Eletroforese

Eletroforese
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Eletroforese

É um processo que consiste na separação dos componentes
de um sistema através da aplicação de um campo elétrico.

É usado para separar e analisar biomoléculas.

Princípio:
Substâncias em solução que possuem carga elétrica livre,
deslocam-se quando submetidas a um campo elétrico de sentido
invariável.

Para que uma partícula se mova é necessário que possua
carga elétrica livre, isto é, excesso ou diferença de elétrons.

Portanto:
- para o ânodo (+) dirigem-se os ânions
- para o cátodo (-) dirigem-se os cátions
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N E
i
E 
i
N
i

i
Ni
Ei   Pi Ei
N
i
Eletroforese

As moléculas são separadas umas das outras conforme o
tamanho, a carga elétrica e a forma.

Separa-se partículas de mesma carga, porém com
quantidades diferente de carga.

Tipos de eletroforese
- Livre
- Anticonvectante
- Carga da partícula
- Peso da partícula
- pH (solução tampão)
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 Moléculas grandes migram lentamente, enquanto
moléculas pequenas movem-se rapidamente.
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N E
i
E 
i
N

i

i
Ni
Ei   Pi Ei
N
i
Eletroforese
Suportes:
Meio sólido: - Papel
- Acetato de celulose
Meio semi-sólido: - Gel de amido
- Gel de agarose
- Gel de poliacrilamida
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A técnica é tão sensível, que pode ser usada eficientemente
para separar moléculas que diferem apenas muito sutilmente
em suas cargas e/ou massas.
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 N i Ei
c2 2
m  2
PV  Ni A mu 2  N A mN i  N A  c 2   N A  average kinetic energy / molecule 
E 
  3 Ei 3
  Pi 2Ei  3
N
N
i
i
Eletroforese
 Marcadores de peso
molecular são usados
para estimar o
tamanho das moléculas
das amostras.
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Eletroforese: a concentração do gel
 A concentração do gel
definirá o tamanho dos
poros a serem
atravessados pelas
moléculas em migração.
 Geis muito
concentrados oferecerão
maior resistência à
migração das moléculas.
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 N i Ei
c2 2
m  2
PV  Ni A mu 2  N A mN i  N A  c 2   N A  average kinetic energy / molecule 
E 
  3 Ei 3
  Pi 2Ei  3
N
N
i
i
Eletroforese: a concentração do gel
 O grau de cross-links pode
ser controlado pela razão de
bis-acrilamida (cross-linker)
e acrilamida (que forma os
polímeros lineares),
determinando o tamanho
dos poros do gel.
 1 molécula de bis-acrilamida
para cerca de 29 monômeros
de acrilamida.
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• Tipos de gel de eletroforese
• Gel de agarose
•É um polissacarídeo; forma
uma rede que segura as
moléculas durante a migração.
Preparo: pó de agarose e solução
tampão (TBE).
Após fundir, coloca-se brometo de
etídio, que fará o DNA ou RNA
"brilhar" quando exposto ao UV.
Coloca-se o pente no gel. O pente
cria poços que serão utilizados
para a aplicação das amostras.
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• Tipos de eletroforese
• Gel de poliacrilamida
Acrilamida e
Bisacrilamida.
A acrilamida é uma
molécula linear,
A bisacrilamida é
em forma de "T".
• Diferentes relações entre as concentrações dessa
moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de
separação.
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• Gel de poliacrilamida
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Eletroforese capilar
- Reduz o tempo de migração dos fragmentos de DNA
substituindo a lâmina de gel por centenas de pequenos
capilares (100 micra de diâmetro interno).
- Aplicação de campos elétricos mais elevados para fazer com
que os fragmentos se separem mais rapidamente.
- O uso de um sistema de detecção através de fluorescência
confocal, excitada por laser, torna possível a análise de
mais de um capilar de cada vez.
- Com a excitação e detecção confocal (uso de mesmos focos), em
que a profundidade de campo do sistema ótico é
suficientemente pequena para sondar apenas o interior de
cada capilar, obtém-se alta resolução e eficiência de
detecção.
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• Gel de eletroforese capilar
Neste novo sistema, uma guarnição de capilares é colocada em um
suporte e, sob controle computadorizado, cada capilar vai sendo
submetido à varredura do feixe de laser. Os fragmentos de DNA,
marcados com corantes de alta fluorescência, emitem fluorescência,
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que é filtrada e detectada por um fotomultiplicador
N E
i
E 
i
N

i

i
Ni
Ei   Pi Ei
N
i
Eletroforese
Fatores que interferem na migração de partículas
- Mobilidade
- Diâmetro
- Peso molecular
- Força iônica
- Viscosidade
- Endosmose
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 N i Ei
c2 2
m  2
PV  Ni A mu 2  N A mN i  N A  c 2   N A  average kinetic energy / molecule 
E 
  3 Ei 3
  Pi 2Ei  3
N
N
i
i
Eletroforese: saída de força
 A saída de força pode
ser de diversos tipos:
- Voltagem constante
(mV)
- Corrente constante
(ampéres)
- Força constante (watts)
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Eletroforese

Proteínas:

Proteínas séricas:
- aminoácidos como eletrólitos
- Albumina
- Globulinas (α1, α2, β, δ)
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Eletroforese

LipoProteínas – unidade de transporte lipídico
- Ultracentrifugação
- Separação por eletroforese

Identificação de 4 faixas lipoproteicas
- Quilomicrons
- Lipoproteína Beta
- Lipoproteína Pré-beta
- Lipoproteína Alfa
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Eletroforese

Hemoglobina
- Hemoglobina anormais
- Carga elétrica
- Ponto isoelétrico
- Hemoglobina S
- Hemoglobina C
- Talassemia Beta
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Eletroforese

Hemoglobina S
- Hemoglobinopatia estrutural
* substituição do ácido glutâmico pela valina
- Indivíduos homozigotos (SS)
- Anemia hemolítica congênita
( anemia falciforme)
- Indivíduos heterozigotos (AS)
- Traço siclêmico
- Geralmente assintomáticos
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Eletroforese

Hemoglobina C
- Hemoglobinopatia estrutural
* substituição do ácido glutâmico pela lisina
- Indivíduos homozigotos (CC)
- Indivíduos heterozigotos (SC)
- Anemia
- Indivíduos heterozigotos (AC)
- Raros sintomas clínicos
- Detecção para aconselhamento genético
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Eletroforese

Talassemia Beta
- Depressão parcial ou total na síntese de
cadeias beta da hemoglobina A
- Indivíduos homozigotos
- Anemia hemolítica grave
- Indivíduos heterozigotos
- Podem ser: assintomáticos
anemia hipocrômica e microcítica
anemia hemolítica leve/ moderada
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 N i Ei
c2 2
m  2
PV  Ni A mu 2  N A mN i  N A  c 2   N A  average kinetic energy / molecule 
E 
  3 Ei 3
  Pi 2Ei  3
N
N
i
i
Eletroforese: métodos de leitura
Eluição
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Eletroforese: métodos de leitura
Densitometria
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OBRIGADA!!!
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