Tese_ICS_Lenita Ramires dos Santos

PPGIm
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO
DE RESPOSTA IMUNE CONTRA ANTÍGENOS
RECOMBINANTES DE Leishmania chagasi
LENITA RAMIRES DOS SANTOS
Salvador-Bahia
2007
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO
DE RESPOSTA IMUNE CONTRA ANTÍGENOS
RECOMBINANTES DE Leishmania chagasi
LENITA RAMIRES DOS SANTOS
Orientador: Dr. Geraldo Gileno de Sá Oliveira
Tese apresentada ao Curso de Pósgraduação em Imunologia do Instituto
de Ciências da Saúde da Universidade
Federal da Bahia para obtenção do
grau de Doutor em Imunologia
Salvador-Bahia
2007
iii
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO
DE RESPOSTA IMUNE CONTRA ANTÍGENOS
RECOMBINANTES DE Leishmania chagasi
LENITA RAMIRES DOS SANTOS
Folha de Aprovação
COMISSÃO EXAMINADORA
Dra Fabíola Cardillo -Pesquisadora Associada - CPqGM-FIOCRUZ-BA
______________________________________________________________________________
Dr. Alan McBride – Pesquisador Visitante - CPqGM-FIOCRUZ-BA
______________________________________________________________________________
Dr. Nicolaus Albert Borges Schriefer – Professor da Pós-graduação em Imunologia – UFBA
______________________________________________________________________________
Dr. Roberto José Meyer Nascimento – Professor da Pós-graduação em Imunologia - UFBA
______________________________________________________________________________
Dr. Geraldo Gileno de Sá Oliveira – Pesquisador Associado– CPqGM-FIOCRUZ-BAOrientador
iv
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Patologia e Bio-Intervenção (LPBI) do
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz (CpqGM) - BA da Fundação Instituto Oswaldo
Cruz com recursos financeiros do Programa RENORBIO (MCT), Programa INOVABIO
(MCT), Programa Milênio Vacinas, FAPESB, CAPES e CNPQ.
v
Dedico esta tese a minha família, que
soube compreender mais este período
de ausência...
Em especial à Julinha, que não se
cansa de dizer:
“Você tá demorando Madrinha!”
vi
AGRADECIMENTOS
Os meus sinceros agradecimentos ao Dr. Geraldo Gileno de Sá Oliveira, por ter
confiado a mim uma parte tão importante de seu trabalho. Agradeço também por sua orientação e
pelo exemplo de conduta profissional.
Ao Dr. Lain Carlos Pontes de Carvalho, pelo acompanhamento ao longo de todo o
trabalho e pelas sugestões e correções nas etapas finais de elaboração da tese. Agradeço também
ao Dr. Washington Luís Conrado dos Santos, pelas sugestões e incentivos, científicos e
culturais, durante todo o período em que estive no laboratório.
Ao Dr. Edmilson Domingos da Silva (Biomanguinhos-RJ), pela produção e purificação
de parte das proteínas recombinantes utilizadas neste estudo.
Ao Dr. Oswaldo Pompílio (CPqAM-PE), pelas subclonagens de dois clones utilizados e
sequenciamento dos insertos dos plasmídeos utilizados neste trabalho.
Ao Dr. Yuri Pepe (Departamento de Física-UFBA), pela elaboração do aparelho de
eletroporação e à Dra. Stella Maria Barrouin-Mello (UFBA), que esteve à frente na confecção
deste equipamento e nos primeiros experimentos utilizando eletroporação em nosso laboratório.
A Ricardo Fraga, Cristiane Pinheiro, Patrícia Meira, Elivani Sacramento, Andréa
Mendes, Diego Moura e Valdir Cerqueira pelo apoio na execução de diversos experimentos
aqui descritos.
Aos demais colegas do LPBI, pelo agradável convívio e incentivo, em especial à Micely
Hermida e Cláudia Santana, companheiras de defesa.
Ao Programa de Pós-graduação em Imunologia da Universidade Federal da Bahia,
pelos ensinamentos proporcionados e apoio administrativo e à Fundação Instituto Oswaldo
Cruz, por disponibilizar toda sua infra-estrutura possibilitando a execução deste trabalho.
A todas as pessoas que participaram da realização deste estudo através de inúmeras
contribuições técnicas e administrativas:
Ana Maria Fiscina (Biblioteca-CPqGM)
Fabienne Petitinga de Paiva (Biotério-CPqGM)
Rejane Márcia Chaves de Menezes (Biotério-CPqGM)
José Fernando Oliveira Costa (LETI-CPqGM)
Matheus Santos de Sá (LETI-CPqGM)
Sérgio Vasconcelos (LPBI-CPqGM)
Em especial, meus agradecimentos à Gyselle Baccan e Sebastião Martins de Souza
Neto, pelo incentivo, sugestões e apoio em todas as etapas deste trabalho e pela compreensão,
amizade e amor incondicionais.
vii
RESUMO
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO DE RESPOSTA IMUNE CONTRA
ANTÍGENOS RECOMBINANTES DE Leishmania chagasi. Lenita Ramires dos Santos. A
leishmaniose visceral (LV), causada pela L. infantum/L. chagasi, é uma doença infecciosa na qual
o cão doméstico é considerado o principal reservatório do agente causal. Uma vacina canina
efetiva pode contribuir para o controle da LV tanto no homem como no cão. Nosso grupo de
pesquisas está avaliando um painel de proteínas recombinantes de formas amastigotas de L.
chagasi a fim de identificar potenciais candidatos à vacina. Neste estudo, foram testados
diferentes protocolos de imunização objetivando induzir uma resposta imune específica tipo Th1
para tais moléculas candidatas. Grupos de camundongos BALB/c foram injetados 3 vezes em
intervalos de 3 semanas, com (a) salina, (b) plasmídeo pBK-CMV vazio, (c) pBK-CMV-Lc9, (d)
pBK-CMV-Lc13, (e) pBK-CMV-Lc14, (f) pBK-CMV-Lc18; (g) uma mistura de plasmídeos ou
(h) uma mistura de plasmídeos associado a pcDNA.3.1-sc-muIL-12. Os plasmídeos foram
injetados por via intramuscular seguida de eletroporação. Três outros grupos de animais foram
introduzidos no estudo e injetados com (i) uma mistura de plasmídeos por via intramuscular sem
eletroporação e (j) Lc9 recombinante (rLc9) associada à saponina e (k) plasmídeo pBK-CMVLc9 nas duas primeiras séries de injeções e rLc9/saponina na terceira e última injeção. Após a
terceira série de injeções, a produção de anticorpos específicos da classe IgG, assim como a
produção de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a, foram avaliadas por ELISA e a resposta
imune celular foi avaliada em termos de resposta proliferativa e produção de citocinas (IFN-γ, IL4, IL-5). No dia 30 e 90 após a terceira série de injeções, os grupos de camundongos de (a) a (i)
foram desafiados pela injeção de L. chagasi e a carga parasitária no baço foi determinada,
respectivamente. Os grupos injetados com pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14 produziram
anticorpos específicos da subclasse IgG, com predomínio de anticorpos da subclasse IgG2a. A
indução de resposta imune celular foi evidenciada após o desafio com promastigotas de
L.infantum/chagasi pela produção específica de IFN-γ no grupo injetado com pBK-CMV-Lc9
(12,77 ng/mL, p < 0,05) e resposta proliferativa em células do grupo de animais injetado com
pBK-CMV-Lc14. A produção de IFN-γ foi induzida também após a injeção de uma mistura de
plasmídeos associado a pcDNA3.1-scmu-IL-12 após estimulação in vitro com rLc9, antes (0,32
ng/mL, p < 0,05) e após o desafio (7,7 ng/mL, p < 0,05). Entretanto, em apenas dois de seis
animais do grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 houve diminuição da carga parasitária no baço.
Provavelmente a intensidade da resposta imune específica induzida não foi forte o suficiente para
induzir proteção nos animais imunizados. O protocolo de imunização com a administração inicial
de DNA plasmideal pBK-CMV-Lc9 seguida de reforço com a proteína rLc9/saponina foi capaz
de aumentar a intensidade da resposta imune específica. Novos experimentos serão realizados a
fim de explorar a capacidade protetora induzida por Lc9, neste e em outros esquemas de
imunização.
Palavras-chave: vacina, leishmaniose visceral, cão
viii
ABSTRACT
EVALUATION OF PROTOCOLS TO INDUCE IMMUNE RESPONSE AGAINST
RECOMBINANT ANTIGENS OF Leishmania chagasi. Lenita Ramires Dos Santos. Visceral
leishmaniasis (VL) caused by L. infantum/L. chagasi is an infectious disease which dogs are
considered the major reservoir of the causal agent. An effective canine vaccine might contribute
to human and dog VL control. Our group is evaluating a panel of L. chagasi amastigote
recombinant proteins to identify potential vaccine candidate antigens. In this study we tested
different immunization protocols aiming to induce a specific Th1 immune response. Groups of
BALB/c mice were injected 3 times, at 3-week intervals, with (a) saline; (b) pBK-CMV empty
plasmid; (c) pBK-CMV-Lc9, (d) pBK-CMV-Lc13, (e) pBK-CMV-Lc14, (f) pBK-CMV-Lc18;
(g) a pool of plasmid or (h) a pool of plasmid associated to pcDNA.3.1-sc-muIL-12. Plasmid
DNA was injected through intramuscular injections followed by electroporation. In addition,
three another groups of animals were used: (i) pool of plasmid without electroporation; (j) Lc9
recombinant protein (rLc9) associated to saponin as adjuvant and (k) pBK-CMV-Lc9 twice and
once with rLc9 (protein). After immunization, specific total IgG as well as IgG1 and IgG2a
isotypes were measure by ELISA and cellular immune response was assessed by
lymphoproliferative assays and cytokine production (IFN-γ, IL-4, IL-5). At 30 and 90 days after
immunization, mice from groups (a) to (i) were challenged by L. chagasi and the splenic parasite
burden was determined, respectively. The mice immunized with pBK-CMV-Lc9, pBK-CMVLc14 and pBK-CMV-Lc18 developed specific total IgG production with, almost, exclusively
IgG2a isotype. The immune cellular immune response was showed after challenge with L.
infantum/chagasi by specific IFN-γ production in the group that was injected with pBK-CMVLc9 (7.7 ng/mL, p < 0.05) and proliferative response by splenic cells of pBK-CMV-Lc14 group
(p < 0.05). The IFN-γ production was induced also after injection of a pool of plasmid in
association with pcDNA3.1-scmu-IL-12 and in vitro stimulation with rLc9, before (0.32 ng/mL,
p < 0.05) and after challenge (12.77 ng/mL, p < 0.05). However, only in two out of six mice of
the pBK-CMV-Lc9 injected group a reduction of spleen parasite burden was observed. Probably,
the specific immune response intensity was not strong enough to induce protection in the
immunized animals. The DNA primer/protein booster immunization protocol was able to
increase the intensity of the Th1 specific immune response to rLc9 protein. Experiments are
underway to assess a possible protective response to these and others immunization schedules.
Key-words: vaccine, visceral leishmaniasis, canine
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais injetados com plasmídeos
recombinantes administrados isoladamente..................................................................................68
FIGURA 2. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos a Lc9 ou Lc14, de animais injetados com plasmídeos recombinantes administrados
isoladamente..................................................................................................................................70
FIGURA 3. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG, reativos a Lc18, de animais
injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente.........................................71
FIGURA 4. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de
camundongos injetados com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, após
cultivo com concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de L. chagasi..........................................74
FIGURA 5. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de
camundongos injetados com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, após
cultivo com proteínas recombinantes de L. chagasi.......................................................................76
FIGURA 6. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1
reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi em animais previamente injetados com
plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, .após a infecção por L. chagasi.............78
FIGURA 7. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG reativos a proteínas
recombinantes de L. chagasi em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes
administrados
isoladamente,
.após
a
infecção
por
L.
chagasi............................................................................................................................................80
FIGURA 8. Avaliação de resposta proliferativa e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, após injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de concanavalina A ou
extrato bruto de L. chagasi, em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes
administrados isoladamente............................................................................................................83
x
FIGURA 9. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente,
após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc9 recombinante.......................86
FIGURA 10. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente,
após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc14 recombinante.....................89
FIGURA 11. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente,
após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc18 recombinante.....................92
FIGURA 12. Avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L. chagasi em
animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente.......94
FIGURA 13. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos ao extrato bruto de antígenos de promastigotas de L. chagasi, de animais injetados com
um pool de plasmídeos recombinantes...........................................................................................96
FIGURA 14. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, injetados com um pool de plasmídeos recombinantes, após cultivo com
concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de antígenos de L. chagasi.........................................99
FIGURA 15. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de
camundongos injetados com um pool de plasmídeos recombinantes, após cultivo com proteínas
recombinantes de L. chagasi........................................................................................................102
FIGURA 16. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais previamente injetados com um
pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi...104
FIGURA 17. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados
pela injeção de promastigotas de L. chagasi, após cultivo com concanavalina A (Con A) ou
extrato bruto de antígenos de L. chagasi......................................................................................107
xi
FIGURA 18. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados
pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc9 recombinante.........................109
FIGURA 19. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados
pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc14 recombinante.......................113
FIGURA 20. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados
pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc18 recombinante.......................114
FIGURA 21. Avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L. chagasi. em
animais previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes...............................116
FIGURA 22. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos a extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais injetados com DNA plasmideal e
proteína recombinante Lc9...........................................................................................................118
FIGURA 23. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos a Lc9, de animais injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9..........120
FIGURA 24. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9, após cultivo com
concanavalina A (Con A).............................................................................................................122
FIGURA 25. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9, após cultivo com
Lc9................................................................................................................................................126
xii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Preparações antigênicas de moléculas candidatas a vacina, avaliadas no modelo
murino de leishmaniose visceral experimental...............................................................................38
TABELA 2. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos
submetidos
a
três
séries
de
injeções
com
plasmídeos
recombinantes
administrados
isoladamente..........................................................................................................................................72
TABELA 3. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados na presença ou na ausência de proteínas recombinantes de L. chagasi, obtidos de grupos de
camundongos submetidos a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes administrados
isoladamente..........................................................................................................................................75
TABELA 4. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
de cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de
camundongos submetidos previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes,
administrados isoladamente, e desafiados com promastigotas de L. chagasi......................................82
TABELA 5. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos
previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e
desafiados com promastigotas de L. chagasi........................................................................................85
TABELA 6. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com Lc14 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos
previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e
desafiados com promastigotas de L. chagasi........................................................................................88
TABELA 7. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com Lc18 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a
três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e desafiados com
promastigotas de L. chagasi..................................................................................................................91
xiii
TABELA 8. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos
submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos........................................................98
TABELA 9. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos,
cultivados na presença ou na ausência de proteínas recombinantes de L. chagasi.............................101
TABELA 10. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por
esplenócitos cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de
camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos e desafiados com
promastigotas de L. chagasi................................................................................................................106
TABELA 11. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por
esplenócitos cultivados em meio de cultura ou meio de cultura com Lc9 em diferentes concentrações,
obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos,
e desafiados com promastigotas de L. chagasi....................................................................................111
TABELA 12. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por
esplenócitos cultivados em meio de cultura ou meio de cultura com Lc14 ou Lc18 em diferentes
concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool
de plasmídeos, e desafiados com promastigotas de L. chagasi...........................................................112
TABELA 13. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por
esplenócitos cultivados com concanavalina A, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três
séries de injeções com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9..............................................121
TABELA 14. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por
esplenócitos cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos .de grupos de camundongos
submetidos a três séries de injeções com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9..................125
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
DMSO
Dimetilsufóxido
cDNA
ácido desoxirribonucleico complementar
DNA
ácido desoxirribonucleico
CpG
citosina-fosfato-guanosina
Con A
concanavalina A
D.O.
densidade óptica
EDTA
ácido etilenodiaminotetracético
EL
eletroporação
ELISA
ensaio imunoenzimático
GM-CSF
fator estimulador de colôniasde granulócitos e monócitos
IFN-γ
interferon gama
Ig
imunoglobulina
IL
interleucina
IPTG
isopropil-β−D-thiogalactosídeo
HEPES
Ácido 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-etano- sulfônico
LB
Luria Bertani
LC
leishmaniose cutânea
LCD
leishmaniose cutânea difusa
xv
LMC
leishmaniose mucocutânea
LV
leishmaniose visceral
LVZ
leishmaniose visceral zoonótica
LCPK
leishmaniose cutânea pós-kalazar
MDP
muramil dipeptídeo
MHC
complexo principal de histocompatibilidade
MS
Ministério da Saúde
MPL
monofosforil lipídico
NK
natural killer
PMSF
fluoreto de fenilmetilsufonila
RPMI 1640
Meio 1640 do Instituto Roswell Park Memorial
SBF
soro bovino fetal
SDS-PAGE
eletroforese em gel de poliacrilamida
TAE
tris-acetato-EDTA
Th
T helper
TNF-α
fator de necrose tumoral alfa
TMB
tetrametilbenzidina
xvi
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE ABREVIATURAS
1. INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA........................................................................................ 19
2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................................... 22
2.1. Leishmaniose – Aspectos Gerais ..................................................................................... 22
2.2. Leishmaniose Visceral...................................................................................................... 24
2.2.1. Aspectos Epidemiológicos .......................................................................................... 24
2.2.2. Aspectos Clínicos da Leishmaniose Visceral.............................................................. 26
Em Seres Humanos................................................................................................................ 26
Em Cães................................................................................................................................. 27
2.2.3. A Resposta Imune na Leishmaniose Visceral ............................................................. 28
Aspectos Gerais da Imunidade na Leishmaniose .................................................................. 28
Leishmaniose Visceral Humana ............................................................................................ 30
Leishmaniose Visceral Canina .............................................................................................. 33
Leishmaniose Visceral Experimental – O Modelo Murino................................................... 34
2.3. O Controle da Leishmaniose Visceral ............................................................................ 36
2.3.1. O Desenvolvimento de Vacinas .................................................................................. 37
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 46
3.1. Objetivo Geral .................................................................................................................... 46
3.2. Objetivos específicos.......................................................................................................... 46
4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................... 47
4.1 Antígenos ............................................................................................................................ 47
4.1.1 Produção de extrato bruto de antígenos de Leishmania chagasi.................................. 47
xvii
4.1.2 Produção de antígenos recombinantes de Leishmania chagasi.................................... 49
Cultivo de E. coli e indução da produção de antígenos recombinantes ................................ 49
Purificação de antígenos recombinantes de L. chagasi ......................................................... 51
Obtenção de proteínas solúveis ou sob a forma de corpúsculos de inclusão ........................ 51
Purificação em coluna de afinidade....................................................................................... 52
4.1.3 Obtenção de plasmídeos para imunização.................................................................... 54
Purificação de plasmídeos pBK-CMV com insertos de antígenos recombinantes de L.
chagasi e de plasmídeocodificando IL-12 murina - pcDNA3.1-scmu-IL12......................... 55
4.2 Animais ............................................................................................................................... 57
4.3 Imunização ......................................................................................................................... 57
4.4. Infecção com Leishmania chagasi ................................................................................... 59
4.5. Avaliação da resposta imune ........................................................................................... 59
4.5.1 Avaliação da resposta imune humoral.......................................................................... 59
Mensuração de anticorpos da classe IgG por ELISA............................................................ 60
Avaliação de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a por ELISA....................................... 61
4.5.2 Avaliação da resposta imune celular ............................................................................ 62
Avaliação de proliferação celular .......................................................................................... 62
ELISA para quantificação de IFN-γ, IL-4 e IL-5 de camundongo........................................ 64
4.6. Avaliação de proteção contra desafio com Leishmania chagasi................................... 66
4.6.1. Determinação de carga parasitária............................................................................... 66
4.7. Análise estatística.............................................................................................................. 67
5. RESULTADOS ........................................................................................................................ 68
5.1. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados com plasmídeos codificando
proteínas de L. chagasi ............................................................................................................ 68
5.1.1. Avaliação da resposta imune humoral......................................................................... 68
xviii
5.1.3. Avaliação da resposta imune humoral após desafio com L. chagasi .......................... 79
5.1.4. Avaliação da resposta imune celular após desafio com L infantum/chagasi .............. 83
5.1.5. Avaliação de proteção contra infecção por L. chagasi................................................ 95
5.2. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados com uma combinação de
plasmídeos codificando proteínas de L. chagasi ................................................................... 97
5.2.1. Avaliação da resposta imune humoral......................................................................... 97
5.2.2. Avaliação da resposta imune celular ........................................................................... 99
5.2.3. Avaliação da resposta imune humoral após desafio com L.infantum/chagasi .......... 105
5.2.4. Avaliação da resposta imune celular após desafio com L. chagasi........................... 107
5.2.5. Avaliação de proteção contra infecção por L. chagasi.............................................. 117
5.3. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados DNA plasmideal seguido
por proteína recombinante – DNA primer/proteína booster.............................................. 119
5.3.1. Avaliação da resposta imune humoral....................................................................... 119
5.3.2. Avaliação da resposta imune celular ......................................................................... 123
6. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 129
7. CONCLUSÕES...................................................................................................................... 142
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 143
9. APÊNDICES .......................................................................................................................... 164
9.1. Apêndice A – Desenho experimental............................................................................... 165
9.2. Apêndice B - Foto do Aparelho eletroporador............................................................166
9.3. Apêndice C – Mapa qualitativo das respostas imunes aos diferentes imunógenos em
ensaios com e sem desafio com L. chagasi..........................................................................................167
9.4. Apêndice D – Manuscrito – primeira versão – a ser submetido posteriormente para
publicação em revista científica indexada....................................................................................168
19
1. INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA
Doenças parasitárias causadas por protozoários constituem um dos maiores problemas em
saúde pública no mundo. Várias das doenças causadas por estes microorganismos são as maiores
causas de mortalidade e de morbidade em países tropicais, principalmente naqueles considerados
em desenvolvimento.
A leishmaniose visceral é uma doença causada por parasitos protozoários do gênero
Leishmania. Em sua forma clássica, a doença caracteriza-se pelo comprometimento de órgãos
internos como o fígado e o baço de indivíduos infectados, a partir da disseminação do parasito
(EVANS et al., 1985; de BEER et al., 1991). É uma das formas mais graves de leishmaniose,
sendo fatal quando não tratada.
Em todo o mundo estima-se que 500.000 mil casos de leishmaniose visceral sejam
registrados anualmente (World Health Organization - WHO, 2002). No Brasil, onde a
leishmaniose visceral é causada pela L. infantum/chagasi, a doença era considerada típicamente
de ambientes rurais. Atualmente, há um grande aumento no número de casos registrados em
várias regiões do país, inclusive em áreas urbanas e suburbanas de grandes cidades (COSTA et
al., 1990; JERONIMO et al., 1994; MARZOCHI et al., 1994).
Na forma zoonótica da leishmaniose visceral, o cão doméstico é o principal reservatório
do agente causal (DEANE & DEANE, 1954; LAINSON et al., 1987; MORENO-ALVAR et al.,
2002). O elevado parasitismo na pele de cães infectados, possivelmente mesmo sem apresentação
de sinais característicos da doença, propicia a infecção de insetos vetores e, consequentemente, a
transmissão para o homem (MOLINA et al., 1994).
A estratégia de controle da leishmaniose visceral zoonótica adotada pelo Ministério da
Saúde do Brasil, compreende pelo menos quatro medidas. São elas: o diagnóstico e tratamento de
casos humanos da doença, atividades de educação em saúde, controle do inseto vetor com
borrifação de inseticidas e a identificação e eliminação de cães errantes ou com diagnóstico
positivo de infecção por Leishmania (BRASIL, 2003). No entanto, essas medidas não têm sido
sistematicamente realizadas e por um tempo suficientemente longo e, possivelmente por isso, não
apresentam a eficácia necessária ao controle da doença. Isso ocorre, em parte, porque tais
20
medidas são de difícil execução e de alto custo, o que implicaria em um maior investimento de
recursos na área de Saúde Pública.
A eliminação de cães infectados, identificados por inquérito sorológico, como medida
efetiva no programa de controle da leishmaniose visceral zoonótica, tem sido questionada
(DIETZE et al., 1997; ASHFORD et al., 1998; COURTENAY et al., 2002). Inclusive, tal medida
não é bem aceita pela comunidade, o que dificulta, em parte, sua implementação. No entanto, há
um consenso geral de que o controle da infecção canina pode reduzir a prevalência da doença
humana em áreas endêmicas para leishmaniose visceral. Uma alternativa proposta para alcançar
este controle seria o desenvolvimento de uma vacina efetiva contra a leishmaniose visceral canina
(TESH, 1995; DYE, 1996). Como no Brasil o uso de medicamentos para o tratamento da
leishmaniose visceral não é recomendado para o cão (BRASIL, 2003), a imunoprofilaxia canina
atenderia interesses tanto na área de Saúde Pública como em Medicina Veterinária.
O desenvolvimento de uma vacina para o cão é vantajoso por vários motivos.
Economicamente, o desenvolvimento de uma vacina canina é extremamente viável. O custo e o
tempo necessário para o desenvolvimento de uma vacina para o cão seriam menor que para uma
vacina para seres humanos. A experiência no país com programas de vacinação animal, como o
da vacina anti-rábica canina, é bem sucedida, com campanhas de vacinação de ampla
abrangência. Além disso, uma vacina para o cão teria grande aceitação pela comunidade em áreas
endêmicas, pois evitaria o sacrifício dos animais, como proposto atualmente.
Visando o desenvolvimento de uma vacina contra a leishmaniose visceral canina, nosso
grupo de pesquisas vem trabalhando na identificação, produção e análise de moléculas candidatas
a componentes de uma vacina, quer seja, antígenos de Leishmania, como também moléculas
imunomoduladoras, como citocinas caninas. Assim, considerando que hospedeiros vertebrados
infectados por Leishmania apresentam a forma intracelular do parasito e que a indução da
resposta imune específica ocorre para antígenos expressos neste estágio, uma biblioteca de cDNA
de formas amastigotas de L. infantum/chagasi foi confeccionada por um dos pesquisadores de
nosso grupo (TEIXEIRA et al., 2007), com o objetivo de identificar antígenos em potencial para
o desenvolvimento de uma vacina. Clones desta biblioteca, reativos a amostras de soro de cães
naturalmente infectados, foram selecionados e as proteínas recombinantes correspondentes foram
produzidas, sendo que algumas delas já estão em fase de avaliação. Em experimentos iniciais,
dois destes antígenos, denominados Lc9 e Lc13, foram administrados em cães saudáveis em
21
associação ao adjuvante saponina. Os animais injetados com esta preparação montaram uma
resposta imune humoral específica intensa, mas, nestes experimentos, a indução de resposta
imune celular não foi observada (SANTOS, 2007), resultado este contrário ao tipo de resposta
imune específica que se espera induzir para obtenção de proteção contra infecção por Leishmania
em cães. No cão, a capacidade de controlar a infecção e apresentar resistência ao estabelecimento
da doença, como vista em animais infectados assintomáticos, parece ser dependente da indução
de uma resposta imune celular específica do tipo Th1 (PINELLI et al., 1994; PINELLI et al.,
1995; RHALEM et al., 1999a). As células Th1 estão envolvidas, principalmente, na produção de
IFN-γ e conseqüentemente, na ativação de macrófagos e destruição de parasitos intracelulares.
Em uma etapa posterior, em experimentos realizados em camundongos, a injeção da
proteína recombinante Lc9 induziu uma resposta imune específica, humoral e celular, com
característica tipicamente Th2. Assim, o uso de diferentes adjuvantes foi avaliado na tentativa de
se obter uma reversão do perfil de resposta imune induzida para Lc9. De cinco adjuvantes
testados, apenas a combinação do antígeno recombinante à saponina foi capaz de levar a uma
resposta específica contra Lc9 com produção mista de anticorpos IgG das subclasses IgG2a e
IgG1 e das citocinas IFN-γ e IL-5 (FRAGA, 2007).
Diante destas observações, foi proposto no presente trabalho a avaliação de diferentes
protocolos de imunização, em camundongos, para a definição de condições adequadas para a
indução de resposta imune do tipo Th1 à moléculas candidatas a componentes de uma vacina
contra leishmaniose visceral canina. A imunização realizada com DNA plasmideal, como
demonstrado em diversos estudos, tende a induzir uma resposta imune com tais características
(LECLERC et al., 1997; ROMAN et al., 1997; ZANGH et al., 2001). Assim, os protocolos
utilizados tiveram como base a injeção de plasmídeos como vetores dos cDNAs correspondentes
a quatro antígenos de L. infantum/chagasi, denominados Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18. As injeções
consistiram da administração de plasmídeos isoladamente, de uma mistura de plasmídeos
associados ou não a plasmídeocodificando IL-12 murina e, ainda, de uma injeção inicial de DNA
plasmideal seguida de reforço com a proteína recombinante.
22
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Leishmaniose – Aspectos Gerais
As leishmanioses, um grupo de doenças infecto-parasitárias de amplo espectro clínico
causadas por protozoários do gênero Leishmania (ROSS, 1903), família Trypanosomatidae,
ordem Kinetoplastidae, compreendem enfermidades de crescente impacto e preocupação
mundial. Estão distribuídas em diversas regiões do mundo e são consideradas endêmicas em pelo
menos 88 países, dentre os quais 72 são países em desenvolvimento (DESJEUX, 1996). Estimase uma prevalência mundial de 12 milhões de casos e uma população com risco de infecção de
quase 350 milhões de indivíduos (WHO, 2002). O aumento crescente no número de casos de
leishmanioses é decorrente, em parte, de rápidas mudanças ambientais e do comportamento
humano observadas nos últimos anos e se relaciona com a atual situação sócio-econômica dos
países afetados (DESJEUX, 1996; WHO, 2002).
O impacto real das leishmanioses como um problema em saúde pública é considerado
subestimado (ASHFORD et al., 1991; DESJEUX, 1996). Enquanto a estimativa de ocorrência
mundial de leishmanioses está em torno de 1,5 a 2 milhões de novos casos por ano, apenas
aproximadamente 600.000 casos são registrados oficialmente. Em parte, isso se deve à falta de
obrigatoriedade de notificação, que ocorre em apenas 48 países dentre os 88 considerados
endêmicos (DESJEUX, 1996). Casos de doença não diagnosticados, muitas vezes pela falta de
acesso aos serviços de saúde, também contribuem para esta subestimativa.
As leishmanioses caracterizam-se pelo amplo espectro de manifestações clínicas
apresentadas pelos indivíduos em decorrência da infecção pelo parasito. As formas clínicas
apresentadas e a magnitude da doença são dependentes de muitos fatores, entre eles, a espécie do
parasito e a imunocompetência do hospedeiro. Comumente, a doença vem sendo dividida em 5
principais síndromes clínicas: a leishmaniose cutânea (LC), a leishmaniose cutânea difusa (LCD),
a leishmaniose mucocutânea (LMC), a leishmaniose visceral (LV) e a leishmaniose cutânea póskalazar (LCPK). Até o presente, pelo menos 20 espécies de Leishmania foram identificadas como
sendo agentes etiológicos de infecções em seres humanos (GRIMALDI et al., 1989; ASHFORD,
2000; DESJEUX, 2004).
23
A transmissão do parasito ocorre através da picada dos insetos vetores, flebotomíneos
pertencentes ao gênero Phlebotomus e Lutzomyia, encontrados no Velho e no Novo Mundo,
respectivamente (LAINSON et al., 1977). O parasito apresenta ciclo de vida digenético, o que
confere à Leishmania uma significante diversidade antigênica (FONG & CHANG, 1982;
CHANG & FONG, 1982; HANDMAN et al., 1984). No hospedeiro invertebrado, formas
promastigotas flageladas são encontradas no intestino médio de insetos fêmeas enquanto que, em
hospedeiros vertebrados, formas aflageladas e intracelulares obrigatórias, as amastigotas,
sobrevivem e replicam-se nos fagolissosomos de células do sistema fagocítico mononuclear
(BARD, 1989). O ciclo de transmissão se inicia quando fêmeas de flebotomíneos ingerem formas
amastigotas de Leishmania de um hospedeiro vertebrado infectado. Formas infectivas,
denominadas metacíclicas, diferenciam-se no trato digestivo do inseto vetor e são regurgitadas
intradermicamente no local da picada em novos hospedeiros durante novo repasto sangüíneo
(BARD, 1989; WALTERS et al., 1989a e b; WALTERS et al., 1993).
O ciclo de transmissão do parasito é geralmente zoonótico, mas pode apresentar-se como
antroponótico em focos restritos (DESJEUX, 1991 revisto em ASHFORD et al., 1996). A
infecção por Leishmania no ser humano é considerada incidental para a maior parte das espécies
e o homem assume o papel de hospedeiro secundário (DESJEUX, 1991; DEDET, 1992;
ASHFORD, 1996). No entanto, seres humanos infectados efetuam o papel de hospedeiro
reservatório, em casos como na leishmaniose cutânea causada por L. tropica e na doença visceral
por L. donovani, que ocorrem no Velho Mundo (DESJEUX, 1991; BERMAN, 2006). Os animais
considerados como hospedeiros reservatórios podem incluir roedores, canídeos e outros
mamíferos (ASHFORD, 1996). O cão doméstico, em muitos casos, é considerado também como
hospedeiro secundário, mas desempenha um papel importante como reservatório, contribuindo
para a manutenção do ciclo de transmissão de um dos agentes etiológicos de uma das formas
mais severas de leishmaniose, a leishmaniose visceral zoonótica (LVZ; DEANE & DEANE,
1954; ASHFORD, 1996).
24
2.2. Leishmaniose Visceral
2.2.1. Aspectos Epidemiológicos
A leishmaniose visceral, também conhecida como calazar na Ásia e na África, é causada
por parasitos do complexo Leishmania donovani, o qual compreende talvez três espécies,
Leishmania (Leishmania) donovani, Leishmania (L.) infantum, e Leishmania (L.) chagasi
(LAINSON et al., 1987). Posteriormente, avaliações fenotípicas e genotípicas dentro do
complexo L. donovani foram realizadas em diferentes níveis, bioquímicos e moleculares,
(MOMEN et al., 1987; RIOUX et al., 1990; CUPOLILLO et al., 1994; MAURÍCIO et al.1999;
MAURÍCIO et al., 2000). Os resultados das avaliações sugerem que as espécies L. infantum e L.
chagasi são indistinguíveis entre si e, por isso, alguns autores passaram a considerá-las como
sendo a mesma espécie e a utilizar os nomes como sinônimos. No transcorrer desta revisão, a
denominação L. infantum/chagasi será utilizada como referência para L. infantum e L. chagasi,
embora o nome L. infantum seja considerado o mais apropriado (MAURICIO et al., 2000;
DANTAS-TORRES, 2006a) uma vez que sua descrição em 1908, por NICOLLE, antecede a de
L. chagasi (CUNHA & CHAGAS, 1937).
A distribuição da LV no mundo é mais restrita quando comparada às outras formas de
leishmaniose. Em todo mundo, cerca de 90% dos casos são registrados em apenas cinco países,
sendo eles, Índia, Nepal, Sudão, Bangladesh e Brasil. Segundo a Organização Mundial da Saúde,
a incidência anual está em torno de 500.000 casos e mais de 200 milhões de indivíduos estão sob
risco de infecção (WHO, 2002). A taxa de mortalidade pode chegar a valores próximos ou
mesmo maiores que 10% do número de casos em tratamento, mesmo em regiões com baixa
incidência de LV, como no estado de São Paulo, assim como em outras regiões do Brasil
(JERÔNIMO et al., 1994; EVANS et al 1992; CVE, 2006).
No Brasil, a média anual de casos registrados entre os anos de 1994 e 2002 foi de 3.156
casos, com uma incidência de dois casos a cada 100.000 habitantes. Na última década,
aproximadamente noventa por cento (90%) dos casos de LV foram registrados na região
Nordeste do país, acometendo principalmente os estados da Bahia, Maranhão, Ceará e Piauí. No
entanto, esta situação vem se modificando. O número de casos registrados na Região Nordeste,
no período entre os anos de 2000 e 2002, apresentou uma redução percentual para setenta e sete
25
por cento, o que não resulta propriamente em um controle regional, visto que, neste mesmo
período ocorreu uma expansão territorial da doença, com surtos ocorridos em outras áreas, como
Rio de Janeiro - RJ, Belo Horizonte - MG, Araçatuba - SP, Santarém - PA e Corumbá – MS
(BRASIL, 2003).
Vários são os fatores que contribuem para o avanço da LV no Brasil e no mundo. As
transformações ambientais, as quais incluem fatores eco-epidemiológicos e sócio-econômicos,
aparecem como uma das principais causas (DESJEUX, 1996). Estas transformações têm sido
provocadas por processos migratórios humanos mais intensos, desmatamento de florestas nativas,
crescimento desordenado das cidades e consequentemente baixas condições econômicas e sociais
da população. Além disso, outros fatores podem alterar a susceptibilidade do hospedeiro, como as
mudanças na resposta imune em indivíduos infectados com o vírus da imunodeficiência adquirida
humana (HIV) (BRASIL, 2003; DESJEUX, 1996; GUERRA, 2004; ALVAR et al., 1997).
Na LVZ o cão doméstico participa da manutenção do ciclo de transmissão do parasito,
atuando como hospedeiro reservatório de fundamental importância (DEANE & DEANE, 1954;
LAINSON & SHAW, 1987; MARZOCHI et al. 1994; VIEIRA & COELHO, 1998; MORENO &
ALVAR, 2002). A LV canina chega a apresentar quase 12% de incidência anual, como registrado
recentemente no município de Jequié, no nordeste da Bahia (MOREIRA et al., 2003). Uma alta
taxa de cães infectados tem sido encontrada em regiões endêmicas para LV humana, com valores
que variam em torno de 40%, a depender do teste utilizado para avaliação, seja pela pesquisa de
anticorpos específicos ou por análise microscópica da presença do parasito em culturas (EVANS
et al., 1992; VIEIRA & COELHO, 1998; CORTADA et al., 2004; DANTAS-TORRES, 2006b).
Com a introdução de técnicas mais sensíveis, como a detecção de DNA por PCR, um número
maior de animais infectados, mesmo sem qualquer sinal da doença, pode ser encontrado, com
taxas de positividade de até 80% (ASHFORD et al., 1995; BERRAHAL, et al., 1996;
QUINNELL, et al., 2001; CORTES et al., 2004). Estes valores reforçam a LV canina como
sendo um grave problema em Saúde Pública, uma vez que tanto animais sintomáticos como
assintomáticos podem participar do ciclo de transmissão para o inseto vetor (ABRANCHES et
al., 1991; VEXENAT et al., 1993).
26
2.2.2. Aspectos Clínicos da Leishmaniose Visceral
Em Seres Humanos
A infecção por L. infantum/chagasi em humanos não necessariamente resulta em
manifestações clínicas, uma vez que existe diferença de susceptibilidade entre os insivíduos. Isso
ocorre, em parte, na dependência de fatores genéticos, status imunológico e comprometimento
nutricional de cada indivíduo (CERF et al., 1987; GRADONI & GRAMICIA, 1994). Assim, a
infecção pode resultar em casos assintomáticos ou oligossintomáticos (BADARÓ et al., 1986a;
GAMA et al., 2004) que podem evoluir para cura clínica espontaneamente ou para a doença
plenamente manifesta, a chamada forma clássica da doença.
