento, é construído então um novo
grupo composto pelos dois elementos. Por outro lado, se um deles já fizer parte de um
grupamento e o outro não, o sistema agrega este elemento “sozinho” ao grupamento do
outro indivíduo. Porém, se os dois elementos já fizerem parte de grupamentos distintos,
junta-se os dois grupos, formando um grupamento maior. Por fim, se os valores
escolhidos não forem considerados em nenhuma das situações citadas, estes valores são
descartados pois os elementos já foram adequadamente agrupados.
Este algoritmo é aplicado iterativamente para todos os elementos da matriz de
similaridade. A Figura 6 apresenta o dendograma resultante da matriz da Figura 5,
representado assim a similaridade entre os elementos da imagem de eletroforese da
Figura 3a.
Figura 6: Dendograma gerado com base na matriz de similaridade da Figura 5.
Analisando o dendograma, pode-se observar a identificação das quatro trilhas
encontradas pelo processo de segmentação, numeradas de 1 a 4 (como apresentado na
Figura 4). O Objetivo do dendograma é apresentar o grau de similaridade entre as
amostras. Esta parecença é apresentada na matriz da Figura 5.
A disposição dos grupamentos é feita com base no grau de semelhança entre os
elementos, onde quanto mais à esquerda for a junção dos indivíduos, maior a
similaridade entre eles. Assim, verifica-se que as trilhas 2 e 4 apresentam a maior
similaridade observada, seguida então pelo grupamento formado pelas trilhas 1 e 3 e,
por fim, um grupamento que envolve todas as amostras, porém com similaridade
inferior às demais, dada à diferenciação existente entre todos os elementos.
4. Resultados e Discussões
A realização deste trabalho possibilitou a construção de uma ferramenta computacional
capaz de construir de forma automática, dendogramas com base em imagens
digitalizadas de gel de eletroforese através de técnicas de processamento de imagens.
Com o intuito de apresentar a ferramenta construída, a Figura 7 demonstra
alguns screenshots colhidos do sistema em execução. A imagem 7a apresenta a etapa de
limiarização. Nesta, a parte esquerda é a imagem original após a passagem do filtro da
mediana, enquanto a parte direita representa a imagem dicotomizada. Analisando a
figura nota-se que o limiar obtido pelo método de Otsu é de 241 (devido aos tons claros
da imagem). Esta imagem em preto e branco é então submetida à construção do
histograma de projeção, conforme apresentado na Figura 7b.
Baseado na projeção dos pixels da Figura 7b, o sistema encontra as trilhas
verticais, que contêm o material genético. A imagem 7c apresenta as quatro canaletas
detectadas na imagem de entrada. Depois de identificadas as regiões de interesse, elas
são comparadas para a construção da matriz de similaridade. A passo seguinte é então
apresentado na Figura 7d, que é o dendograma obtido com base nas semelhanças
apresentadas na matriz.
5. Conclusões
Com a construção deste software, verificou-se que a computação pode ser uma
importante aliada ao estudo biológico, inclusive à genética de populações. O
desenvolvimento de ferramentas adequadas propicia não só agilidade nos processos
comparativos, tornando o processo menos oneroso, mas também minimizam o risco de
erros de interpretação. Além disso, a ferramenta também permite a avaliação de muitos
parâmetros que geralmente são ignorados por analistas humanos.
O software construído mostrou-se bastante eficiente em termos consumo de
tempo para a detecção e interpretação das trilhas, bem como na construção do
dendograma das mesmas. Verificou-se também que o método aplicado é bastante eficaz
visto que para todas as imagens de teste aplicadas, o sistema conseguiu detectar de
forma correta as canaletas.
Visando retificar a robustez e eficácia do software construído, pretende-se
futuramente, aplicar à ferramenta um conjunto massivo de imagens provenientes do
processo de eletroforese em gel de diversas áreas, como microbiologia, genética,
biologia molecular. Espera-se, futuramente implementar técnicas estatísticas
possibilitando assim a aplicação adaptativa dos parâmetros utilizados no processamento
da imagem em estudo.
