crescimento microbiano

ATENÇÃO
UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
DISCIPLINA: BIOQUÍMICA GERAL
PROFESSORAS: Adriana Silva Lima e Márcia Aparecida Cezar

Em Microbiologia quando falamos em crescimento
microbiano estamos nos referindo ao número e
Crescimento Microbiano
não ao tamanho das células

Microrganismos em crescimento estão aumentando
seu número

É importante entender as condições necessárias
para o crescimento microbiano
CRESCIMENTO MICROBIANO:

Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a
um aumento do número de células e não ao aumento
das dimensões celulares.
ajuda
a
explicar
a
ambientais
distribuição
dos
microrganismos na natureza,

Figura 1: Crescimento Microbiano =
associado ao crescimento de uma
população de células (uma célula dará
origem a duas ao fim de um certo tempo,
tempo de geração ou de duplicação.)
tornando
possível
o
desenvolvimento
de
métodos para o controle

Curva de crescimento
ou a otimização das atividades microbianas.
Fatores ambientais
Figura 02: Curva de crescimento
O
O entendimento das influências
crescimento de microrganismos em um recipiente fechado (batelada)

Fatores necessários para o crescimento
Fatores Físicos ( temperatura, pH, pressão osmótica)
Fatores Químicos (nutrientes, água, O2 etc.)

Meio de Cultura
Meio Complexo
Meio Definido

Crescimento da cultura bacteriana
Quantificação Direta (nº. de colônias viáveis ou não)
Quantificação Indireta (turbidez, peso seco etc.)
apresenta um ciclo típico com todas as fases de crescimento.
5
1
FATORES NECESSÁRIOS PARA O CRESCIMENTO
FATORES FÍSICOS
1. TEMPERATURA:
- FATORES FÍSICOS:
temperatura
pH
pressão osmótica (concentração de sal)
- FATORES QUÍMICOS:
água
fontes de carbono e nitrogênio
minerais
oxigênio
fatores orgânicos

A elevação da temperatura, até certos limites
leva ao aumento do crescimento e das
atividades metabólicas

Acima dessa temperatura, as funções celulares
caem rapidamente para zero.
Importante fator ambiental que afeta o crescimento e
a sobrevivência dos microrganismos
Estes não são capazes de crescer em temperaturas
muito frias ou muito quentes
Entretanto os valores absolutos de temperaturas
mínima e máxima variam de maneira ampla dentre
os diferentes microrganismos, refletindo a variação
térmica e a temperatura média de seus habitats
 A maioria dos microrganismos cresce bem nas
temperaturas ideais para os seres humanos
 Temperatura de crescimento mínima:
< temperatura onde a espécie é capaz de crescer
 Temperatura de crescimento ótima:
onde a espécie apresenta melhor crescimento


Cada organismo

Temperatura mínima

Temperatura ótima

Temperatura máxima
 Temperatura de crescimento máxima:
> temperatura, onde ainda é possível o
crescimento
A Temperatura pode afetar os seres vivos de duas
maneiras opostas.
À
medida que a temperatura aumenta, as
reações químicas e enzimáticas passam a
ocorrer com maior velocidade.
Certas
proteínas podem sofrer danos
irreversíveis.
Figura 3. Taxa de crescimento vs. temperatura
2
FATORES FÍSICOS
1. TEMPERATURA:
Termófilos extremos
Microrganismos são classificados em 3
grupos:
Psicrófilos: crescem em baixas temperaturas
(-10 a 15 °C)
Mesófilos: crescem em temperaturas
moderadas (10 a 50 °C)
Termófilos: crescem em altas temperaturas
(40 a 70 °C)
Termófilos extremos (68 a 110 °C)
Figura 5. Curva de crescimento característica de diferentes microrganimos


Psicrófilos: temperatura ótima: 15 °C
não causam problemas na preservação de
alimentos

Foram inicialmente caracterizados como
organismos capazes de crescer a 0 °C

Pode crescer a 0°C, mas sua T ótima de
crescimento é de 15 °C

A maioria desses organismos é altamente sensível
a altas T °C

Encontrados em profundezas dos oceanos e
regiões polares

Psicrotróficos:

Capaz de crescer a 0 °C

Crescimento temperatura ótima: 20 a 30 °C

Não podem crescer em T acima de 40 °C

Crescem em temperatura de refrigeradores

Encontrados em alimentos estragados

Os microrganismos podem sobreviver próximas a
temperatura de congelamento

Permanecem dormentes
Efeito da temperatura no crescimento microbiano

Mesófilos:

temperatura ótima: 25 a 40 °C (mais
encontrados)
Figura 6: Efeito da temperatura no crescimento microbiano

corpo de animais (temperatura da pele)

bactérias patogênicas: temp. ótima 37 °C

degradam alimentos e são patogênicos
17
3

Termófilos:

Capazes de crescer em altas temperaturas

temperatura ótima de crescimento: 50 a 60 °C

ambiente de águas termais

Solo aquecido

(***não crescem em temp. < 45 °C)

material estocado (altas temp.)