Na forma clássica da doença, seja em crianças, jovens ou adultos, as manifestações
clínicas são: por febre irregular, palidez discreta e letargia, sendo o estado geral do paciente
preservado. Na medida em que a doença evolui, outros sinais e sintomas são comumente
encontrados, como por exemplo, hepatoesplenomegalia, perda de peso e anorexia, que variam de
grau moderado a acentuado, seguidos por sintomas ou sinais menos frequentes como
sangramentos espontâneos, icterícia e edema (HO et al., 1982; EVANS et al., 1985; de BEER et
al., 1991). Dados laboratoriais geralmente indicam um grau elevado de pancitopenia (anemia,
plaquetopenia e leucopenia), hipoalbuminemia e hipergamaglobulinemia. Infecções secundárias
pulmonares (broncopneumonias) em pacientes hospitalizados levam ao agravamento dos casos e
contribuem para a mortalidade. O óbito, que ocorre frequentemente em crianças menores de 5
anos e em indivíduos com idade avançada, está associado a carga parasitária elevada, anemia
profunda, excessiva perda de massa corporal e distúrbios digestivos com episódios de vômitos
durante o curso de tratamento (SEAMAN et al., 1996).
O tratamento da LV humana é realizado mais comumente com antimoniais pentavalentes.
Apesar de existirem duas diferentes formulações no mercado, apenas o antimoniato de N-metil
glucamina, o Glucantime, está disponível em nosso país, e é a droga de primeira escolha para o
tratamento da LV humana. O surgimento de resistência a este medicamento já foi relatado em
algumas regiões do mundo, como na Índia e no Sudão (JACKSON et al., 1990; GROGL et al.,
1992), mas, no Brasil, não existe nenhuma documentação acerca da presença de cepas de L.
infantum/chagasi resistentes in vitro. No Brasil, o medicamento é distribuído pelo Ministério da
Saúde, com recomendações cautelosas sobre as dosagens e tempo de tratamento utilizado
27
(BRASIL, 2003). Alternativamente o tratamento pode ser realizado com drogas como a
anfotericina B e a miltefosina, mas o uso dessas drogas é recomendado apenas em casos
especiais, como reincidivas (SUNDAR et al., 2002). Em geral, pacientes com LV respondem
bem ao tratamento com Glucantime e desenvolvem cura clínica com aparente resistência à
reinfecções (PAMPIGLIONE et al., 1975; BADARÓ et al., 1986).
Em Cães
Cães infectados com L. infantum/chagasi apresentam um amplo espectro de
manifestações clínicas. Animais infectados podem apresentar-se como assintomáticos,
oligossintomáticos ou polissintomáticos (MANCIANTI et al., 1988; ABRANCHES et al., 1991;
OLIVEIRA et al., 1993; PINELLI et al., 1994). A intensidade do parasitismo em cães pode estar
diretamente associada à gravidade do quadro clínico (BARROUIN-MELO, et al., 2004; REIS et
al., 2006).
Os sinais típicos de LV canina compreendem lesões cutâneas (80 %) - alopecia
generalizada ou localizada, descamação, eczema em focinho e orelhas, pelos opacos, ulcerações
nas orelhas, focinho, cauda e articulações; perda de peso e do apetite; linfoadenopatia localizada
ou generalizada; onicogrifose e lesões oculares (73 %); anemia; diarréia crônica; coriza e edema
das patas. Em casos avançados, são relatados: falência renal, apatia e sonolência intensas,
neuralgia, poliartrite, polimiosite, rachaduras nos cochins plantares, úlceras interdigitais e lesões
ósseas (ALMEIDA et al., 2005).
Há várias alterações bioquímicas e hematológicas em cães infectados naturalmente ou
experimentalmente com L. infantum/chagasi, algumas das quais podem estar correlacionadas ao
estado clínico do animal (REIS et al., 2006). Os achados laboratoriais incluem anemia
normocítica/normocrômica e aumento dos níveis de proteínas totais do soro, com
hipergamaglobulinemia marcante (CIARAMELLA et al., 1997; ALMEIDA et al., 2005).
No Brasil, até o presente momento não há recomendação de tratamento para LV canina
[SÃO PAULO (ESTADO) – nota técnica do MS]. As tentativas realizadas com drogas
tradicionalmente utilizadas para o tratamento de casos humanos apresentam baixa eficácia
(MANCIANTI et al., 1988; GRAMICCIA et al., 1992; BANETH & SHAW, 2002). Em muitos
casos, melhora clínica e redução do parasitismo são observados. No entanto, o tratamento é
incapaz de promover cura clínica persistente e eliminar a infectividade do cão para o inseto vetor
28
(MOLINA et al.1994, FERRER et al. 1995). Além disso, devido à ineficácia do tratamento em
cães com as drogas utilizadas para o tratamento humano, existe a possibilidade de seleção de
cepas resistentes de L. infantum/chagasi (JACKSON et al., 1990; GROGL et al., 1992; LIRA et
al., 1999; ABDO et al., 2003).
2.2.3. A Resposta Imune na Leishmaniose Visceral
Aspectos Gerais da Imunidade na Leishmaniose
Considerando-se que as Leishmania sp. são parasitas intracelulares obrigatórios em seus
hospedeiros vertebrados, a imunidade mediada por células é o principal mecanismo de defesa do
organismo, particularmente pela ação de macrófagos ativados por citocinas derivadas de células
auxiliadoras do tipo Th1. No entanto, uma resposta imune com estas características depende,
dentre outros fatores, da resposta imune inicial, seguindo-se a interação do patógeno com as
células do hospedeiro, o que pode resultar no controle ou no estabelecimento da infecção (revisto
em MULLER, 1989).
Em uma fase bastante inicial, a capacidade de um microorganismo se multiplicar no
interior de células fagocíticas pode ser, em parte, controlada geneticamente. Estudos em
camundongos mostram a participação de um gene envolvido no controle da multiplicação
parasitária, o Scl11A1 (CROKER et al., 1984; VIDAL et al., 1995). Este gene codifica uma
proteína transmembrana, altamente depende de pH, presente na superfície lissosomal, que
participa do fluxo de cátions divalentes contra um gradiente de prótons e regula a homeostase de
íons metálicos (ferro, manganês e zinco) em células de origem macrofágica/monocítica. Estudos
funcionais com Scl11A1 murino implicam seu envolvimento na ativação de macrófagos,
incluindo regulação de citocinas e quimiocinas, proteínas do complexo principal de
histocompatibilidade II (MHC classe II) e indução de óxido nítrico síntase (iNOS) (BARTON et
al., 1995; JABADO et al., 2000). Polimorfismos presentes neste gene afetam diretamente a
resistência inata do hospedeiro à infecções intracelulares. Estudos recentes em leishmaniose
visceral humana e canina, apontam para a existência de polimorfismos no gene Scl11A1 tanto no
homem como no cão, ressaltando a potencial importância de características genéticas na
susceptibilidade ou resistência à infecção na leishmaniose visceral (ALTET, 2002; MOHAMED
et al., 2004; SANCHEZ-ROBERT et al., 2005).
29
Fatores genéticos têm sido implicados com susceptibilidade ou resistência a leishmaniose
visceral não apenas na resposta imune inicial, no controle da infecção, mas também no
desenvolvimento de uma resposta imune adquirida, podendo influenciar no progresso da infecção
e no aparecimento de doença visceral propriamente dita. Neste caso, alterações funcionais em
genes que codificam proteínas relacionadas ao sistema imune, principalmente relacionados ao
complexo principal de histocompatibilidade, estariam envolvidos, mas há dados controversos em
seres humanos e ainda escassos para análise em cães (QUINNEL et al., 2003). No modelo
murino de leishmaniose visceral, genes relacionados ao MHC controlam a susceptibilidade à L.
infantum e L. donovani (BLACKWEL et al., 1980; LECLERCQ et al., 1996) e uma mutação
específica na cadeia I-A beta do MHC classe II está associada à resistência a infecção por L.
donovani (SEN & ROY, 1998). Em seres humanos, um estudo da freqüência de antígenos HLA
de classe 1 em associação à leishmaniose visceral mostrou uma associação significante apenas de
um antígeno, o HLA-A26, e prevalência em indivíduos doentes no Irã (FAGHIRI et al., 1995),
enquanto que outros estudos não apresentam qualquer associação entre alelos HLA e
susceptibilidade à leishmaniose visceral humana (MEDDEB-GARNAOUI et al. 2001;
PEACOCK et al. 2002; SINGH et al., 1997).
Já nos primeiros estágios da infecção, protozoários do gênero Leishmania são capazes de
evadir-se às barreiras imunes naturais do organismo. Alterações na constituição de proteínas na
superfície de formas infectantes de Leishmania permitem ao parasito escapar à lise mediada pelo
complemento. Exemplo disso é a super-expressão de gp63 (glicoproteína) e de longas moléculas
de LPG (lipofosfoglicanos), observada durante o desenvolvimento de promastigotas procíclicas
em promastigotas metacíclicas, ainda no interior do tubo digestivo do inseto vetor, previne a
inserção do complexo lítico C5b-C9 (MAC – complexo de ataque a membrana) na superfície do
parasito (PUNTES et al., 1990; BRITTINGHAM et al., 1995). Já no interior da célula, estas
moléculas agem impedindo a maturação do fagossomo e inibindo a ação de enzimas líticas,
presentes no lissosomo (DESJARDINS et al., 1997; DERMINE et al.,2000). Outros mecanismos
envolvem a inibição das vias de sinalização celular, a inibição da produção de óxido nítrico e de
citocinas (DESCOTEAUX, 1992; MOORE, 1993; REINER et al., 1994; PROUDFOOT, 1995;
CARRERA et al., 1996). Percebe-se que o parasita evoluiu de maneira a explorar o sistema
imune do próprio hospedeiro, modulando-o e proporcionando um ambiente favorável para o
30
estabelecimento da infecção. O desequilíbrio da relação parasita-hospedeiro seria a causa tanto da
eliminação da infecção, quanto do processo patogênico nas leishmanioses.
Leishmaniose Visceral Humana
A leishmaniose visceral humana caracteriza-se por uma deficiência da resposta imune
mediada por célula específica para a Leishmania. Neste contexto, observam-se uma diminuição
de resposta de células T, proliferação e citotoxicidade, com ausência da produção de citocinas do
tipo Th1, como interferon-gama (IFN-γ), interleucina (IL)-2 e IL-12. Indivíduos com
leishmaniose visceral, em sua forma clássica, não apresentam reatividade em resposta ao teste de
Montenegro, o qual mede uma resposta de hipersensibilidade tardia a antígenos de Leishmania
injetados na pele (HALDAR et al., 1983; HO et al., 1983; SARAN et al., 1991). Da mesma
forma, em ensaios in vitro, células do sangue periférico de indivíduos doentes são incapazes de
proliferar ou produzir IFN-γ em resposta a antígenos específicos (CARVALHO et al., 1981;
HALDAR et al., 1983; HO et al., 1983; NEOGY et al., 1988). Já o perfil imunológico observado
na maioria dos pacientes infectados assintomáticos caracteriza-se por apresentar a capacidade
linfoproliferativa e de produção de IFN-γ mantidos frente a exposição in vitro a antígenos
específicos (CARVALHO et al., 1992; HOLADAY et al., 1993a). A imunodeficiência específica
observada em indivíduos com leishmaniose visceral é revertida após tratamento terapêutico, com
o aparecimento da capacidade proliferativa, produção de citocinas do tipo Th1 e resposta positiva
ao teste intradérmico de Montenegro em um período que varia de 2 a 20 semanas (CARVALHO
et al., 1981; HALDAR et al., 1983; HO et al., 1983; HOLADAY et al., 1993).
O controle e a proteção na leishmaniose visceral é, em geral, dependente da produção de
IFN-γ, que, entre outras funções, ativa a capacidade microbicida de macrófagos infectados e
aumenta a expressão de MHC classe I e MHC classe II em células fagocíticas, regulando a
diferenciação e expansão de populações de linfócitos Th1 CD4+ e T CD8+ antígeno-específicos
(MURRAY et al., 1983a; MURRAY et al., 1983b). Dessa forma, a incapacidade de células de
indivíduos doentes em proliferar frente ao estímulo específico e de produzir IFN-γ implica
diretamente no aumento da carga parasitária e nos processos patológicos observados na
leishmaniose visceral humana. Vários são os fatores que regulam a produção de IFN-γ na
31
leishmaniose visceral, mas as citocinas IL-12 e IL-10 têm papel fundamental neste controle
(BACELLAR et al., 2000).
A interleucina 12 (IL-12) é um potente indutor de resposta celular do tipo Th1, agindo
como fator estimulador de células natural killer (NK) e fator de maturação de linfócitos T
citotóxicos e Th1, desempenhando um importante papel na indução da produção de IFN-γ por
células T e NK (KOBAYASHI et al., 1989). A IL-12 é produzida por macrófagos, monócitos,
neutrófilos e células dentríticas e, em menor escala, por linfócitos B, mediante estímulos
inflamatórios gerados por bactérias, parasitos intracelulares e fungos (TRINCHIERI et al., 2003).
Na leishmaniose visceral humana, células do sangue periférico de indivíduos na fase ativa da
doença não são capazes de produzir IL-12, subunidade p40, após estímulo in vitro com lisado de
L. donovani, mas essa produção é observada em indivíduos curados (GHALIB et al., 1995).
Além disso, a adição de IL-12 recombinante em cultura de células de indivíduos com
leishmaniose visceral induz a produção de IFN-γ e a capacidade proliferativa destas células ao
estímulo por antígenos de Leishmania, ao passo que, sua neutralização, com anticorpos
específicos anti-IL-12, em cultura de células do sangue periférico de indivíduos assintomáticos,
inibe estes mesmos efeitos do estímulo antigênico (GHALIB et al., 1995; BACELLAR et al.,
1996; BACELLAR et al., 2000).
Fatores imunossupressores que atuam em células de indivíduos com leishmaniose visceral
humana estão presentes tanto em nível celular quanto no soro de indivíduos doentes. Foi
demonstrado inicialmente, em um co-cultivo de células de um mesmo indivíduo, obtidas antes e
após o tratamento quimioterápico, que a capacidade de responder a antígenos de Leishmania,
restaurada após o tratamento, podia ser inibida na presença de células obtidas antes do tratamento
(CILLARI et al., 1988; CARVALHO et al., 1989). Dentre estes fatores estão células
imunossupressoras (T TCR γ-δ+ CD4+, T CD8+ e T CD4-CD8-), as citocinas IL-4, IL-6, IL-10 e
IL-13 e receptores solúveis de IL-4 e de IL-2 (ZWINGENBERGER et al., 1990; BARRALNETTO et al., 1991; SANG et al., 1999; BABALOO et al., 2001).
A IL-10 foi inicialmente caracterizada como uma citocina produzida por células do tipo
Th2 (FIORENTINO et al., 1989). Posteriormente foi observado que sua produção ocorre em
diversos tipos celulares, inclusive por macrófagos (MOSMANN & MOORE, 1991; WILLIANS
et al., 1996; PROBST et al., 1997). Esta citocina desempenha um papel central na patogênese da
leishmaniose visceral, especialmente pela regulação negativa da resposta imune do tipo Th1,
32
predominante nos casos de resistência e cura da infecção (GHALIB et al., 1993; HOLADAY et
al., 1993b). Estas afirmações são suportadas pelas observações das funções supressoras de IL-10
exercidas sobre macrófagos, desativação e inibição das atividades leishmanicidas e supressão da
produção de IFN-γ (GAZINELLI et al., 1992).
A participação de IL-10 na leishmaniose visceral humana foi inicialmente observada a
partir da expressão de RNA mensageiro, em amostras obtidas de aspirado de linfonodo e baço de
indivíduos na fase ativa da doença, em pacientes do Sudão e da Índia (GHALIB et al., 1993;
KARP et al., 1993). Ainda nestes dois trabalhos, a análise da expressão de RNA mensageiros que
codificam IL-10 e IFN-γ, demonstrou a co-existência destas duas citocinas no tecido, o que
implicaria na supressão, mediada por IL-10, das funções macrofágicas induzidas por IFN-γ. A
produção de RNA mensageiro que codifica IL-10 e a liberação desta citocina no sobrenadante de
cultura de células também é induzida em células mononucleares do sangue periférico de
indivíduos com leishmaniose visceral quando estimuladas com antígeno de L. donovani ou L.
infantum/chagasi, respectivamente (GHALIB et al., 1993; HOLADAY et al., 1993b). Neste
mesmo contexto, ocorre ausência de proliferação e liberação de IFN-γ no sobrenadante das
culturas. Assim, a presença de IL-10, mais que a ausência de IFN-γ, seria um fator que
beneficiaria a progressão da infecção para a doença ativa. O uso de IL-10 humana recombinante
ou a sua neutralização com anticorpos monoclonais específicos resultam, in vitro, na modulação
negativa ou positiva, respectivamente, da capacidade de células mononucleares do sangue
periférico de indivíduos com leishmaniose visceral ativa, tratados ou assintomáticos, em
responder frente ao estímulo com antígenos específicos (GHALIB et al., 1993; HOLADAY et
al., 1993b; CARVALHO et al, 1994; GHALIB et al., 1995; BACELLAR et al., 2000).
A participação de IL-4 na imunosupressão e, consequentemente, na patogenicidade da
leishmaniose visceral humana ainda é questionável. Esta citocina, embora presente no soro de
indivíduos doentes (ZWINGENBERGER et al., 1990) está ausente ou é detectável em
quantidades muito baixas após em cultivo celular após estímulo específico e a neutralização de
sua atividade não implica na reversão da imunodepressão característica da leishmaniose visceral
humana (CARVALHO et al., 1994; BACELLAR et al., 2000). Apesar disso, quando a
neutralização de IL-4 ocorre simultaneamente com a de IL-10, com o uso de anticorpos
monoclonais específicos para cada uma das citocinas, o efeito de indução da capacidade
linfoproliferativa e de produção de IFN-γ ocorre sinergisticamente, mostrando o envolvimento de
33
IL-4 na modulação da resposta imune induzida na leishmaniose visceral humana (CARVALHO
et al., 1994).
A resposta imune humoral na leishmaniose visceral humana caracteriza-se pela ativação
policlonal de linfócitos B, com produção de altas concentrações de anticorpos e de complexosimune no soro (BEHFOROUZ et al., 1983; GALVÃO-CASTRO et al., 1984). Títulos elevados
de anticorpos específicos parecem estar relacionados mais à patogênese da doença, como uma
disfunção imunológica, que à proteção propriamente dita. Em seres humanos, a presença de
anticorpos correlaciona-se a alta parasitemia e esta produção é controlada seguindo-se ao
tratamento (MILES et al., 2005).
Leishmaniose Visceral Canina
A resposta imune na leishmaniose visceral canina assemelha-se em muitos aspectos à
resposta induzida na leishmaniose visceral humana. A resposta imune específica mediada por
células, quando presente, é capaz de controlar a infecção e, assim, os animais podem permanecer
sem qualquer sinal da doença (PINELLI et al., 1994). De fato, o desenvolvimento de sinais na
leishmaniose visceral canina está associado a mudanças imunológicas que envolvem a supressão
da imunidade celular, como a ausência de resposta linfoproliferativa a antígenos de Leishmania
de LUNA et al., 1999; MORENO et al., 1999), incapacidade de produção de IFN-γ e de IL-2
(SANTOS-GOMES et al., 2002), além de uma diminuição no número de células T no sangue
periférico de animais naturalmente infectados, predominantemente de células T CD4+
(BOURDOISEAU et al., 1997; MORENO et al., 1999).
Os mecanismos efetores implicados na resistência e no controle da infecção por L.
donovani e L. infantum/chagasi no cão são dependentes do estabelecimento de uma resposta
específica de células Th1, com elevada produção de IFN-γ, IL-2 e TNF-alfa (PINELLI et al.,
1994; PINELLI et al., 1995). O desenvolvimento deste tipo de resposta celular no cão também
está associado à ação de IL-12 (OKANO et al., 1997; SALDARRIAGA et al., 2006). O papel da
IL-12 na indução e manutenção de uma resposta Th1 na leishmaniose visceral canina têm sido
recentemente investigado. Células de sangue periférico de cães com leishmaniose visceral ativa
respondem ao tratamento in vitro com esta citocina pelo aumento na expressão de RNA
mensageiro para IFN-γ e pela detecção desta citocina no sobrenadante de cultura de células (dos
SANTOS et al., 2004; STRAUSS-AYALI, 2005). Além disso, a produção de IFN-γ induzida por
34
IL-12, na presença de antígenos de Leishmania, ocorre com maior intensidade, o que sugere que
seu uso como agente imunoterápico é factível (STRAUSS-AYALI, 2005).
O envolvimento de citocinas produzidas por células Th2 na susceptibilidade à
leishmaniose visceral canina ainda não está esclarecido. Os dados implicam para a existência de
uma resposta mista Th1/Th2, mesmo em cães assintomáticos, embora IFN-γ e IL-2 predominem
nesta situação (SANTOS-GOMES et al., 2002; CHAMIZO et al., 2005). No entanto, comumente
observa-se a expressão de RNA mensageiro para IL-10 e IL-4 em células derivadas de animais
com sinais clínicos de leishmaniose visceral, após estimulação inespecífica com mitógenos ou
com antígenos de Leishmania (PINELLI et al., 1999; QUINNELL et al., 2001). Entretanto, em
cães experimentalmente infectados por L. infantum, a expressão de RNA para IL-10 não têm sido
geralmente detectada, ocorrendo apenas excepcionalmente em períodos mais tardios de infecção
(SANTOS-GOMES et al., 2002; RAFATI et al., 2005).
Em relação à resposta imune humoral na leishmaniose visceral canina, assim como em
seres humanos, está claro que infecções sintomáticas estão associadas à produção elevada de
anticorpos específicos IgG, IgE e IgA (INIESTIA et al., 2005; REIS et al., 2006). Entretanto,
apesar de um grande número de publicações na área de investigação da cinética e distribuição das
subclasses de imunoglobulinas G, seguindo-se às infecções natural ou experimental em cães, não
há um padrão consistente que aponte para um predomínio de subclasses diferentes de
imunoglobulinas associado ao desenvolvimento ou não de sintomas (DEPLAZES et al., 1995;
BOURDOUISEAU et al., 1997; LEANDRO et al., 2001; REIS et al., 2006).
Leishmaniose Visceral Experimental – O Modelo Murino
A maior parte do que se sabe hoje sobre os mecanismos envolvidos na estimulação e
manutenção da resposta imune nas leishmanioses é derivado de estudos realizados em
camundongos. No entanto, a infecção experimental de camundongos de diversas linhagens, seja
com L. donovani ou L. infantum/chagasi, não reproduz o curso fatal da infecção, a exemplo do
que ocorre na leishmaniose visceral humana e canina (KAYE, 2004). Ao contrário, no modelo
murino de leishmaniose visceral experimental, mesmo animais geneticamente susceptíveis à
infecção são capazes de controlar o parasitismo nos diferentes órgãos afetados (WILSON et al.,
35
1996). Assim, este padrão de controle assemelha-se a infecção subclínica observada em alguns
indíviduos das espécies humana e canina (OLIVEIRA et al., 1993; BADARÓ et al., 1996).
O crescimento parasitário diferencial, no fígado e no baço, observada após infecção
murina com L donovani ou L. infantum/chagasi é uma característica marcante da leishmaniose
visceral experimental e não depende da via nem da forma parasitária utilizada (AHMED et al.,
2003). No fígado ocorre uma multiplicação rápida do parasito durante as quatro primeiras
semanas após a infecção, com posterior resolução espontânea por volta da oitava semana. Por
outro lado, no baço e na medula óssea, o que se observa é que a replicação do parasito se inicia
em um momento mais tardio e permanece em níveis baixos durante toda a vida do animal
(WILSON et al., 1996; MELBY et al., 1998).
O desenvolvimento de imunidade mediada por células é necessária para o controle da
infecção por L donovani ou L. infantum/chagasi e, neste contexto, células T são fundamentais
(SKOV et al., 1974; REZAI et al., 1980; MURRAY et al., 1987). A participação tanto de células
T CD4+ como de células T CD8+ foi demonstrada em experimentos em que anticorpos
neutralizadores anti-CD4 e anti-CD8 foram utilizados (STERN et al., 1988). Estas células
participam principalmente pela produção de fatores solúveis que medeiam as ações ativadoras
e/ou imunossupressoras de diversas outras células. A célula T CD4+ é a principal produtora de
IFN-γ (STERN et al., 1988). No entanto, clones de células T CD8+ se desenvolvem no baço de
animais infectados e, além de exibir atividade citotóxica in vitro contra antígenos de L. donovani,
produzem RNA mensageiro para IFN-γ, TNF-α e quimiocinas C-C (TZAGOSIS et al., 2003).
A formação de granulomas no fígado coincide com o início da resolução da infecção neste
órgão, a qual também coincide com a produção de IFN-γ (SQUIRES et al., 1989). Na fase inicial
de replicação do parasito, a produção de IFN-γ é inibida, pelo menos em parte, por TGF-β
(WILSON et al., 1998). Interessantemente, IFN-γ é produzido, em cultura, por esplenócitos de
animais infectados e, no entanto, os parasitos sobrevivem no baço (MELBY et al., 2001).
No modelo murino de leishmaniose visceral experimental, ao contrário do que se observa
na leishmaniose cutânea, não há uma dicotomia clara de células do tipo Th1 e Th2, associadas à
resistência e proteção ou à susceptibilidade, respectivamente. Seja no fígado ou no baço, as
citocinas IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10 são produzidas concomitantemente (KAYE et al., 1991;
MIRALLES et al., 1994; WILSON et al., 1996; MELBY et al., 2001). Assim, a relação entre
resistência ou susceptibilidade e produção de citocinas não está completamente definida. De
36
qualquer forma, assim como ocorre em seres humanos, a IL-10, mais do que IL-4, parece estar
envolvida na progressão da doença (MURRAY et al., 2002) e, junto com TGF-β, pode contribuir
para a supressão da produção de IFN-γ (WILSON et al., 1998). Por outro lado, a produção de IL12, direta ou indiretamente, pela indução da produção de IFN-γ, está associada ao controle da
infecção (MELBY et al., 2001).
O tipo e a intensidade de resposta imune humoral específica e o controle da infecção
experimental por Leishmania em camundongos apresentam clara correlação. Em um trabalho
recente foi demonstrado que, o tamanho da lesão causada por L. major, em camundongos
BALB/c normais e deficientes de imunoglobulina, foi modulada na dependência da existência ou
não de anticorpos específicos contra Leishmania, com um aumento considerável no tamanho da
lesão quando anticorpos estavam presentes (MILES et al., 2005). No entanto, a produção de
anticorpos específicos de subclasses distintas está relacionada à citocinas produzidas por células
tipo Th1 ou Th2. Assim, elevação na produção de IgG1 e IgE é fortemente regulada por IL-4,
enquanto que, a produção de anticorpos IgG2a é regulada por citocinas produzidas por células
TCD4+ tipo Th1, como IFN-γ (HEINZEL et al., 1989). Estas subclasses estão frequentemente
presentes no soro dos animais durante a progressão ou controle da infecção, respectivamente.
Dessa forma, a produção e avaliação de anticorpos na leishmaniose murina deve ser considerada
com cautela.
2.3. O Controle da Leishmaniose Visceral
As medidas para o controle da leishmaniose visceral, preconizadas pela Organização
Mundial de Saúde e adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil, envolvem: (i) vigilância
epidemiológica, tanto para seres humanos como para cães, para que se possa realizar o
diagnóstico precoce e o tratamento adequado de casos humanos da doença e a eliminação de cães
identificados como infectados; (ii) combate ao inseto vetor através do uso de inseticida e (iii)
atividades em educação em saúde (BRASIL, 2006). Estas medidas têm se mostrado pouco
efetivas no controle da leishmaniose visceral zoonótica, em parte pela falta de integração entre as
estratégias utilizadas. Além disso, tais medidas são frequentemente descontinuadas, devido ao
alto custo e laboriosidade de execução (TESH, 1995; COURTENAY et al., 2002).
37
Dentre as medidas aplicadas ao controle da leishmaniose visceral, a contribuição efetiva
da eliminação de cães domésticos infectados e animais errantes de áreas endêmicas, tem sido
bastante questionada (DIETZE et al., 1997; ASHFORD, et al. 1998). Alguns fatores estão
relacionados ao insucesso desta medida, como a baixa sensibilidade dos métodos diagnósticos
empregados (EVANS et al., 1990; ASHFORD et al., 1995; BERRAHAL et al., 1996) e o longo
intervalo de tempo entre a realização dos testes e a remoção dos animais (BRAGA et al., 1998).
Uma medida alternativa para o controle da leishmaniose visceral zoonótica seria a
prevenção da infecção canina e/ou da transmissão do parasito do cão para o inseto vetor. Assim, a
imunoprofilaxia contra a leishmaniose visceral, obtida pelo uso de uma vacina efetiva para uso
canino, culminaria, provavelmente, com a redução da incidência de LV humana (TESH, 1995;
DYE, 1996; MORENO & ALVAR, 2002). A busca de imunógenos potenciais, candidatos a
vacina, tem se mostrado bastante promissora e tem resultado em diversos trabalhos nesta área,
tanto no modelo murino de leishmaniose visceral como também, em estágios mais avançados, em
cães experimentalmente infectados.
2.3.1. O Desenvolvimento de Vacinas
Apesar do extenso número de publicações acerca de avaliações de moléculas candidatas a
vacina a imunoprofilaxia contra as leishmanioses ainda é um desafio. Até o presente, apenas um
esquema de vacinação profilática contra a leishmaniose cutânea está em prática no Uzbequistão,
o qual faz uso de um processo antigo de indução de resposta imune protetora, conhecido como
“leishmanização” (GAFUROV, 1999; revisto em KHAMESIPOUR et al., 2006). Nesta vacina,
uma mistura de promastigotas virulentas de L. major, vivas e mortas, isoladas a partir de uma
lesão ativa, é administrada em crianças em idade escolar meses antes do início do ciclo de
transmissão da doença. Apesar de eficaz, este é um método que apresenta inúmeros riscos,
principalmente diante da atual situação frente a infecções por HIV.
Nenhuma vacina contra a leishmaniose visceral humana está em uso, em rotina, em
qualquer parte do mundo. Nas últimas décadas, várias moléculas, frações ou subunidades, têm
sido identificadas como potenciais candidatas a componentes de uma vacina contra leishmaniose
visceral a partir de avaliações em modelos experimentais (Tabela 1). A preparação que se
encontra em estágio mais avançado de investigação, inclusive já comercializada no Brasil, faz
uso de uma preparação com uma fração protéica denominada ligante de manose-fucose (FML),
38
purificada a partir de isolados de L. donovani (PALATNIK et al., 1994). Esta preparação,
proposta para uso em cães, já foi avaliada experimentalmente em diversos modelos e também em
um estudo de fase III, com cães naturalmente expostos à infecção (DA SILVA et al., 2000). No
entanto, diante de algumas incompreensões acerca da real efetividade desta vacina na eliminação
ou redução da transmissão do parasito do cão para seres humanos, e assim, sobre o controle da
leishmaniose visceral humana, o Ministério da Saúde do Brasil não autorizou seu uso como
medida de controle da leishmaniose visceral (BRASIL, 2003). Assim, novos experimentos foram
realizados na tentativa de solucionar esta questão (NOGUEIRA et al., 2005).
Diversos outros estudos de vacinação em cães foram realizados desde a última década.
Além de preparações com frações purificadas de Leishmania, como a descrito anteriormente,
tentativas do uso de parasitos mortos e antígenos recombinantes, em uma série de associações
com adjuvantes compatíveis com o uso em cães, foram feitas objetivando induzir uma resposta
imune protetora contra leishmaniose visceral canina (revisto em BARBIERI, 2006). O uso de
promastigotas de L. brasiliensis e de L. infantum, mortas pelo uso de mertiolate ou pelo calor e
associadas à BCG como adjuvante, apresentaram resultados promissores em avaliações de fase I
e de fase II (MAYRINK et al., 1996, MOHEBALI et al., 2004), mas avaliações de campo não
resultaram em proteção ou não foram ainda realizadas (GENARO et al., 1996).
A capacidade de indução de resposta imune protetora em cães tem sido observada também
para antígenos secretados em cultura de promastigotas de L. infantum, LiESAp, administrado em
associação ao adjuvante muramil dipeptídeo (MDP). Para esta combinação, uma eficácia
protetora de 100% foi registrada após infecção experimental e esta proteção foi correlacionada
com a indução de uma resposta imune específica tipo Th1, forte e duradoura (LEMERSE et al.,
2005). Uma publicação recente apresenta os resultados da avaliação desta preparação em cães
naturalmente expostos em uma área endêmica no sul da França, com uma taxa de proteção em
torno de 92% num período de dois anos de acompanhamento (LEMERSE et al., 2007). A
administração de preparações multicomponentes de antígenos recombinantes de L. infantum
(proteína Q + BCG) e de L. infantum/chagasi [TSA, LeIF e LmSTI1 em associação à
monofosforil lipídico (MPL)] resultou em alto índice de proteção (90%) contra infecção
experimental em cães e capacidade de indução de anticorpos de isotipo IgG2a, respectivamente
(MOLANO et al., 2003; FUGIWARA et al., 2005). Esta mesma preparação, quando avaliada em
campo, não resultou em proteção significativa dos animais (GRADONI et al., 2005). Vale
39
ressaltar também que, em estudos anteriores, a produção de anticorpos neutralizadores contra
proteínas de promastigotas de L. infantum em cães imunizados não resultou em proteção nos
animais vacinados (OGUNKOLADE et al., 1988; DUNAN et al., 1989), o que reforça a
associação entre resistência e imunidade mediada por células.
40
Tabela 1. Preparações antigênicas de moléculas candidatas a vacina, avaliadas no modelo murino
de leishmaniose visceral experimental.
Referência
1ª geração
STREIT et al., 2001
preparação
Resultado (redução carga parasitária e citocinas)
Infecção subclínica (injeção
cutânea alta dose) promastigotas
vivas L. chagasi
fígado (75%)
Produção de IFN-γ, IL-4 e IL-10
Não induz TGF-β
BRETON et al.,2005
L. tarentolae promastigotas
vivas
fígado (80%) e baço (85%) - 30 dias após desafio
Produção de IFN-γ
IL-4 não detectável
Lcr1/Adjuvante de Freund
fígado (40%) e baço (37,5%)
proliferação e produção de IFN-γ (pt recomb. em células
animais infectados)
SANTOS et al., 1999
FML/rIL-12
FML/BCG
FML/saponina R ou Quil A
ou QS21
fígado – preparação FML/QS21 (79,2%)
Acs IgG1 = IgG2a (maioria)
DTHa em todas combinações exceto BCG, sendo
QS21 + elevado
IFN-γ apenas FML/QS21
FML/IL-12 - falha em reduzir carga parasitária
STAGER et al., 2000
rHASPB1
fígado e baço (até 90% após 80 dias infecção)
Resposta de Ac exclusivamente IgG1 com proliferação
celular e produção de IFN-γ preferencialmente por T CD8+
e ausência de IL-4
DOLE et al.,2000
rORFF/rBT1
81% (baço e fígado)
Títulos elevados de anticorpos específicos e proliferação de
esplenócitos.
PARAGUAI-DE-SOUZA
et al., 2001
gp36 purificada/saponina (R)
fígado (68,1%)
Produção de Ac específicos IgG1 e IgG2a
Proliferação células linfonodo e resposta de DTH
GHOSH et al., 2001a
rA2
fígado - 89%
Produção de Ac específicos IgG1 e IgG2a
Proliferação de esplenócitos e produção elevada de IFN-γ.
Animais imunizados e grupo controle apresentam produção
de IL-4 a níveis similares
TONUI et al., 2003
LPG + BCG
Induz resposta Th1 mas não protege
TEWARY et al., 2004a
rORFF/ODN*
fígado e baço (84%)
Produção anticorpos IgG1 e IgG2a
Proliferação celular e aumento produção de IFN-γ
sem alteração níveis IL-4 em relação aos controles
TEWARY et al., 2006
rORFF + pIL-12
82-83% fígado e no baço
Ac IgG1 e IgG2a específicos rORFF com proliferação celular,
predomínio de IFN-γ e baixa produção IL-4
ROSA et al., 2007
rLIRIC1 e LIRIC2
baço 50,4% para LiRic1 e 66,9% para LiRic2
Induz proliferação celular e IFN-γ.
Diminuição produção IL-10 e IL-4 após estímulo in vitro.
Forte participação células T CD4+
2ª geração
WILSON et al., 1995d
continuação
41
Referência
preparação
Resultado (redução carga parasitária e citocinas)
MELBY et al., 2000
“biblioteca” de cDNA
amastigota
baço até 1000x - 4 semanas após o desafio
Produção de IFN-γ elevada
Produção de IL-4 e IL-10 não detectadas
GHOSH et al., 2001b
A2 DNA
65% fígado
Produção de Ac específicos IgG1 e IgG2a
Proliferação celular e produção de IFN-γ.
Produção de IL-4 não difere dos controles.
MARQUES-DA-SILVA
et al., 2005
TEWARY et al., 2005
p36 (LACK) DNA
Não houve proteção no fígado e no baço
Produção concomitante de IFN-γ e IL-10
fígado e baço (DNA e DNA/pt) em torno de 75-80%
Ac IgG2a > IgG1,
proliferação celular e produção de IFN-γ
IL-4 produção mínima
AGUILAR-BE et al., 2005
rNH36/saponina
NH36-DNA
fígado: 79% (NH36/sap) e 88% (NH36-DNA)
Ac específicos IgG1 e IgG2a. (fraca)
Reação de DTH e aumento de 2-5x T CD4+
produtoras de IFN-γ (NH36-DNA)
DONDJI et al.,2005
LACK-DNA primer
LACK-Vaccinia virus booster
baço (9-30x), fígado (6-9x), linfonodo (144-244x).
Produção de IFN-γ, TNF-alfa e IL-10
(IFN-γ > IL-10)
RAFATI et al., 2006
cpa-DNA/cpb-DNA primer (2x)
seguido por rCPA e rCPB
booster
(Montanide 720 e ODN)
fígado e baço (proteção completa)
Predomínio Ac IgG2a
Produção de IFN-γ e IL-5
CARTER et al., 2007
γ-GCS DNA
fígado (44%)
Ac IgG1 e IgG2a
Produção de IFN-γ similar aos controles
3ª. geração
a
rORFF/alum
ORFF-DNA
ORFF-DNA primer /
rORFF/alum booster
DTH – reação de hipersensibilidade do tipo tardia
ODN – oligonucleotídeos CpG não-metilados
b
Vacinas de DNA Contra Leishmaniose Visceral
A imunização com moléculas de DNA capazes de expressar proteínas recombinantes in
vivo é uma tecnologia recente que vem sendo amplamente avaliada como ferramenta para induzir
a prevenção ou para o tratamento de doenças infecciosas (WAHREN, 1996; ALARCON et al.,
1999). De um modo geral, neste sistema, os cDNAs de antígenos candidatos à vacina são
clonados em vetores de expressão, apropriados para células de mamíferos, que utilizam a
maquinaria da célula hospedeira necessária para a expressão do gene ou do fragmento do gene de
interesse. Estes vetores podem ser injetados diretamente na pele ou no músculo e, rapidamente,
são internalizados pelas células locais, onde, após translocação para o núcleo, ocorre a transcrição
42
do RNA mensageiro e, posteriormente, a produção da proteína recombinante (WOLFF &
BUDKER, 2005). Assim, após processamento por células apresentadoras de antígenos e
apresentação via moléculas do MHC, na dependência das características imunogênicas da
proteína, ocorre a indução de uma resposta imune específica (TANG et al., 1992).