Figura 7. Etapas do processo executado pelo sistema. a) Imagem original e sua
respectiva binarizada; b) Histograma de projeção obtido; c) Identificação das
canaletas com base no histograma de projeção; d) Dendograma construído.
7. Referências
Arias, M. C. e Infante-Malachias, M. E. (2001). RFLP: O emprego de enzimas de
restrição para detecção de polimorfismos do DNA. In Biologia Molecular e
Evolução, p. 143-152, Holos Editora.
Brun, A. L. e Kiel, G. (2010) “Aplicação de Histogramas de Projeção na Segmentação
de Imagens de Eletroforese”. In: II Simpósio de Tecnologia da Informação (STIN),
Três de Maio.
Corrêa, E. M. e Possik, P. A. (2011) A análise de DNA por eletroforese. Academia de
Ciência e Tecnologia, http://www.ciencianews.com.br/siteDNA/biomol-index.html,
Agosto.
Cruz, C. D. (2008), Programa Genes - Diversidade Genética. Editora UFV, 1ª edição.
Cruz, C. D. e Schuster I. (2008) “Programa GQMOL – Genética quantitativa e
molecular”, http://www.ufv.br/dbg/gqmol/gqmol.htm, Agosto.
Faleiro, F. G. (2007), Marcadores genético-moleculares aplicados a programas de
conservação e uso de recursos genéticos. Embrapa Cerrados, 1ª edição.
Ferreira, M. E. e Grattapaglia, D. (1998), Introdução ao uso de marcadores moleculares
em análise genética. Embrapa-Cenargen, 3ª edição.
Gonzalez, R. C. e Woods, R. E. (2000), Processamento de imagens digitais. Edgard
Blüncher Ltda, 1ª edição.
IBM
Corporation.
(2010)
“SPSS
Advanced
Statistics”,
http://www01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/advanced-statistics/, Agosto.
LOPES, R. et al. (2002) Marcadores moleculares dominantes (Rapd e Aflp).
Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento. Brasília, Ano V, Número 29, p. 56-60,
nov/dez.
Machado, A. M. C. et al. (1997) “An iterative algorithm for segmenting lanes in gel
electrophoresis images”. In: XI Simpósio Brasileiro de Computação Gráfica e
Processamento de Imagens – SIBGRAPI. Campos do Jordão.
Milach, S. C. K. (1999) Marcadores de DNA. Biotecnologia Ciência e
Desenvolvimento. Brasília, Ano II, Número 9, p. 40-43, jul/ago.
Naoum, P. C. (1990), Eletroforese – Técnicas e Diagnósticos. Livraria Santos Editora,
2ª edição.
Otsu, N. (1979) A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE
Transactions on Systems, Man, and Cybernetics, vol. 9, n. 1, p. 62-66.
Paulino, A. A. et al. (2007) “Detecção de canaletas em imagens de géis de eletroforese
usando filtro de kalman”. In: XXX Congresso Nacional de Matemática Aplicada e
Computacional – CNMAC. Florianópolis.
Rohlf, F. J. (1998), NTSYSpc – Numerical taxonomy and multivariate analysis system.
v 2.0. New York.
SAS Institute Inc. (1999), SAS/STAT User's Guide. v. 8. Cary, NC.
Solferini, V. N. e Selivon, D. (2001) “Biologia Molecular e Evolução”, Polimorfismo
de Isoenzimas, Matioli S. R., Holos Editora, 1ª edição, p. 137-142.
Statsoft. (2011) Electronic Statistics Textbook, http://www.statsoft.com/textbook/,
Agosto.
Ye, X. et al. (1999) “A recent development in image analysis of electrophoresis gels”.
In: Vision Interface '99, Trois-Rivières, p. 432-438, Maio.