Endosporos formados por bactérias termofílicas são
resistentes ao calor sobrevivendo ao tratamento por
aquecimento nos alimentos enlatados

A elevação da temperatura nos alimentos estocados pode
permitir a germinação destes endosporos, degradando os
alimentos
Figura 7. Esquema de formação do endosporo
Temperatura: Psicrófilos, Mesófilos e Termófilos
Figura 8: Efeito da temperatura no crescimento microbiano
Thermus
aquaticus
Park Nacional de
Yellowstone
Min. 40oC
òtima:70-72oC
Máxima: 79 oC
Figura 9: Exemplo de microrganismo termófilo
Thermus aquaticus
21
Figura 10: Exemplo de microrganismo termófilo
22
FATORES FÍSICOS
2. pH
refere-se a acidez ou a alcalinidade de uma
solução;
maioria dos microrganismos cresce melhor perto
da neutralidade (pH 6,5 – 7,5);
poucas bactérias são capazes de crescer em pH
ácido (como pH 4,0)
Figura 11. Distribuição de alguns microrganismos de acordo com o pH
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
4
Bactérias: faixa entre pH 7,0
pH
Exceções:
Bactérias acidófilas: alto grau de tolerância à acidez
(Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5)
Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 – 11).
Fungos - tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (pH
<5).
Figura 12: Efeito do pH no crescimento microbiano
26
pH
Mínimo, Ótimo
e
Máximo
pH ótimo
pH máximo
0.5
2.0-2.8
4.0-6.0
Sulfolobus acidocaldarius 1.0
2.0-3.0
5.0
Bacillus acidocaldarius
2.0
4.0
6.0
Zymomonas lindneri
3.5
5.5-6.0
7.5
Lactobacillus acidophilus
4.0-4.6
5.8-6.6
6.8
Staphylococcus aureus
4.2
7.0-7.5
9.3
Escherichia coli
4.4
6.0-7.0
9.0
Clostridium sporogenes
5.0-5.8
6.0-7.6
8.5-9.0
Erwinia caratovora
5.6
7.1
9.3
Pseudomonas aeruginosa
5.6
6.6-7.0
8.0
Thiobacillus novellus
5.7
7.0
9.0
Streptococcus
pneumoniae
6.5
7.8
8.3
Nitrobacter sp
6.6
7.6-8.6
10.0
Thiobacillus thiooxidans
FATORES FÍSICOS
para o crescimento de alguns procariotos
pH mínimo
Organismo
3. PRESSÃO OSMÓTICA:
Movimento da água através de uma membrana
seletivamente permeável que produz uma pressão
Os microrganismos retiram da água a maioria dos
nutrientes solúveis (conteúdo celular 80 – 90 % de água)
 A água presente no interior da célula pode ser removida
por elevações na Pressão osmótica
 Pressão osmótica: retira a H2O dentro da célula
27


OSMOSE:
É o movimento líquido de moléculas de solvente através de
uma membrana seletivamente permeável

Que sai de uma área de ALTA concentração de moléculas

Condição Isotônica:

Em um meio:
a concentração geral de solutos se iguala com aquela
encontrada dentro da célula
A água sai e entra na célula na mesma velocidade
(sem alteração líquida)
O conteúdo celular está em equilíbrio com a solução
fora da parede celular



de solvente (baixa concentração de Soluto)

para uma área de baixa concentração de moléculas de
solvente (alta concentração de Soluto)

Nos sistemas vivos, o principal solvente é a água
Figura 13: Célula em ambiente isotônico
5


Condição Hipotônica:
Fora da célula é um meio cuja concentração de
solutos é inferior ao interior da célula

Condição Hipertônica:

É um meio que possui uma concentração maior de
solutos do que no interior da célula
Perda de H2O do meio intracelular para o extracelular,
através da membrana plasmática (meio com
concentração de sais).