A magnitude e o perfil da resposta imune induzida após injeção de DNA plasmideal são
dependentes de fatores relacionados ao antígeno produzido, a características específicas do vetor
carreador do gene, e, ainda, da via de administração utilizada. Estudos baseados em avaliação das
subclasses de anticorpos e padrão de citocinas têm demonstrado que a resposta imune induzida
após injeção intramuscular com DNA plasmideal é preferencialmente do tipo Th1. Este perfil de
resposta
imune
foi
observado,
inicialmente,
em
camundongos
imunizados
com
plasmídeocodificando a proteína β-galactosidase, nos quais ocorre uma produção acentuada de
anticorpos de isotipo IgG2a e secreção de IFN-γ por células T CD4+, mas não a secreção de IL-4
ou IL-5. Um padrão inverso, com produção de anticorpos de isotipo IgG1 e secreção de citocinas
tipo Th2, foi encontrado quando a mesma proteína foi administrada em salina ou hidróxido de
alumínio como adjuvante (RAZ et al., 1996). Credita-se a capacidade imunoestimulatória da
injeção com DNA a sequências repetitivas de nucleotídeos presentes na molécula de plasmídeo.
Estas sequências consistem de dinucleotídeos não-metilados de citosina-fosfato-guanosina (CpG)
que podem diretamente estimular células do sistema imune (HALPERN et al., 1996; KLINMAN
et al., 1997; LECLERC et al., 1997).
O primeiro estudo em que foi feita a avaliação de um candidato a vacina sob a forma de
DNA contra leishmaniose foi publicado há pouco mais de 10 anos (XU & LIEW, 1994). Neste
trabalho foi registrado que a injeção intramuscular de um plasmídeo, capaz de expressar em
células eucarióticas o gene gp63, induziu uma forte resposta imune tipo Th1 em camundongos,
assim como, uma significante proteção contra infecção por L. major. Subseqüentemente, vários
foram os relatos de moléculas candidatas a vacina contra leishmaniose cutânea administradas sob
a forma de DNA (GURUNATHAN et al., 1997; SJOLANDER et al., 1998; RAFATI et al.,
2001; MENDEZ et al., 2001; SEREZANI et al., 2002; DUMONTEIL et al., 2003; IBORRA et
al., 2003; CAMPBEL et al., 2003). A mesma abordagem, para avaliação de moléculas candidatas
a uma vacina contra a leishmaniose visceral, tem sido recentemente explorada (Tabela 1).
As proteínas recombinantes A2 (amastigote-specific), ORFF (open read frame F), NH36
(nucleoside hidrolase 36) e CPA/CPB (cisteína proteases), produzidas in vivo após injeção de
43
plasmídeos recombinantes, foram capazes de induzir a produção de anticorpos específicos de
isotipo IgG2a, proliferação celular e produção de IFN-γ em camundongos BALB/c,
características típicas de uma resposta imune predominantemente do tipo Th1. A resposta obtida
para cada uma destas proteínas foi associada a diversos níveis de proteção contra a infecção,
tanto no fígado como no baço dos animais desafiados (GHOSH et al., 2001; SUKUMARAN et
al., 2003; AGUILAR-BE et al., 2005; RAFATI et al., 2006). Há apenas três relatos na literatura
onde a injeção com plasmídeo recombinante não foi capaz de induzir proteção contra
Leishmania. Dois destes registros mostram que a administração de proteína LACK sob a forma
de DNA apesar de altamente imunogênica, com perfil claro de resposta imune tipo Th1, não
conferiu proteção em camundongos BALB/c, quer seja contra L. donovani ou L.
infantum/chagasi (MELBY et al., 2001; MARQUES-DA-SILVA et al., 2005), apesar de sua
eficácia no controle de lesões cutâneas induzidas por L. major (GURUNATHAN et al., 1997). O
terceiro registro é de um caso em que uma resposta imune tipo Th2, induzida pela proteína Meta
1, não pode ser revertida para Th1 mesmo quando a injeção com plasmídeo recombinante foi
utilizada (SEREZANI et al., 2002).
Até o presente, pelo menos três avaliações de possíveis candidatos a componentes de uma
vacina de DNA contra a leishmaniose visceral foram realizadas no modelo canino de infecção
experimental. Uma preparação com 10 diferentes cDNAs (H2A, H2B, H1, H3, H4, p36 – LACK,
PSA-2, TSA, STI1 e ARP-1) de L. donovani, todos sob a forma de plasmídeo, foram utilizados
em um protocolo de imunização e posterior desafio com L. donovani (SALDARRIAGA et al.,
2006). Nos outros dois estudos foram avaliados protocolos de imunização heteróloga, nos quais a
primeira injeção foi realizada com plasmídeos capazes de codificar a proteína LACK ou as
cisteínas proteínases CPA e CPB de L. infantum/chagasi e, posteriomente, um reforço feito com
o vírus vaccinia capaz de expressar a proteína LACK e a administração das cisteínas proteínases
recombinantes, respectivamente. (RAMIRO et al., 2003; RAFATI et al., 2005).
O protocolo de administração de LACK-DNA (plasmídeo seguido de vírus vaccinia), e
posterior desafio com L. infantum/chagasi, conferiu proteção em 60% dos animais vacinados,
acompanhados durante um período de 17 meses (RAMIRO et al., 2003). Proteção contra o
desafio com L. infantum, em cães, também foi observada após imunização com DNAcodificando
cisteínas proteínases seguido de reforço com as proteínas recombinantes. Neste estudo, células
mononucleares de sangue periférico de animais imunizados apresentaram uma capacidade
44
proliferativa específica e produção de RNA mensageiro para IFN-γ elevada quando comparados
aos animais do grupo controle não vacinados. Também o perfil da produção de anticorpos e a
capacidade de responder ao teste intradérmico de Montenegro foram diferentes entre os grupos,
com aumento de IgG2a e reação positiva no grupo imunizado. Além disso, após o desafio com L.
infantum/chagasi, parasitos foram identificados apenas em material da medula óssea do grupo
controle não imunizado (RAFATI et al, 2005). Uma resposta imune com as características
descritas acima, também foi observada após a administração da preparação multicomponente em
cães (SALDARRIAGA et al., 2006). Neste estudo, o controle da multiplicação do parasito nos
linfonodos drenantes ocorreu, nos animais imunizados, após o desafio por L. infantum/chagasi
logo na fase inicial da infecção, mas não foi capaz de impedir a disseminação para outros órgãos.
Avaliações de fase III para preparações baseadas em imunização com DNA plasmideal não foram
realizadas até o momento.
Dentre as várias estratégias utilizadas para identificação de antígenos com potencial para
uso em uma vacina, a busca por antígenos que ocorrem no estágio intracelular de Leishmania é
freqüentemente utilizada (WILSON et al., 1995; MELBY et al., 2000; MARTINS et al., 2006).
A forma amastigota das diversas espécies de Leishmania é a que persiste no interior de células do
sistema monofagocítico do hospedeiro vertebrado. Dessa maneira, uma resposta imune protetora
deve ser induzida para antígenos expressos neste estágio (McMAHON-PRATT et al., 1998).
Assim, nosso grupo de pesquisa confeccionou uma biblioteca de cDNA de formas amastigotas de
L. chagasi e, diferentemente de outros grupos, os antígenos identificados nesta biblioteca foram
selecionados a partir do uso de um pool de soro de cães infectados obtidos de uma área endêmica
para leishmaniose visceral (TEIXEIRA et al., 2007). Estes animais apresentavam além de
resposta imune humoral, resposta celular com DTH positivo para antígenos de L.
infantum/chagasi. Dessa forma, apenas antígenos naturalmente reconhecidos pelo sistema imune
canino foram selecionados.
Considerando-se que uma vacina canina efetiva contra a leishmaniose visceral deve, em
princípio, ser capaz de induzir uma resposta imune predominantemente celular do tipo Th1, a
identificação de antígenos, adjuvantes e/ou métodos de imunização que propiciem uma resposta
com estas características deve ser o alvo para a obtenção desta vacina. Como demonstrado em
experimentos anteriores, o uso de injeções de DNA tem levado a resultados bastante promissores
neste sentido (RAMIRO et al., 2003; RAFATI et al., 2005; SALDARRIAGA et al., 2006). Além
45
disso, a imunização com plasmídeo tem a vantagem de ser altamente estável, reprodutível e de
baixo custo. Estes fatores, somados à capacidade de indução de uma resposta imune protetora que
seja capaz de impedir e/ou controlar a infecção em cães e contribuir para a interrupção do ciclo
de transmissão do parasito para seres humanos, serão avaliados em uma vacina que venha
substituir os métodos atualmente empregados para o controle da leishmaniose visceral.
46
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Avaliar diferentes protocolos de imunização na indução de resposta imune, em
camundongos, a moléculas candidatas a componentes de uma vacina contra leishmaniose visceral
canina.
3.2. Objetivos específicos
1. Avaliar a capacidade de indução de resposta imune humoral e celular contra antígenos
recombinantes de L. chagasi, injetados em camundongos sob forma de plasmídeo,
isoladamente ou como uma combinação de plasmídeos ou, ainda, após injeção inicial com
DNA e reforço com a proteína recombinante correspondente, nos seguintes aspectos:
a) Produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1;
b) Resposta proliferativa de esplenócitos após estimulação específica in vitro;
c) Produção de citocinas (IFN-gama, IL-4 e IL-5) em sobrenadantes de
esplenócitos após estimulação específica in vitro.
2. Avaliar a capacidade de antígenos recombinantes de L. chagasi, administrados
isoladamente sob a forma de plasmídeo ou como uma combinação de plasmídeos, em
induzir proteção e/ou controle contra infecção homóloga em camundongos.
47
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Antígenos
4.1.1 Produção de extrato bruto de antígenos de Leishmania chagasi
A cepa de L. chagasi MHOM/BR2000/Merivaldo2 foi utilizada para a preparação de
extrato bruto de antígenos de Leishmania. Esta cepa foi isolada inicialmente, através de punção
esplênica, de um paciente com leishmaniose visceral de uma área endêmica do município de
Jequié-Bahia (PARANHOS-SILVA et al., 2001). A partir de isolamento e expansão, alíquotas de
formas promastigotas dessa cepa de L. chagasi foram armazenadas em nitrogênio líquido. A cepa
foi mantida em nosso laboratório através de cultivo em meio Schneider (Sigma-Aldrich, Saint
Louis, MO, EUA) ou de passagens sucessivas em hamsters. As infecções de hamsters foram
realizadas por injeção intraperitoneal de 1 x 107 formas de promastigotas de cultura ou de
suspensão de fragmentos macerados de baço ou fígado de um hamster previamente infectado.
A preparação de extrato bruto de antígenos de Leishmania foi iniciada a partir da
obtenção de formas promastigotas de L. chagasi. Para a obtenção de promastigotas, fragmento de
baço ou fígado de hamster infectado foi macerado e incubado em meio de cultura Schneider
Drosophila (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA Sigma-Aldrich, EUA), pH 7.2,
suplementado com 20% de soro bovino fetal inativado (SFB, Gibco, EUA), a temperatura de 24o
C, conforme método descrito por Paranhos-Silva e colaboradores (PARANHOS-SILVA et al.,
1996). Formas promastigotas geradas foram transferidas para frascos de cultura e submetidas a
passagens sucessivas em volumes de cultura cada vez maiores. Volumes de meio de cultura com
Leishmania na fase logarítmica ou na fase estacionária de multiplicação foram misturados de
modo a originar uma suspensão com proporção de 30% e 70% de parasitos da primeira e da
última fase, respectivamente, conforme descrito previamente (RODRIGUES, 2004). A suspensão
resultante foi centrifugada a 500 x g, a 4oC, por 10 minutos. Em seguida, os parasitos foram
lavados três vezes com salina tamponada com fosfato, pH 7,2 (PBS, NaCl a 137 mM, KCl a 2,68
mM, Na2HPO4 a 9,58 mM e NaK2PO4 a 1,47 mM). O sedimento obtido após a última lavagem
contendo 12,75 x 1010 promastigotas foi ressuspenso para a concentração de 7,5 X 109 parasitos
48
por mL, em 17 mL de PBS, pH 7.2, com inibidores enzimáticos para inibir proteólise, nas
seguintes concentrações finais: antipaína a 5 µg/mL, fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) a 1
mM, pepstatina A a 5 µg/ml, L-trans-epoxisuccinil-L-leucilamino-4-guanidinobutano (E-64) a 8
µM, leupeptina a 5 µg/mL (Sigma-Aldrich). A suspensão foi submetida a sonicação com cinco
pulsos de 40 Hz, sobre gelo. Os pulsos foram realizados cada um com dez segundos de duração,
com intervalo de 60 segundos entre cada dois pulsos consecutivos, usando-se o aparelho
Ultrasonic Processor (PGC Scientifics, Gaithersburg, Maryland, EUA). Posteriormente, a
concentração protéica foi mensurada pelo método da fluorescamina, conforme método
previamente descrito (UDENFRIEND et al., 1972; BOHLEN et al., 1973). A partir daí, amostras
de 500 µL de extrato bruto de antígenos com concentração protéica de 18,28 mg/mL foram
submetidas à esterilização por irradiação gama e armazenadas a – 20°C. Para a esterilização,
tubos de microcentrifugação de 1,5 mL, com amostra de extrato bruto de antígenos, foram
colocados em um saco contendo gelo e expostos a 60.000 rads usando-se um irradiador gama
IBL Cs137 (CIS Bio International, Gif-Sur-Yvette Cedex, França).
A preparação de extrato bruto de antígenos de formas promastigotas de L. chagasi para
uso como antígeno na sensibilização de placas de microtitulação em ELISA foi realizada
essencialmente como descrita no parágrafo acima, com algumas modificações. Resumidamente,
formas promastigotas de L. chagasi, em fase estacionária, cultivadas por até sete passagens,
foram obtidas por centrifugação a 800 x g, por 10 minutos, à 4ºC. Em seguida, os parasitos foram
lavados três vezes em PBS, pH 7,2 por centrifugação e o sedimento final ressuspenso em 10 mL
de PBS, pH 7,2, foi sonicado, sobre o gelo, com cinco pulsos de 40 Hz (Ultrasonic Processor,
PGC Scientifics, Gaithersburg, Maryland, EUA). Os pulsos foram realizados com 45 segundos de
duração/pulso, com intervalo de 60 segundos entre cada dois pulsos consecutivos. A
determinação da concentração de proteína solubilizada de L. chagasi foi realizada pelo método de
Bradford (BRADFORD, 1976), comparando a densidade óptica desta com a de concentrações
conhecidas de albumina sérica bovina. A quantidade de antígeno, obtida a partir de 3 x 1010
promastigotas de L. chagasi foi de 97,5 mg, foi ressuspensa em um volume de 10 mL de solução
salina, resultando em uma concentração de 9,75 mg/mL. O extrato de antígenos foi aliquotado à 20º C até o momento do uso.
49
4.1.2 Produção de antígenos recombinantes de Leishmania chagasi
Em estudos prévios em nosso laboratório, uma biblioteca de DNA complementar (cDNA)
de formas amastigotas de L. chagasi (cepa MHOM/BR2000/Merivaldo2) foi confeccionada em
fago lambda (fago lambda ZAP Express, Stratagene, La Jolla, CA, EUA), visando à seleção e à
avaliação de antígenos protéicos recombinantes para o desenvolvimento de uma vacina, um
método imunoterápico e ensaios imunodiagnósticos para leishmaniose visceral humana e canina.
Clones de fagos recombinantes produzindo, em Escherichia coli, antígenos capazes de
reagir com anticorpos de uma mistura de soros de quatro cães naturalmente infectados por
Leishmania, que apresentavam resposta imune humoral e celular específicas, foram selecionados
e submetidos à excisão, seguindo-se recomendações da Stratagene, de modo a gerar clones
correspondentes de fagímideos, plasmídeos que exibem a seqüência COS de fago lambda
(TEIXEIRA et al., 2007). Quatro desses clones de plasmídeo foram denominados pBKCMVLc9, pBKCMV-Lc13, pBKCMV-Lc14 e pBKCMV-Lc18. A seqüência de DNA das
extremidades 5’ e 3’ de cada inserto desses clones foi determinada e o gene que codifica cada
polipeptídio foi identificado no genoma de Leishmania infantum do banco de dados do Instituto
Sanger (http://www.genedb.org/genedb/linfantum/), através de uma colaboração com o Dr.
Osvaldo Pompilio de Melo Neto do Departamento de Microbiologia do Centro de Pesquisas
Aggeu Magalhães (FIOCRUZ, Recife, PE). Posteriormente, parte dos insertos que codificam os
polipeptídeos Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 foi subclonado em plasmídeo pRSET (Invitrogen,
Carlsbad, California, EUA), gerando as construções pRSETB-Lc9, pRSETB-Lc13, pRSETALc14 e pRSETB-Lc18, respectivamente, capazes de promover super-expressão de cada um dos
polipeptídeos recombinantes na linhagem de Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Invitrogen). O
plasmídeo pRSET acrescenta, na extremidade amina do polipeptídio recombinante, uma
seqüência de seis histidinas.
Cultivo de E. coli e indução da produção de antígenos recombinantes
Para a produção de proteínas recombinantes de L. chagasi Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 em E.
coli, volumes de 2 litros a 10 litros de cultura de E. coli da cepa BL21(DE3)pLysS (Invitrogen)
transformada com cada uma das construções plasmidiais pRSETB-Lc9, pRSETB-Lc13,
pRSETA-Lc14 e pRSETB-Lc18, respectivamente, foram utilizados. Resumidamente, uma
50
colônia de cada bactéria transformada com pRSETB-Lc9, pRSETB-Lc13, pRSETA-Lc14 ou
pRSETB-Lc18 foi inoculada, separadamente, em um volume de 50 mL de meio de cultura LuriaBertani [caldo LB: 1% de bacto-triptona (HiMedia, Mumbai, Índia), 0,5% de extrato de levedura
(Isofar, Duque de Caxias – RJ), 1% de cloreto de sódio (Isofar), pH 7.0] com 50 µg/mL de
ampicilina (Sigma-Aldrich) e 35 µg/mL de cloranfenicol (Sigma-Aldrich), e cultivada a 37°C, em
uma incubadora orbital (Orbit Environ Shaker, Lab-Line, Seatlle, WA, EUA), sob agitação
constante a 250 rpm, por aproximadamente 16 horas para obtenção de um pré-inóculo. Após esse
período, a leitura de densidade óptica (D.O.) de cada pré-inóculo foi avaliada a 600 nm. O préinóculo de cada preparação foi utilizado para gerar grandes volumes de cultura, entre 2 a 5 litros
por preparação. Cada pré-inóculo foi diluído em meio de cultura LB sem antibióticos, de modo a
obter-se uma leitura de D.O. a 600 nm de valor próximo ou igual a 0,1. O volume final de cultivo
de cada bactéria foi preparado de acordo com a D.O. obtida de cada pré-inóculo. Frascos
Erlenmeyers de 1000 mL e de 2000 mL receberam um volume máximo de 200 mL e 400 mL da
cultura recém diluída, respectivamente, não ultrapassando portanto 20% da capacidade máxima
de cada frasco. As culturas bacterianas de cada frasco Erlenmeyer foram incubadas, a 37° C, sob
agitação constante a 250 rpm. Quando a medida da densidade óptica da cultura, avaliada a 600
nm, atingiu um valor entre 0,4 e 0,6, um volume de isopropil-thio-B-D-galactosídio (IPTG,
Invitrogen) preparado a 1M foi acrescentado para obter-se a concentração final de 0,25 mM nas
culturas de E. coli transformadas com as construções pRSETB-Lc9 ou pRSETA-Lc14 e
concentrações finais de 0,125 mM de IPTG para culturas de E. coli transformadas com as
construções pRSETB-Lc13 ou pRSETB-Lc18, com a finalidade de induzir a produção da
proteína recombinante. Estas concentrações foram determinadas em experimentos prévios nos
quais foram avaliados o pontos máximo de produção de cada uma das proteínas recombinantes a
partir de ensaios de dose-resposta e cinética de produção. Após a indução com IPTG, as culturas
de cada frasco Erlenmeyer foram incubadas por mais três horas nas condições indicadas acima. A
suspensão de bactéria de cada frasco foi centrifugada a 5.000 x g, a 4° C, por 15 minutos. Os
sedimentos de cada preparação, correspondentes a todo o volume de cada cultura, foram pesados
e armazenados a –20°C até o momento da purificação. Sedimentos obtidos a partir de alíquotas
de um mililitro da cultura de bactéria, coletadas antes e após três horas de indução com IPTG,
foram usadas para avaliação da produção da proteína recombinante.
51
Purificação de antígenos recombinantes de L. chagasi
As purificações de antígenos recombinantes foram realizadas separadamente para uso em
cultivo celular, para estímulo in vitro de esplenócitos murinos e para uso em ELISA, para
sensibilização de placas de microtitulação. As proteínas recombinantes purificadas e utilizadas
em cultivo celular foram gentilmente preparadas pelo Dr. Edmilson Domingos da Silva, de
Biomanguinhos, Instituto Fundação Osvaldo Cruz, RJ, utilizando-se três metodologias:
cromatografia de afinidade com metal imobilizado (como realizado em nosso laboratório), diálise
em G25 e troca Iônica (Poros HQ), seguindo-se as instruções dos fabricantes. As proteínas
recombinantes de Leishmania chagasi Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 utilizadas para ensaios de ELISA,
foram purificadas apenas usando-se colunas de cromatografia de afinidade preparadas com
Sepharose quelada por níquel (“Sepharose Chelating Sepharose Fast Flow”, Amersham
Biosciences Corp., New Jersey, EUA), como descrito posteriormente. Uma etapa prévia à
purificação das proteínas envolveu a lise bacteriana e obtenção de cada proteína recombinante
seja na forma solúvel ou sob a forma de corpúsculos de inclusão, na fração insolúvel da
preparação (SAMBROOK & RUSSEL, 2000).
Obtenção de proteínas solúveis ou sob a forma de corpúsculos de inclusão
Para a purificação de Lc9, sedimento bacteriano de 5 litros do cultivo de bactéria
[BL21(DE3)pLysS transformada com pRSETB-Lc9, pesando 8.5 g, dividido em quatro tubos de
polipropileno do tipo Falcon de 50 mL, foi descongelado a 4°C e ressuspenso em tampão de lise
(20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0), com auxílio de um agitador vórtex
(Labnet, Woodbridge, NJ) e reunidos em um só tubo. Para cada grama de sedimento foram
utilizados três mililitros de tampão de lise. Um miligrama de lisozima (Sigma) foi acrescentado
para cada mililitro da suspensão. Em seguida, o tubo foi incubado por 20 minutos sobre gelo.
Posteriormente, para auxiliar no processo de lise bacteriana, foram adicionados quatro
miligramas de ácido deoxicólico (Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany) para cada grama
do sedimento bacteriano original. O material foi, então, incubado a 37ºC, durante 15 minutos, em
banho-maria. Depois disso, visando à fragmentação de DNA genômico da bactéria, o conteúdo
do tubo foi sonicado sob o gelo. Foram aplicados quatro pulsos ultrassônicos com potência de
52
300 Watts (cada pulso teve 30 segundos duração e os intervalos entre cada dois pulsos
consecutivos foram de 10 segundos), usando-se um aparelho ultrasonicador (Sonifier Cell
Disruptor, Branson Sonic Power Company, Danbury, Connecticut, EUA). A suspensão resultante
foi centrifugada a 17.000 x g, a 4° C, por 15 minutos. O sobrenadante e o sedimento, esse último
depois de três lavagens com tampão de lise, foram separadamente transferidos para tubos Falcon
de 50 mL, os quais foram armazenados a -20ºC até o uso. Uma amostra do sobrenadante e outra
do sedimento, retiradas antes do armazenamento, foram analisadas através de gel de
poliacrilamida contendo dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE; LAEMMLI, 1970) para
determinar-se qual das duas frações exibia maior enriquecimento da proteína recombinante Lc9.
A análise revelou que a fração solúvel exibia cerca de 80 % da proteína Lc9 produzida em E. coli
(FRAGA, 2007).
As preparações de Lc13, Lc14 e Lc18, para posterior purificação em coluna de afinidade
por cromatografia, foram obtidas seguindo-se o procedimento descrito no parágrafo anterior, com
apenas pequenas modificações. Foram utilizados sedimentos bacterianos armazenados em tubos
tipo Falcon de 50 mL, equivalentes a volumes de cultura de 2,8 L, 10L e 2L litros do cultivo de
bactéria BL21(DE3)pLysS transformada com pRSETB-Lc13, pRSETA-Lc14 ou pRSETB-Lc18,
pesando 10,3 g, 14,37 g e 4,62 g, respectivamente. Após a lise bacteriana e etapas de
centrifugação, os sedimentos insolúveis de BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc13, BL21(DE3)pLysSpRSETA-Lc14 ou BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc18 foram ressuspensos com aproximadamente
30 mL, 29 mL e 20 mL de tampão de ligação com agente denaturante (20 mM Na2HPO4, 500
mM NaCl, 10 mM imidazol, 8M uréia, pH 8,0), respectivamente, e armazenados a -20ºC até o
momento de uso. Amostras do sobrenadante e dos sedimentos, retiradas antes do armazenamento,
foram analisadas através de SDS-PAGE para determinar-se qual das duas frações exibia maior
enriquecimento das proteínas recombinantes Lc13, Lc14 e L18. A análise revelou que a fração
insolúvel exibia maior concentração de cada uma das proteínas analisadas em relação a fração
solúvel.
Purificação em coluna de afinidade
Lc9
Um volume de 25 mL de proteínas da fração solúvel de bactéria BL21(DE3)pLysSpRSET-Lc9 foi aplicado, oito vezes, sobre uma coluna de 2 mL da resina Sepharose-níquel
53
(“Sepharose Chelating Sepharose Fast Flow”, Amersham Biosciences Corp., New Jersey, EUA),
preparada seguindo-se as recomendações do fabricante. Resumidamente, para preparação da
coluna, 2 mL de resina foram lavados três vezes com 10 mL de água destilada de cada vez e, em
seguida, expostos a um volume de 1,5 mL de NiSO4 (Merck, São Paulo, São Paulo, Brasil) a 100
mM, por 15 minutos. A resina foi então lavada mais três vezes com água destilada e equilibrada
com 10 mL de tampão de uma solução a 20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH
8,0 e depois transferida para o suporte da resina. Após drenagem do tampão de lise, foram
aplicados, em cada passagem, 3 mL da fração solúvel mencionada acima. Depois de 30 minutos,
o fluxo foi ajustado para permitir exposição das proteínas à resina por mais 30 minutos. A resina
foi lavada três vezes com 10 mL de solução Na2HPO4 a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a
31,25 mM, pH 8,0 (solução de lavagem) de cada vez e, em seguida, proteínas foram eluídas da
coluna com quatro lavagens de 4 mL de solução Na2HPO4 a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a
500 mM, pH 8,0 (solução de eluição) de cada vez. Amostras efluentes da coluna, obtidas após
aplicação das proteínas, durante a lavagem e durante a eluição, foram coletadas para análise por
SDS-PAGE, juntamente com o material inicialmente aplicado na coluna para avaliação do
processo de purificação da proteína recombinante. As frações cromatrográficaS exibindo Lc9
foram reunidas e submetidas à diálise contra PBS, pH 7.2, realizada em três banhos de 8 horas a
4° C. Após a diálise, a fração solúvel obtida após a centrifugação a 17000 g durante 15 minutos a
4° C, foi quantificada através do método da fluorescamina (Sigma-Aldrich) de determinação
protéica, e armazenadas, em PBS, a -20°C até o momento de uso. Algumas amostras, antes de
serem armazenadas, foram submetidas à esterilização por irradiação gama, como descrito
anteriormente, para uso posterior em ensaios celulares.
Lc13, Lc14 e Lc18
As proteínas recombinantes Lc13, Lc14 e Lc18 foram purificadas por cromatografia de
afinidade, como descrito para a purificação de Lc9, usando-se uma resina quelada com níquel,
exceto que, para estas purificações foi utilizado o método de centrifugação (“batch”) ao invés de
coluna, propriamente dita. Um volume de aproximadamente 1 mL, 29 mL e 20 mL de proteínas
da fração insolúvel de bactéria BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc13, BL21(DE3)pLysS-pRSETALc14 ou BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc18 foi utilizado para purificação, em tubos tipo Falcon de
54
15 mLcontendo 2 mL da resina de Sepharose carregada com níquel (“Sepharose Chelating
Sepharose Fast Flow”, Amersham Biosciences Corp., New Jersey, EUA), preparada seguindo-se
as recomendações do fabricante. As amostras foram incubadas durante 30 minutos, a temperatura
ambiente, sob agitação constante tipo end-over-end em agitador hematológico (Fisher Scientific,
EUA). Posteriormente, os tubos foram centrifugados a 500 x g, durante 5 minutos a 4oC. O
sobrenadante foi removido e armazenado para análise. A resina foi lavada três vezes com 10 mL
de tampão fosfato a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a 31,25 mM, uréia a 8 M, pH 8,0 (solução
de lavagem) de cada vez e, em seguida, proteínas foram eluídas da resina com quatro lavagens de
4 mL de tampão fosfato a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a 500 mM, uréia a 8 M, pH 8,0
(solução de eluição) de cada vez. As frações cromatrográficas das purificações de Lc13, Lc14 ou
Lc18 foram analisadas por SDS-PAGE, e submetidas à diálise contra PBS, pH 7.2, realizada em
três banhos de 8 horas a 4°C. Após a diálise, as frações insolúveis obtidas após a centrifugação a
17000 x g durante 15 minutos a 4° C, foram quantificadas através do método da fluorescamina
(Sigma-Aldrich) de determinação protéica e armazenadas, em PBS, a -20°C até o momento de
uso.
4.1.3 Obtenção de plasmídeos para imunização
Como descrito anteriormente, no item 4.1.2., uma biblioteca de cDNA de formas
amastigotas de L. chagasi foi confeccionada, por um dos pesquisadores do nosso laboratório,
tendo como um dos objetivos o desenvolvimento de uma vacina contra a leishmaniose visceral
canina, na qual antígenos protéicos recombinantes, provenientes desta biblioteca, seriam
utilizados. Clones da biblioteca de cDNA, que foi confeccionada em fago lambda (fago lambda
ZAP Express, Stratagene, La Jolla, CA, EUA), são capazes de gerar facilmente, por um processo
denominado de excisão, fagimídios (pBK-CMV). Tais fagimídios comportam-se como
plasmídeos e são capazes de levar a expressão de proteínas recombinantes tanto em células
procarióticas (E. coli) quanto em células eucarióticas (células de mamíferos). Dessa forma,
plasmídeos purificados podem ser utilizados diretamente para injeção de animais e avaliados
como vacinas de DNA pela análise da imunogenicidade de cada proteína recombinante produzida
in vivo. Quatro desses clones de plasmídeos denominados pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13,
pBKCMV-Lc14 e pBKCMV-Lc18 foram selecionados e obtidos para imunização de
camundongos BALB/c. Cada um destes plasmídeos é capaz de produzir in vivo a proteína
55
recombinante correspondente acrescida de uma seqüência de 32 aminoácidos de β-galactosidase,
devido à uma seqüência de nucleotídeos que codifica para B-galactosidase que antecede o sítio de
inserção do cDNA clonado. Por este motivo, pBK-CMV, sem inserto exógeno, foi purificado e
utilizado como controle negativo.
Purificação de plasmídeos pBK-CMV com insertos de antígenos recombinantes de L.
chagasi e de plasmídeocodificando IL-12 murina - pcDNA3.1-scmu-IL12
Para obtenção de plasmídeos pBKCMV-B-gal, pBKCMV-Lc9, pBKCMV-Lc13,
pBKCMV-Lc14, pBKCMV-Lc18 e pcDNA3.1-scmu-IL-12, usados para injeção dos animais,
foram utilizadas colunas de troca iônica (sílica-DEAE) para a purificação de DNA em média
escala (Qiagen Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA, EUA), seguindo-se as recomendações
do fabricante. Resumidamente, E. coli da linhagem TOP10, transformadas previamente com cada
uma das construções, pBKCMV-B-gal, pBKCMV-Lc9, pBKCMV-Lc13, pBKCMV-Lc14,
pBKCMV-Lc18 e pcDNA3.1-scmu-IL-12, foram semeadas, a partir de um estoque de bactéria
permanente armazenado a -70oC, em uma placa de meio de cultura LB-ágar (Gibco) com 50
µg/mL de kanamicina ou 50 µg/mL de ampicilina (para TOP10/pcDNA3.1-scmu-IL-12) e
cultivadas por 18 horas a 37oC. No dia posterior à preparação de cada placa, uma colônia de
TOP10 de cada um dos clones de plasmídeo foi inoculada em um tubo de vidro estéril de 50 mL
contendo 5 mL de meio de cultura LB (Gibco) com 50 µg/mL de kanamicina ou 50 µg/mL de
ampicilina e cultivada por 8 horas a 37oC sob agitação constante de 250 rpm. Em seguida, 4 mL
de cada pré-inóculo foi misturado a 2 litros de meio LB com 50 µg/mL de kanamicina ou 50
µg/mL de ampicilina resultando em uma diluição de 1:500. O volume total de cada cultura foi
redistribuído em 5 frascos Erlenmeyers de 2000 mL, sendo 400 mL de cultura em cada um. Cada
cultura foi incubada durante cerca de 18 horas a 37oC sob agitação constante de 250 rpm. O
sedimento bacteriano de cada cultura foi obtido após centrifugação a 6000 x g, por 15 minutos, a
4oC e armazenado a -20oC até o momento do uso.
Para obtenção dos plasmídeos em fase aquosa/solúvel para posterior passagem na coluna
de purificação foi realizada lise alcalina como recomendado pelo fabricante do kit de purificação.
Então, cada sedimento bacteriano de TOP10 transformada com pBKCMV, pBKCMV-Lc9,
pBKCMV-Lc13, pBKCMV-Lc14, pBKCMV-Lc18 ou pcDNA3.1-scmu-IL-12 foi ressuspenso
56
completamente com 200 mL de tampão P1 (50 mM Tris-Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA; 100 µg/mL
RNAse A) em um frasco Erlenmeyer de 1000 mL. Em seguida foram adicionados à suspensão
bacteriana 200 mL de solução P2 (200mM NaOH, 1% SDS) e, após agitação suave por inversão
de 4 a 6 vezes, incubados a temperatura ambiente por 5 minutos. Após este período de incubação
foram adicionados 200 mL de solução P3 (3M acetato de potássio, pH 5,5) seguido novamente de
agitação suave por inversão de 4 a 6 vezes seguida de incubação por 30 minutos no gelo. O lisado
bacteriano de cada preparação foi transferido para frascos de centrifugação (Beckman Coulter,
EUA) em volumes de aproximadamente 150 mL por frasco e centrifugados a 20.000 x g durante
30 minutos a 4o C. O sobrenadante foi removido, transferido para novos frascos e submetidos a
centrifugação de 20.000 x g por 15 minutos a a 4o C. Após esta última centrifugação, o
sobrenadante foi passado através de um filtro de pano de algodão para completa remoção de
partículas.
Cada coluna utilizada para purificação dos plasmídeos foi preparada seguindo-se as
instruções do fabricante. Resumidamente, 35 mL de tampão QBT (750mM NaCl; 50 mM MOPS,
pH7,0; 15% isopropanol; 0,15% Triton X-100) foi utilizado para equilibrar cada coluna. A
passagem de cada tampão pela coluna, assim como das amostras contendo plasmídeo, ocorreu
por fluxo gravitacional. Após a aplicação da amostra foram adicionados a cada coluna 200 mL de
tampão de lavagem QC (1M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7,0; 15% isopropanol). A eluição foi feita
com 35 mL de tampão QF (1,25 M NaCl, 50 mM Tris.Cl, pH 8,5; 15% de isopropanol). Cada
eluato foi armazenado em tubos Falcon de 50 mL a 4o C até o momento da precipitação do DNA.
Para a precipitação, foram adicionados 24,5 mL de isopropanol (Sigma, St Louis, EUA) para
cada eluato. Após agitação suave, o material foi centrifugado a 5000 x g durante 60 minutos a 4o
C. O sobrenadante da centrifugação foi descartado e cada sedimento obtido foi lavado com 3,5
mL de etanol 70% por centrifugação de 5000 x g durante 60 minutos a 4o C. Ao final, o
sedimento contendo DNA plasmideal foi ressuspenso com cerca de 1 mL de água Mili Q, para
armazenamento, ou solução salina [cloreto de sódio a 0,85 %, (Isofar)], para uso em injeções, e
solubilizado a 65o C por cerca de 30 a 60 minutos. A concentração de plasmídeo e a pureza do
material obtido foi determinada pela leitura de densidade óptica em filtro de 260 nm e 280 nm,
respectivamente, em aparelho espectrofotômetro Ultrospec. Cerca de 100 ng de cada plasmídeo
foi analisado em gel de agarose (Amersham Biosciences) a 1% corado com brometo de etídeo
(Sigma-Aldrich) a 0,5 µg/mL em tampão Tris-acetato-EDTA (TAE; 20 mM de Tris, 0,1% de
57
ácido acético e 1 mM de EDTA – pH 8,0) após eletropforese por 1 hora a 80V. Uma amostra de
marcadores de pares de bases (1 Kb DNA ladder; Invitrogen Corporation) também foi fracionado
no gel. A migração das bandas presentes no gel foi documentada pelo sistema Eagle Eye II
(Stratagene, La Jolla, CA, EUA). Os plasmídeos foram armazenados em alíquotas a -20 oC até o
uso.
4.2 Animais
Foram utilizados 180 camundongos da linhagem isogênica BALB/c, machos e fêmeas,
com idade entre 5 e 6 semanas, mantidos no biotério do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz
(CPqGM-FIOCRUZ-Salvador-Bahia). Os camundongos foram alojados em caixas de 30 x 19,5 x
12 cm, entre três e seis animais por caixa, durante todo o período do experimento, no biotério do
CPqGM, sob condições adequadas de temperatura (21oC ± 1o C) e de umidade (50 - 60%). Os
animais foram mantidos com alimentação (ração comercial BioBase, Base Química Prod. Quím.
Ltda., Brasil) e água ad libitum.
4.3 Imunização
Foram realizados três protocolos de imunização, nos quais plasmídeos (pBK-CMV-Lc9,
pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-14 e pBK-CMV-Lc18) foram (i) administrados isoladamente ou
como (ii) uma combinação (pool) de plasmídeos, associados ou não a plasmídeocodificando IL12 murina (pcDNA3.1-scmu-IL-12) ou ainda, (iii) um protocolo de imunização tipo DNA
primer/proteína booster, no qual pBK-CMV-Lc9 foi injetado nas duas primeiras injeções e
posterior reforço com Lc9 recombinante associada a saponina (ver Apêndice A). Para realização
das injeções foram formados cinco grupos de doze animais e um grupo de dezoito animais para o
protocolo (i), quatro grupos de doze animais e um grupo de dezoito animais para o protocolo (ii)
e seis grupos de seis animais para o protocolo (iii). Como grupos controles, os animais receberam
salina, pBK-CMV vazio, saponina ou Lc9 apenas. Foram realizadas três séries de injeções com
intervalos de 21 dias entre cada duas injeções consecutivas. Os animais receberam injeção
intramuscular, na região do quadríceps, de 50 µL de cada plasmídeo na concentração de 1 mg/mL
(50 µg/injeção) ou 50 µL de uma mistura em partes iguais de cada um, preparados na
concentração de 5 mg/mL (200 µg total/injeção ou 250 µg total/injeção quando associado a
58
pcDNA3.1-scmu-IL-12) e submetidos a eletroporação (ver Apêndice B; MIR et al., 1999;
LUCAS & HELLER, 2001). Um grupo de animais foi formado para receber a injeção de um pool
de plasmídeos sem serem submetidos a eletroporação. Os grupos controles foram injetados com
50 µL de salina ou 50µL de pBK-CMV vazio (50 ou 200 µg para os protocolos nos quais
plasmídeos foram administrados isoladamente ou como pool, respectivamente). Para a realização
de eletroporação, os animais foram previamente anestesiados com 100 mg/kg de quetamina
(Agribrands do Brasil Ltda, Paulínia, SP) e 15 mg/kg de xilazina (Bayer S.A., São Paulo, SP) por
via intraperitoneal. Imediatamente após as injeções anteriormente citadas, eletrodos do
eletroporador foram introduzidos na região muscular, em torno do local da injeção, e foram
aplicados cinco pulsos elétricos de 100 volts/cm, com duração de 20 milisegundos por pulso e
intervalo de um segundo entre cada dois pulsos consecutivos. O aparelho eletroporador utilizado
foi projetado e elaborado pelo prof. Dr. Yuri Pepe, do Departamento de Física, da Universidade
Federal da Bahia.
Quando a proteína recombinante purificada, Lc9, foi utilizada para avaliação em um
protocolo de imunização com injeção incial de DNA seguida de reforço com a proteína, a
preparação foi feita em salina/saponina de forma a obter-se uma mistura com concentração de 1
mg/mL de Lc9 e 1 mg/mL de saponina. Para realização deste protocolo de imunização foram
formados seis grupos. Os animais foram injetados com salina, saponina, pBK-CMV vazio, Lc9
associada a saponina, pBK-CMV-Lc9 ou, por fim, pBK-CMV-Lc9 (duas primeiras injeções) e
Lc9 associada a saponina (última injeção). Os animais do grupo Salina (50 µL) e dos grupos
injetados com plasmídeo (volume de 50 µL/50 µg de plasmídeo) receberam eletroporação no
músculo, na região do quadríceps, logo após as injeções, como descrito acima. Os grupos
Saponina (volume de 200 µL/100 µg de saponina) e Lc9 associada a saponina (volume de 200 µL
contendo 100 µg de saponina/100 µg de Lc9) receberam injeções por via subcutânea, na região
dos flancos, nos dias 0, 21 e 42 do experimento. Os animais do grupo previamente injetado com
pBK-CMV-Lc9 receberam uma injeção de Lc9 associada a saponina, por via subcutânea, apenas
na última série de injeções, dia 42 do experimento.
59
4.4. Infecção com Leishmania chagasi
Para avaliar a capacidade de os antígenos recombinantes Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 em
induzir resposta imune capaz de conferir proteção contra e/ou controle da infecção por L.
chagasi, camundongos BALB/c injetados com cada uma das proteínas recombinantes sob a
forma de DNA plasmideal, como citados em dois dos protocolos de imunização avaliados neste
trabalho, foram desafiados pela infecção com promastigotas de L. chagasi, cerca de três a quatro
semanas após a terceira série de injeções. Para obtenção de promastigotas, fragmento de fígado
de hamster infectado com L. chagasi MHOM/BR/2000/Merivaldo2, foi macerado em meio de
cultura Schneider (Sigma), com 20% de soro fetal bovino (Gibco) como previamente descrito no
item 4.1.1. O cultivo foi realizado em frasco de cultura de 25 cm2 (Corning, Nova Iorque, EUA) e
mantido a 26oC. Após a primeira passagem, iniciada com 5 x 106 promastigotas de L.
chagasi/mL, e mantida por aproximadamente quatro dias em cultivo, promastigotas foram
coletadas e lavadas três vezes com solução salina estéril. O sedimento obtido após a última
lavagem foi ressuspenso com 1 mL de salina estéril. Em seguida foi realizada contagem das
células em câmara de Neubawer e a concentração de promastigotas foi ajustada com salina para 1
x 108 parasitos/mL.
Para a infecção de camundongos, seis animais por grupo foram injetados, por via
intraperitoneal, com 1 x 107 parasitos em um volume de 100 µL. Os grupos experimentais foram
previamente injetados conforme descrito no item anterior. Como grupo controle sem infecção,
animais previamente injetados com salina foram injetados novamente apenas com 100 µL de
salina estéril por via intraperitoneal. A avaliação de carga parasitária no baço e a avaliação da
resposta imune humoral e celular de cada animal foi realizada entre 54-60 dias após a infecção.
4.5. Avaliação da resposta imune
4.5.1 Avaliação da resposta imune humoral
A avaliação da produção de anticorpos (IgG total ou subclasses IgG1 e IgG2a) antiLeishmania (extrato bruto de antígenos ou antígeno recombinante) foi realizada em amostras de
soro obtidas 10 dias após a terceira série de injeções e entre 54-60 dias após a infecção com L.
chagasi, realizando-se ensaios imunoenzimáticos em fase sólida (ELISAs).
60
Para obtenção de soros, amostra de sangue de cada animal, coletada pelo plexo retroorbitário após aplicação de uma gota de anestésico (cloridrato de proximetacaína a 0,5 %,
Anestalcon, Alcon Laboratórios do Brasil Ltda, São Paulo, SP) na mucosa ocular, foi incubada,
em tubo de microcentrifugação, a temperatura ambiente por 1 a 2 horas para permitir a
coagulação. Depois disso, os tubos foram centrifugados a 1500 x g e a temperatura ambiente, por
10 minutos. Após a transferência para novos tubos, as amostras de soro foram armazenadas a
-20° C até o momento de uso.
Mensuração de anticorpos da classe IgG por ELISA
Para avaliar a produção de anticorpos
específicos
da classe
IgG,
ensaios
imunoenzimáticos foram realizados em placas de microtitulação de poliestireno com 96 poços
(Cliniplate, Thermo Labsystems, Helsinki, Finlândia). Poços das placas de microtitulação foram
sensibilizados com 100 µL de Lc9 a 5 µg/mL, 100 µL de uma preparação de Lc13 a 1,5 µg/mL,
100 µL de Lc14 a 10 µg/mL, 100 µL de Lc18 a 1,5 µg/mL ou 100 µL de extrato bruto de
antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL, diluídos em tampão carbonato-bicarbonato de sódio a 0,1
M, pH 9.6, por 16 horas, a 4o C em câmara úmida. Após a sensibilização, os poços das placas
foram lavados quatro vezes com PBS. Em seguida, para bloquear sítios de ligação de proteína
não ocupados pelos antígenos, foram colocados 150 µL de leite desnatado (Itambé, Belo
Horizonte, Brasil) a 10% em PBS (m/v) em cada poço. As placas foram então incubadas por 1
hora, a temperatura ambiente, em câmara úmida. Os poços foram lavados três vezes com PBS
contendo 0,05% de Tween 20 (v/v, PBS-T, Sigma-Aldrich). Cem microlitros de cada amostra de
soro diluída foram colocados por poço e as placas foram incubadas por 1 hora, a temperatura
ambiente, em câmara úmida. As amostras de soros foram testadas em uma única diluição (1:100
ou 1:200), em duplicata, ou nas diluições de 1:200, 1:1000, 1:5000, 1:25000 e 1:125000 (para
avaliar amostras dos animais injetados com proteína recombinante ou a combinação de DNA
seguido de proteína) em PBS-T, com 10% de leite desnatado.
Como controles negativo e positivo do ensaio, foram usados soros de camundongos
BALB/c injetados com salina ou com a proteína recombinante Lc9 ou Lc13 emulsionadas em
adjuvante completo de Freund, obtidos em um experimento realizado previamente. Soro de
camundongos BALB/c injetados com plasmídeo pBKCMV-Lc14, obtidos em um experimento
piloto, foram utilizados como controle em ELISA para detecção de anticorpos anti-Lc14. Soro de
61
camundongos BALB/c infectados com L. chagasi (gentilmente cedido por uma pesquisadora de
nosso laboratório, Dra. Neuza Alcântara) foi utilizado como controle positivo de testes ELISA
para detecção de anticorpos anti-Lc18 e anti-L. chagasi. Após o período de incubação das
amostras, os poços das placas de microtitulação foram lavados três vezes com PBS-T. Cem
microlitros de anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo conjugado a peroxidase (SigmaAldrich) diluído a 1: 400 ou 1:4000 em PBS-T com 10 % de leite desnatado foram colocados por
poço e as placas foram incubadas por 1 hora, a temperatura ambiente, em câmara úmida. Os
poços foram lavados três vezes com PBS-T e a reação foi revelada pela adição de 150 µL do
substrato peróxido de hidrogênio na presença de tetrametilbenzidina (TMB; Sigma), por 15
minutos, a temperatura ambiente e ao abrigo de luz. O substrato foi preparado, em volume
suficiente para uma placa de 96 poços, pela mistura de 150 µL de TMB [10mg/mL em
dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma)], 2,91 mL de acetato de sódio 0,5 M (Sigma), 90µL de ácido
cítrico 0,5 M (Sigma), 12 mL de água destilada e 15µL de peróxido de hidrogênio 30% P.A.
(Isofar). A reação foi neutralizada com 50 µL de ácido sulfúrico a 4 M (Quimex, São Paulo,
Brasil) por poço. A leitura da densidade óptica a 450 nm foi realizada em espectrofotômetro
(Spectramax Precison Microplate Reader, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, EUA)
usando o programa de computação Softmax Pro versão 5.0 (Molecular Devices Corporation,
Sunnyvale, CA, EUA). Os resultados foram expressos individualmente e como média aritmética
de cada grupo.
Avaliação de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a por ELISA
A produção de anticorpos específicos das subclasses IgG1 ou IgG2a foi avaliada através
de
ensaios
imunoenzimáticos
realizados,
essencialmente,
conforme
descrito
acima.
Resumidamente, placas de microtitulação de 96 poços foram sensibilizadas com proteína
recombinante Lc9, Lc14 ou extrato bruto de L. chagasi. Após lavagem dos poços, bloqueio de
sítios inespecíficos com 200 µL de PBS contendo 10% de soro fetal bovino (PBS-SFB) e
lavagem novamente, os poços receberam 100 µL de amostras de soros diluídas a 1:500 ou 1:1000
(para ELISA anti-L. chagasi),1:3000 (para ELISA anti-Lc9 ou anti-Lc14 ) ou 1:350.000 (para
ELISA anti-Lc9 com amostras obtidas a partir da injeção de proteína Lc9 ou injeção inicial com
DNA seguida de reforço com Lc9) em PBS-SFB. Após incubação das placas e lavagem, os poços
62
receberam 100 µL de anticorpos de rato anti-IgG1 ou anti-IgG2a de camundongo conjugados a
biotina (BD Pharmingen, EUA) diluídos a 1:500 em PBS-SFB. As placas foram incubadas por
duas horas a temperatura ambiente e lavadas. Os poços receberam 100 µL de avidina conjugada a
peroxidase (Sigma-Aldrich) estocada a 1 mg/mL e diluída a 1:400. As placas foram incubadas
por 45 minutos, a temperatura ambiente e, em seguida, lavadas oito vezes. Os poços receberam
100 µL de substrato TMB por 15 minutos. A solução contendo substrato foi preparada pela
mistura de 1 mL de TMB a 1 mg/mL em DMSO, 9 mL de tampão citrato-fosfato a 0,05 M, pH
5.0 [fosfato de sódio dibásico 0,2 M (Isofar), ácido cítrico 0,1M (Sigma)] e 2 µL de peróxido de
hidrogênio 30% P.A (Isofar). Transcorridos 15 minutos, a reação enzimática foi interrompida
pela adição de 50 µL/poço de ácido fosfórico (Quimex) a 1:20 (v/v). Finalmente, foi realizada a
leitura da densidade óptica usando-se filtro de 450 nm.
4.5.2 Avaliação da resposta imune celular
A avaliação da resposta imune celular específica foi realizada entre três e quatro semanas
após a terceira série de injeção. Para os animais desafiados pela injeção de promastigotas de L.
chagasi, uma avaliação foi realizada entre 54-60 dias após a infecção. A resposta imune celular
foi avaliada através da mensuração da proliferação celular e produção de citocinas por células
esplênicas expostas a extrato bruto de antígenos de L. chagasi e aos antígenos recombinantes
Lc9, Lc14 e Lc18 in vitro.
Avaliação de proliferação celular
O baço de cada animal foi removido imediatamente após o sacrifício, em condições
assépticas, e transferido para uma placa de Petri de poliestireno (Corning Incorporated, Nova
Iorque, EUA) de 35 mm de diâmetro contendo 2 mL de meio 1640 do Instituto Rosewell Park
Memorial (RPMI 1640, Sigma-Aldrich) e gentamicina a 40 µg/mL (Sigma-Aldrich). Em seguida,
o baço foi macerado com auxílio de êmbolo de seringa (Injex, Indústrias Cirúrgicas LTDA,
Distrito Industrial Ourinhos, SP), gerando uma suspensão celular. Cada suspensão foi submetida
a centrifugação a 100 x g, por 15 segundos. O sobrenadante foi coletado e transferido para um
novo tubo e, posteriormente, centrifugado a 450 x g, por 10 minutos, a 4ºC. Cada sedimento
celular foi ressuspenso em 2 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal
63
[(v/v), SFB, Gibco BRL Life Technologies], 2 mM L-glutamina (Sigma-Aldrich) e 0,01 mM 2mercaptoetanol (Sigma-Aldrich; RPMI suplementado). A partir daí, uma amostra de cada
suspensão celular foi diluída a 1:10 em azul de tripan a 0,4% (Sigma-Aldrich) e a concentração
de células foi determinada, usando-se uma câmara de Newbauer (Boeco). Para isso, foram
contadas pelo menos 100 células de cada suspensão. A concentração de células de cada
suspensão foi ajustada para 3 x 106/mL, usando-se meio RMPI suplementado. As células foram
cultivadas em placas de microtitulação de 96 poços, de poliestireno, de fundo chato, apropriadas
para cultura celular (Costar Corning Inc., Nova Iorque, EUA). Um volume de 100 µL, com 3 x
105 células, de cada suspensão de células foi aplicado por poço, em triplicata, para cada animal e
para cada uma das avaliações realizadas. Para determinação do nível basal de proliferação
(controle negativo, em três e cinco dias de cultivo) e adequação das condições de cultura para
proliferação celular (controle positivo de ensaio), respectivamente, foram acrescentados 100 µL
de meio RMPI suplementado ou 100 µL de concanavalina A (Con A, Sigma-Aldrich) a 4 µg/mL
de meio suplementado, em triplicata, para cada animal. Para avaliação de proliferação
conseqüente a estímulo específico, foram adicionados, em triplicata, para cada animal, 100 µL de
extrato bruto de antígenos de L. chagasi diluído a 20 µg/mL ou 100 µL de cada uma das
proteínas recombinantes, Lc9, Lc13, Lc14 ou Lc18 diluídas a 20 µg/mL (para avaliação após as
três séries de injeção) e 0,2 µg/mL, 2 µg/mL ou 20 µg/mL de meio suplementado (para avaliação
realizada após a infecção). As placas de microtitulação foram incubadas a 37º C, em atmosfera
úmida com CO2 a 5% (v/v). Após incubação por três dias, para placas onde células foram
incubadas com Con A, e de cinco dias, para placas onde células foram incubadas com antígenos,
30 µL de RPMI suplementado contendo 1 µCi de timidina[H]3+ (Amersham Biosciences,
Uppsalla, Suécia) foram acrescentados a cada poço. As placas foram incubadas por mais 18 horas
nas mesmas condições anteriores e, depois disso, foram mantidas a -20º C até a coleta das
células. As células foram coletadas em papel de filtro de fibra de vidro (Packard Canberra
Company, Meriden, EUA) e partículas beta emitidas durante o período de um minuto (cpm)
foram determinadas por um contador beta modelo Matrix 9600 (Packard Canberra Company). Os
resultados foram expressos em índice de proliferação (média aritmética de cpm de triplicatas nas
quais células foram estimuladas com Con A ou antígenos dividida pela média aritmética de cpm
de triplicatas nas quais as células foram cultivadas somente com meio de cultura suplementado).
64
Avaliação da produção de citocinas por ELISA
Para a mensuração da produção de citocinas (IFN-γ, IL– 4 e IL-5) esplenócitos foram
cultivados em placas de 24 poços, de poliestireno, de fundo chato, apropriadas para cultura
celular (Costar Corning Inc.). Para isso, um volume de 300 µL de suspensão de esplenócitos de
cada animal na concentração de 3 x 106/mL, cuja obtenção foi descrita acima, foi colocado em
cada um de sete poços de uma placa (para os grupos injetados com salina ou pBK-CMV vazio do
protocolo de imunização no qual plasmídeos foram (i) administrados isoladamente e para todos
os grupos do protocolo de imunização no qual uma (ii) mistura de plasmídeos foi utilizada), em
cada um de quatro poços de uma placa [demais grupos do protocolo (i)] e em cada um seis poços
de uma placa (para os grupos de animais do protocolo de imunização do tipo DNA
primer/proteína booster). Em seguida, em cada um dos poços, foram acrescentados 300 µL de
RMPI suplementado, 300 µL de concanavalina A [4 µg/mL ou 1,5 µg/mL para células de
animais utilizados no protocolo de imunização (iii)], 300 µL de antígeno bruto de L. chagasi [20
µg/mL, apenas para o células de animais utilizados no protocolo de imunização (i) e (ii), 300 µL
de Lc9 a 20 µg/mL ( para todos os grupos experimentais) e 300 µL de Lc14 ou Lc18 a 20 µg/mL
[para os grupos experimentais utilizados nos protocolos de imunização (i) e (ii)]. As células
foram incubadas durante 48 horas em estufa a 37º C, em atmosfera úmida com 5% CO2. Após
este período, o sobrenadante de cada poço foi coletado em tubos para microcentrífuga de 1,5 mL
e centrifugado a 280 x g, durante 5 minutos, à temperatura ambiente, para a remoção de células e
estocado a -20º C, até o momento do uso.
ELISA para quantificação de IFN-γγ, IL-4 e IL-5 de camundongo
Ensaios imunoenzimáticos de captura (ELISA) foram utilizados para a mensuração da
concentração de IFN-γ, IL-4 e IL-5 murinos presentes nos sobrenadantes de esplenócitos
cultivados conforme descrição acima. Para a sensibilização das placas de microtitulação de 96
poços (“High Binding”; Corning Incorporated Life Sciences) anticorpos monoclonais de rato
anti-IFN-γ, anti-IL-4 e anti-IL-5 murino (BD Pharmigen) foram usados na concentração de 2
µg/mL, e aplicados um volume de 50 µL/poço, seguindo-se a incubação durante 16 horas em
câmara úmida, a 4º C. Os poços foram lavados duas vezes com 200 µL/ poço de PBS-T e em
seguida, 200 µL/ poço de PBS contendo 10% de soro fetal bovino (CULTILAB) foram
65
adicionados para bloquear os sítios de ligação livres, por 2 horas em câmara úmida, a temperatura
ambiente. Diluições duplas e seriadas de IFN-γ recombinante (BD pharmingem), IL-4
(sobrenadante de células transfectadas) e IL-5 murinos recombinante (BD Pharmigen) foram
usadas em duplicatas de poços, no volume de 100 µL/poço, para a elaboração da curva de
calibração em cada placa utilizada. As curvas de calibração variavam de 30 ng/mL a 0,029 ng/mL
para IFN-γ e de 5000 pg/mL a 4 pg/mL para IL-4 e IL-5, além de somente o diluente das
amostras como branco do ensaio. As amostras do sobrenadante de cultura foram testadas em
duplicatas com 100 µL/poço, sem diluições prévias, ou diluídas a 1:2 ou 1:5, em pool ou
individualmente, por 4 horas em câmara úmida, a temperatura ambiente. Após 4 lavagens dos
poços com PBS-T, 100 µL de anticorpos biotinilados anti-IFN-γ, anti-IL-4 e anti-IL-5 produzidos
em rato (BD Pharmigen), usados na concentração de 2 µg/mL, foram aplicados por poço e
incubados por 45 minutos em câmara úmida, a temperatura ambiente. Em seguida, foram feitas 6
lavagens com PBS-T e 100 µL/poço de avidina conjugada a peroxidase (SIGMA), estocada a 1
mg/mL e, diluída a 1:400 foram adicionados e incubados por mais 30 minutos, sob as mesmas
condições. Os poços foram lavados oito vezes com PBS-T e a reação foi revelada pela adição de
100 µL/poço do substrato peróxido de hidrogênio preparado pela mistura de 1mL de cromógeno
TMB a 1 mg/mL em DMSO, 9 mL de tampão citrato-fosfato pH 5,0 e 2µL de peróxido de
hidrogênio a 30 volumes. A reação foi neutralizada com a adição de 50 µL de ácido fosfórico,
diluído a 1:20 (v/v). A leitura da densidade óptica a 450 nm foi realizada em um
espectrofotômetro (Spectramax Precison Microplate Reader, Molecular Devices Corporation,
Sunnyvale, CA, EUA) usando o programa de computação Softmax Pro versão 5.0 (Molecular
Devices Corporation). A média dos valores de densidade óptica foi usada para a elaboração da
curva de calibração e determinação da concentração de cada uma das citocinas das amostras,
usando-se o programa de computação GraphPad, PRISM, versão 4.0 (GraphPad Software, Inc).
Posteriormente, a concentração foi corrigida pelo fator de diluição utilizado.
66
4.6. Avaliação de proteção contra desafio com Leishmania chagasi
4.6.1. Determinação de carga parasitária
A capacidade de proteínas recombinantes de L. chagasi em induzir resposta imune capaz
de conferir proteção contra e/ou controle da infecção por L. infantum/chagasi, foi determinada
pela avaliação da carga parasitária em animais imunizados e posteriormente desafiados pela
injeção de formas promastigotas do parasito. A carga parasitária de cada animal foi determinada
pela avaliação microscópica da presença de formas promastigotas em diluições de macerado de
baço através de ensaio de diluição limitante (BUFFET et al., 1995). Resumidamente, o baço de
cada animal foi removido assepticamente, como descrito no item 4.4.2.1, e pesado em balança de
precisão (Gehaka Ind. e Com. eletro-eletrônica, São Paulo, Brasil). Em seguida, os baços foram
macerados com o auxílio de um embôlo de seringa em 2 mL de meio de cultura de Schneider
suplementado com 20% de SFB (meio de Schneider suplementado), resultando em um volume de
aproximadamente 2,2 mL e uma diluição de aproximadamente 1/10. Para soltar os grumos
celulares, o macerado foi passado através de uma agulha de 21G acoplada a uma seringa de 3
mL. Em placas de microtitulação de 96 poços, estéreis, tratadas para cultivo celular, foi
adicionado um volume de 180 µL de meio de cultura de Schneider suplementado da 1a linha de
poços (linha A) até a 8a linha de poços (linha H). Foi analisado macerado de baço de dois animais
em cada placa, cada um em sextuplicata de poços. Portanto, em cada seis poços da 1a linha de
uma placa (linha A) foram adicionados 20 µL de macerado de baço de um animal, diluído
previamente a aproximadamente 1/10, resultando em uma diluição de aproximadamente 1/100.
Em seguida, realizou-se diluição seriada, com volume de 20 µL nos 180 µL da linha B (diluições
seriadas de 1/10) até a última linha da placa (linha H). O mesmo volume foi descartado após
homogeneização na linha H. As placas foram incubadas em estufa BOD a 25oC. A presença ou
ausência de Leishmania foi avaliada a partir de observações realizadas 7 e 15 dias após o início
da incubação. O título foi determinado, para cada um de seis poços da sextuplicata de cada
animal, como a recíproca da última diluição onde foi possível visualizar pelo menos uma
Leishmania, e, em seguida, calculando-se a média geométrica da recíproca dos seis títulos
obtidos. Para o cálculo da carga parasitária utilizaram-se as seguintes fórmulas:
67
Carga parasitária (no de parasitos/g de tecido) = média geométrica das recíprocas dos
títulos/peso da secção de baço macerado (g) x 100 (recíproca da fração do baço macerado
inoculado no 1o poço).
Carga parasitária total = carga parasitária x peso total do baço (g)
4.7. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas através dos testes paramétricos de análise de
variância (ANOVA) e a comparação entre os grupos foi realizada pelo pós-teste Tukey. O valor
fixado para significância estatística foi de p < 0.05.
68
5. RESULTADOS
5.1. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados com plasmídeos codificando
proteínas de L. chagasi
5.1.1. Avaliação da resposta imune humoral
A indução de resposta imune humoral em camundongos injetados com pBK-CMV-Lc9, pBKCMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18 foi avaliada em amostras de soro obtidas 10 dias
após três séries de injeção de plasmídeo. Os resultados da avaliação da produção de anticorpos
específicos, realizada por ELISA, foram descritos abaixo.
Os grupos de camundongos injetados com pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14, mas não os
injetados com pBK-CMV-Lc13 ou pBK-CMV-Lc18, produziram anticorpos da classe IgG reativos
com o extrato bruto de antígenos de L. chagasi (Figura 1). A comparação das médias dos valores de
densidade óptica revelou diferença estatisticamente significante entre os grupos (ANOVA, p <
0,001). Comparação adicional mostrou diferenças estatisticamente significativas tanto entre a média
dos valores de densidade óptica (X ± SD) dos grupos injetados com pBK-CMV-Lc9 (0,257 ± 0,059) e
pBK-CMV-Lc14 (0,477 ± 0,086; Tukey, p < 0,001) quanto entre a média do grupo pBK-CMV-Lc9
ou do grupo pBK-CMV-Lc14 e a dos demais grupos (Tukey, p < 0,001). A relação entre todos os
grupos foi: pBK-CMV-Lc14 > pBK-CMV-Lc9 > pBK-CMV-Lc13 = pBK-CMV-Lc18 = pBK-CMV
vazio = salina (Tukey, p < 0,05).
Em análise subseqüente, para mensuração de anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1 reativos
com o extrato bruto de antígenos, foi observado que o grupo injetado com pBK-CMV-Lc14 produziu
anticorpos tanto de isotipo IgG2a (D.O.450 nm de 0,660 ± 0,137) como IgG1 (0,272 ± 0,101)
enquanto que o grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 produziu anticorpos apenas de isotipo IgG2a
(0,276 ± 0,103; Figura 1). A comparação das médias de densidade óptica, correspondentes à
mensuração de IgG2a ou de IgG1 revelou diferença estatisticamente significativa entre os grupos
(ANOVA, p < 0,0001 para IgG2a e para IgG1). Além disso, a comparação de cada dois grupos entre
si indicou que a média de densidade óptica obtida para IgG2a tanto do grupo pBK-CMV-Lc9 (Tukey,
p < 0,01) como do grupo pBK-CMV-Lc14 (Tukey, p < 0,001) foi significativamente maior do que a
média dos grupos controles Salina e pBK-CMV vazio. Finalmente, a média de densidade óptica
69
obtida para IgG1 do grupo pBK-CMV-Lc14 foi significativamente superior a média de todos os
outros grupos (Tukey, p < 0,001). A proporção da média de densidade óptica, relacionada à
mensuração de IgG2a e de IgG1, para o grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 e para o grupo injetado
com pBK-CMV-Lc14 foi de 2,10 ± 0,83 e 2,78 ± 1,25.
A avaliação da produção de anticorpos reativos a cada uma das proteínas recombinantes de L.
chagasi (Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18) foi avaliada para cada grupo de animais injetados com plasmídeos
pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18.
No ensaio para avaliação de anticorpos da classe IgG reativos a Lc9, os valores de densidade
óptica (X ± SD) obtidos para o grupo de animais injetados com pBK-CMV-Lc9 foram
significativamente maiores (1,827 ± 0,774; ANOVA, p < 0,0001, Tukey, p < 0,001, Figura 2A) do
que os valores obtidos para os grupos de animais que receberam salina ou pBK-CMV vazio.
Adicionalmente, os valores de densidade óptica referentes à mensuração de anticorpos das subclasses
IgG2a e IgG1 foram estatisticamente maiores (1,545 ± 0,379 e 0,619 ± 0,279, ANOVA, p < 0,0001,
Tukey, p < 0,001) no grupo de camundongos injetados com pBK-CMV-Lc9 do que nos grupos Salina
e pBK-CMV vazio (Figura 2A). Embora ambas subclasses de IgG tenham sido produzidos após a
injeção de pBK-CMV-Lc9, a proporção entre os valores de densidade óptica obtidos para IgG2a e
IgG1 das amostras do grupo de animais injetados com pBK-CMV-Lc9 foi de 3,29 ± 2,32.
Também na avaliação de anticorpos da classe IgG reativos a Lc14, os valores de densidade
óptica (X ± SD) obtidos para o grupo de grupo de animais injetados com pBK-CMV-Lc14 foram
estatisticamente superiores (1,525 ± 0,336; ANOVA p < 0,0001 e Tukey, p < 0,001) aos valores
obtidos para os grupos controles Salina e pBK-CMV vazio (Figura 2B). Da mesma forma, em análise
subseqüente, os valores de densidade óptica referentes à mensuração de anticorpos das subclasses
IgG2a e IgG1 foram estatisticamente maiores (1,198 ± 0,386 e 0,711 ± 0,536, respectivamente;
ANOVA, p < 0,0001, Tukey, p < 0,001) no grupo de camundongos injetados com pBK-CMV-Lc14
do que nos grupos Salina e pBK-CMV vazio (Figura 2B). A proporção entre os valores de densidade
óptica obtidos para IgG2a e IgG1 das amostras do grupo de animais injetados com pBK-CMV-Lc14
foi de 2,76 ± 2,28.
70
1.0
IgG
*
*
Densidade Óptica (450 nm)
0.5
0.0
1.0
IgG1
*
0.5
0.0
1.0
0.5
*
IgG2a
*
pB Sali
n
KpB
CM a
KV
C
EL
pB MV
KLc
C
9
E
pB MV
Lc L
K13
CM
EL
V
pB
Lc
K14
CM
EL
V
Lc
18
EL
0.0
Figura 1. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais injetados com plasmídeos
recombinantes administrados isoladamente. Camundongos BALB/c (12 a 18 animais/grupo)
foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV
vazio, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via
intramuscular seguida de eletroporação (EL). Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira
série de injeção, foram diluídas de 1:100 para a detecção de anticorpos IgG e diluídas de 1:500
para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de
microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL de extrato total de antígenos de L.
chagasi a 10 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias
aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05;
comparação em relação aos grupos controles.
71
Os valores de densidade óptica encontrados no ensaio para mensuração de anticorpos da
classe IgG reativos a Lc13 para o grupo de animais injetados com pBK-CMV-Lc13 e para os grupos
controles (Salina e pBK-CMV vazio) foram semelhantes (dados não mostrados), indicando que não
houve produção de anticorpos específicos para Lc13 após a injeção de pBK-CMV-Lc13.
No ensaio para avaliação da produção de anticorpos da classe IgG reativos a Lc18, os valores
(X ± SD) de densidade óptica encontrados para amostras de animais do grupo injetado com pBKCMV-Lc18 (0,135 ± 0,025) foram muito próximas daquelas encontradas para amostras dos grupos
controles Salina e pBK-CMV vazio. No entanto, a comparação das médias das leituras de densidade
óptica revelou diferença estatisticamente significante entre os grupos (ANOVA p<0,0001). A
comparação de cada dois grupos entre si indicou que a média de densidade óptica obtida para o grupo
de animais injetados com pBK-CMV-Lc18 foi maior que a média dos valores obtidos para os grupos
controles (Tukey p < 0,001; Figura 3).
72
A
3
B
*
IgG
IgG
*
2
1
Densidade Óptica (450 nm)
0
3
IgG1
IgG1
*
2
*
1
0
3
IgG2a
*
IgG2a
*
2
1
Lc
14
EL
EL
KCM
VpB
pB
KC
M
V
in
a
Sa
l
EL
-L
c
9
EL
KCM
V
pB
pB
KCM
V
Sa
li
na
0
Figura 2. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos a Lc9 ou Lc14, de animais injetados com plasmídeos recombinantes administrados
isoladamente. Camundongos BALB/c (12 a 18 animais/grupo) foram submetidos a três séries de
injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9 ou pBKCMV-Lc14, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Amostras de soro, obtidas 10
dias após a terceira série de injeção, foram diluídas de 1:200 para a detecção de anticorpos IgG e
diluídas de 1:3000 para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em
placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL de Lc9 a 5 µg/mL ou Lc14 a
10 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias
aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05;
comparação em relação aos grupos controles.
0.3
*
0.2
0.1
L
18
E
V
M
C
pB
K
pB
K
C
Lc
M
V
a
al
in
S
EL
0.0
EL
Densidade Óptica (450 nm)
73
Figura 3. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG, reativos a Lc18, de animais
injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente. Camundongos BALB/c
(12 a 18 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de
plasmídeo pBK-CMV ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL).
Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira série de injeção, foram diluídas de 1:200 e
avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL
da proteína recombinante Lc18 a 1,5 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as
barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de
pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.
74
5.1.2. Avaliação da resposta imune celular
A resposta proliferativa e a produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5), por células esplênicas,
após a estimulação in vitro com um mitógeno (Con A), extrato bruto de antígenos de
L.infantum/chagasi ou proteína recombinante purificada (Lc9, Lc14 ou Lc18), foram avaliadas três a
quatro semanas depois de três séries de injeções de salina, plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMVLc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-14 ou pBK-CMV-Lc18.
Os valores de cpm (X ± SD) encontrados quando as células esplênicas foram cultivadas, por
três dias, somente em meio de cultura ou meio de cultura contendo Con A ou, por cinco dias, em
meio de cultura ou meio de cultura contendo extrato bruto de antígeno de L. chagasi, estão
apresentados na Tabela 2. Os valores de índice de proliferação [valor de cpm de células cultivadas na
presença de estímulo (Con A) / valor de cpm de células cultivadas somente com meio de cultura]
correspondentes a cada grupo de animais foram obtidos. A comparação entre as médias dos valores
de índice de proliferação não revelou diferença significativa entre os grupos após estimulação
inespecífica com o mitógeno Con A (Figura 4A).
Tabela 2. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos
submetidos a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente.
Condições de cultura
Grupos de
camundongos
3 dias
(2 µg/mL)
Meio de
cultura
5 dias
Extrato bruto de
antígenos L. chagasi
(10 µg/mL)
277 ± 83
249 ± 121
13740 ± 4421
11060 ± 4544
410 ± 353
262 ± 97
510 ± 247
496 ± 177
pBK-CMV-Lc9 EL
289 ± 133
11300 ± 4868
311 ± 168
760 ± 405
pBK-CMV-Lc13 EL
384 ± 271
10770 ± 5635
411 ± 74
805 ± 162
pBK-CMV-Lc14 EL
414 ± 165
13740 ± 5389
568 ± 250
934 ± 311
pBK-CMV-Lc18 EL
488 ± 274
11550 ± 4866
357 ± 134
766 ± 417
Meio de
cultura
Salina EL
pBK-CMV EL
Con A
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (4 a 6 animais/grupo).
Esplenócitos foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em
triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos.
75
A avaliação da produção de citocinas no sobrenadante das culturas de células esplênicas
mantidas em cultivo por 48 horas com Con A foi realizada por ELISA utilizando-se anticorpos
comerciais específicos. A produção de IFN-γ foi observada em todos os grupos avaliados (Figura
4C). A comparação das médias dos valores de concentração de IFN-γ obtido para cada grupo não
apresentou diferença significativa (Figura 4C). Os valores correspondentes a concentração de IFN-γ
(ng/mL) presente no sobrenadante das culturas de células esplênicas mantidas em cultivo por 48 horas
apenas em meio de cultura foram de 0,6 ± 1,1 para o grupo injetado com salina; 0,3 ± 0,5 para o
grupo injetado com pBK-CMV vazio; 0,3 ± 0,4 para o grupo injetado com pBK-CMV-Lc14 e não
determinado (ND) para os grupos injetados com pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13 ou pBK-CMVLc18. As citocinas IL-4 e IL-5 não foram detectadas no sobrenadante das culturas mantidas apenas
em meio de cultura, mas foram detectadas nos sobrenadantes das células estimuladas com Con A
(dados não mostrados). No entanto, os valores da concentração de IL-4 e de IL-5 encontrados após
estimulação com Con A foram muito próximos aos valores do limite de detecção do ensaio que
correspondem a 20 pg/mL e 40 pg/mL, respectivamente.
Já quando esplenócitos foram cultivados na presença de extrato bruto de antígenos de L.
chagasi, os valores de índice de proliferação encontrados não apresentaram diferença entre os grupos
(Figura 4B). Os valores de concentração de IFN-γ (Figura 4D), IL-4 e IL-5 (dados não mostrados),
avaliados no sobrenadante de células cultivadas por 48 horas meio de cultura contendo extrato bruto
de antígeno de L.infantum/chagasi permaneceram abaixo do limite de detecção do ensaio em todos os
grupos avaliados.
A resposta proliferativa e a capacidade de produção de citocinas por células esplênicas foram
avaliadas após estimulação in vitro com Lc9, Lc14 e Lc18. A proteína recombinante Lc13 purificada
para avaliações in vitro apresenta um pequeno fragmento de β-galactosidase, peptídeo presente
também na porção N-terminal da proteína codificada in vivo pelo plasmídeo pBK-CMV. Dessa
forma, a avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas dos animais
do grupo injetado com pBK-CMV-Lc13, realizada a partir da estimulação com a proteína purificada
descrita acima, ficou comprometida por apresentar dados que não discriminam entre resposta imune
específica para Lc13 ou para β-galactosidase (dados não mostrados).
76
Extrato de antígenos
L. chagasi
Con A
Ìndice de Proliferação
300
A
B
C
D
200
100
85
65
45
25
10
5
0
IFN-γγ (ng/mL)
40
30
20
10
Sa
li
pB na
EL
pB K-C
M
K
-C
V
EL
M
pB
VK
L
-C
c9
M
EL
VpB
Lc
K
-C
13
M
EL
VpB
Lc
K
-C
14
M
EL
VLc
18
EL
pB
K
pB
K
Sa
lin
a
EL
-C
M
V
-C
EL
M
pB
VLc
K
-C
9
M
EL
VpB
L
c
K
13
-C
M
EL
VpB
L
c1
K
-C
4
M
EL
VLc
18
EL
0
Figura 4. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de
camundongos injetados com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, após
cultivo com concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de L. chagasi. Camundongos BALB/c (4 a
6 animais/grupo), previamente injetados com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV
vazio, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via
intramuscular seguida de eletroporação (EL), foram sacrificados cerca de 3 a 4 semanas após a
terceira série de injeção. Células esplênicas foram estimuladas com Con A a 2 µg/mL (A e C) ou
extrato bruto de antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL (B e D). Para a avaliação da proliferação (A
e B), o cultivo foi realizado por 3 dias (Con A) ou 5 dias (extrato bruto) a 37oC e 5% de CO2 em
atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as
células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (C e D), sobrenadantes das
culturas de células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após 48 horas de
incubação e utilizados em ELISA, individualmente (C) ou como uma mistura de partes iguais de
sobrenadante por grupo (D). Os gráficos mostram valores de índice de proliferação (A e B) e
concentração de IFN-γ (ng/mL, C e D). Os símbolos (A e B) representam valores individuais e
média aritmética de cada grupo e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada grupo (C e
D).
77
Os valores de cpm (X ± SD) encontrados quando esplenócitos foram cultivados, por cinco
dias, somente com meio de cultura ou meio de cultura contendo Lc9, Lc14 ou Lc18, estão
apresentados na Tabela 3. A comparação das médias dos valores dos índices de proliferação não
revelou diferença significativa entre os grupos em qualquer das condições testadas (Figura 5A, B e
C). Também não houve diferença entre as médias dos valores de concentração de IFN-γ, avaliado no
sobrenadante das células, obtido após o cultivo por 48 horas com cada uma das proteínas
recombinantes (Figura 5D, E e F). Já os valores de concentração de IL-4 e IL-5 estiveram sempre
abaixo do limite de detecção do ensaio (dados não mostrados).
Tabela 3. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados na presença ou na ausência de proteínas recombinantes de L. chagasi, obtidos de grupos de
camundongos submetidos a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes administrados
isoladamente.