Figura 14: Célula em ambiente hipotônico


Plasmólise: diminuição da membrana
plasmática da célula devido a perda de H2O por
osmose.
Esse fenômeno é importante pois inibe o
crescimento no momento em que a membrana
plasmática se separa da parede celular
Figura 15: Célula em ambiente hipertônico
Concentração de sais
Não Halófilos: não necessitam de sal e não
toleram a presença no meio.
Halotolerantes: não necessitam de sal mas
toleram a presença no meio.
Halófilos: necessitam de sal em uma concentração
moderada
Halófilos extremos: necessitam de sal em altas
concentrações.
Área de Alimentos
-adição de sais: plasmólise
preservação de alimentos (peixe salgado, mel e leite)
Alta concentração de sal ou açúcar
Halofílicos Extremos (ou obrigatórios):
necessitam de altas concentrações
de sais para o crescimento
Halofílicos Facultativos: mais abundantes
não exigem altas concentrações de sais
Figura 16. Taxa de crescimento de alguns microrganimos vs. a concentração de sal.
-Adição de ágar:
normalmente 1,5% para solidificar o meio
> concentração = inibição de alguns microrganismo
> concentração de sal = pressão osmótica
6
FATORES QUÍMICOS
FATORES QUÍMICOS
1. ÁGUA:
2. FONTES DE CARBONO, NITROGÊNIO, ENXOFRE E
FÓSFORO:
- Essencial para os microrganismos
- Disponibilidade variável no ambiente
a) CARBONO:
Ambiente com < concentração de água:
essencial para a síntese de todos os compostos orgânicos
necessários para a viabilidade celular (elemento estrutural básico
para os seres vivos)
desenvolvem mecanismos para obter água através do
aumento da concentração de solutos internos seja pelo
bombeamento de íons para o interior celular ou pela
síntese de solutos orgânicos (açúcares, álcoois ou
aminoácidos).
b) NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO:
- N, S: síntese de proteínas
- N, P: síntese de DNA e RNA, ATP
Peso seco de uma célula bacteriana: 14 % N, 4 % S, P
NITROGÊNIO
- utilizado para sintetizar os grupos aminos presentes nos
aminoácidos.
Obtenção de N:
- Decomposição de materiais orgânicos (proteínas, aminoácidos)
- Amônia (NH4 +)
- Nitrato (NO3-)
b) NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO:
organismos quimio-heterotróficos: obtém C a partir de materiais
orgânicos como proteínas, carboidratos e lipídeos.
organismos quimio-autotróficos
organismos fotoautotróficos
C a partir de CO2
Bactérias Fixadoras de Nitrogênio
Fixação de N: algumas bactérias são capazes de utilizar N
gasoso diretamente da atmosfera.
Microrganismos do solo (ex. bactérias dos gêneros
Rhizobium e Bradyrhizobium) utilizam este processo para
obtenção de N, tanto para elas como para as plantas que
convivem simbioticamente (algumas leguminosas – soja,
feijão).
Cultivo de leguminosas: > fertilidade do solo sem a
necessidade de implementação de fertilizantes químicos
c) POTÁSSIO, MAGNÉSIO E CÁLCIO:
ENXOFRE
- também são elementos essenciais para os microrganismos
- utilizado na síntese de aminoácidos contendo S e de vitaminas
(tiamina e biotina).
- frequentemente encontrados como co-fatores para as reações
enzimáticas.
Fontes naturais de S:
íon sulfato (SO4-2), sulfito de hidrogênio, aminoácidos
d) ELEMENTOS TRAÇOS:
FÓSFORO
- FERRO, COBRE, MOLIBDÊNIO, ZINCO
- essencial para a síntese dos ácidos nucléicos e para os
fosfolipídeos componentes da membrana celular.
- utilizados como co-fatores essenciais para atividade de
algumas enzimas
Fontes naturais de P:
íon fosfato (PO4-3), DNA, RNA, ATP
utilizar água destilada para meio de cultura – contém todos os
elementos traços
7
Fatores Necessários
FATORES QUÍMICOS
Fontes de Energia
- Orgânicos
- Inorgânicos
-Luz
Fontes de Carbono
- Orgânicos (Heterotróficos): Açúcares, Proteínas
- Inorgânicos (Autotróficos): CO2
- extremamente importante no desenvolvimento microbiano
Fontes de N
- Orgânicos: NH4+
- Inorgânicos: N2 (fixadoras de nitrogênio), NO2-, NO3-
- organismos classificados em:
3. OXIGÊNIO:
1. AERÓBIOS
- Estritos (obrigados): necessitam de O2
- Facultativos: não necessitam de O2 mas crescem melhor com O2
- Microaerófilo: necessitam de O2 mas em níveis menores
2-
Fontes de P e S
- HP04
- SO42-
Fontes de outros Elementos
- Na+, K+, Mg++, Fe+++
- traços de Zn++, Mn++, Co++,
Fatores de Crescimento
- Vitaminas
- Aminoácidos
- Fatores presentes no SANGUE
- Fatores presentes no SOLO
Mo+++, Se++
2. ANAERÓBIOS
- Aerotolerantes: não necessitam de O2 mas crescem melhor sem O2
- Estritos (obrigados): não toleram O2 (letal)
43
Efeito do oxigênio no crescimento microbiano
Durante as reações de redução
do O2 são formados vários
intermediários tóxicos.
Presença de Oxigênio
1
Aeróbios Obrigatórios
Ex. Pseudomonas spp.
2
Facultativos
Ex. Escherichia coli
Meio gelatinoso com