Salina EL
Meio de
cultura
410 ± 353
Condições de cultura
5 dias
Lc9
Lc14
(10 µg/mL)
(10 µg/mL)
1478 ± 192
1165 ± 296
Lc18
(10 µg/mL)
3208 ± 2055
pBK-CMV EL
pBK-CMV-Lc9 EL
pBK-CMV-Lc14 EL
262 ± 97
311 ± 168
568 ± 250
2578 ± 1241
1395 ± 229
-a
2901 ± 992
-a
-a
Grupos de
camundongos
pBK-CMV-Lc18 EL
489 ± 327
-
a
1264 ± 228
-a
1588 ± 606
-a
3945 ± 117
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (4 a 6 animais/grupo).
Esplenócitos foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em
triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos.
a
não realizado
78
Lc9
Índice de Proliferação
80
60
Lc14
A
B
D
E
Lc18
C
40
20
20
15
10
5
0
IFN-γγ (ng/mL)
3
F
2
1
EL
EL
M
VLc
18
V
M
-C
-C
pB
K
Sa
lin
a
EL
EL
pB
K
pB
K
-C
K
-C
M
VLc
M
V
14
EL
EL
a
pB
K
-C
pB
Sa
lin
EL
M
VLc
9
EL
-C
M
V
K
pB
Sa
l
in
a
EL
0
Figura 5. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de
camundongos injetados com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, após
cultivo com proteínas recombinantes de L. chagasi. Camundongos BALB/c (4 a 6
animais/grupo), previamente injetados com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio,
pBK-CMV-Lc9; pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de
eletroporação (EL) foram sacrificados cerca de 3 a 4 semanas após a terceira série de injeção.
Células esplênicas foram estimuladas com Lc9, Lc14 e Lc18 a 10 µg/mL. Para a avaliação da
proliferação celular (A, B e C) o cultivo foi realizado por 5 dias a 37oC e 5% de CO2 em
atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as
células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (D, E e F), sobrenadantes
das culturas de células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após 48 horas de
incubação e utilizados em ELISA. Os gráficos mostram valores de índice de proliferação (A, B e C)
e concentração de IFN-γ (ng/mL, D, E e F).Os símbolos (A, B e C) representam valores individuais
e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada grupo (D, E e F).
79
5.1.3. Avaliação da resposta imune humoral após desafio com L. chagasi
Os resultados da avaliação da produção de anticorpos específicos, realizada por ELISA, em
amostras de soro obtidas cerca de 60 dias após a injeção com promastigotas de L.infantum/chagasi
estão descritos a seguir.
Anticorpos da classe IgG reativos com o extrato bruto de L. chagasi foram detectados em
amostras de soro dos grupos de camundongos desafiados pela injeção com promastigotas de L.
chagasi que haviam sido previamente injetados com pBK-CMV-Lc9 ou pBK-CMV-Lc14 (Figura 6).
A comparação das médias dos valores de densidade óptica revelou que os valores de densidade óptica
(X ± SD) obtidos para os grupos injetados com pBK-CMV-Lc9 (0,237 ± 0,079) foram superiores
apenas em relação aos valores encontrados para o grupo de animais injetados apenas com salina, sem
infecção enquanto que a média dos valores de densidade óptica obtida para amostras do grupo pBKCMV-Lc14 (0,569 ± 0,100) foi superior aos valores obtidos para todos os demais grupos (ANOVA, p
< 0,0001 e Tukey, p < 0,05). A relação entre todos os grupos foi a seguinte: pBK-CMV-Lc14 > pBKCMV-Lc9 > Salina sem infecção = Salina = pBK-CMV vazio = pBK-CMV-Lc13 = pBK-CMV-Lc18
(Tukey, p < 0,05).
Posteriormente, em análise para a mensuração de anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1
reativos com o extrato bruto de antígenos, anticorpos de ambas subclasses foram detectados em
amostras do grupo de animais injetados previamente com pBK-CMV-Lc14 e apresentaram valores de
densidade óptica de 0,410 ± 0,080 e 0,238 ± 0,127, respectivamente (Figura 6). A comparação
estatística entre as médias de densidade óptica obtidas para cada grupo avaliado revelou que os
valores encontrados em amostras do grupo previamente injetado com pBK-CMV-Lc14 foram
maiores que os valores encontrados para amostras dos demais grupos (ANOVA, p < 0,0001 para
IgG2a e para IgG1 e Tukey, p < 0,05). A proporção da média de densidade óptica, relacionada à
mensuração de IgG2a e de IgG1 para o grupo pBK-CMV-Lc14, foi de 2,19 ± 1,29.
80
1.0
IgG
*
Densidade Óptica (450 nm)
0.5
0.0
1.0
*
IgG1
*
0.5
0.0
1.0
IgG2a
*
0.5
0.0
L EL EL EL EL
a
c
fe lin V E c9
3
4
8
n
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c1 Lc1 Lc1
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C V
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M
V
V
VBK -C
M CM
lin
M
p
a
C
K
-C
S
pB BK BK BK
p
p
p
Figura 6. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1
reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi em animais previamente injetados com
plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, .após a infecção por L. chagasi.
Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a três séries de injeções
com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13,
pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL).
Aproximadamente 30 dias após as injeções supracitadas, cada grupo, exceto 6 animais do grupo
Salina (Salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L.infantum/chagasi
por via intraperitonial. Amostras de soro, obtidas aproximadamente 60 dias após o desafio, foram
diluídas de 1:100 para a detecção de anticorpos IgG e diluídas de 1:500 para a detecção de
anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços présensibilizadas com 100 µL de extrato total de antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL. Os símbolos
representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de
densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação ao
grupo salina, sem infecção.
81
A avaliação da produção de anticorpos reativos com as proteínas recombinantes Lc9 e Lc14
foi avaliada, por ELISA, em amostras de soro obtidas após a injeção de promastigotas de L. chagasi.
A comparação das médias dos valores de densidade óptica obtidos em ELISA para detecção de
anticorpos anti-Lc9 e anti-Lc14 revelou diferença estatisticamente significativa entre os grupos
(ANOVA, p < 0,0001). Comparação adicional mostrou que os valores (X ± SD) de densidade óptica
obtidos para o grupo injetado previamente com pBK-CMV-Lc9 (2,412 ± 0,249) ou com pBK-CMVLc14 (1,687 ± 0,419) foi superior aos valores obtidos para os grupos controles (Tukey, p < 0,05).
A determinação das subclasses de anticorpos IgG1 e IgG2a reativos com as proteínas
recombinantes não foi realizada em amostras de soro obtidas após a injeção de L. chagasi.
Densidade Óptica (450 nm)
82
3
*
A
2
1
B
-C
M
V
pB
K
-C
K
M
VLc
9
EL
EL
a
pB
Sa
l
*
2
1
0
Sa
lin
a
s/
in
fe
c
Sa
lin
a
EL
pB
K
-C
M
pB
V
EL
K
-C
M
VLc
14
Densidade Óptica (450 nm)
3
Sa
lin
in
a
EL
s/
i
nf
0
Figura 7. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG reativos a proteínas recombinantes
de L. chagasi em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados
isoladamente, .após a infecção por L. chagasi. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram
previamente submetidos a injeção com foram previamente submetidos a três séries de injeções
com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9 ou pBK-CMV-Lc14,
por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após as injeções
supracitadas, cada grupo, exceto 6 animais do grupo Salina (Salina EL s/ inf), recebeu uma
injeção de 1 x 107 promastigotas de L.infantum/chagasi por via intraperitonial. Amostras de soro,
obtidas aproximadamente 60 dias após o desafio, foram diluídas de 1:200 e avaliadas, em
duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL de Lc9 a 5
µg/mL (A) ou 100 µL de Lc14 a 10 µg/mL. Os gráficos mostram valores de densidade óptica
correspondentes a mensuração de IgG anti-Lc9 (A) e de IgG anti-Lc14 (B). Os símbolos
representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de
densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação
aos grupos controles.
83
5.1.4. Avaliação da resposta imune celular após desafio com L infantum/chagasi
A resposta proliferativa e a capacidade de produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5) após
estimulação in vitro de esplenócitos murinos com Con A, extrato bruto de antígenos de
L.infantum/chagasi ou proteína recombinante purificada (Lc9, Lc14 ou Lc18) foram avaliadas oito
semanas depois da infecção de camundongos com promastigotas de L.infantum/chagasi, previamente
submetidos a três séries de injeções de salina, plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9, pBKCMV-Lc13, pBK-CMV-14 ou pBK-CMV-Lc18. Os resultados são apresentados abaixo.
Os valores de cpm (X ± SD) encontrados quando as células esplênicas foram cultivadas, por
três dias, somente em meio de cultura ou meio de cultura contendo Con A ou, por cinco dias, em
meio de cultura ou meio de cultura contendo extrato bruto de antígenos de L. chagasi, estão
apresentados na Tabela 4.
A comparação dos valores de índice de proliferação encontrados, com base nos valores de
cpm, não apresentou diferença estatisticamente significante entre os grupos após estimulação
inespecífica com Con A (Figura 8A).
Quando as células foram mantidas em cultura por 48 horas na presença de Con A houve
também a indução da produção de IFN-γ, IL-4 e IL-5 em todos os grupos avaliados, como
demonstrado pela mensuração de cada citocina no sobrenadante das culturas (Figura 8C, E e G). A
comparação dos valores de concentração de IFN-γ não revelou diferença significante entre os grupos.
A concentração de IFN-γ, IL-4 e IL-5, presente no sobrenadante da cultura de esplenócitos após
cultivo somente em meio de cultura por 48 horas, esteve sempre abaixo do limite de detecção do
ensaio (dados não mostrados).
Já quando esplenócitos foram cultivados na presença de extrato bruto de antígenos de L.
chagasi, os valores de índice de proliferação encontrados não apresentaram diferença entre os grupos
(Figura 8B).
Para avaliação da produção de citocinas as células foram cultivadas por 48 horas na
presença de extrato bruto de antígenos de L. chagasi. Os valores de concentração de IFN-γ,
detectado no sobrenadante das culturas, estiveram abaixo ou muito próximo ao valor de limite de
detecção do ensaio (0,1 ng/mL), exceto para o grupo injetado com pBK-CMV vazio que
apresentou 0,6 ± 1,2 ng/mL de IFN-γ no sobrenadante (Figura 8D). No entanto, este valor não
foi estatisticamente superior aos valores encontrados para os demais grupos. Da mesma forma,
84
os níveis de IL-4 e IL-5 estiveram abaixo do limite de detecção do ensaio que correspondem a 20
pg/mL e 40 pg/mL, respectivamente (Figura 8F e H).
Tabela 4. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos de
cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos
submetidos previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados
isoladamente, e desafiados com promastigotas de L. chagasi.
Condições de cultura
Grupos de
camundongos
3 dias
Meio
de cultura
Con A
(2 µg/mL)
Meio
de cultura
5 dias
Extrato bruto de
antígenos L. chagasi
(10 µg/mL)
Salina sem infecção
Salina EL
744 ± 403
699 ± 402
17490 ± 8344
16790 ± 12830
2174 ± 812
2273 ± 734
3102 ± 1496
2999 ± 1550
pBK-CMV EL
543 ± 347
13240 ± 10720
2052 ± 1112
3671 ± 2286
pBK-CMV-Lc9 EL
601 ± 588
20190 ± 13410
2280 ± 841
3109 ± 1848
pBK-CMV-Lc13 EL
675 ± 308
20360 ± 11360
2130 ± 1084
3361 ± 2162
pBK-CMV-Lc14 EL
759 ± 627
19920 ± 20870
1369 ± 451
2194 ± 1353
pK-CMV-Lc18 EL
489 ± 332
21100 ± 11720
1625 ± 770
2765 ± 1973
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Células
esplênicas foram obtidas aproximadamente 60 dias após a injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L.
chagasi e cultivadas a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e
Métodos.
in
a
EL
s/
S a i nf
pB l i na
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C
K
M
pB C M V E
V
L
K
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L
K
-C Lc1
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L
K
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18
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K
-C Lc1
pB M V 3
K
-C Lc1
4
M
VLc
18
Sa
l
IL-5 (pg/mL)
IL-4 (pg/mL)
IFN-γγ (ng/mL)
Ìndice de Proliferação
85
Con A
100
150
100
400
400
Extrato de antígenos
L. chagasi
60
20
20
10
0
50
3
2
1
0
300
200
100
0
A
B
C
D
E
F
G
H
300
200
100
0
86
Figura 8. Avaliação de resposta proliferativa e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, após injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de concanavalina A ou
extrato bruto de L. chagasi, em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes
administrados isoladamente. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente
submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio,
pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular
seguida de eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, os
animais foram desafiados pela injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi,
exceto 6 animais do grupo Salina (Salina EL s/ inf). A proliferação celular (A e B) e a produção
de citocinas, IFN-γ (C, D), IL-4 (E, F) e IL-5 (G e H) foram avaliadas cerca de 60 dias após a
infecção. Esplenócitos foram estimulados com Con A a 2 µg/mL (A, C, E e G) ou extrato bruto
de L. chagasi a 10 µg/mL (B, D, F e H) a 37o C e 5% de CO2 em atmosfera úmida. Para a
avaliação da proliferação, o cultivo foi realizado por 3 dias (Con A) ou 5 dias (extrato bruto).
Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram
incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), IL-4 e IL-5 (pool),
sobrenadantes das culturas de células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após
48 horas de incubação e utilizados em ELISA. Os símbolos representam valores individuais (A e
B) e as barras representam médias aritméticas ± SD (C e D).
87
Os resultados correspondentes à avaliação da resposta proliferativa e da capacidade de
produção de citocinas após a estimulação in vitro com Lc9, Lc14 e Lc18 estão descritos abaixo.
O valor de índice de proliferação (X ± SD) encontrado quando as células esplênicas
obtidas do grupo previamente injetado com pBK-CMV-Lc9 foram cultivadas por cinco dias na
presença de Lc9 (10 µg/mL) foi de 2,9 ± 3,9 (Figura 9A). Quando Lc9 foi utilizada em
concentrações menores (1 µg/mL ou 0,1 µg/mL) os valores de índice de proliferação encontrados
foram semelhantes ao apresentado acima (Figura 9B e C). Em nenhuma das condições testadas, a
comparação das médias dos valores de índice de proliferação de cada grupo apresentou diferença
estatística significativa entre os grupos. Os valores de cpm que deram origem a estes resultados
estão descritos na Tabela 5.
Já a produção de IFN-γ, avaliada após a estimulação com Lc9 (10 µg/mL) por 48 horas,
foi observada no sobrenadante da cultura de células do grupo previamente injetado com pBKCMV-Lc9 (Figura 9D). O valor correspondente à concentração de IFN-γ (X ± SD), obtido para
este grupo, foi superior aos valores encontrados para os demais grupos (12,78 ± 9,38 ng/mL;
ANOVA, p = 0,0075 e Tukey, p<0,01 em relação ao grupo injetado apenas com salina, sem
infecção e p<0,05 em relação ao grupo injetado com salina e desafiado com L. infantum/chagasi).
Na mesma condição descrita acima, a produção de IL-4 ou de IL-5 não foi detectada em nenhum
dos grupos avaliados (dados não mostrados).
Tabela 5. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos
previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e
desafiados com promastigotas de L. chagasi.
Condições de cultura
5 dias
Grupos de
camundongos
Salina sem infecção
2625 ± 1036
Lc9
(0,1 µg/mL)
5550 ± 2105
Salina EL
2753 ± 1258
4994 ± 2502
5303 ± 2063
6980 ± 2982
pBK-CMV EL
2131 ± 889
3840 ± 1554
4084 ± 2171
4748 ± 1502
pBK-CMV-Lc9 EL
1507 ± 622
4263 ± 1722
3799 ± 2424
4212 ± 3867
Meio
de cultura
Lc9
(1 µg/mL)
6485 ± 1356
Lc9
(10 µg/mL)
6893 ± 2287
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Células
esplênicas foram obtidas aproximadamente 60 dias após a injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L.
chagasi e cultivadas a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e
Métodos.
s/
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c
Sa
lin
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EL
EL
pB
KCM
pB
V
KEL
CM
VLc
9
EL
Sa
lin
a
IFN-γγ (ng/mL)
Índice de Proliferação
88
10
8
A
6
4
2
0
10
8
B
6
4
2
0
10
8
C
6
4
2
0
30
D
*
20
10
0
89
Figura 9. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente,
após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc9 recombinante. Camundongos
BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a três séries de injeções com salina ou
com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou, pBK-CMV-Lc9, por via intramuscular seguida de
eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, os animais foram
desafiados pela injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi, exceto 6 animais
do grupo Salina (Salina EL s/ inf). A proliferação celular (A, B e C) e a produção de IFN-γ (D)
foram avaliadas cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados com Lc9 nas
concentrações de 10 µg/mL (A e D), 1 µg/mL (B) ou 0,1 µg/mL (C). Para a avaliação de
proliferação, o cultivo foi realizado por 5 dias a 37oC e 5% CO2 em atmosfera úmida. Após este
período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais
18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), sobrenadantes das culturas de células,
estimuladas com Lc9 a 10 µg/mL, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em
ELISA. Os símbolos representam valores individuais (A, B e C) e as barras representam médias
aritméticas ± SD (D). * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey (p < 0,01 em comparação ao
grupo Salina sem infecção e em relação ao grupo Salina infectado).
90
Os valores de cpm encontrados após o cultivo de células esplênicas obtidas de grupos de
camundongos injetados somente com salina ou injetados com salina, pBK-CMV vazio ou pBKCMV-Lc14 e desafiados pela injeção de L. chagasi, em meio de cultura ou meio de cultura contendo
Lc14, estão apresentados na Tabela 6. A comparação das médias dos índices de proliferação
revelou diferença significante entre os grupos quando as células esplênicas foram cultivadas na
presença de Lc14 a 0, 1 µg/mL (ANOVA, p = 0,0313) contudo, não mostrou diferença significante
quando tais células foram cultivadas em meio contendo Lc14 nas concentrações de 1 µg/mL ou 10
µg/mL (Figura 10A e 10B). Quando o índice de proliferação de esplenócitos submetidos à
estimulação com 0,1 µg/mL de Lc14 foram comparados entre os grupos houve diferença
estatística significante entre os animais previamente injetados com pBK-CMV-Lc14 (5,6 ± 2,7) em
relação aos demais grupos, previamente injetados com salina ou pBK-CMV vazio (Tukey, p < 0,05;
Figura 10C).
Em análise subseqüente, para mensuração da produção de IFN-γ no sobrenadante das culturas,
a comparação dos valores encontrados (X ± SD) não apresentou diferença estatística significante
entre os grupos avaliados (Figura 10D). Além disso, as citocinas IL-4 e IL-5 também não foram
detectadas no sobrenadante das culturas de nenhum dos grupos testados (dados não mostrados).
Tabela 6. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com Lc14 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos
previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e
desafiados com promastigotas de L. chagasi.
Condições de cultura
5 dias
Grupos de
camundongos
Meio de cultura
Salina sem infecção
Salina EL
pBK-CMV EL
pBK-CMV-Lc14 EL
3099 ± 931
3813 ± 1728
2663 ± 1029
1822 ± 1020
Lc14
(0,1 µg/mL)
9151 ± 2167
8097 ± 2476
6381 ± 2356
9110 ± 5017
Lc14
(1 µg/mL)
9788 ± 5615
7898 ± 4323
6233 ± 3433
9281 ± 6247
Lc14
(10 µg/mL)
3548 ± 939,1
2525 ± 828
2452 ± 1523
1975 ± 729
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Células
esplênicas foram obtidas aproximadamente 60 dias após a injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L.
chagasi e cultivadas a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e
Métodos.
pB
K
Sa
l
-C
M
M
4
V
Lc
1
-C
V-
K
lin
a
EL
EL
EL
s/
in
fe
c
Sa
EL
pB
in
a
IFN-γγ (ng/mL)
Índice de Proliferação
91
12
A
8
4
12
0
B
8
4
0
12
C
*
8
4
0
12
D
8
4
0
92
Figura 10. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente,
após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc14 recombinante. Camundongos
BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a três séries de injeções com salina ou
com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, ou pBK-CMV-Lc14, por via intramuscular seguida
de eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, os animais
foram desafiados pela injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi, exceto 6
animais do grupo Salina (Salina EL s/ inf). A proliferação celular (A, B e C) e a produção de
IFN-γ (D) foram avaliadas cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados com
Lc14 recombinante nas concentrações de 10 µg/mL (A e D), 1 µg/mL (B) ou 0,1 µg/mL (C). Para
a avaliação de proliferação, o cultivo foi realizado por 5 dias a 37oC e 5% CO2 em atmosfera
úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço. As células foram
incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), sobrenadantes das
culturas de células, estimuladas com Lc14 a 10 µg/mL, foram coletados após 48 horas de
incubação e utilizados em ELISA. Os símbolos representam valores individuais (A, B e C) e as
barras representam médias aritméticas ± SD (D). *p < 0,05 em comparação aos grupos Salina e
pBK-CMV vazio infectados.
93
O cultivo de esplenócitos em meio de cultura apenas ou meio de cultura contendo Lc18 a 0,1
µg/mL e 1 µg/mL, com células obtidas de grupos de camundongos injetados somente com salina ou
infectados com L.infantum/chagasi, previamente injetados com salina, pBK-CMV vazio ou pBKCMV-Lc18, resultou em índices de proliferação cujos valores das médias não apresentaram diferença
estatística significante quando comparadas entre os grupos (Figura 11A e B). Os valores de cpm que
deram origem a estes resultados estão apresentados na Tabela 7.
Da mesma forma, a comparação dos valores de concentração de IFN-γ, mensurados no
sobrenadante das culturas obtidos após 48 horas na presença de 1 µg/mL de Lc18, não apresentou
diferença estatística entre os grupos (Figura 11C). Nas mesmas condições avaliadas, IL-4 e IL-5 não
foram detectadas no sobrenadante das culturas (dados não mostrados).
Um mapa qualitativo da resposta imune murina aos diferentes imunógenos utilizados para
injeção, antes e após o desafio com L. chagasi, está apresentado no Apêndice C.
Tabela 7. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com Lc18 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a
três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e desafiados com
promastigotas de L. chagasi.
Condições de cultura
5 dias
Grupos de
camundongos
Salina sem infecção
3410 ± 1752
Lc18
(0,1 µg/mL)
8544 ± 2184
Salina EL
3307 ± 1018
5882 ± 2430
1836 ± 713
pBK-CMV EL
2014 ± 843
5646 ± 2215
1474 ± 451
pBK-CMV-Lc18 EL
1414 ± 807
4135 ± 2284
1355 ± 376
Meio
de cultura
Lc18
(1 µg/mL)
2324 ± 632
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Células
esplênicas foram obtidas aproximadamente 60 dias após a injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L.
chagasi e cultivadas a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e
Métodos.
94
10
8
A
Índice de Proliferação
6
4
2
0
10
B
8
6
4
2
0
15
IFN-γγ (ng/mL)
C
10
5
EL
K
-C
M
VLc
18
V
EL
EL
a
pB
lin
Sa
K
-C
M
pB
Sa
lin
a
EL
s/
in
fe
c
0
Figura 11. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente,
após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc18 recombinante. Camundongos
BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a três séries de injeções com salina ou
com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de
eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, os animais foram
desafiados pela injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi, exceto 6 animais
do grupo Salina (Salina EL s/ inf). A proliferação celular (A, B e C) e a produção de IFN-γ (D)
foram avaliadas cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados com Lc18
recombinante nas concentrações de 1 µg/mL (A e C) ou 0,1 µg/mL (B). Para a avaliação de
proliferação, o cultivo foi realizado por 5 dias a 37o C e 5% CO2 em atmosfera úmida. Após este
período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais
18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), sobrenadantes das culturas de células,
estimuladas com Lc18 a 1 µg/mL, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em
ELISA, como descrito em Material e Métodos. Os símbolos representam valores individuais (A e
B) e as barras representam médias aritméticas ± SD ( C).
95
5.1.5. Avaliação de proteção contra infecção por L. chagasi.
Os resultados da avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por
L.infantum/chagasi, realizada por diluição limitante cerca de 8 semanas após a infecção, estão
descritos abaixo.
A injeção de pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18
não induziu proteção contra a infecção após a injeção de promastigotas de L.infantum/chagasi
(Figura 12A). No entanto, a comparação entre as médias dos valores de carga parasitária total
indicou diferença entre os grupos (ANOVA, p = 0,0491). Comparação adicional revelou que esta
diferença ocorreu apenas entre as médias dos grupos previamente injetados com pBK-CMV-Lc9
e pBK-CMV-Lc18 (Tukey, p<0,05). De fato, em dois de seis animais do grupo previamente
injetado com pBK-CMV-Lc9, não foi observada a presença de formas promastigotas na menor
diluição do macerado da secção de baço utilizado para avaliação da carga parasitária.
Além disso, não houve qualquer alteração relacionada ao tamanho do baço dos animais em
nenhum dos grupos infectados. Os valores encontrados (X ± SD), correspondentes ao peso do
baço, estão apresentados na Figura 12B.
96
carga parasitária total (log10)
10
A
8
*
6
4
2
0
2
% baço/peso corporal
B
1
Sa
lin
a
EL
s/
i
n
Sa fec
l
pB ina
EL
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K
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Lc
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V- 9 E
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K
-C
13
pB MV
EL
-L
K
c1
-C
4
M
E
VLc L
18
EL
0
.
Figura 12. Avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L. chagasi em
animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente.
Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a três séries de injeções
com 50 µL de salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMVLc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de eletroporação
(EL). Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, os animais foram desafiados
pela injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L.infantum/chagasi, exceto 6 animais do
grupo Salina (Salina EL s/ inf). Após aproximadamente 60 dias, os animais foram sacrificados e
o baço foi utilizado para determinação da carga parasitária por ensaio de diluição limitante, como
descrito em Material e Métodos. (A) carga parasitária total (log 10). (B) peso do baço em relação
ao peso corporal (valores em %). Os símbolos representam valores individuais e as barras
representam médias aritméticas. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey (p < 0,05) em relação
ao grupo pBK-CMV-Lc18.
97
5.2. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados com uma combinação de
plasmídeos codificando proteínas de L. chagasi
5.2.1. Avaliação da resposta imune humoral
Os resultados da avaliação da produção de anticorpos específicos, realizada por ELISA,
em amostras de soro obtidas 10 dias após três séries de injeção de uma mistura de plasmídeos
estão descritos abaixo.
A injeção de uma mistura (pool) de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBKCMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18), na presença ou na ausência de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL12, e o mesmo pool de plasmídeos injetados sem eletroporação, induziu a produção de anticorpos
da classe IgG reativos a extrato bruto de antígenos de L. chagasi (Figura 13). A comparação das
médias dos valores de densidade óptica obtidos para cada grupo revelou diferença
estatisticamente significante (ANOVA, p < 0,0001). Comparação adicional entre os grupos,
usando-se o pós-teste Tukey, mostrou a seguinte relação: pool de plasmídeos + pIL-12 EL > pool
de plasmídeos EL = pool de plasmídeos > pBK-CMV = Salina (p < 0,05).
Posteriormente, a mensuração de anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1 reativos a
extrato bruto de antígenos foi realizada. Anticorpos reativos com extrato bruto de antígenos de L.
infantum/chagasi de isotipo IgG2a foram detectados em todos os grupos que foram injetados com
pool de plasmídeos (Figura 13). A comparação estatística das médias de densidade óptica,
correspondentes à mensuração de IgG2a revelou diferença entre os grupos (ANOVA, p < 0,0001).
Além disso, comparação adicional entre as médias de densidade óptica obtidas para IgG2a
mostrou a seguinte relação: pool + pIL-12 EL > pool EL > pool s/ EL > pBK-CMV = Salina
(Tukey, p < 0,05). Finalmente, a medida de densidade óptica obtida para IgG1 do grupo injetado
apenas com pool de plasmídeo, sem eletroporação, foi a única com valor de média superior às médias
dos grupos controles Salina e pBK-CMV vazio (ANOVA, p < 0,003 e Tukey, p < 0,05). A proporção
IgG2a/IgG1 encontrada para os grupos que receberam eletroporação após as injeções, pool de
plasmídeos e pool de plasmídeos associado à pIL-12 e para o grupo injetado com o pool de
plasmídeos apenas, sem eletroporação foi de 3,89 ± 0,98; 5,18 ± 2,68 e 2,42 ± 1,31,
respectivamente.
98
1.0
IgG
*
*
*
Densidade Óptica (450 nm)
0.5
0.0
1.0
IgG1
*
0.5
0.0
1.0
IgG2a
*
*
*
0.5
0.0
EL lasm L asm
EL
l
V
m
E
M
as ol p -12 ol p
l
a
C
p
S
l
K
po pÍL po
pB poo
+
a
lin
EL
Figura 13. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos ao extrato bruto de antígenos de promastigotas de L. chagasi, de animais injetados com
um pool de plasmídeos recombinantes. Camundongos BALB/c (12 a 18 animais/grupo) foram
submetidos a três séries injeções de salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou 200
µg de um pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBKCMV-Lc18) acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmur-IL-12 (50 µg), por via
intramuscular seguido de eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o
pool de plasmídeos, sem EL. Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira série de injeção,
foram diluídas de 1:100 para a detecção de anticorpos IgG e diluídas de 1:1000 para a detecção
de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços
pré-sensibilizadas com 100 µL de extrato total de antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL. Os
símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores
de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação
aos grupos controles.
99
5.2.2. Avaliação da resposta imune celular
A resposta proliferativa e a produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5), por células esplênicas,
após a estimulação in vitro com um mitógeno (Con A), extrato bruto de antígenos de L. chagasi ou
proteína recombinante purificada (Lc9, Lc14 ou Lc18), foram avaliadas três a quatro semanas depois
de três séries de injeções de salina, plasmídeo pBK-CMV vazio, pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9,
pBK-CMV-13, pBK-CMV-14 e pBK-CMV-18) ou pool de plasmídeos acrescido de pcDNA3.1scmur-IL-12 (p-IL-12) seguido de eletroporação (EL) ou ainda, pool de plasmídeos sem eletroporação.
Os valores de cpm (X ± SD) encontrados quando as células esplênicas foram cultivadas, por
três dias, somente em meio de cultura ou meio de cultura contendo Con A ou, por cinco dias, em
meio de cultura ou meio de cultura contendo extrato bruto de antígenos de L.infantum/chagasi, estão
apresentados na Tabela 8.
A comparação dos valores de índices de proliferação [valor de cpm de células cultivadas na
presença de estímulo (Con A) / valor de cpm de células cultivadas somente com meio de cultura]
correspondentes a cada grupo de animais, não revelou diferença significativa entre os grupos (Figura
14A).
As suspensões de células esplênicas obtidas foram cultivadas também somente em meio de
cultura ou meio de cultura contendo Con A por 48 horas visando a avaliação da produção de
citocinas. A produção de IFN-γ, IL-4 e de IL-5 foi observada em todos os grupos avaliados (Figura
14C, E e G). Não houve diferença entre os grupos em relação a produção de IFN-γ como revelado
pela comparação entre as médias dos valores de concentração de IFN-γ obtidos. A produção de
IFN-γ, IL-4 ou de IL-5 não foi detectada no sobrenadante de células cultivadas somente em meio de
cultura.
Quando esplenócitos foram cultivados na presença de extrato bruto de antígenos de L.
chagasi por um período de cinco dias, os valores de índice de proliferação encontrados não
apresentaram diferença entre os grupos (Figura 14B). Os valores que deram origem a este resultado
estão apresentados na Tabela 8. Quando o cultivo das células foi realizado por 48 horas, para
avaliação da produção de citocinas, a concentração de IFN-γ (Figura 14D), IL-4 (Figura 14F) e IL-5
(Figura 14H) permaneceram abaixo do limite de detecção do ensaio em todos os grupos.
100
Tabela 8. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos
submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos.
Grupos de
camundongos
Condições de cultura
3 dias
Meio de cultura
(2 µg/mL)
Con A
Meio
de cultura
5 dias
Extrato bruto de
antígenos L. chagasi
(10 µg/mL)
Salina EL
pBK-CMV EL
443 ± 419
642 ± 362
15820 ± 2428
12930 ± 5048
576 ± 437
945 ± 599
781 ± 577
1324 ± 597
pool plasm EL
800 ± 708
10030 ± 6097
1223 ± 1280
1708 ± 986
pool plasm + pIL-12 EL
409 ± 199
14940 ± 8137
670 ± 432
1016 ± 453
pool de plasm
390 ± 220
17130 ± 6632
478 ± 281
1119 ± 572
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (5-6 animais/grupo). Esplenócitos
foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em
volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos.
m
EL
EL
as
12
m
pl
L-
ol
pI
po
+
as
300
200
100
0
H
m
0
G
as
10
F
EL
20
E
pl
V
EL
0
D
pl
M
a
5
C
ol
-C
lin
m
EL
EL
10
B
ol
K
Sa
12
m
pl
as
L-
as
ol
pI
po
+
pB
m
EL
85
65
45
25
A
po
as
pl
V
Ìndice de Proliferação
Con A
po
pl
ol
400
M
EL
400
-C
a
IFN-γγ (ng/mL)
30
po
K
lin
IL-4 (pg/mL)
300
200
100
po
ol
pB
Sa
IL-5 (pg/mL)
101
Extrato de antígenos
L. chagasi
300
200
100
0
102
Figura 14. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, injetados com um pool de plasmídeos recombinantes, após cultivo com
concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de antígenos de L. chagasi. Camundongos BALB/c (5
a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de
plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBKCMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18) acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1scmu-IL-12 (50 µg), por via intramuscular seguido de eletroporação (EL). Um grupo de animais
foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. A avaliação da proliferação
celular (A e B) e da produção de citocinas IFN-γ (C e D), IL-4 (E e F) e IL-5 (G e H) foram
realizadas entre 3 e 4 quatro semanas após a terceira série de injeção. Esplenócitos foram
cultivados com Con A a 2 µg/mL (A, C, E e G) ou extrato bruto de L .infantum/chagasi a 10
µg/mL (B, D, F e H). Para a avaliação de proliferação, o cultivo foi realizado por 3 dias (Con A)
ou 5 dias (extrato bruto) a 37o C e 5% de CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de
timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a
dosagem de IFN-γ (amostras individuais), IL-4 e IL-5 (pool), sobrenadantes das culturas de
células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após 48 horas de incubação e
utilizados em ELISA, como descrito em Material e Métodos.Os gráficos mostram valores de índice
de proliferação (A e B) e concentração de IFN-γ (ng/mL, C e D), IL-4 (pg/mL, E e F) e IL-5
(pg/mL, G e H). Os símbolos (A e B) representam valores individuais e as barras representam médias
aritméticas ± SD de cada grupo (C e D).
103
A resposta proliferativa e a produção de citocinas foram avaliadas também após o cultivo de
células esplênicas em meio de cultura ou meio de cultura contendo Lc9, Lc14 ou Lc18. Os valores de
cpm referentes a estes resultados estão apresentados na Tabela 9.
Os valores de índices de proliferação obtidos após a estimulação de esplenócitos com Lc9,
Lc14 ou com Lc8 não apresentaram diferença estatisticamente significante entre os grupos
(Figura 15A, B e C).
A produção de IFN-γ, avaliada pela mensuração por ELISA no sobrenadante das culturas,
foi observada em alguns grupos de animais após o cultivo com as proteínas recombinantes
correspondentes (Figura 15D, E e F). Contudo, a comparação das médias de cada grupo revelou
diferença estatística significante apenas quando as células foram cultivadas na presença de Lc9
(ANOVA, p=0,0126). Comparação adicional, usando o pós-teste de Tukey, mostrou que a
produção de IFN-γ foi significantemente maior no grupo de animais injetados com pool de
plasmídeos + p-IL-12 EL (0,32 ± 0,2 ng/mL), apresentando a seguinte relação entre os grupos:
pool de plasmídeos + p-IL-12 EL > pool de plasmídeos sem eletroporação = pBK-CMV vazio >
pool de plasmídeos EL = Salina (p < 0,05) . As citocinas IL-4 e IL-5 não foram detectadas em
nenhum dos grupos em nenhuma das condições de cultivo, seja na presença de Lc9, Lc4 ou Lc18
(dados não mostrados).
Tabela 9. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos de
grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos, cultivados
na presença ou na ausência de proteínas recombinantes de L. chagasi.
Grupos de
camundongos
Meio de
culturaa
Condições de cultura
5 dias
Lc9
Meio de
Lc14
culturab
(10µg/mL)
(10µg/mL)
Lc18
(10µg/mL)
Salina EL
624 ± 382
1668 ± 891
595 ± 559
2046 ± 544
3525 ± 944
pBK-CMV EL
945 ± 599
2579 ± 1321
672 ± 370
1886 ± 774
2340 ± 534
pool plasm EL
1447 ± 1292
696 ± 263
1505 ± 1545
1385 ± 403
2177 ± 510
pool plasm + pIL-12 EL
670 ± 432
2029 ± 885
942 ± 499
1843 ± 1022
4008 ± 4325
pool de plasm
478 ± 281
1518 ± 557
459 ± 275
1780 ± 647
2649 ± 840
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (5 a 6 animais/grupo).
Esplenócitos foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em
triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos.
a
células esplênicas cultivadas apenas em meio de cultura na mesma placa onde houve o cultivo com Lc9.
b
células esplênicas cultivadas apenas em meio de cultura na mesma placa onde houve o cultivo com Lc14 e Lc18.
104
Lc9
Lc14
Índice de Proliferação
80
60
C
B
A
Lc18
40
20
20
15
10
5
0
IFN-γγ (ng/mL)
2.0
D
E
F
1.5
1.0
*
0.5
V
EL
pl
pl
a
sm
as
m
EL
+p
IL
-1
2
EL
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M
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pB
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V
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m
EL
+p
IL
-1
2
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m
EL
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M
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a
pB
K
Sa
Sa
lin
a
pB
EL
K
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pl
as
pl
as
m
m
EL
+p
IL
-1
2
EL
po
ol
pl
as
m
0.0
Figura 15. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de
camundongos injetados com um pool de plasmídeos recombinantes, após cultivo com proteínas
recombinantes de L. chagasi. Camundongos BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a
três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de
um pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18)
acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg), por via intramuscular seguido de
eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem
eletroporação. A avaliação da proliferação celular (A, B e C) e da produção de IFN-γ (D, E e F)
foi realizada entre 3 e 4 quatro semanas após a terceira série de injeção. Esplenócitos foram
cultivados em meio de cultura, meio de cultura contendo Lc9 (A e D), Lc14 (B e E) ou Lc18 (C e
F) a 10 µg/mL. Para a avaliação de proliferação, o cultivo foi realizado 5 dias a 37o C e 5% de
CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e
as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ, sobrenadante das
culturas de células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após 48 horas de
incubação e utilizados em ELISA. *ANOVA seguido de pós-teste de Tukey (p < 0,05) em
comparação aos grupos pBK-CMV vazio e pool de plasmídeos sem eletroporação. Os símbolos
(A e B) representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada
grupo (C e D).
105
5.2.3. Avaliação da resposta imune humoral após desafio com L.infantum/chagasi
Os resultados da avaliação da produção de anticorpos específicos, realizada por ELISA, em
amostras de soro obtidas cerca de 60 dias após a injeção com promastigotas de L. chagasi foram
descritos abaixo.
Anticorpos da classe IgG reativos a extrato bruto de L. chagasi foram detectados em amostras
obtidas após o desafio com promastigotas, de grupos de animais previamente submetidos a três séries
de injeções com salina, pBK-CMV vazio, pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-13, pBKCMV-14 e pBK-CMV-18) ou pool de plasmídeos acrescido de pcDNA3.1sc-mu-IL-12 (p-IL-12),
todos estes grupos com injeção intramuscular seguida de eletroporação (EL) e ainda, um grupo
injetado com pool de plasmídeos sem eletroporação (Figura 16). Amostras de camundongos
somente injetados com salina, sem infecção, apresentaram valores de densidade óptica de 0,076 ±
0,012. A comparação das médias de cada grupo revelou diferença estatisticamente significativa entre
eles (ANOVA, p<0,0001). Comparação adicional mostrou a seguinte relação: pool + pIL-12 EL =
pool EL = pool s/ EL > Salina = Salina s/ inf = pBK-CMV vazio (Tukey, p < 0,01).
Em análise subseqüente, anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1 reativos a extrato bruto
de antígenos foram mensurados (Figura 16). Anticorpos de isotipo IgG2a foram detectados nos
três grupos previamente injetados com pool de plasmídeos. A comparação das médias de
densidade óptica, correspondentes à mensuração de IgG2a, revelou diferença estatisticamente
significativa entre os grupos (ANOVA, p < 0,0001) e, por comparação adicional encontrou-se a
seguinte relação: pool + pIL-12 EL = pool EL = pool s/ EL > pBK-CMV = Salina = Salina s/ inf
(Tukey, p < 0,001). Já em relação à detecção de anticorpos de isotipo IgG1, a comparação das
médias de densidade óptica obtidas revelou diferença significativa entre os grupos (ANOVA, p <
0,0033), contudo, a comparação adicional pelo pós-teste de Tukey revelou diferença significante
apenas entre o grupo injetado com pool de plasmídeos sem eletroporação e os grupos Salina sem
infecção e Salina infectado (p < 0,05). Finalmente, a proporção IgG2a/IgG1 foi de 4,60 ± 1,96; 4,38
± 2,92 e 3,04 ± 1,51 para os grupos injetados com pool de plasmídeos seguido de eletroporação,
com ou sem pIL-12 e para o grupo injetado com pool de plasmídeos sem eletroporação,
respectivamente.
106
1.0
IgG
*
*
*
Densidade Óptica (450 nm)
0.5
0.0
1.0
IgG1
*
0.5
0.0
1.0
IgG2a
*
*
*
0.5
0.0
c
EL asm L asm
fe a EL V EL
n
i
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pl E pl
M las
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ol L-12 ool
-C
a s Sa
p
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li
pB poo
Sa
+
Figura 16. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais previamente injetados com um
pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi.
Camundongos BALB/c (5 a 6 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com
salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos
(pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18) acrescido ou não de
plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg) por via intramuscular, seguida de eletroporação (EL).
Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação.
Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, cada grupo, exceto 6 animais do grupo
salina (salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi por via
intraperitonial. Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira série de injeção, foram diluídas
de 1:100 para a detecção de de anticorpos IgG e diluídas de 1:1000 para a detecção de anticorpos
IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços présensibilizadas com 100 µL de extrato total de antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL. Os símbolos
representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de
densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação
aos grupos controles.
107
5.2.4. Avaliação da resposta imune celular após desafio com L. chagasi
Células esplênicas de animais injetados com pool de plasmídeos, em qualquer das variações
testadas, com ou sem eletroporação, na presença ou na ausência de pIL-12, foram obtidas após
infecção experimental com promastigotas de L. chagasi e estimuladas in vitro com Con A, por três
dias, ou com extrato bruto de antígenos de L. chagasi, por 5 dias. Os valores de cpm encontrados,
para as condições descritas, estão apresentados na tabela 10.
A comparação entre as médias dos valores de índice de proliferação, encontrados após a
estimulação com Con A, não apresentou diferença estatisticamente significativa entre os grupos
(Figura 17A). Da mesma forma, a produção de IFN-γ e de IL-4 foi observada em todos os grupos
avaliados (Figura 17C e E). A comparação dos valores de concentração de IFN-γ obtidos para cada
grupo não apresentou diferença entre eles. Infelizmente, não foi possível avaliar a produção de IL-5
nestas mesmas amostras.
Os valores de índices de proliferação, correspondentes à condição onde extrato bruto de
antígenos de L. chagasi foi adicionado a cultura, não apresentaram valores de média
estatisticamente diferente entre os grupos (Figura 17B).
Na avaliação da produção de IFN-γ (Figura 17D), foi observado que em dois grupos
desafiados pela injeção de L. chagasi valores detectáveis de IFN-γ foram mensurados, animais
previamente injetados com salina (5,23 ± 12,14 ng/mL) e com pool de plasmídeos acrescido de pIL12 (5,34 ± 12,09 ng/mL). No entanto, quando as células de animais destes dois grupos foram
cultivadas somente em meio de cultura foi observada produção de IFN-γ (6,69 ± 11,98 ng/mL e 7,49
± 12,27 ng/mL, respectivamente) sem adição de estímulo exógeno, sendo que células de um animal
de cada grupo apresentaram os mesmos valores, acima do limite de detecção do ensaio, seja após
cultivo em meio de cultura ou em meio de cultura com extrato bruto de antígenos. Não foi possível
detectar IL-4 em nenhum dos grupos, permanecendo sempre abaixo do limite de detecção do ensaio
(Figura 17F).
108
Tabela 10. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos
submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos e desafiados com promastigotas de
L. chagasi.
Condições de cultura
Grupos de
camundongos
3 dias
5 dias
Extrato bruto de
antígenos
(10 µg/mL)
Meio de
cultura
Con A
(2 µg/mL)
Meio de
cultura
Salina sem infecção
Salina EL
1152 ± 565
1703 ± 677
30030 ± 13470
36710 ± 10860
2491 ± 1634
3666 ± 2045
4148 ± 1657
5415 ± 3156
pBK-CMV EL
1389 ± 846
33630 ± 16990
1682 ± 992
2889 ± 1546
pool plasm EL
667 ± 339
10810 ± 13040
3032 ± 2217
6967 ± 5483
pool plasm + pIL-12 EL
1684 ± 1009
43930 ± 20130
2224 ± 2378
3557 ± 2650
pool de plasm
1010 ± 216
29970 ± 10740
3117 ± 2842
8346 ± 4612
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Células
esplênicas foram obtidas aproximadamente 60 dias após a injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L.
chagasi e cultivadas a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e
Métodos.
109
Extrato de antígenos
L. chagasi
Ìndice de Proliferação
Con A
100
60
A
B
C
D
E
F
20
20
10
IFN-γγ (ng/mL)
0
125
75
25
20
10
0
IL-4 (pg/mL)
400
300
200
100
EL
K
po CM
po
V
o
ol
E
pl l pl
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as
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m
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EL
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pB
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2
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EL
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a
Sa
l
pB
Sa
lin
a
EL
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in
f
0
Figura 17. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção
de promastigotas de L. chagasi, após cultivo com concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de antígenos
de L. chagasi. Camundongos BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções
com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos,
acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg), por via intramuscular seguida de
eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem
eletroporação. Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, cada grupo, exceto 6 animais do
grupo Salina (salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L .infantum/chagasi por
via intraperitonial. A avaliação da proliferação celular (A e B) e da produção de citocinas IFN-γ (C e D) e
IL-4 (E e F) foi realizada cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados com Con A a 2
µg/mL (A, C, E) ou extrato bruto de L. chagasi a 10 µg/mL (B, D, F). Para a avaliação de proliferação, o
cultivo foi realizado por 3 dias (Con A) ou 5 dias (extrato bruto) a 37o C e 5% de CO2 em atmosfera
úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas
por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais) e IL-4 (pool de sobrenadante),
sobrenadantes das culturas de células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após 48 horas
de incubação e utilizados em ELISA. Os gráficos mostram valores de índice de proliferação (A e B) e
concentração de IFN-γ (ng/mL, C e D) e IL-4 (pg/mL, E e F). Os símbolos (A e B) representam valores
individuais e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada grupo (C e D).
110
A resposta proliferativa e a capacidade de produção de citocinas após estimulação in vitro
com Lc9, Lc14 e Lc18 foram avaliadas para cada grupo e estão descritos abaixo.
Na presença de Lc9, mesmo em três concentrações diferentes, 10 µg/mL, 1 µg/mL e 0,1
µg/mL, esplenócitos murinos obtidos após a injeção de promastigotas de L. chagasi apresentaram
valores de índices de proliferação celular que, quando comparados, não resultou em diferença
significativa entre os grupos (Figura 18A, B e C). Os valores de cpm que deram origem a esses
resultados estão descritos na Tabela 11.
Em avaliação subseqüente, para mensuração da produção de IFN-γ, por ELISA (Figura
18D), foi observado que células esplênicas de um dos grupos de animais, previamente injetado
com pool de plasmídeos e pIL-12, produziram IFN-γ após cultivo com Lc9 (7,77 ± 6,43 ng/mL) e
esta produção foi estatisticamente significativa quando comparada ao grupo somente injetado
com salina e animais infectados previamente injetados com pBK-CMV vazio (ANOVA, p =
0,0116; Tukey, p < 0,05). A produção de IL-4 não foi detectada no sobrenadante da cultura de
células de nenhum dos grupos, permanecendo sempre abaixo do limite de detecção do ensaio.
EL
s/
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a
pB
EL
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po
V
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EL
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pl
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EL
m
+p
I
po L-1
2
ol
pl
as
m
Sa
lin
a
IFN-γγ (ng/mL)
Índice de Proliferação
111
20
A
10
20
0
B
10
0
20
C
10
0
20
D
*
15
10
5
0
112
Figura 18. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados
pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc9 recombinante. Camundongos
BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50
µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9,
pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18) acrescido ou não de plasmídeo
pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg) por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Um grupo
de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. Aproximadamente
30 dias após a terceira série de injeção, cada grupo, exceto 6 animais do grupo Salina (salina EL
s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi por via intraperitonial. A
proliferação celular (A, B e C) e a produção de IFN-γ (D) foram avaliadas cerca de 60 dias após a
infecção. Esplenócitos foram cultivados em meio de cultura apenas ou em meio de cultura
contendo Lc9 nas concentrações de 10 µg/mL (A e D), 1 µg/mL (B) ou 0,1 µg/mL (C). Para a
avaliação da proliferação celular, o cultivo foi realizado por 5 dias 37o C e 5% de CO2 em
atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as
células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais),
sobrenadantes das culturas de células, incubadas na presença de 10 µg/mL de Lc9, foram
coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA, como descrito em Material e
Métodos. * p < 0,05 em comparação aos grupos Salina sem infecção e pBK-CMV vazio
infectado. Os símbolos (A, B e C) representam valores individuais e as barras representam médias
aritméticas ± SD de cada grupo (D).
113
Já a incubação in vitro com Lc14 e Lc18, nas concentrações de 0,1 µg/mL e 1 µg/mL, não
resultou em proliferação celular que apresentasse valores de índice de proliferação
significativamente diferente entre os grupos (Figura 19A e B, 20A e B). Os valores de cpm
obtidos após estimulação com Lc14 ou Lc18 foram apresentados na Tabela 12. Quanto à
produção de citocinas, apenas um dos grupos, animais injetados com salina e infectados com L.
chagasi, apresentou valor de média da concentração de IFN-γ estatisticamente superior em
relação à média obtida para o grupo de animais não infectados (ANOVA, p = 0,0051 e Tukey, p
< 0,05) e do grupo injetado com pBK-CMV e infectado ( p <001, Figura 19C). Este resultado não
foi observado em um experimento anterior no qual células de animais infectados, previamente
injetados com salina foram cultivadas na presença de 10 µg/mL de Lc14 (Figura 10D). A
comparação das médias da concentração de IFN-γ encontradas após o cultivo com Lc18 não
apresentou diferença entre os grupos avaliados. A produção de IL-4 não foi detectada em
qualquer condição de estímulo, quer seja na presença de Lc14 ou de Lc18.
Tabela 11. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados em meio de cultura ou meio de cultura com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de
grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos, e
desafiados com promastigotas de L. chagasi
Condições de cultura
5 dias
Grupos de
camundongos
Meio de
cultura
Lc9
(0,1 µg/mL)
Lc9
(1 µg/mL)
Lc9
(10 µg/mL)
Salina sem infecção
2311 ± 1677
4640 ± 2003
5178 ± 1595
7813 ± 3337
Salina EL
2704 ± 1443
5053 ± 2309
5989 ± 2044
6344 ± 2252
pBK-CMV EL
1478 ± 1044
3368 ± 1925
5372 ± 1171
7058 ± 741
pool plasm EL
2775 ± 2060
6214 ± 4041
8535 ± 3292
7009 ± 3163
pool plasm + pIL-12 EL
1816 ± 999
4141 ± 2780
6261 ± 3734
8265 ± 4928
pool de plasm
3618 ± 1595
6455 ± 2419
7896 ± 2643
9074 ± 3730
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Células
esplênicas foram obtidas aproximadamente 60 dias após a injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L.
chagasi e cultivadas a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e
Métodos.
114
Tabela 12. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados em meio de cultura ou meio de cultura com Lc14 ou Lc18 em diferentes concentrações,
obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos,
e desafiados com promastigotas de L. chagasi
Condições de cultura
5 dias
Grupos de
camundongos
Salina sem infecção
2736 ± 1854
Lc14
(0,1 µg/mL)
7829 ± 1926
Salina EL
2790 ± 1631
9118 ± 3832
10410 ± 3864
pBK-CMV EL
2113 ± 1089
5642 ± 2759
7891 ± 1262
pool plasm EL
2477 ± 1661
7511 ± 5387
7430 ± 3329
pool plasm + pIL-12 EL
1830 ± 1555
7145 ± 2897
8328 ± 3132
pool de plasm
3448 ± 1594
7953 ± 1787
11340 ± 4304
Meio de cultura
Grupos de
camundongos
Lc14
(1 µg/mL)
8677 ± 2155
Condições de cultura
5 dias
Salina sem infecção
1914 ± 1511
Lc18
(0,1 µg/mL)
6115 ± 3028
Salina EL
2179 ± 1241
4037 ± 1799
1193 ± 544
pBK-CMV EL
989 ± 629
2889 ± 1593
1386 ± 569
pool plasm EL
2491 ± 1859
4391 ± 5314
1221 ± 506
pool plasm + pIL-12 EL
1275 ± 922
2682 ± 1359
1019 ± 529
pool de plasm
2459 ± 1593
4599 ± 2264
1346 ± 360
Meio de cultura
Lc18
(1 µg/mL)
1743 ± 509
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Células
esplênicas foram obtidas aproximadamente 60 dias após a injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L.
chagasi e cultivadas a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e
Métodos.
115
25.0
A
Ìndice de Proliferação
12.5
0.0
25.0
B
12.5
0.0
30
C
*
IFN-γγ (ng/mL)
24
18
12
6
Sa
lin
a
EL
s/
i
nf
Sa ec
li
pB na
EL
KCM
po
V
ol
EL
po
pl
as
ol
m
pl
as
EL
m
+p
IL
-1
po
2
ol
pl
as
m
0
Figura 19. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção
de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc14 recombinante. Camundongos BALB/c (5 a 6
animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBKCMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos, acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmuIL-12 (50 µg) por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado
apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. Aproximadamente 30 dias após a terceira série de
injeção, cada grupo, exceto 6 animais do grupo Salina (salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107
promastigotas de L. chagasi por via intraperitonial. A proliferação celular (A e B) e a produção de IFN-γ
(C) foram avaliadas cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados com Lc14 nas
concentrações de 1µg/mL (A) ou 0,1 µg/mL (B). Para a avaliação de proliferação celular, o cultivo foi
realizado por 5 dias. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células
foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), sobrenadantes das
culturas de células, incubadas na presença de 1 µg/mL de Lc14, foram coletados após 48 horas de
incubação e utilizados em ELISA. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey (p < 0,05) em relação ao
grupo injetado com salina, sem infecção e ao grupo injetado com pBK-CMV vazio, infectado. Os
símbolos (A e B) representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas ± SD de
cada grupo (C).
116
20
A
Ìndice de Proliferação
10
0
20
B
10
0
IFN-γγ (ng/mL)
20
C
10
Sa
lin
a
EL
s/
Sa inf
li
pB na
EL
KCM
po po
V
ol
EL
ol
p
pl
as lasm
m
EL
+p
IL
-1
2
po
EL
ol
pl
as
m
0
Figura 20. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados
pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc18 recombinante. Camundongos
BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50
µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos, acrescido ou não
de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg) por via intramuscular seguida de eletroporação
(EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação.
Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, cada grupo, exceto 6 animais do grupo
Salina (salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi por via
intraperitonial. A proliferação celular (A e B) e a produção de IFN-γ (C) foram avaliadas cerca de
60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados em meio de cultura apenas ou em meio de
cultura contendo Lc18 nas concentrações de 1µg/mL (A) ou 0,1 µg/mL(B). Para a avaliação de
proliferação celular, o cultivo foi realizado por 5 dias. Após este período, 1 µCi de timidina
tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem
de IFN-γ (amostras individuais), sobrenadantes das culturas de células, incubadas na presença de
1 µg/mL de Lc18, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA. Os
símbolos (A e B) representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas ± SD de
cada grupo (C).
117
5.2.5. Avaliação de proteção contra infecção por L. chagasi
Os resultados da avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L.
chagasi, realizada por diluição limitante cerca de oito semanas após a infecção, estão descritos
abaixo.
A injeção de uma mistura de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMVLc14 e pBK-CMV-Lc18), quer seja com ou sem eletroporação, na presença ou na ausência de
pcDNA3.1-scmu-IL-12, não induziu diminuição da carga parasitária total no baço de
camundongos, após desafio com promastigotas de L. chagasi. (Figura 21A). No entanto, a
comparação entre as médias indicou diferença entre os grupos (ANOVA, p = 0,026).
Comparação adicional mostrou que esta diferença ocorreu entre a média obtida para o grupo
injetado com pool de plasmídeos associado à pIL-12 e a média do grupo injetado previamente
apenas com salina (Tukey, p < 0,05), revelando um ligeiro aumento na carga parasitária mesmo
na presença de IL-12. Contudo, não houve alteração significativa relacionada ao tamanho do baço
dos animais em nenhum dos grupos infectados (Figura 21B).
Um mapa qualitativo da resposta imune murina aos diferentes imunógenos utilizados para
injeção adminsitrados como um pool de plasmídeos, antes e após o desafio com L. chagasi, está
apresentado no Apêndice C.
118
carga parasitária total (log10)
10
A
*
8
6
4
2
0
2
% baço/peso corporal
B
1
Sa
lin
a
EL
s/
in
fe
c
Sa
lin
a
pB
EL
K
-C
M
V
po
EL
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lp
ol
la
sm
pl
as
EL
m
+p
IL
-1
2E
L
po
ol
pl
as
m
0
Figura 21. Avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L. chagasi. em
animais previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes. Camundongos
BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50
µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9,
pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18) acrescido ou não de plasmídeo
pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg) por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Um grupo
de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. Aproximadamente
30 dias após a terceira série de injeção, cada grupo, exceto 6 animais do grupo Salina (salina EL
s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi por via intraperitonial. Após
aproximadamente 60 dias, os animais foram sacrificados e o baço foi utilizado para determinação
da carga parasitária por ensaio de diluição limitante, como descrito em Material e Métodos. (A)
carga parasitária total (log 10). (B) peso do baço em relação ao peso corporal (valores em %). Os
símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas. * ANOVA
seguido de pós-teste de Tukey (p < 0,05) em relação ao grupo Salina infectado.
119
5.3. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados DNA plasmideal seguido por
proteína recombinante – DNA primer/proteína booster
5.3.1. Avaliação da resposta imune humoral
Os resultados da avaliação da produção de anticorpos específicos, realizada por ELISA,
em amostras de soro obtidas 10 dias após três séries de injeção de plasmídeo estão descritos
abaixo.
O grupo de camundongos injetado com pBK-CMV-Lc9 nas duas primeiras séries de injeções
seguida pela administração de Lc9 associada a saponina na última dose produziu anticorpos da classe
IgG reativos com o extrato bruto de antígenos de L. chagasi. O valor de densidade óptica (X ± SD),
correspondente à mensuração para este grupo, foi de 0,287 ± 0,031. A produção de anticorpos
específicos também foi observada para os grupos de animais injetados com Lc9 associada à
saponina ou injetados somente com pBK-CMV-Lc9 nas três séries de injeções, cujos valores de
densidade óptica foram de 0,381 ± 0,035 e 0,137 ± 0,042 (Figura 22). A comparação das médias
dos valores de densidade óptica revelou diferença estatisticamente significante entre os grupos
(ANOVA, p < 0,0001) e apresentou a seguinte relação: Lc9/saponina > pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina
> pBK-CMV-Lc9 > pBK-CMV = Saponina = Salina (Tukey, p<0,001).
Posteriormente, foram realizados ensaios para mensuração de anticorpos das subclasses
IgG2a e IgG1 reativos a extrato bruto de antígenos. Anticorpos de ambas subclasses foram
detectadas em amostras obtidas do grupo Lc9/saponina e do grupo pBK-CMV-Lc9/Lc9 sap
(Figura 22). A comparação das médias de densidade óptica, correspondentes à mensuração de IgG2a
revelou diferença estatisticamente significativa entre os grupos (ANOVA, p < 0,0001). Comparação
adicional entre cada dois grupos mostrou a seguinte relação: Lc9/saponina = pBK-CMV-Lc9/Lc9
saponina > pBK-CMV-Lc9 > pBK-CMV = Saponina = Salina (Tukey, p < 0,05). Finalmente, a
comparação das médias de densidade óptica, correspondentes à mensuração de IgG1, também revelou
diferença estatisticamente significativa entre os grupos (ANOVA p < 0,0001) e a seguinte relação foi
encontrada entre os grupos: Lc9/saponina > pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina > pBK-CMV-Lc9 = pBKCMV = Saponina = Salina (Tukey, p < 0,001). A proporção da média de densidade óptica,
relacionada à mensuração de IgG2a e de IgG1, para o grupo injetado com Lc9 associada à saponina,
foi de 0,65 ± 0,14 enquanto que para o grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 apenas ou com pBKCMV-Lc9 seguido de Lc9/saponina foi de 2,71± 2,0 e 2,27± 1,77; respectivamente.
120
1.2
IgG
0.8
*
*
Densidade Óptica (450 nm)
0.4
*
0.0
1.2
IgG1
*
0.8
*
0.4
0.0
1.2
0.8
IgG2a
*
*
*
0.4
0.0
a
EL nin
EL nina
EL
EL
9
a
V
9
o
o
c
n
c
M
p
p
li
L
a
L
-C /sa
VSa Sa
V- nin
K
9
M
M
C
C po
pB Lc
KK- /sa
B
B
p
p Lc9
+
Figura 22. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos a extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais injetados com DNA plasmideal e
proteína recombinante Lc9. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram submetidos a três
séries de injeções com salina ou 100 µg de saponina, 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, 100
µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina ou 50 µg de pBK-CMV-Lc9. Um outro grupo
experimental foi injetado com 50 µg de pBK-CMV-Lc9 nas duas primeiras séries de injeção e
100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina na última dose. As injeções com saponina ou
Lc9/saponina foram administradas por via subcutânea. As injeções de salina ou DNA plasmideal
foram administradas por via intramuscular seguida por eletroporação (EL). Amostras de soro,
obtidas 10 dias após a terceira série de injeção, foram diluídas de 1:200 para a detecção de
anticorpos IgG e diluídas de 1:500 para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em
duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL de extrato
total de antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as
barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de
pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.
121
No ensaio para avaliação de anticorpos da classe IgG reativos a Lc9, os grupos de animais
injetados com Lc9/saponina, pBK-CMV-Lc9 seguido de Lc9/saponina ou pBK-CMV-Lc9
exibiram valores de densidade óptica significativamente maiores (2,447 ± 0,212; 2,531 ± 0,114,
1,881 ± 0,331, respectivamente) que os grupos de animais que receberam salina, saponina ou
pBK-CMV vazio (Figura 23). A comparação das médias dos valores de densidade óptica revelou
diferença estatisticamente significativa entre os grupos e apresentou a seguinte relação:
Lc9/saponina = pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina > pBK-CMV-Lc9 > pBK-CMV = Saponina =
Salina (ANOVA: p<0,0001, pós-teste de Tukey: p<0,001).
Como na diluição previamente avaliada não foi possível discriminar entre os valores de
densidade óptica obtidos para os grupos injetados com Lc9/saponina e pBK-CMV-Lc9 seguido
de Lc9/sap, uma curva de diluição foi realizada entre 1:200 e 1:125.000. Assim, os valores de
densidade óptica (X ± SD) obtidos na leitura realizada a partir da diluição de 1:5000 foram
comparados por ANOVA seguido de pós-teste de Tukey. Os valores de densidade óptica
encontrados para o grupo injetado com Lc9/saponina (2,105 ± 0,226) foi superior aos valores
encontrados para o grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 seguido de Lc9/saponina (1,757 ± 0,299)
e aos valores encontrados para o grupo injetado somente com pBK-CMV-Lc9 (0,378 ± 0,238,
ANOVA, p < 0,0001 e Tukey, p < 0,05, dados não mostrados).
Adicionalmente, a mensuração de anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1 específicos
para Lc9 mostrou que, na diluição avaliada, o único grupo a apresentar anticorpos de ambas
subclasses foi o grupo injetado com Lc9/saponina, apresentando valores de densidade óptica (X ±
SD) de 0,355 ± 0,172 e 1,183 ± 0,270, respectivamente (Figura 23). A comparação das médias
obtidas revelou diferença significante entre os grupos, tanto para IgG2a como para IgG1
(ANOVA, p < 0,0001 e p<0,001, respectivamente). A comparação adicional, usando pós-teste de
Tukey, apresentou a seguinte relação entre os grupos: Lc9/saponina = pBK-CMV-Lc9/Lc9
saponina > pBK-CMV-Lc9 = pBK-CMV = Saponina = Salina (IgG2a, p < 0,001) e Lc9/saponina
> pBK-CMV-Lc9/Lc9 = pBK-CMV-Lc9 = pBK-CMV = Saponina = Salina (IgG1, p < 0,001).
Finalmente, a proporção entre os valores de densidade óptica obtidos para IgG2a e IgG1
encontrada para o grupo injetado com Lc9/saponina foi de 0,29 ± 0,10 enquanto que para o grupo
injetado com pBK-CMV-Lc9 seguido de Lc9/saponina foi de 1,54 ± 0,81.
122
3
IgG
*
IgG1
*
*
*
2
Densidade Óptica (450 nm)
1
0
2
1
0
2
1
IgG2a
*
*
0
a
EL EL
EL nina
EL nin
9
a
V
c
c9
M apo
l in a p o
-L V-L ina
a
C
V
s
S
S
M
M on
K 9/
-C K-C sap
p B Lc
K
/
p B pB L c9
+
Figura 23. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos a Lc9, de animais injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9.
Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com salina
ou 100 µg de saponina, 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, 100 µg de Lc9 associada a 100 µg
de saponina ou 50 µg de pBK-CMV-Lc9. Um outro grupo experimental foi injetado com 50 µg
de pBK-CMV-Lc9 nas duas primeiras séries de injeções e 100 µg de Lc9 associada a 100 µg de
saponina na última dose. As injeções com saponina ou Lc9/saponina foram administradas por via
subcutânea. As injeções de salina ou DNA plasmideal foram administradas por via intramuscular
seguida por eletroporação (EL). Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira série de
injeção, foram diluídas de 1:200 para a detecção de anticorpos IgG e diluídas de 1:350.000 para a
detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de
96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL Lc9 a 5 µg/mL. Os símbolos representam valores
individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. *
ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.
123
5.3.2. Avaliação da resposta imune celular
A resposta proliferativa e a produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5), por células esplênicas,
foram avaliadas após estimulação in vitro com um mitógeno, Con A, ou com o antígeno Lc9 cerca de
3 a 4 semanas após as séries de injeções realizadas.
A comparação das médias dos valores de índice de proliferação de cada um dos grupos,
obtidos a partir da estimulação com Con A por 3 dias, não apresentou diferença significativa. (Figura
24A). Os valores de cpm obtidos para esta avaliação estão descritos na Tabela 13. Da mesma forma,
a comparação das médias dos valores de concentração de IFN-γ não apresentou diferença
significativa em nenhum dos grupos testados. Todos os grupos foram capazes de produzir IL-4 e IL-5
após estimulação com Con A, contudo, em alguns grupos a concentração encontrada para estas
citocinas foi muito próxima ao limite de detecção do ensaio. (Figura 24C e D). As concentrações de
IFN-γ, IL-4 ou IL-5 de células mantidas em meio de cultura por 48 horas ficaram abaixo do nível de
detecção dos ensaios (0,1 ng/mL; 20 pg/mL e 40 pg/mL, respectivamente).
Tabela 13. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a
três séries de injeções com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9.
Condições de cultura
Grupos de
camundongos
3 dias
Meio
de cultura
Con A
(0,75 µg/mL)
Salina EL
493 ± 175
3755 ± 2599
Saponina
432 ± 122
3470 ± 1728
pBK-CMV EL
605 ± 172
3791 ± 2038
Lc9/saponina
492 ± 280
3429 ± 1355
pBK-CMV-Lc9 EL
359 ± 94
6691 ± 1312
pBK-CMV-Lc9 EL/ Lc9/sap
946 ± 662
5513 ± 1281
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Esplenócitos
foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em
volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos.
Sa
li
Sa na
EL
po
ni
pB na
EL
KCM
Lc
V
9
EL
pB /sa
p
on
pB K-C
in
M
KCM V-L a
c9
VLc
EL
9
EL
/L
c9
IL-5 (pg/mL)
IL-4 (pg/mL)
IFN-γγ (ng/mL)
Índice de Proliferação
124
40
0
100
240
A
30
20
10
30
0
B
20
10
80
C
60
40
20
0
200
D
160
120
80
40
0
125
Figura 24. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9, após cultivo com
concanavalina A (Con A). Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram submetidos a três
séries de injeções com salina ou 100 µg de saponina, 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, 100
µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina ou 50 µg de pBK-CMV-Lc9. Um outro grupo
experimental foi injetado com 50 µg de pBK-CMV-Lc9 nas duas primeiras séries de injeções e
100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina na última dose. As injeções com saponina ou
Lc9/saponina foram administradas por via subcutânea. As injeções de salina ou DNA plasmideal
foram administradas por via intramuscular seguida por eletroporação (EL). A avaliação da
proliferação celular (A) e da produção de citocinas IFN-γ (B), IL-4 (C) e IL-5 (D) foram
realizadas entre 3 e 4 quatro semanas do término das injeções. Esplenócitos foram cultivados com
Con A (0,75 µg/mL) por 3 dias a 37o C e 5% de CO2 em atmosfera úmida para avaliação de
proliferação celular. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as
células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), IL-4
e IL-5 (pool), sobrenadantes das culturas de células, incubadas nas mesmas condições descritas
acima, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA. Os gráficos mostram
valores de índice de proliferação (A), concentração de IFN-γ em ng/mL (B), IL-4 (C) e IL-5 (D)
em pg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias
aritméticas.
126
Para avaliação da resposta imune específica, foram avaliadas a resposta proliferativa e a
produção de citocinas por esplenócitos estimulados in vitro com Lc9 por um período de 5 dias e de 48
horas, respectivamente.
Os valores de cpm (X ± SD) encontrados quando as células esplênicas foram cultivadas em
meio de cultura ou meio de cultura contendo Lc9 nas concentrações de 0,1 µg/mL, 1 µg/mL ou 10
µg/mL estão apresentados na Tabela 14. Os valores de índice de proliferação encontrados, em
esplenócitos estimulados com Lc9 na concentração de 0,1 µg/mL, para os grupos injetados com
Lc9/saponina (6,7 ± 2,3) ou com pBK-CMV-Lc9 seguido de Lc9/saponina (3,6 ± 1,4) foram
superiores aos valores encontrados para os demais grupos (relação entre os grupos: Lc9/saponina >
pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina > pBK-CMV-Lc9 = pBK-CMV = Saponina = Salina, ANOVA, p <
0,0001 e Tukey, p < 0,05), Figura 25C. Houve também uma diferença significativa entre os
grupos quando os valores de índice de proliferação obtidos a partir do cultivo de células
esplênicas com 1 µg/mL ou 10 µg/mL de Lc9 foram comparados (ANOVA, p < 0.0003 e p <
0,0001, respectivamente). A comparação adicional pelo pós-teste de Tukey revelou a seguinte
relação entre os grupos: pBK-CMV-Lc9/Lc9 sap = Lc9/sap > pBK-CMV-Lc9 saponina = pBKCMV = Saponina = Salina (para 10 µg/mL de Lc9, p < 0,01) e Lc9/saponina > pBK-CMVLc9/Lc9 saponina = pBK-CMV-Lc9 = pBK-CMV = Saponina = Salina (para 10 µg/mL de Lc9, p
< 0,05), Figura 25A e B.
127
Tabela 14. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a
três séries de injeções com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9.
Condições de cultura
5 dias
Grupos de
camundongos
Salina EL
784 ± 322
Lc9
(0,1 µg/mL)
839 ± 427
Saponina
964 ± 275
962 ± 299
1142 ± 515
1034 ± 552
pBK-CMV EL
770 ± 254
1015 ± 487
1482 ± 958
999 ± 294
Lc9/saponina
910 ± 388
5655 ± 1959
8400 ± 4507
10192 ± 4766
pBK-CMV-Lc9 EL
651 ± 349
919 ± 408
1131 ± 621
2183 ± 1283
pBK-CMV-Lc9 EL/ Lc9/sap
786 ± 626
2153 ± 621
2440 ± 1020
5205 ± 2295
Meio de cultura
Lc9
(1 µg/mL)
1099 ± 652
Lc9
(10 µg/mL)
1420 ± 628
Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Esplenócitos
foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em
volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos.
A média da concentração de IFN-γ do grupo de animais injetado com Lc9/saponina (13,9
± 12,76 ng/mL) foi superior às médias obtidas para o grupo pBK-CMV-Lc9 (1,2 ± 0,9 ng/mL) e
pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina (1,9 ± 0,9 ng/mL). A comparação das médias da concentração de
IFN-γ entre os grupos mostrou a seguinte relação: Lc9/saponina > pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina =
pBK-CMV-Lc9 = pBK-CMV = Saponina = Salina (ANOVA, p < 0,0005, pós-teste de Tukey, p <
0,01, Figura 25D). Os valores de concentração de IFN-γ dos animais dos grupos controles Salina.
Saponina e pBK-CMV vazio ficaram abaixo do nível de detecção do ensaio (0,1 ng/mL). As
concentrações de IL-4 e IL-5 foram avaliadas apenas no pool de sobrenadantes de células
cultivadas na presença de Lc9. A produção de IL-4 e de IL-5 foi detectada no sobrenadante das
células dos animais do grupo injetado com Lc9/saponina (29 pg/mL e 549 pg/mL,
respectivamente) enquanto que para os demais grupos os valores estiveram sempre abaixo do
limite de detecção do ensaio, 20 pg/mL e 40 pg/mL, respectivamente (Figura 25E e F).
Um mapa qualitativo da resposta imune murina à rLc9, administrada em diferentes
preparações, está apresentado no Apêndice C.
128
A
*
IFN-γγ (ng/mL)
20
10
20
10
0
30
20
10
*
*
Sa
l
in
a
Sa EL
p
pB on
i
K
-C na
M
Lc
V
pB
EL
pB 9/s
a
K
K
po
-C
C
n
M
M
in
VLc V-L a
c
9
EL 9 E
L
/L
c9
/s
ap
0
*
5
4
3
2
1
0
E
30
20
10
0
600
C
D
10
40
*
IL-4 (pg/mL)
B
IL-5 (pg/mL)
Índice de Proliferação
0
30
30
500
F
400
300
200
100
0
Sa
lin
Sa a E
pB pon L
K- in
Lc CM a
pB
K pB 9/s V E
-C K
a
L
M -C po
V- M ni
Lc V- na
L
9
EL c9
/L EL
c9
/s
ap
30
Figura 25. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9, após cultivo com Lc9.
Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com salina ou 100
µg de saponina, 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, 100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina ou
50 µg de pBK-CMV-Lc9. Um outro grupo experimental foi injetado com 50 µg de pBK-CMV-Lc9 nas
duas primeiras séries de injeções e 100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina na última dose. As
injeções com saponina ou Lc9/saponina foram administradas por via subcutânea. As injeções de salina ou
DNA plasmideal foram administradas por via intramuscular seguida por eletroporação (EL). A avaliação
da proliferação celular (A, B e C) e da produção de citocinas IFN-γ (D), IL-4 (E) e IL-5 (F) foi realizada
entre 3 e 4 quatro semanas do término das injeções. Esplenócitos foram cultivados em meio de cultura ou
meio de cultura contendo Lc9 a 10µg/mL (A, D, E e F), 1µg/mL (B) ou 0,1µg/mL (C). Para a avaliação de
proliferação, o cultivo foi realizado por 5 dias a 37o C e 5% de CO2 em atmosfera úmida. Após este
período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas.
Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), IL-4 e IL-5 (pool), sobrenadantes das culturas de células,
incubadas na presença de 10µg/mL de Lc9, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em
ELISA, como descrito em Material e Métodos. Os gráficos (A, B e C) mostram valores de índice de
proliferação e concentração de IFN-γ em ng/mL (D), IL-4 (E) e IL-5 (F) em pg/mL. Os símbolos
representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas. * ANOVA seguido de pósteste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.
129
6. DISCUSSÃO
A leishmaniose visceral é, ainda, um grave problema em saúde pública e em medicina
veterinária ocorrendo principalmente em países em desenvolvimento (WHO, 2002). As medidas
adotadas pelos órgãos públicos de saúde para o controle da doença têm-se mostrado ineficazes ao
longo dos anos, de modo que a leishmaniose visceral apresenta-se em elevada expansão em todo
mundo, inclusive no Brasil. Isso ocorre, em parte, porque tais medidas são frequentemente
descontinuadas e de difícil execução. Uma alternativa para o controle da leishmaniose visceral
humana é o controle da infecção no cão, principal hospedeiro reservatório do parasito. Assim, o
desenvolvimento de uma vacina efetiva contra leishmaniose visceral canina, que vise à
interrupção do ciclo de transmissão do parasito, é um dos objetivos pelo qual nosso grupo de
pesquisa vem trabalhando nos últimos anos.
No presente trabalho, o efeito de diferentes protocolos de imunização, em camundongos,
usando moléculas candidatas a componentes de uma vacina contra leishmaniose visceral canina,
foi avaliado com a finalidade de se identificar uma estratégia de imunização que favorecesse a
indução de uma resposta imune celular predominantemente do tipo Th1. Assim, a utilização de
plasmídeos como vetor de expressão de DNA foi a base deste trabalho. Os protocolos utilizados
consistiram da injeção de plasmídeos capazes de levar à expressão in vivo de cDNAs
codificadores de proteínas de formas amastigotas de L. chagasi. Estes plasmídeos foram
administrados isoladamente por injeção intramuscular seguida de eletroporação, ou como uma
mistura de plasmídeos, associados ou não a plasmídeo capaz de levar à expressão de IL-12
murina, ou, ainda, pela administração inicial de DNA plasmideal e posterior reforço com a
proteína recombinante correspondente. A resposta imune foi caracterizada nas duas vertentes,
humoral e celular. A produção de anticorpos específicos e a reatividade de esplenócitos présensibilizados ao extrato bruto de antígenos de promastigotas de L. infantum/chagasi, bem como,
com cada uma das proteínas recombinantes, foram avaliadas. Dessa forma, o perfil de resposta
imune obtido seguindo-se os protocolos utilizados foi determinado. Adicionalmente, os animais
foram expostos ao agente etiológico da leishmaniose visceral por infecção experimental com
promastigotas de L. chagasi. Assim, a capacidade de responder ao estímulo antigênico natural foi
também avaliada.