indicador redox:
Ex: H2O2, OH°, O2-
Rosa quando oxidado
Os microrganismos aeróbios e
facultativos utilizam enzimas
como a catalase para destruir as
formas tóxicas
Aeróbio
Incolor quando
reduzido
Anaeróbio Facultativo Microaerófilo
3
Anaeróbios Obrigatórios
Ex. Clostridium tetani
Anaeróbio
aerotolerante
2
1
3
Agar tioglicolato
Figura 17: Efeito do oxigênio no crescimento microbiano
45
Figura 19 Transporte de anaeróbios
Figura 18: Efeito do oxigênio no crescimento microbiano
46
Figura 20:Sistema para cultivo de anaeróbios
47
48
8
Figura 21:Sistema para cultivo de anaeróbios
Figura 22:Sistema para cultivo de anaeróbios
49
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
50
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
(1) CONTAGEM EM PLACAS
- CONTAGEM EM PLACAS
- FILTRAÇÃO
- MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL
- CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO
- técnica mais utilizada na determinação do tamanho da
população bacteriana;
VANTAGEM: qualificação de células viáveis
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:
DESVANTAGEM: tempo (24 h para o aparecimento das colônias)
- TURBIDIMETRIA
- ATIVIDADE METABÓLICA
- PESO SECO
Cálculo:
nº de colônias na placa
x índice de diluição da
amostra = nº de
bactérias/mL
-DILUIÇÃO SERIADA
-MÉTODO DE
ESPALHAMENTO EM
PLACA
Figuras 14 e 15: Cultura pura e visualização sob microscópio
53
Figura 23. Contagem em placas e diluição seriada
9
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O
CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
(2) FILTRAÇÃO
- < nº de bactérias = pode ser utilizado o método de filtração
para a sua contagem.
- concentração de bactérias sobre a superfície de uma membrana
de filtro de poros muito pequenos após a passagem de um
volume de 100 mL de água.
- filtro posteriormente transferido para uma placa de petri
contendo meio sólido.
Figura 24: Contagem de bactérias utilizando método de filtração
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
(3) O MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
- utilizado para microrganismos que não crescem bem em meio
sólido.
A) diluição a partir de um alto volume de inóculo (ex. 10 mL)
B) diluição a partir de um médio volume de inóculo (ex. 1 mL)
c) diluição a partir de um baixo volume de inóculo (ex. 0,1 mL)
d) contagem do nº de tubos positivos
e) estimativa do nº de células/mL de bactérias
Figura 25: Contagem de bactérias utilizando método de filtração
10 mL de inóculo
6 tubos positivos
(com crescimento
bacteriano)
6
Tabela de combinações
(NMP)
6-3-1
3 tubos positivos
1 mL de inóculo
3
Índice de NMP/100 mL = 110
Inferior = 40
Superior = 300
Confiabilidade de 95%
0,1 mL de inóculo
1 tubos positivos
Figura 26. Método do número mais provável (NMP)
1
Figura 27. Método do número mais provável (NMP)
10
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem direta
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO DIRETA:
(4) CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO
- um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado em
uma área definida da lâmina de microscópio.
- a amostra pode ser corada ou analisada a fresco.
- utilizam câmaras de contagem
DESVANTAGENS: - não separa células mortas e vivas
- pode haver erros de contagem
- difícil contagem para bactérias móveis
Figura 28. Utilização da câmara de contagem Petroff-Hausser.
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem direta
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:
(1) TURBIDIMETRIA
- monitoramento do crescimento bacteriano através da turbidez
- espectrofotômetro (660 nm)

Vantagens: método rápido e fácil
(2) ATIVIDADE METABÓLICA

Desvantagens
Não distingue as células vivas das mortas
- quantidade de um certo produto (como ácido ou CO2) é
diretamente proporcional ao número de células bacterianas.
Pode-se omitir células pequenas
Células móveis precisam ser imobilizadas
65
11
- Quero traçar uma Curva de Crescimento Bacteriano.
- Como o crescimento da cultura bacteriana pode ser acompanhado?
Acompanhando-se o aumento da turvação ao longo do cultivo
A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº.
de bactérias.
Quanto > o nº. de bactérias < a quantidade de luz que é transmitida
Figura 29. Determinação do nº de bactérias por turbidimetria.
68
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem indireta
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:
b) Contagem de células viáveis:
(3) PESO SECO
Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.
- principalmente para fungos filamentosos
a) fungo é removido do meio por filtração
b) seco em dessecador
c) posterior pesagem.
70
Contagem eletrônica
71
12