130
Embora não completamente esclarecida, a resposta imune capaz de conferir proteção
contra a leishmaniose visceral no cão é dita ser predominantemente celular com produção de
citocinas por células T CD4+ do tipo Th1 (PINELLI et al., 1995; RHALEM et al., 1999). Dessa
forma, a base para o desenvolvimento de uma vacina contra leishmaniose visceral canina implica
em induzir uma resposta imune com tais características previamente à exposição ao agente
causal.
O modelo murino apresenta algumas vantagens em relação ao uso do cão para uma
análise inicial de antígenos candidatos a componente de uma vacina. Este é um modelo de fácil
manipulação e, principalmente, tem comercialmente disponível os reagentes necessários para
análise da resposta imune. Usando este modelo, a indução de uma resposta imune específica foi
avaliada após a injeção de rLc9 em salina, ou associada a cinco diferentes adjuvantes incluindo
adjuvante de Freund, saponina, hidróxido de alumínio, óleo de amendoim e IL-12 codificada por
um vetor plasmideal. Resultados obtidos em nosso laboratório mostraram que a injeção de rLc9
em camundongos, apenas preparada em salina, leva à indução de uma resposta imune com
elevada produção de anticorpos, ausência de resposta proliferativa e indução da produção de
citocinas produzidas apenas por células do tipo Th2, como demonstrado pela detecção de IL-5 e
ausência de IFN-γ. Esta resposta só foi parcialmente revertida quando rLc9 foi administrada
associada à saponina. A injeção de camundongos utilizando esta combinação foi a única a induzir
uma resposta imune celular específica com proliferação de células esplênicas e produção de IFNγ, mantendo, no entanto, a produção de IL-5 além de uma intensa resposta imune humoral
específica na qual houve um predomínio de anticorpos IgG da subclasse IgG1 (FRAGA, 2007).
Estes achados estão de acordo com dados da literatura, os quais mostram que saponina é capaz de
estimular ambos os tipos de células T CD4+ Th1 e Th2 (BOMFORD et al., 1992) e apresenta-se
como um dos mais potentes adjuvantes para gerar uma significante resposta imune mediada por
células e anticorpos (BOMFORD et al., 1980). Resultado semelhante foi obtido neste trabalho,
no qual um grupo de camundongos imunizado com rLc9/saponina foi utilizado para comparação
com outros protocolos de imunização, discutido posteriormente.
Atualmente, a vacinação com DNA plasmideal tem se apresentado como uma estratégia
promissora para o desenvolvimento de vacinas contra diversos tipos de infecções, principalmente
aquelas que envolvem a indução de resposta imune contra patógenos intracelulares. Muitas são as
vantagens para o uso de plasmídeos e/ou outras moléculas de DNA como vetores de expressão de
131
antígenos in vivo. Ao contrário dos métodos convencionais de vacinação, os quais muitas vezes
se utilizam patógenos inativados ou vivos e atenuados, a reprodutibilidade e padronização lote-alote do material utilizado, além de questões relacionadas à segurança podem ser contornados.
Além disso, um adjuvante capaz de induzir preferencialmente uma resposta celular deve ser
utilizado para obtenção de uma resposta imune que realmente seja eficiente no controle de
infecções intracelulares. O uso de DNA como vetor de expressão de antígenos recombinantes
atende a algumas dessas necessidades.
Como descrito neste trabalho, a injeção de plasmídeos capazes de levar à expressão in
vivo de cDNAs codificadores de proteínas recombinantes de formas amastigotas de L.
infantum/chagasi, administrados isoladamente, resultou na indução de resposta imune humoral
específica para três de quatro plasmídeos utilizados. Esta resposta foi identificada frente a
reatividade de anticorpos com proteínas do extrato bruto de promastigotas (após a injeção de
pBK-CMV-Lc9 ou pBK-CMV-Lc14) e contra as proteínas recombinantes (após a injeção de
pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18).
A diferente reatividade ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi encontrada entre os
grupos injetados com diferentes plasmídeos pode ser explicada pela representatividade, maior ou
menor, de cada uma das proteínas de L. chagasi presentes no extrato bruto de antígenos e que
correspondem às proteínas recombinantes Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18. Vale ressaltar que os
plasmídeos utilizados para a injeção codificam proteínas da forma amastigota de Leishmania.
Como existe uma grande variabilidade antigênica entre as diferentes formas do parasito (FONG
& CHANG, 1982; HANDMAN et al., 1984) não podemos descartar a possibilidade de ausência
ou baixa expressão das proteínas correspondentes à Lc13 e Lc18 em promastigotas. Uma
avaliação complementar pode ser feita por Western blotting, na qual extrato bruto de antígenos
das formas amastigota e promastigota de L. chagasi seria previamente fracionado por SDSPAGE. Dessa forma, a reatividade dos anticorpos induzidos pela injeção de plasmídeos poderia
ser avaliada em um ensaio de maior sensibilidade e especificidade.
A ausência de reatividade de anticorpos específicos para Lc13 ou para Lc18 à antígenos
presentes no extrato bruto de promastigotas pode também estar relacionada a intensidade da
resposta imune humoral induzida após a injeção de pBK-CMV-Lc13 ou pBK-CMV-Lc18. Foi
observado, em ELISA para detecção de anticorpos específicos para Lc13 ou Lc18 utilizando-se
proteínas recombinantes purificadas para sensibilização das placas, que a medida de densidade
132
óptica encontrada foi semelhante a dos grupos controles ou extremamente baixa, em amostras de
animais injetados com pBK-CMV-Lc13 ou pBK-CMV-Lc18, respectivamente, indicando que
não houve produção de anticorpos específicos como a observada para as injeções de pBK-CMVLc9 ou pBK-CMV-Lc14. A intensidade da resposta imune, por sua vez, depende de fatores como
a imunogenicidade inerente a cada proteína, a quantidade de proteína produzida e que vai
estimular o sistema imune ou mesmo, como é o caso, de características próprias da imunização
com plasmídeo.
As proteínas Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 são naturalmente imunogênicas para o cão. Estas
proteínas foram selecionadas a partir de uma biblioteca de cDNA de formas amastigotas de L.
chagasi, com base na reatividade de cada clone a uma mistura de soro de cães naturalmente
infectados (TEIXEIRA et al., 2007). A imunogenicidade de Lc13 recombinante foi demonstrada
em experimentos anteriores realizados em nosso laboratório, onde a injeção de Lc13,
administrada como emulsão em adjuvante de Freund ou em combinação à saponina, induziu uma
resposta imune humoral de forte intensidade tanto em camundongos como em cães,
respectivamente (PENHA FILHO, 2003; SANTOS, 2007). Já em relação a Lc18 recombinante,
existe a possibilidade de que a pouca intensidade da resposta imune humoral obtida nos animais
injetados com pBK-CMV-Lc18 esteja relacionada a baixa imunogenicidade desta proteína.
A ausência ou fraca indução de resposta imune humoral não é uma característica
incomum após injeções com DNA, a qual tende a favorecer uma resposta imune celular
(IBORRA et al., 2003; RAFATI et al., 2005). Este fato pode estar relacionado a características
imunológicas estabelecidas após a injeção de moléculas de DNA plasmideal. A ativação
completa de linfócitos B, frente à exposição a antígenos T dependentes, e sua diferenciação para
plasmócitos depende diretamente do micro ambiente onde este tipo de linfócito foi ativado e de
interações com células T auxiliares que secretam principalment e as citocinas IL-4 e IL-5,
potentes moduladoras da produção de anticorpos. No entanto, frequentemente, injeções com
DNA ativam células T auxiliares do tipo Th1, principais produtoras de IFN-γ (LECLERC et al.,
1997). Esta característica, intrínsica a moléculas de DNA plasmideal, está associada à presença
de seqüências imunomodulatórias, dinucleotídeos CpG não metilados, os quais influenciam
diretamente a produção de citocinas como IFN-γ e IL-12 (KLINMAN et al., 1996; LECLERC et
al., 1997). No entanto, a produção de IL-6 também é induzida por estas seqüências
imunomodulatórias, e esta citocina, que é capaz de promover a ativação e secreção de anticorpos
133
por células B diferenciadas (KLINMAN et al., 1996; MURAGUCHI et al., 1988) pode
contribuir, pelo menos num momento inicial de ativação, para a indução da produção de
anticorpos.
Outros pontos que precisam ser mencionados estão relacionados à quantidade de proteína
necessária para a indução de uma resposta imune em associação à sua localização celular.
Quando comparamos a intensidade da resposta imune humoral específica para Lc9 de grupos de
animais injetados com Lc9 associada à saponina, administrada a 100 µg/dose, ou injetados com
pBK-CMV-Lc9 a diferença entre os grupos foi da ordem de 40 vezes. Ao contrário da exposição
de grande quantidade de rLc9 exposta ao sistema imune após injeção em associação a saponina, a
produção das proteínas recombinantes de L. chagasi pelo vetor de expressão pBK-CMV é
intracelular e não há em nenhuma das cadeias polipeptídicas um sinal para a secreção das
proteínas. Esta condição pode, inclusive, favorecer o estabelecimento de uma resposta imune
celular, de interesse para o nosso trabalho (TORRES et al., 1999, DREW et al., 2000).
Paralelamente à avaliação da injeção de plasmídeos recombinantes administrados
isoladamente, uma preparação multicomponente foi utilizada para injeção de camundongos, na
qual uma mistura em partes iguais de cada um dos plasmídeos, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMVLc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18, foi administrada em três diferentes condições:
injeção intramuscular seguida ou não de eletroporação ou ainda, associada ao plasmídeo
pcDNA3.1A-scmu-IL-12, também seguida de eletroporação. A partir destes experimentos, foi
observado que houve reatividade de anticorpos ao extrato bruto de antígenos de promastigotas de
L infantum/L. chagasi nas três condições de tratamento utilizadas. No entanto, existe uma forte
possibilidade de que esta reação tenha ocorrido, como visto anteriormente, decorrente da
interação de anticorpos específicos para Lc9 e Lc14, produzidos em maior intensidade após
injeção isolada de pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14, respectivamente.
Uma das vantagens em se utilizar a imunização com DNA plasmideal para a indução de
resposta imune é a possibilidade de combinar vários plasmídeos codificando antígenos de
diferentes estágios ou linhagens de um mesmo patógeno com diferentes alvos antigênicos ou
ainda, de patógenos diferentes, em uma única vacina. Uma vacina multicomponente pode ser
mais abrangente na cobertura contra infecções e dessa forma mais eficiente. Relatos anteriores
mostram que imunizações com uma mistura de proteína ou de polissacarídeos têm levado a uma
diminuição da resposta aos componentes individuais da mistura (HUNT et al., 1994; FATTOM et
134
al., 1999). Ao contrário, a combinação de moléculas de plasmídeos recombinantes, como em
avaliações realizadas no modelo murino de malária e tuberculose, não implica em
competitividade de antígenos, mas sim em aumento da resposta imune e de proteção (DOOLAN
et al., 1996; MORRIS et al., 2000; GRIFANTINI et al., 1998).
A compatibilidade de plasmídeos e antígenos deve ser avaliada, caso a caso, porque
diferentes combinações podem comportar-se diferentemente (SEDEGAH et al., 2004). Como a
medida da reatividade dos anticorpos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi foi semelhante
àquela observada quando os plasmídeos pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14 foram administrados
separadamente, não parece ter havido uma incompatibilidade de componentes nesta preparação.
No entanto, quanto à resposta imune celular apenas a estimulação in vitro com Lc9 resultou em
produção de IFN-γ, enquanto que, a resposta linfoproliferativa vista anteriormente para Lc14 não
foi observada. De qualquer forma, diante dos resultados obtidos pela injeção isolada de
plasmídeos, uma nova combinação de plasmídeos, que inclua outros antígenos mais
imunogênicos, pode ser uma alternativa para obtenção de uma resposta imune protetora no
modelo murino de leishmaniose visceral.
A administração dos plasmídeos quer seja isoladamente ou em combinação, foi realizada
por meio de injeções intramusculares seguida de eletroporação. A eletroporação in vivo é uma
estratégia utilizada para aumentar a eficiência de transfecção e os níveis de expressão de
polipeptídeos após injeção de DNA plasmideal (RIZZUT0 et al., 1999). Esta técnica permite um
aumento no nível de expressão de polipeptídeos exógenos, em função do aumento no número de
células transfectadas e, provavelmente, pelo aumento no número de cópias de plasmídeo
recombinante introduzido em cada célula muscular (AIHARA & MIYAZAKI, 1998). Isso
ocorre, em parte, devido à uma rápida desestruturação da membrana celular e abertura de poros
que permitem a passagem de grandes moléculas (SOMIARI et al., 2000).
Como apresentado neste trabalho, o uso de eletroporação não induziu um aumento
significativo na intensidade da resposta imune como têm sido descrito em diversos outros
trabalhos (WIDERA et al., 2000, KADOWAKI et al., 2000 , ZUCCHELLI et al., 2000). Em
experimentos anteriores realizados em nosso laboratório, o uso de eletroporação levou a um
aumento significativo na expressão do cDNA que codifica IL-12 murina após a injeção do
plasmídeo pcDNA3.1A-scmu-IL-12 comparada a administração do mesmo plasmídeo sem
eletroporação. Este aumento na produção de IL-12 murina foi demonstrado indiretamente pela
135
detecção de IFN-γ em níveis elevados apenas no soro dos animais submetidos a eletroporação em
relação aos animais que não foram submetidos ao tratamento com choque elétrico (BARROUINMELLO et al., dados não publicados). Os plasmídeos utilizados neste trabalho, pBK-CMV
(Stratagene) e pcDNA3.1 (Invitrogen), possuem as características apropriadas para a produção de
proteína recombinante in vivo em células de mamíferos, como por exemplo a presença de uma
forte região promotora para expressão em células eucarióticas (PASLEAU et al., 1985; XIA et
al., 2006).
A produção de anticorpos específicos que ocorre naturalmente na infecção por
Leishmania, parece ter pouca, ou mesmo, nenhuma importância na proteção contra a infecção
quer seja em seres humanos ou em cães (BEHFOROUZ et al., 1983; GALVÃO-CASTRO et al.,
1984; INIESTIA et al., 2005; REIS et al., 2006). Apesar disso, a avaliação da produção de
anticorpos pode fornecer informações gerais a respeito da imunogenicidade de diferentes
candidatos a vacina. No modelo murino, a produção de anticorpos das diferentes subclasses de
IgG, específicas para o antígeno, é uma medida conveniente para a avaliação da regulação de
uma resposta imune mediada por células Th1 ou Th2.
A resposta imune humoral que foi induzida pela administração de plasmídeos capazes de
codificar proteínas de formas amastigotas de L. chagasi, quer seja administrados isoladamente ou
como uma mistura de plasmídeos, apresentou-se predominantemente com produção de anticorpos
de isotipo IgG2a. Em camundongos, a produção de IFN-γ, um marcador da resposta imune
celular do tipo Th1, induz a acumulação de RNA mensageiro para cadeia pesada de
imunoglobulina gama 2a em células B e correlaciona-se diretamente com uma elevada produção
de anticorpos de isotipo IgG2a (SNAPPER et al., 1987). Por outro lado, na presença de IL-4 e/ou
IL-5 a produção de anticorpos de isotipo IgG1 é favorecida (SNAPPER et al., 1987;
PURKERSON & ISACKSON, 1992). Em todas as avaliações realizadas neste trabalho, na qual
plasmídeo foi utilizado para injeção de camundongos, a medida de densidade óptica para
detecção de anticorpos de isotipo IgG2a foi maior que a medida de anticorpos de isotipo IgG1.
Vale ressaltar que a avaliação da proporção de anticorpos IgG2a/IgG1 é relativa uma vez que
para determinação de cada uma destas subclasses se utilizam ensaios imunoenzimáticos distintos.
Nossa observação diante de repetidas avaliações é que a relação IgG2a > IgG1 se mantém para
injeções com DNA e, torna-se inversa para imunização com proteína, assim como verificado
utilizando-se soro de camundongos infectados com L. chagasi (dados não mostrados). Assim,
136
diante do predomínio de anticorpos de isotipo IgG2a, uma resposta imune celular do tipo Th1,
com produção de IFN-γ, foi esperada para os animais injetados com plasmídeos recombinantes.
O uso de plasmídeo como vetor de expressão de antígenos recombinantes foi utilizado no
presente trabalho visando à identificação de um protocolo de imunização capaz de favorecer a
indução de uma resposta imune celular do tipo Th1, contra antígenos de L. chagasi. A indução de
resposta imune celular específica, após as séries de injeções de plasmídeos recombinantes
capazes de codificar antígenos de L. chagasi, ocorreu em apenas um grupo de animais os quais
foram injetados com pool de plasmídeos associado ao plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12. As
células esplênicas destes animais produziram IFN-γ in vitro apenas após cultivo com Lc9
recombinante e esta produção foi estatisticamente significante em relação aos demais grupos. A
produção de IFN-γ após a série de injeções com um pool de plasmídeos associado a pcDNA3.1scmu-IL-12 foi de pouca intensidade, mas consistente, pois manteve-se após a infecção com
promastigotas de L. chagasi. Após a infecção foi possível detectar a indução de resposta imune
celular específica em células de animais injetados com pBK-CMV-Lc9, com produção
estatisticamente significante de IFN-γ, e em células de animais injetados com pBK-CMV-Lc14,
com resposta proliferativa.
Apesar de pouco intensa, a resposta imune induzida após as injeções de plasmídeos foi
predominantemente do tipo Th1. Em nenhum momento a produção de IL-4 ou de IL-5 foi
detectada no sobrenadante das culturas, exceto após estimulação com concanavalina A,
mostrando que as células eram capazes de produzir tais citocinas. No entanto, não podemos
descartar a possibilidade de que tenha ocorrido a indução da produção destas citocinas após
estimulação in vitro. As dosagens de IL-4 e IL-5 no sobrenadante de cultura de células precisam
ser avaliadas de forma cautelosa, uma vez que o consumo destas citocinas por células estimuladas
pode levar a uma medida subestimada e interpretações pouco confiáveis quanto ao tipo de
resposta imune que está sendo avaliada (EWEN & BACA-ESTRADA, 2001). Vários autores têm
demonstrado que a expressão do receptor de IL-4, tanto em sua forma solúvel como ligado à
membrana, pode ser induzida durante diversas condições de estímulo in vitro, incluindo o uso de
mitógenos de células T, concanavalina A ou anticorpos anti-CD3, além de IL-4, levando ao
consumo da citocina ainda em cultura (RENZ et al., 1991; CHILTON et al., 1993; BLUM et al.,
1996). Assim, outras técnicas para avaliação de IL-4 e IL-5, rotineiramente utilizadas por
137
diversos laboratórios, precisam ser consideradas tal como o uso de RT-PCR ou ELISPOT, por
exemplo.
O papel da IL-12 na potencialização da resposta imune foi apenas modestamente
observado tanto para resposta imune humoral como para resposta imune celular. Esta é uma
citocina conhecida pelo seu papel em promover a diferenciação e expansão de células do tipo Th1
a antígenos co-administrados, principalmente por induzir a produção de IFN-γ (TRINCHIERI,
2003). A resposta imune humoral também é influenciada pela ação da IL-12, indiretamente,
mediado também por IFN-γ, na indução de troca de isotipo de anticorpos para IgG2a (MORRIS
et al., 1994; METZGER et al., 1996). Foi observado neste trabalho que houve um aumento
estatisticamente significativo na produção de anticorpos quando os camundongos foram injetados
com plasmídeocodificando IL-12 murina associado ao pool de plasmídeos recombinantes. Além
disso, a intensidade de reatividade de anticorpos IgG2a não foi diferente da produção induzida no
grupo que não recebeu IL-12. Da mesma forma, em relação a resposta imune celular, não foi
observada linfoproliferação frente ao cultivo com qualquer uma das proteínas recombinantes. Já a
produção de IFN-γ foi detectada no grupo injetado com pool de plasmídeos associado à IL-12
murina (plasmídeo) mas apenas quando o estímulo in vitro utilizado foi Lc9 recombinante.
Ainda assim, a concentração de IFN-γ neste grupo de animais foi menor que a concentração
obtida com células de animais injetados apenas com pBK-CMV-Lc9 sem a associação a IL-12
murina.
A IL-12 pode regular negativamente a resposta imune, na dependência da quantidade em
que ela é administrada (KURZAWA et al., 1998; LASARTE et al., 1999; CHEN, et al., 2001).
Neste trabalho foram utilizadas três séries de injeções de pcDNA3.1-scmu-IL-12 seguida de
eletroporação. Assim, existe a possibilidade de, ao invés de contribuir para a diferenciação e
potencialização da resposta imune, a IL-12 tenha proporcionado efeitos tóxicos que conduziram
para o comprometimento do desenvolvimento de uma resposta imune eficiente. De fato, em
experimentos realizados paralelamente por nosso grupo, foi observado que, em diferentes
linhagens de camundongos, mesmo doses menores de plasmídeo codificando IL-12 após injeção
intramuscular seguida por eletroporação levaram a um aumento no tamanho do fígado e dos
linfonodos drenantes e a uma intensa esplenomegalia, com alterações histológicas na polpa
vermelha caracterizada pela presença de corpos apoptóticos e macrófagos vacuolares (SANTOS,
2007; PINHEIRO et al., dados não publicados).
138
No modelo murino experimental de leishmaniose visceral, o uso de IL-12
concomitantemente a injeção de antígenos purificados, como a fração FML e o antígeno
recombinante rHASPB1, quer seja administrada como proteína recombinante ou sob a forma de
plasmídeo, não foi capaz de induzir qualquer alteração nos níveis de proteção obtidos em sua
ausência (SANTOS et al., 1999; STAGER et al., 2000). Já a indução de resposta imune
específica para o antígeno recombinante ORFF na presença de IL-12, codificada in vivo após a
injeção de um vetor plasmideal, apresenta resultados extremamente satisfatórios, inclusive com
significativo aumento na capacidade de controle da infecção após desafio dos animais
imunizados (TEWARY et al., 2006).
Alguns resultados obtidos a partir da injeção de IL-12, para uso como adjuvante, no cão
também são aparentemente contraditórios. Recentemente, nosso grupo de pesquisa e outros
grupos, demostraram que células de animais com leishmaniose visceral são capazes de responder
ao estímulo in vitro com IL-12 canina, resultando principalmente em produção de IFN-γ e
proliferação celular, caracterizando a indução de uma resposta imune Th1 (SANTOS et al., 2004;
STRAUSS-AYALI et al., 2005; SALDARRIAGA et al., 2006b). No entanto, a resposta imune
induzida em cães injetados com uma preparação multivalente de plasmídeos capazes de codificar
antígenos recombinantes de Leishmania não sofreu qualquer alteração pela administração
concomitante com um plasmídeocodificando IL-12 canina (SALDARRIAGA et al., 2006a).
Assim, as condições de uso desta citocina como um adjuvante em uma vacina para o cão
precisam ser ainda criteriosamente avaliadas.
A ausência ou baixa intensidade de resposta imune induzida após a injeção de plasmídeos
capazes de codificar proteínas de formas amastigotas de L. chagasi pode explicar a incapacidade
de controle da infecção após o desafio. Ainda assim, existe a possibilidade de que as proteínas
Lc9 e Lc14 apresentem algum potencial na indução de resposta imune protetora uma vez que
após a infecção com promastigotas de L. chagasi, houve resposta imune específica contra estas
proteínas. Além disso, em dois de seis animais injetados previamente com pBK-CMV-Lc9 não
foi detectada a presença de promastigotas de L. chagasi na primeira diluição do macerado de
baço quando realizada a avaliação de carga parasitária. Este pode ser um resultado fortuito, mas
há necessidade de se averiguar a possibilidade de indução de imunidade protetora a partir da
injeção com Lc9 com a realização de novos experimentos.
139
É sabido que a produção de IFN-γ é essencial para que ocorra proteção no modelo murino
de leishmaniose visceral, no entanto, parece que citocinas do tipo Th2 podem ter algum papel nas
etapas iniciais de indução da resposta imune. Há publicações que relatam que mesmo na presença
de uma forte resposta imune celular tipo Th1, obtida pela administração de plasmídeos capazes
de codificar o gene LACK, o controle da infecção por L. donovani ou L. infantum/chagasi em
camundongos não foi obtido (MELBY et al., 2001; MARQUES-DA SILVA et al., 2005). Estes
autores discutem sobre o papel de IL-4 na ativação de células T CD8+ específicas para antígenos
de parasitos intracelulares, como recentemente demonstrado por Stager et al., 2003 e Morrot et
al., 2005. No entanto, pelo menos até o momento, não há dados da literatura que façam este tipo
de associação para células caninas, ao contrário, IL-4 tem sido detectada em animais infectados e
com sinais de leishmaniose visceral, embora também sua participação na patogênese da doença
também não esteja esclarecida (QUINELL et al., 2001; CHAMIZZO et al., 2005).
Diante dos resultados obtidos pela administração de plasmídeos, quer seja isoladamente
ou como uma mistura de DNA, realizamos experimentos visando aumentar a intensidade da
resposta imune específica contra Lc9, uma das proteínas recombinantes aparentemente mais
promissoras, mantendo o padrão de resposta obtido após a injeção de plasmídeo. Como descrito
anteriormente, a resposta imune murina frente ao estímulo com rLc9 associada a diferentes
adjuvantes foi avaliada previamente em nosso laboratório. O resultado obtido a partir desta
análise inicial foi que a injeção de Lc9 associada à saponina foi a única combinação capaz de
induzir uma resposta imune bastante intensa apresentando, no entanto, um padrão misto de
resposta tipo Th1/Th2 (FRAGA, 2007). Então, fizemos uso de uma estratégia de imunização
heteróloga tipo DNA primer/proteína booster, uma metodologia capaz de aumentar a resposta de
célula T à vacinação e que vem sendo utilizada para gerar imunizações efetivas contra malária e
uma variedade de parasitos, principalmente em animais de grande porte (RAMSHAW &
RAMSAY, 2000; JONES et al., 2001; DUNACHIE & HILL, et al., 2004; COBAN et al., 2004).
A administração de plasmídeo pBK-CMV-Lc9 e posterior reforço com a proteína rLc9
purificada levou a um aumento moderado na intensidade da resposta imune humoral e celular
frente ao estímulo antigênico específico. Observamos que (i) o padrão da produção de anticorpos,
IgG2a > IgG1 foi mantido mesmo após a injeção de rLc9 associada à saponina; (ii) uma resposta
proliferativa, antes não observada após as injeções com pBK-CMV-Lc9, foi evidente e (iii) ao
contrário da injeção somente com a proteína, apenas IFN-γ foi produzido enquanto IL-4 e IL-5
140
estavam ausentes. Entretanto, como a produção de IL-10 pode ser fortemente induzida na
presença de saponina, como demonstrado inicialmente tanto para administração de ovalbumina
como para um antígeno específico de Tripanosoma cruzi (TADOKORO et al., 1996), ensaios
para detecção desta citocina devem ser realizados para avaliar se, utilizando este protocolo de
imunização, uma resposta imune exclusivamente do tipo Th1 pode ser obtida. A avaliação da
produção de IL-10 faz-se necessária, uma vez que esta citocina apresenta um importante papel na
regulação da resposta imune na leishmaniose visceral humana e murina, e, provavelmente
também no cão (MURRAY et al., 2002).
A possibilidade de que a resposta imune induzida a partir da imunização inicial com pBKCMV-Lc9 e posterior reforço com rLc9/saponina seja capaz de conferir proteção contra infecção
por Leishmania precisa ser futuramente avaliada, assim como, após a injeção de rLc9 associada à
saponina. Neste trabalho, os resultados obtidos após a utilização de Lc9 sob a forma de proteína
em associação à saponina para a indução de resposta imune confirmam os dados previamente
obtidos em nosso grupo. Como demonstrado recentemente, mesmo uma resposta imune
específica com características Th1/Th2 pode levar ao controle da infecção por L. chagasi, como
observado para a proteína recombinante A2 (GHOSH et al., 2002). Estes dados nos encoraja
ainda mais para a obtenção de informações a cerca da real efetividade de uma resposta imune
gerada contra Lc9 no controle da infecção por L. chagasi.
Outras combinações de rLc9, ou outras proteínas recombinantes, com adjuvantes que
sejam compatíveis com o uso em cães devem ainda ser avaliadas, quer seja para imunização com
proteínas apenas ou para combinação com um vetor de expressão de DNA. Possibilidades
alternativas seriam a combinação com oligonucleotídeos CpG, o uso de Montanide 720, muramil
dipeptídeo (MDP), e ISCOMS como um novo sistema de liberação de antígenos entre outros
adjuvantes comercialmente disponíveis que tendem a favorecer uma resposta celular (KLINMAN
et al., 1997; ARAÚJO & MOREIN, 1991; BIRKETT et al., 2002). Em cães, resultados
promissores foram observados na avaliação da combinação de antígenos de L. infantum com
MDP quanto à indução de imunidade protetora contra infecção natural em uma área endêmica
para leishmaniose visceral no sul da França (LEMERSE et al., 2007).
Além disso, nosso grupo vem ao longo dos anos ampliando o painel de citocinas caninas
recombinantes que podem ser avaliadas quanto à capacidade de aumentar a intensidade da
resposta imune a antígenos co-administrados, direcionar e manter uma resposta celular tipo Th1
141
e/ou que seja capaz de induzir células de memória eficientemente. Além da obtenção de novas
citocinas, como IL-7 e IL-15, avaliações recentes, realizadas em nosso grupo de pesquisa,
mostram que a associação de IL-12 e IL-2 promovem um efeito sinérgico na produção de IFN-γ e
esta pode ser uma estratégia alternativa na modulação da resposta à antígenos co-administrados
(PEREIRA, 2006).
A partir deste e de outros trabalhos paralelos, foi possível iniciar em nosso grupo de
pesquisa o estabelecimento de um conjunto de metodologias e informações úteis para a avaliação
de antígenos candidatos à uma vacina, a partir do domínio de estratégias de imunização e de
avaliação da resposta imune murina. Com base em nossos achados, a indução de resposta imune
contra Lc9 e também contra Lc14 a partir da injeção de plasmídeos recombinantes é uma
metodologia viável para a obtenção de resposta imune celular. Embora algumas manipulações
precisem ser feitas, esquemas de imunização em cães a partir da injeção inicial de DNA devem
ser retomadas. Além disso, novos experimentos serão realizados a fim de explorar a capacidade
protetora induzida por Lc9, neste e em outros esquemas de imunização.
142
7. CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos neste trabalho, podemos concluir que:
1. O uso dos plasmídeos pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14 para injeção em camundongos,
permite a indução de resposta imune contra as proteínas Lc9 e Lc14 de L. chagasi.
2. A resposta imune obtida a partir do uso de pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14,
administrados isoladamente ou como parte de uma combinação de plasmídeos,
caracteriza-se como uma resposta tipo Th1 de pouca intensidade.
3. A indução de uma potente resposta imune humoral e celular mista Th1/Th2 específica
para Lc9 é obtida após a injeção de rLc9 associada à saponina, confirmando dados
previamente obtidos por nosso grupo.
4. A utilização de um protocolo de imunização do tipo DNA primer/proteína booster, em
que o sistema imune é estimulado inicialmente pela administração de plasmídeo (pBKCMV-Lc9) e, posteriormente, pela proteína recombinante (Lc9) aumenta a intensidade da
resposta imune específica e apresenta o mesmo padrão de resposta obtido pela injeção
com DNA apenas.
5. A injeção de plasmídeos recombinantes capazes de codificar antígenos de amastigotas de
L. chagasi, administrados isoladamente ou como um pool de plasmídeos, não conferiu
controle do parasitismo esplênico no modelo murino de leishmaniose visceral, mesmo na
presença de uma aparente resposta imune do tipo Th1.
143
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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164
9. APÊNDICES
165
APÊNDICE A – Desenho Experimental
camundongos BALB/c ♂ e ♀, 6 semanas de idade
PROTOCOLO 1
PROTOCOLO 2
PROTOCOLO 3
Salina ELb (18)c
Salina EL (18)
Salina EL (6)
pBKCMV vazio EL (12)
pBKCMV vazio EL (12)
Saponina (6)d
pBKCMV-Lc9 EL (12)
pool de plasmídeos EL (12)
pBKCMV vazio EL (6)
pBKCMV-Lc13 EL (12)
pool plasmídeos + pIL-12m EL (12)
Lc9/saponina (6)d
pBKCMV-Lc14 EL (12)
pool plasmídeos sem EL (12)
pBKCMV-Lc9 EL (6)
pBKCMV-Lc18 EL (12)
pBKCMV-Lc9 (EL) +
Lc9/saponina (6)d/e
Resposta imune humoral
Resposta imune celular
Resposta imune humoral
ELISA para detecção de Ac
Linfoproliferação (3 dias/5 dias)
IgG total
IgG: subclasses IgG1 e IgG2a
Produção de citocinas (48 h)
(IFNγ/IL4/IL5)
ELISA para detecção de
anticorpos
anti-Lc9
IgG total
IgG: subclasses IgG1 e IgG2a
Injeção de promastigotas
de L. infantum/chagasi
Resposta imune humoral
Resposta imune celular
ELISA para detecção de Ac
Linfoproliferação (3 dias/5 dias)
IgG total
IgG: subclasses IgG1 e IgG2a
Produção de citocinas (48 h)
(IFNγ/IL4/IL5)
Resposta imune celular
Produção de citocinas (48 h)
(IFNγ/IL4/IL5)
Análise de proteção
Determinação da carga parasitária
– Ensaio de Diluição Limitante
Avaliação do tamanho do baço
a três injeções com intervalos de 3 semanas
por via intramuscular
bEL – eletroporação
C no animais/grupo
d injeção subcutânea
e 2 séries de injeções de DNA e 1 de proteína
166
APÊNDICE B – Foto do aparelho eletroporador
Tempo de pulso (mseg)
Ajuste de voltagem
Leitura da voltagem (x5)
Botão de disparo dos pulsos
Eletrôdos
Elaborado pelo Dr. Yuri Pepe – Departamento de Física - UFBA
APÊNDICE C – Mapa qualitativo das respostas imunes aos diferentes imunógenos em ensaios com e sem desafio com L. chagasi
Sem desafio
Reatividade ao extrato bruto de L. chagasi
Condições
IgG
IgG1
IgG2a
pBK-CMV-Lc9 EL
pBK-CMV-Lc13 EL
pBK-CMV-Lc14 EL
pBK-CMV-Lc18 EL
pool pBK-CMV Lc9-Lc18
pool pBK-CMV Lc9-Lc18 EL
pool pBK-CMV Lc9-Lc18 + pIL-12 EL
pBK-CMV-Lc9 + Lc9/sap
Lc9/sap
Prolif
IFNg
IL4
IL5
Reatividade às proteínas homólogas aos
imunógenos
IgG
*
*
*
*
*
*
*
*
*
IgG1
IgG2a
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Prolif
IFNg
IL4
IL5
*
*
Após o desafio
Reatividade ao extrato bruto de L. chagasi
Condições
IgG
IgG1
IgG2a
Prolif
IFNg
IL4
IL5
pBK-CMV-Lc9 EL
pBK-CMV-Lc13 EL
pBK-CMV-Lc14 EL
pBK-CMV-Lc18 EL
pool pBK-CMV Lc9-Lc18
pool pBK-CMV Lc9-Lc18 EL
pool pBK-CMV Lc9-Lc18 + pIL-12 EL
pBK-CMV-Lc9 + Lc9/sap
*
*
*
*
*
*
*
Lc9/sap
*
*
*
*
*
*
*
* Não avaliado
Positivo com p<0,05 em relação aos controles (ANOVA seguido de pós-teste de Tukey)
Produção com p<0,05 usando teste t em relação aos controles
negativo
Reatividade às proteínas homólogas aos imunógenos
IgG
*
*
*
*
*
*
*
IgG1
IgG2a
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Prolif
IFNg
IL4
IL5
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
167
168
APÊNDICE D – Manuscrito – primeira versão – a ser submetido posteriormente para
publicação em revista científica indexada.
169
Title
Evaluation of different protocols in the attempt to modulate the murine immune response towards
a new recombinant antigen candidate for a vaccine against canine visceral leishmaniasis
Authors
Lenita Ramires dos Santos1,2; Ricardo Evangelista Fraga1,2; Cristiane Garboggini de Melo
Pinheiro1,2; Márcio Silva Rodrigues1; Washington Luís Conrado dos Santos2, Lain Carlos Pontesde-Carvalho2; Geraldo Gileno de Sá Oliveira2*
1
Programa de Pós-Graduação em Imunologia – PPGIm – Universidade Federal da Bahia –
UFBA. 2Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, BRAZIL
*Corresponding Author
Geraldo G S Oliveira
Mailing address: Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz,
Rua Waldemar Falcão, No. 121, Brotas. Salvador-Bahia, BRAZIL. CEP. 40295-001.
Tel: 55-71-3176-2262 or 55-71-3176-2290 - Fax: 55-71-3176-2326
e-mail: [email protected]
170
Abstract
Zoonotic visceral leishmaniasis is a progressive infectious disease and domestic dogs are
considered the major reservoir of the causal agent. In principle, a canine vaccine might block to
transmission cycle. Aiming to assess the potential of a new Leishmania chagasi/infantum
recombinant antigen (named rLc9) as a vaccine component, the murine immune response to rLc9
was studied. Groups of BALB/c mice were injected 3 times at 3-week intervals with i) rLc9 alone
or associated with Freund’s adjuvant, saponin, peanut oil, alum or a plasmid encoding single
chain murine IL-12 (pcDNA3.1-scmIL-12); (ii) rLc9-saponin associated with the administration
of a single dose of different amounts (from 0,4 to 50 µg) of pcDNA3.1-scmIL-12; iii) DNA
plasmid encoding Lc9 (pBK-CMV-Lc9) alone or pBK-CMV-Lc9 twice followed by rLc9.
Plasmid DNA was injected intramuscularly followed by electroporation. The mice that received
rLc9 or pBK-CMV-Lc9, in any association, developed specific IgG production. The animals
immunized rLc9-saponin or Lc9 associated with any amount of single doses pcDNA3.1-scmIL12 tested produced specific IgG2a and IgG1, while mice immunized with rLc9 alone or rLc9
associated with any of the other adjuvants, generated IgG1 but not IgG2a specific antibodies.
Mice injected with pBK-CMV-Lc9 followed by booster with rLc9, generated exclusively IgG2a
specific antibodies. The mice immunized with rLc9-saponin or with a initial injection of pBKCMV-Lc9/rLc9 showed specific lymphoproliferative response but IFN-γ production was
statistically significant related to the controls groups only in the first one. However, the groups
injected with pBK-CMV-Lc9 or pBK-CMV-Lc9/rLc9 do not produced IL-5 and the group
sensitized with rLc9-saponin/pcDNA3.1-scmIL-12 showed a reduced IL-5 concentration related
to rLc9-saponin injected group, after in vitro stimulation with Lc9. In conclusion, mice
immunized with the new recombinant antigen rLc9 develop a mild Th2 immune response. The
association of rLc9 and saponin in mice induced a strong mixed Th1/Th2 immune response
which was not modified to Th1 type by using mIL-12. Nevertheless, a cellular immune response
was generated after initial injection of pBK-CMV-Lc9 with proliferative response and only a
mild IFN- γ production.
Keywords: Visceral leishmaniasis; recombinant antigen, vaccine
171
1. Introduction
Visceral leishmaniasis (VL) is a progressive parasitic infection which is caused by at least
two different species of protozoan: Leishmania donovani and Leishmania infantum/chagasi
(Mauricio et al., 1999; WHO, 1990). Natural infection is transmitted by the bite of phlebotomine
sand fly insects of the family Psychodidae, subfamily Phlebotominae (Alexander, 2000; KillickKendrick, 1990). L. infantum/chagasi, which is found mainly in the Mediterranean basin and
South America, is a zoonotic disease that frequently causes generalized disease in both people
and dogs that can be fatal (Abranches et al., 1991; Corredor et al., 1989; Deane and Deane,
1955). Dogs are considered the major reservoirs of L. infantum/chagasi and in endemic areas
canine infection rates often exceed 30 % (Ashford et al., 1995; Berrahal et al., 1996). Thus,
canine infection constitutes an important problem for controlling zoonotic VL because sick dogs,
and possibly asymptomatic animals, are the major reservoirs of the parasite (Corredor et al.,
1989; Lopes et al., 1984; Molina et al., 1994).
The evidence of acquired immunity and resistance to reinfection in natural Leishmania
hosts suggests that the vaccine design against VL is feasible. In dogs, protective immune
response against VL seems to be cellular of the so-called Th1 type (Pinelli et al., 1994), and the
predominant cytokine expressed after specific stimulation is interferon gamma (IFN-γ). Thus,
most of the studies aim to identify Leishmania antigens capable of stimulating a Th1 type
characteristic immune response. In fact, several antigens identified as candidates to vaccine
component showed a protective-associated immune response but with different organ-specific
protection degree in a murine experimental model of VL (reviewed in Khamesipour et al., 2006).
Surprisingly, murine experimental VL protection has been found also in a mixed specific
Th1/Th2 environment (Ghosh et al., 2001; Mazumdar et al., 2004) whereas an antigen highly
immunogenic and Th1 immune response inducer, rLACK, was not capable to induce a protective
immune response against neither L. donovani nor L. chagasi (Melby et al., 2001; Marques-daSilva et al., 2005). In spite of the fact that the clear Th1 versus Th2 dichotomy to be found in the
murine cutaneous leishmaniasis model caused by L. major, characterized by Th1 cytokines (IFNγ) associated with resistance/protection and Th2-type cytokines (IL-4) with disease
exacerbation/susceptibility, it is not so evident in experimental visceral leishmaniasis. It is also of
172
common sense that protection in visceral leishmaniasis is more difficult to obtain than the others
Leishmania models.
Traditionally experimentally used adjuvant such as Freund´s adjuvant and BCG can
modulate the strength, type and intensity immune response to Leishmania antigens (Champsi and
McMahon-Pratt, 1988; Kenney et al., 1999; Khalil et al., 2006). However, the use of this
adjuvants to use in dogs and in humans is not reccomended due several toxic effects. In the last
years, many others adjuvant formulations and new immunization protocols have been constantly
evaluated (Palatinik-de-Sousa et al., 1994, Ali and Afrin, 1998). Among different vaccination
protocols, the use of IL-12 in co-administration of parasite fractions or antigens (Afonso et al.,
1994; Tewary et al., 2006) and DNA-based immunization have driven, in same cases, the specific
cellular immune response to Th1-type without the induce local toxic effects (Watts and Kennedy,
1999), which plays an important role against intracellular parasites. Recently, the use of a
heterologous DNA primer-protein booster immunization strategy to induce potent cellular
immunity to Leishmania antigens and to promote control of infections is been susscefully
evaluated (Iborra et al., 2003; Tewary et al., 2005; Rafati et al, 2006).
In this study, we examined the immunogenic properties of a new Leishmania
infantum/chagasi recombinant antigen (rLc9) aimming to access the potential of this protein as a
vaccine component. This recombinant protein was identified in an amastigote form cDNA library
(Teixeira et al., 2007) and it was selected by antibody reactivity with pooled serum samples of
VL asymptomatic dogs. In addition, aiming to modulate efficiently the immune response to rLc9,
we evaluated and described here different immunization protocols in an attempt to induce a large
spectrum of murine specific immune response to rLc9 to find further a Leishmania protectiveassociated immune response.
2. Material and Methods
2.1. Animals
Six to eight-week-old BALB/c mice (male and female) were obtained from the Gonçalo Moniz
Research Center Animal House and kept under appropriate conditions with free access to food
173
and water. The use of mice in this study (six/group) was approved by a national relevant
committee.
2.2. Plasmid preparation
Plasmid DNA (pBK-CMV-Lc9) was obtained from a cDNA library constructed with L. chagasi
RNA amastigotes in lambda phage (Stratagene). For prokaryotic protein expression and
purification, Lc9 cDNA was subcloned by transfering pBK-CMV-Lc9 to pRSET plasmid (latter
named pRSET-Lc9) by KpnI and BamHI enzymatic digestion and ligation. The plasmid encoding
a single-chain murine IL-12 (pCIneo-scmu-IL-12) was provided by Dra. Emmanuela Handman
(The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Australia), and was subcloned by PCR
to a plasmid ampicilin-resistance pcDNA3.1 (Invitrogen) and named pcDNA3.1-scmu-IL-12.
The plasmids used for mice injection (pBK-CMV-Lc9 and pBK-CMV vector without insert,
pcDNA3.1-scmu-IL-12 and pcDNA3.1 vector without insert) were prepared from overnight
cultures and purified by anion-exchange chromatography using a Qiagen Megaprep kit (Qiagen,
Hilden, Germany), according to the manufacturer’s instructions.
2.3. Expression of rLc9 in Escherichia coli and purification
For His-tagged rLc9 production, the Escherichia coli strain BL21(DE3)pLysS was transformed
with pRSET-Lc9 and grown following standard procedures in LB medium. After induction with
0,25 mM IPTG at an OD600 of 0.6 the cells were grown for a further 3 h and centrifuged. The
bacterial pellets were ressuspended in a lysis and ligation buffer (20 mM Na2HPO4, 500 mM
NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0) with 4 mg of deoxicholate acid/sediment weight (gr) and 1 mg
lisozyme/suspension volume, then followed by sonication and centrifugation at 17.000 g, 4° C,
for 15 minutes. The purification was done with soluble fraction using Chelating Sepharose Fast
Flow (Amersham). At the end, the bounded proteins were eluted with a buffer containing
Imidazole 0,5 M. The fractions containing the recombinant protein, as determined by SDSPAGE, were pooled and dialyzed against PBS. The purity of the recombinant protein was
checked by running it on SDS-PAGE gel followed by Comassie blue staining. Western blot was
performed for detecting rLc9 protein, using a mixture of dog´s serum with reactive antibodies
174
anti- L. chagasi and a mouse anti-His tag antibody, after transfer purified rLc9 to nitrocellulose
using a Bio-Rad transblot apparatus (Bio-Rad Laboratories).
2.4. Mammalian cell expression of rLc9
COS-7 cells were cultured in DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) medium
supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine (Life Technologies), 1%
non-essential amino-acid solution (Life Technologies) and 1% penicillin/streptomycin solution
(Life Technologies), from now on referred as supplemented DMEM, at 37° C and 5% CO2,
humidified atmosphere. The day before transfection, 106 cells were plated into 35 mm petri
dishes. Transfections were carried out with 1 µg of plasmid, either pBK-CMV-Lc9 or pBK-CMV
empty plasmid (the latter as the negative control), per petri dish, using lipofectamine (Life
Technologies), following the manufacturer's instructions. The day after transfection, the attached
cells on the petri dishes were washed once with 0.15 M phosphate buffered saline, pH 7.2 (PBS),
and cultured with fresh DMEM medium. After 48 hours, the cells were scraped out of plates and
ressuspended in SDS-PAGE (Laemmli, 1970) sample buffer. The rLc9 expression was
determined in transfected cells by Western blot analysis using a pool of serum of Leishmania
positive dogs. For Western blotting, transfected or untransfected cells were analysed as whole
cell lysate separately.
2.5. Immunization protocols
Immunizations experiments with the recombinant protein were performed injecting groups of six
mice with (i) 100 µg of rLc9 protein in saline or rLc9 associated with (ii) Freund’s adjuvant, (iii)
saponin, (iv) peanut oil or (v) alum, subcutaneously (s.c) in the dorsal region. Control mice
received the adjuvant alone. Boosters were given twice with the same antigen preparations at 3weeks intervals (table 1). For the experiments with DNA construction (pBK-CMV-Lc9), animals
were immunized by intramuscular (i.m) injection of 50 µg (in 50 µL) of plasmid DNA diluted in
saline in each hind leg quadriceps followed by electroporation, 100V with 5 pulses and 20 ms of
intervald. Control groups of mice were injected with sterile saline and with the vector pBK-CMV
devoid of insert. In a DNA primer/protein booster protocol, groups of mice were injected with
175
i.m. twice with plasmid DNA at 3-week intervals and boosted s.c. once with rLc9/saponin.
Additionally, fifty micrograms of plasmid encoding murine IL-12 (pcDNA3.1-mIL-12) was
administered (i.m. followed by electroporation) in groups of mice injected with rLc9, at 3-week
intervals, or a single dose of different amounts of the same plasmid DNA (50 µg, 10 µg, 2 µg and
0.4 µg pcDNA3.1-mIL-12) associated with rLc9-saponin were injected, followed by two
additional rLc9-saponin booster.
2.6. Determination of Ag-specific antibody response and isotypes
Serum samples were obtained at 2 weeks after the last injection dose by orbital plexus puncture.
Total IgG, IgG1 and IgG2a were measured in individual serum samples by ELISA against rLc9
and promastigote Leishmania antigens. Briefly, for the total specific IgG production, 96-well
microtiter plates were coated with 0,5 µg rLc9, overnight at 4oC, in a 100 µL volume of
carbonate-bicarbonate buffer pH 9,6. All incubations were carried out for 60 minutes at room
temperature except for the substrate-development step, and then the plates were washed thrice
after each incubation step with PBS containing 0,05% Tween-20 (PBST). After blocking with
10% skimmed milk in PBS, wells were incubated with a dilution of each sample (1:5.000)
followed by horseradish peroxidase (HRP)-conjugated-goat anti mouse IgG (Sigma) at 1:400
(protocol 1 and protocol 2) or other batch of anti mouse IgG at 1:4000 (protocol 3). Wells colors
reaction were developed at room temperature with TMB-H2O2 (Sigma) for 15 minutes and
stopped with H2SO4. Then, the absorbance at 450 nm was measured. To detect specific isotypes
to rLc9 and promastigote Leishmania antigens the plates were coated as described above. The
blocking stage and washes were done with 10% FBS in PBS only and with PBST, respectively.
After incubation of samples (diluted at 1:50.000 or 1:350.000), biotinylated monoclonal rat antimouse IgG1 or IgG2a (Pharmingem) were added to the wells and incubated for two hours.
Avidin-peroxidase incubation followed by addition of substrate TMB-H2O2 was used to
development of color and measured at 450 nm as described before.
176
2.7. Splenocytes culture and proliferation assay
Spleens were removed aseptically from mice in each group 3 to 4-weeks after the last injection
dose. Single-cells suspensions were prepared by grinding the spleen with the disk bottom of the
plunger from 5-mL syringe. RPMI 1640 medium (10 mL) was added to the suspension, and then
the contents was mixed well it was centrifuged at 4oC by 100 x g for 30 seconds. The supernatant
was pipetted out slowly and the cells were pelleted by centrifugation at 4oC and 400 x g for 10
minutes. Supplemented RPMI medium (FBS 10%; 50 uM 2-ME 0,01M; HEPES 1mM pH 7,2;
glutamine 200mM) was used to ressuspend and adjuste the cells concentration to 3 x 106/mL. For
proliferation assay, 3 x 105 cells were plated in triplicate onto 96 well plates in a 100 uL volume
in the presence or absence of 2 µg/mL T-cell mitogen Concanavalin A (100 µL) or 10 µg/mL
rLc9 (100 µL) for 3 and 5 days at 37oC in 5% CO2, respectively. Proliferation was quantified by
measurement of the incorporation of 1 µCi of [3H]-labeled thymidine during additional 18 hours
of culture. Stimulation index (Si) were calculated as the ratios of [3H]-thymidine incorporation in
the presence of antigen versus the non-stimulated (medium alone) control.
2.8. Cytokine production assay
For cytokine production 300 µL of 9 x 105 cells, prepared as described above, were plated onto
24-wells plates and incubated in the presence or absence of 2 µg/mL Con A mitogen (300 µL) or
10 µg/mL of rLc9 (300 µL). After 48 hours of incubation at 37oC in 5% CO2, supernatants were
collected and cytokine concentrations were quantified by capture ELISA with biotinylated antimouse IFN-gamma and anti-mouse IL-5 (BD Pharmingem) followed by incubation with avidin
conjugated to peroxidase (Sigma). The color reation development was done by the addition of
substrate buffer (TMB-H2O2). The reaction was stopped after 5-10 minutes with 50 µL of H2SO4
and the absorbance at 450 nm was measured. A standard curve was plotted using recombinant
murine IFN-γ or IL-5 in the same assay and the limit of detection was 0,110 ng/mL and 40
pg/mL, respectively
2.9. Statistical analysis
177
Comparison of the level of antibody induction, spleen cells proliferation and cytokine production
between the groups were determined by one-way ANOVA test followed by Tukey’s post-test
using “GraphPad Prism” software (version 4.0). The reported P-values < 0.05 were regarded as
statistically significant.
3. Results
3.1. In vitro expression of rLc9
The rLc9 protein was produced in a prokaryotic expression system in attempt to obtain a
high production and purification facility process. A high level expression of rLc9 recombinant
protein was achieved when BL21(DE3)pLysS E. coli lineage was used. A band of approximately
39 kDa was observed in E. coli lysate transformed with pRSET-Lc9 and cultured for 3 hours after
IPTG induction by 12% SDS-PAGE. A similar band was not observed when a negative control
plasmid was used to transform E. coli and the lysate was subjected to SDS-PAGE, neither before
nor after IPTG induction. The rLc9 preparation, purified as described in Material and Methods
did not show relevant contaminating proteins bands on the SDS-PAGE gel (Figure 1A). The
expression of the recombinant L. chagasi antigen was confirmed by using Western blot assay
which showed a reaction between anti-Leishmania dog’s serum and an anti-His tag antibody with
the corresponding band (Figure 1B).
Plasmid pBK-CMV-Lc9, used to animal injections, was tested for their ability to express
rLc9 by transient transfection of COS-7 cells. The Western blot analysis of rLc9 protein levels 48
h after transfection with Lc9 gene is shown in Figure 1C. As is seen, only the extract of cells
transfected with pBK-CMV-Lc9 showed the presence of a protein identified after incubation with
a mixture of serum of dogs with positive response to L. chagasi. The control plasmid-transfected
cells did not show any band upon incubation with anti-Leishmania antibodies. A little band of
low molecular weight was also recognized in the pBK-CMV-Lc9/COS-7 transfected cells.
178
3.2. Generation of specific rLc9 immune responses with Th2 characteristics
To evaluate antigen-specific immune response primed by rLc9, humoral response was
assessed in all tested groups. BALB/c mice that were injected three times with rLc9 only or with
different adjuvants were capable to produce a specific IgG antibody response (Figure 2). The
specific Lc9 humoral immune response intensity was higher in the group that were injected with
rLc9 in association with saponin than in the others groups (ANOVA, p < 0.0001; Tukey, p<0,05)
and similar to the response induced by rLc9 administration with Freund´s adjuvant. The relation
between the groups were rLc9/sap > rLc9/alum = rLc9/Freund´Adj = rLc9/peanut oil > rLc9
alone = rLc9/pcDNA3.1-scmuIL-12 > saline (p < 0.05). Because of the antibody isotype provides
a convenient surrogate marker for the induction of Th1 and Th2 CD4+ T cell differentiation, we
determined the relationship between IgG2a and IgG1 production, respectively. All the groups
showed an elevated IgG1 specific antibody production after rLc9 administration (Figure 2) with
only a minor difference between the groups that were injected with rLc9 alone or associated to pIL-12 and the others (ANOVA, p<0.0001; Tukey, p < 0.001). However, IgG2a specific Lc9
antibody production was observed only when saponin was used as adjuvant (Figure 2; 3 out of 3
experiments, ANOVA, p < 0.0001; Tukey, p < 0.001). The injection of rLc9 in association with
saponin gives the highest IgG2a/IgG1 ratio with (X ± SD, 0.77 ± 0.09) and by additional
statistical comparison a relation between the groups were rLc9/sap > rLc9/alum =
rLc9/Freund´Adj = rLc9/peanut oil = rLc9 alone = rLc9/pcDNA3.1-scmuIL-12 (data not shown,
ANOVA p < 0.0001 and Tukey p < 0.05).
Cellular immune response was evaluated by the determination of immune response
phenotype elicited by rLc9 injection alone or in combination of different adjuvant. Suspensions
of splenocytes from injected rLc9 mice were restimulated in vitro with rLc9 and tested for the
proliferation and cytokine production. A significant cell mediated response was evident only in
mice that were injected with rLc9 in association to saponin. As shown in Fig 2, immunization
with this protein preparation resulted in splenocyte proliferation (2 out of 3 experiments) in vitro
response to 0,1 µg/mL rLc9 stimulation (ANOVA, p < 0.0014; Tukey, p < 0.01). Others rLc9
concentrations used in the in vitro culture also induced statistically significant cell proliferation
(10 µg/mL, 1 out of 3 experiments and 1 µg/mL, 2 out of 3 experiments, data not shown).
179
However, all the other groups tested did not show significant splenocyte proliferation when
compared to the saline control group.
The cytokine production by splenocyte of mice that were injected with rLc9 showed a
predominant Th2 immune response profile. No IFN-gamma production was induced in response
to rLc9 protein injection administered with saline alone or in combination with Freund´s
adjuvant, peanut oil, alum or murine IL-12 plasmid DNA in contrast to production detected after
rLc9/saponin administration (Figure 2, ANOVA, p< 0.0005; Tukey, p < 0.01). All groups, with
exception of Freund´s adjuvant and peanut oil, showed a high IL-5 level production (Figure 2).
Interestingly, the association of rLc9 with saponin was the only one that induced IFN-gamma
production (3 out of 3 experiments) with concomitant IL-5 production (3 out of 3 experiments).
Then, an exclusively Th2 characteristic immune response induced by rLc9 protein could be
modified to a mixed Th1/Th2 type when Lc9 recombinant protein is administered in association
with saponin.
3.3. Specific rLc9 immune response in mice injected with different amounts of plasmid encoding
murine IL-12
In order to modify to Th1 type the specific immune response generated to rLc9 protein, a
plasmid encoding a murine single-chain IL-12 was co-administrated with rLc9 in mice. However,
as seen before, no change was observed with this combination. Posterior experiments showed that
a high dose of pcDNA3.1-scmur-IL-12 (50 µg) in different lineages of mice caused a significant
increase in the liver, spleen and draining lymph node size of the injected animals so that it could
be compromised the immune system (data not shown). Then, a single dose of different amounts
of pcDNA3.1-scmu-IL-12 were used in association with rLc9 protein and saponin (rLc9/sap)
preparation to verify if a in vivo lower concentration of IL-12 was capable to drive the rLc9
immune response to a Th1 type.
A high intensity specific humoral immune response was observed to rLc9 protein in all
conditions tested except to the controls groups injected with saline or saponin (Figure 3A,
ANOVA, p < 0.0001; Tukey, p < 0.001 all groups compared to the control groups). No difference
occurred when the recombinant protein was administered only with saponin or with DNA
plasmid (either pcDNA3.1 empty or four different amounts of pcDNA3.1-scmu-IL-12).
180
However, even so all the groups that received rLc9 showed the same intensity of a specific IgG1
production (Figure 3), a small difference was observed in the level of IgG2a production when
rLc9 was co-administrated with 50 µg of pcDNA3.1-scmu-IL-12 in a single dose of injection
(Figure 3). This difference was statistically significant (ANOVA, p < 0.0001; Tukey, p < 0.05)
compared to rLc9/sap injection only or the lower IL-12 DNA plasmid quantity co-administration
[pcDNA3.1-scmu-IL-12 (0.4 µg)]. The other two concentrations of IL-12 DNA plasmid, as well
as pcDNA3.1 empty, induced IgG2a specific antibody but with no statistically difference
compared to rLc9/sap response. The highest IgG2a/IgG1 ratio was observed in immunized mice
co-injected with 50 µg of pcDNA3.1-scmu-IL-12, with X ± SD of 0,81 ± 0,14, but with no
statistical difference compared to the others groups.
The cellular immune response induced using this immunization protocol was evidenced
only by cytokine production. No statistically significant splenocyte proliferation difference was
observed when all the groups were compared (Figure 3) but the IFN-gamma production was
detected in all the groups injected with rLc9. However, the group injected with the higher and the
lower murine IL-12 DNA plasmid concentration showed the a reduction in IFN-gamma level
(Figure 3). In addition, even IFN-gamma have been detected, statistical difference occurred only
between rLc9/saponin injected group and the controls groups injected with saline or saponin
(ANOVA, p < 0.0158; Tukey, p < 0.05). Interestingly, the IL-5 production observed after rLc9
administration was moderately diminished when 50 µg of DNA plasmid encoding murine IL-12
was used in a single dose injection co-administrated with the rLc9 to immunization (Figure 3)
and was kept lower also when 0.4 µg of DNA plasmid was used to injection. This latter result
may constitute a fortuitous result and need to be repeats to confirm the data.
3.4. Immune response to rLc9 after initial priming with plasmid DNA (pBK-CMV-Lc9)
DNA immunizations are known to promote a Th1-type immune response to encoded
proteins (Watts and Kennedy, 1999; Gurunathan et al., 2000). Thus, we examined the use of a
recombinant DNA plasmid injection to produce in vivo rLc9 protein and to try to induce a Th1type specific immune response in injected mice. Animals injected with pBK-CMV-Lc9 alone
were capable to respond specifically to rLc9 protein with IgG antibody production but with a
very lower intensity than the protein administration (Figure 4). However, this response is
181
predominantly of IgG2a isotype (2 out of 2 experiments) as seen clearly in others serum dilution
tested (data not shown). The cellular immune response was also very weak (2 out of 2
experiments) and not statistically significant when compared to controls groups (Figure 4).
A heterologous immunization strategy was used to try to increase the intensity of immune
response to the recombinant protein without revert the Th1 type characteristic. To do that, mice
were injected twice with pBK-CMV-Lc9 with 3-weeks intervals and boosted once with rLc9/sap
(table 1). As seen in Figure 4, a specific antibody production was also detected using this
immunization strategy. By statistical analysis, the mean optical density of the groups was
different and showed the relation: rLc9/sap > pBK-CMV-Lc9/rLc9/sap > pBK-CMV-Lc9 >
empty pBK-CMV = saponin = saline (ANOVA, p < 0.0001; Tukey, p < 0.001). Additionally,
while the IgG1 antibody production was higher in the group injected with rLc9 associated to
saponin the IgG1 production was not significantly detected using the DNA primer/protein booster
protocol of immunization (Figure 4, ANOVA, 0.0001; Tukey, p < 0.001 related to Lc9/saponin
compared to all the others groups). Finally, the IgG2a specific antibody production was not
statistically different between the two groups mentioned above (Figure 4). However, an
IgG2a/IgG1 ratio (X ± SD) of 0.29 ± 0.10 to rLc9/sap injection compared to 1.54 ± 0.8 to DNA
primer/protein booster (Student´s t test) is predicted of a Th1 differentiation to this latter group as
seen also to absent IgG1 production. Statistical comparison of the groups using the IgG2a/IgG1
ratio values showed the relation Lc9/sap < pBK-CMV-Lc9/rLc9/sap = pBK-CMV-Lc9 = empty
pBK-CMV = saponin = saline (ANOVA p < 0.0001 and Tukey p < 0.05).
After analysis of the cellular immune response, it was observed that a splenocyte
proliferation and Th1-type cytokine production were also induced by the DNA primer followed
by protein booster protocol (Figure 4). The proliferative response induced was statistically
different compared to the controls groups and the rLc9/saponin injected group (Saline = Saponin
= empty pBK-CMV = pBK-CMV-Lc9 < pBK-CMV-Lc9/Lc9 < Lc9/saponina; ANOVA, p <
0.0001; Tukey, p < 0.05). A more pronounced proliferation, but not statistically different when
compared to controls groups, was observed to DNA primer/protein booster injected group using
others concentrations of rLc9 used to culture in vitro (1 µg/mL and 10 µg/mL, data not shown).
Gamma-interferon production was detected in the culture supernatant at 13.9 ng/mL, 1.18 ng/mL
and 1.88 ng/mL to rLc9/sap, pBK-CMV-Lc9 or pBK-CMV-Lc9 followed by rLc9 booster,
respectively, but only the rLc9/saponin injected group showed a statiscally significant diference
182
related to all the others groups (ANOVA, p < 0.0005; Tukey, p < 0.01). Administration of rLc9
protein induced a IL-5 production (Figure 4) as seen before in other immunization protocol tested
(table 1, Figure 2 and 3). This IL-5 production was completely abrogated, with no production
detected, if rLc9 immune response is primed with pBK-CMV-Lc9 DNA plasmid (Figure 4).
4. Discussion
In this study, we evaluated the immunogenic properties of a new L. infantum/L. chagasi
recombinant antigen (rLc9) as a potential vaccine component candidate against canine visceral
leishmaniasis. Groups of BALB/c mice were used to the first evaluation of rLc9 injection as this
is an easy and useful model to manipulate and access the immune response to a specific antigen
and further to check the role of this response in an infection context. In an initial step, several
adjuvants were tested in association with recombinant protein. In addition, DNA-based
immunization was examined. All protocols used were done aiming to modulate as the specific
immune response type as the intensity to further evaluation of the effective role of the immune
response to Lc9 in an infection challenge with L. infantum/L. chagasi.
The rLc9 protein was successfully expressed both in a prokaryotic and eukaryotic
systems. The specificity of the recombinant protein (39 kDa approximately) was confirmed by
reactivity with positive pooled serum of dogs with visceral leishmaniasis and an anti-His-Tag
antibody to detect rLc9-(6) histidine-fusion protein produced in E. coli. It is possible that a band
of low molecular weight recognized by specific antibodies in the pBK-CMV-Lc9 transfected
COS-7 cells maybe rLc9 with partial degradation or mRNA anormally transcribed as sometimes
it is observed in prokaryotic expression (Schoemaker et al., 1985). A high purity degree
preparation of rLc9 was used to injection of mice, as seen in the SDS-PAGE analysis.
The immunogenic properties of the rLc9 were clearly observed. A specific antibody
production was induced by rLc9 administration. It must be emphasized that this response
presented a Th2-type characteristic pattern with exclusive IgG1 isotype and IL-5 production. No
proliferative response or IFN-γ production was observed. Early observations also have shown the
natural immunogenicity of this protein. The first one is that the screening of the cDNA library
was done with reactive dog´s serum to L. infantum/L. chagasi visceral leishmaniasis and latter by
183
the reactivity of human visceral leishmaniasis patient’s serum (unpublished data). Moreover,
initial experiments in our lab showed that the rLc9 induced a strong humoral specific response
but it wasn’t observed a proliferative cellular immune response in immunized dogs. Then, as
protection or resolution of infection in the dog’s visceral leishmaniasis it is associated to a potent
cellular immune response that result in IFN-γ production (Pinelli et al., 1994; Martinez-Moreno
et al., 1995; Rhalem et al., 1999), efforts to modulate the immune system response to rLc9 in the
murine model were done first by the use of several adjuvant association.
Our data demonstrate that among the tested adjuvant only one, the rLc9/saponin
association, was effective to change the rLc9 immune response. Using this preparation, a specific
cellular immune response was efficiently induced with only a minor difference, but statistically
significant, in relation to the intensity of the humoral response compared to the others adjuvant
association. However, even so a specific cellular proliferation has been observed, a mixed
Th1/Th2 pattern of cytokine production (IFN-γ and IL-5) and antibody isotype (IgG1 and IgG2)
was present. This result is in agreement with other work that show the consistent ability of
saponin in stimulate of both Th1 and Th2-type cells, with concomitant production of IFN-gamma
and IL-10 (Tadokoro et al., 1996). In addition, when compared with a panel of differents
adjuvants, associated to a purified glycoprotein from Trypanossoma cruzi, saponin also was the
only one to induce delayed-type hipersensitivity and partial protective immunity to a challenge
with live parasites (Scott et al., 1984). In the Leishmania models, the saponin as an adjuvant has
been susccessfully combined to the FML-antigen of L. donovani to induce strong specific
humoral and cellular immune response in immunized BALB/c mice after infection challenge and
with high degree protection (84.4%) in terms of the reduction of parasite liver burden (Palatinikde-Sousa et al., 1994 ). In an outbreed mice model, the FML-saponin preparation (or their
saponin fractions) also induced IgG2a specific antibodies production in the presence of IgG1
isotype with DTH reaction and IFN-gamma detected in the serum of immunized mice correlated
with protection (Santos et al., 2002). In our data reported here, the immune response pattern
induced by rLc9/saponin was consistently observed in two others posterior experiments.
Contrary to our expectations, the potent immunomodulatory activity of IL-12 was not
observed in the first realized experiments. The use of recombinant murine IL-12 to modulate the
immune response to soluble Leishmania major antigens (SLA) was clearly demonstrated prior by
Afonso et al., 1994 and recently, as IL-12 DNA plasmid injection given with a specific L.
184
donovani antigen rORFF (Tewary et al., 1996). We have presumption about ours results that a
toxic effect caused by IL-12 must be compromised the immune response as described by others
(Kurzawa et al., 1998; Lasarte et al., 1999; Chen et al., 2001). In another studies it was also
demonstrated that IL-12 administration was midly detrimental to spleen instead to contribute to
protection (Satger et al., 2000). In the present work, a high level of IL-12 in vivo expression
could be induced after DNA plasmid injection followed by electroporation technique as it is
showed to other proteins (Rizzuto et al., 1999; Yamashita et al., 2001). Moreover, initially it was
used an immunization protocol with 3 time injection of pcDNA3.1-scmu-IL-12. In previous
experiments realized in our laboratory, serum of BALB/c mice injected intramuscularly with
pcDNA3.1-scmu-IL-12 followed by electroporation showed high levels of IFN-gamma as a
consequence of IL-12 effects (Barrouin-Mello, unpublished data) and a evident splenomegaly
was also observed after IL-12 plasmid administration (data not shown). Thus, as showed in
posterior experiments in this study, a single dose injection of DNA plasmid encoding IL-12 was
capable to modulate moderately the specific immune response to rLc9 with a reduction of IL-5
production.
A Th1-type immune response was induced to rLc9 when initial DNA-based immunization
was done but at lower intensity than protein injection. However, the low or even absence of
humoral response seems to be frequently common for DNA vaccines, which favors cellular rather
than humoral response (Gurunathan et al., 2000; Mendez et al., 2001; Dumonteil et al., 2003;
Aguilar-Be et al., 2005). Thus, it is not easy to explain why the splenocyte proliferation and IFNgamma production was absent or was produced at not statistically significant level, respectively,
when only pBK-CMV-Lc9 was administered. We cannot exclude the possibility of a low protein
expression in vivo even using a plasmid with a potent promoter and with a high GC content
associated to transfection enhancer technique. There is need to consider the prokaryotic promoter
presence in the vector that can cause interference with the in vivo expression, as manufacturer
insctructions (Stratagene).
We demonstrated that an exclusive specific IgG2a production was detected in the serum
samples of initially pBK-CMV-Lc9 injected animals. As a clear correlation exist between the
antibody isotype switch and the cellular immune response pattern associated (Snapper et al.,
1987; Purkerson and Isackson, 1992) we speculated that IFN-γ producer cells were primed after
pBK-CMV-Lc9 injection. This Th2/Th1 change to rLc9 immune response was expected since
185
almost all of the DNA vaccines already tested in leishmaniasis experimental models resulted in
the development of a Th1-type response with varying degrees of protection (Xu and Liew, 1995;
Gurunathan et al., 1997; Walker et al., 1998; Sjolander et al., 1998; Méndez et al., 2001; Rafati et
al., 2001). In only one published study, a Th2-type specific response to a Leishmania
recombinant protein, the Meta 1 antigen, could not be reverted by the use of DNA injection
(Serezani et al., 2002) and the authors attributed this to the potent Th2-immunodominance of the
protein.
The intensity of the Th1-type response induced to rLc9 after DNA encoding plasmid
immunization could be moderatelly increased by the use of the heterologous DNA primer/protein
booster strategy. Moreover, in the induced rLc9 murine immune response after heterologous
DNA primer/protein booster, neither IgG1 antibodies nor IL-5 production was present at the
tested conditions. In other study, a lack of protection against L. major infection was observed
following a primer/booster immunization with rLIPO and the authors attributed this to the IgG1
specific antibody detection although splenocytes and lymph node cells from these mice produced
high levels of IFN-gamma when stimulated in vitro with rLIPO (Iborra et al., 2003). In spite of
the fact that there was no detection neither of IgG1 antibodies nor IL-5 in our model of
immunization with rLc9 in a DNA-based immunization and in a DNA primer/protein booster
strategy we cannot exclude that IL-10, a key role cytokine involved in susceptibility and/or
disease progression in human visceral leishmaniasis and in murine experimental model (Ghalib et
al., 1993; Bacellar et al., 2000; Murphy et al., 2001), it was produced after in vitro stimulation
with rLc9. This possibility needs to be evaluated in future experiments and to do this LPS
determination of purified rLc9 used to in vitro experiments should be tested to exclude the
possibility of induction of this and the others cytokines by contamination of this molecule (Huang
et al., 1999).
Even though the rLc9 protein has been selected by an amastigote form cDNA library this
protein is present in both the promastigote and amastigote forms of the parasite (data not shown).
It was demonstrated by antibody reactivity of immunized mice with L infantum/chagasi
promastigote total extract antigens. However, only a lower reaction was developed in the ELISA.
Thus, our data suggest that the Lc9 protein could be in a lower representation in the Leishmania
promastigote total extract antigens. Even so, when initial injection with pBK-CMV-Lc9 was
used, predominant IgG2a isotype reactive antibodies were observed in the anti-total antigens
186
ELISA after the complete immunization series. In addition, in a prior challenge experiment with
L. infantum/chagasi promastigotes, splenocytes of previous pBK-CMV-Lc9 injected group
produced high levels of IFN-gamma after in vitro stimulation with rLc9 which was statistically
different to the controls (ANOVA, p<0.001 and Tukey, p < 0.05) showing that in a recall
response the immunized animals were capable of reactive specific memory cells.
In summary, a mild Th2 immune response was induced in mice by the new recombinant
L. infantum/chagasi antigen, named rLc9. However, the use of saponin as adjuvant associated
with rLc9 antigen changed the response to a strong mixed Th1/Th2 pattern which was not
modified to Th1 type by using mIL-12. Nevertheless, initial injection of pBK-CMV-Lc9 induced
a predominantly Th1 immune response and heterologous DNA primer/protein booster is a useful
strategy to intensify this response. Our studies permitted us to obtain a broad range of rLc9
specific immune response in mice. Future directions are in order to analyze the protocols efficacy
in terms of protection against infection both in experimental murine visceral leishmaniasis as in
the dog, the outbreed model and target of the vaccine.
Acknowledgments
We thank Andréa Mendes, Patrícia Meira and Elivani Sacramento for helping us with
suggestions and/or experiments during the development of the work. Financial Support:
INOVABIO Program, MCT, Brazil, RENORBIO Program, MCT, Brazil, MILENIO VACINAS
Program, CNPq and FAPESB.
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191
FIGURE LEGENDS
FIG 1. In vitro expression of rLc9. (A) Procaryotic expression system of rLc9 in E. coli
transformed with pRSET-Lc9 3 hours before (lane 4) and after (lane 5) IPTG induction was
evaluated after 12% SDS-PAGE. The rLc9 purified in a niquel column is showed at lane 6. The
negative control plasmid pRSET without insert did not show any band at the same region neither
before (lane 2) nor after (lane 3) IPTG induction. In (B) Western blot is showing the specificity
of rLc9 protein in E. coli identified by a pooled of dog´s serum with positive immune response to
L. infantum/L. chagasi (lane 4) and with a mouse anti-His tag antibody (lane 5) in a nitrocellulose
membrane blotted with rLc9 after a 10,5% SDS-PAGE. Serum of normal dog and mouse antiIgG were used as negative control (lanes 2 and 3, respectively). In (C) rLc9 eukaryotic expression
was demonstrated in transfected COS-7 cells. The pBK-CMV-Lc9 DNA plasmid (lane 4) and
pBK-CMV empty control (lane 3) were introduced in mammalian cells (COS-7 only, lane 2) by
lipofectamine treatment. Identification of rLc9 in the cell lysate was done after 10,5% SDSPAGE followed by transfer to nitrocellulose membrane. Reactivity with positive pooled serum
dog’s visceral leishmaniasis was detected only in lane 3. The rLc9 L. chagasi recombinant
protein is indicated by arrows to the right of the panel. The location and size (kDa) of the
molecular mass markers (Bio-Rad) are shown at the left and in lane 1.
FIG 2. Specific immune response in mice injected with rLc9 and different adjuvants.
BALB/c mice (six/group) were injected s.c.3 times at 3-week intervals with saline, 100 µg of
rLc9 alone or associated with Freund’s adjuvant, saponin, peanut oil, alum or 50 µg of a plasmid
encoding single chain murine IL-12 (pcDNA3.1-scmIL-12). Plasmid DNA was injected
intramuscularly followed by electroporation. Mice were bled 10 day following the final injections
and serum from the mice in each group was evaluated individually. For indirect ELISA, 96-well
microtiter plates were coated with 100 µL of rLc9 (5 µg/mL) by overnight incubation in 0,1M
carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6, by overnight incubation. For total IgG detection serum
samples were diluted 1:5000. Then, goat anti-mouse IgG-peroxidase was used. For measurement
of IgG1 and IgG2a, samples were diluted to 1:50.000 followed by biotin-conjugated rat antimouse IgG1 or anti-mouse IgG2a and avidin-peroxidase incubation. Color development was
done with substrate buffer containing TMB-H2O2 and optical density at 450 nm was determined.
Each sample was examined in duplicate. Results are expressed as the mean ± SD. Cellular
192
immune response was evaluated with 4 weeks after the final injection. Individual spleen cell
suspension was obtained and cultured for lymphoproliferative response assay and cytokine
production measurement. For cell proliferation, 3 x 105 cells/well were cultured, in triplicate, in a
96-wells plate with supplemented culture medium alone or with rLc9 (0,1 µg/mL) for 5 days at
37oC in a humidified ambient with 5% CO2. Cell proliferation was measured by more 18 h
incubation of cells with 3H-thymidine. The results are presented as the mean of Stimulation
Index (SI) ± SD of each group. To cytokine production evaluation, splenocytes were cultured in a
24-wells, 9 x 105 cells/well, in the presence of rLc9 (10 µg/mL) for 48 h. Then, supernatants were
collected and used in a capture ELISA to detect IFN-gamma and IL-5. Individual samples were
tested to IFN-gamma and pooled samples to IL-5 measurement. The IFN-γ values are represented
as the mean ± SD of each group. * ANOVA and Tukey, p < 0.05 compared to control group.
FIG 3. Specific immune response in mice injected with rLc9 and different amounts of
murine IL-12 encoding DNA plasmid. BALB/c mice (six/group) were injected s.c.3 times at 3week intervals with 100 µg of rLc9/saponin (rLc9 sap). In the first dose of injection, a plasmid
encoding single chain murine IL-12 (pcDNA3.1-musc-IL-12) was administered in animals of
four groups at different quantities soon after rLc9 injection. Plasmid DNA intramuscular injection
was followed by electroporation. Saline, Saponin and pcDNA3.1 empty plasmid control groups
were included in the experiment. Mice were bled 10 day after the final injections and serum from
the mice in each group was evaluated individually. To indirect ELISA assay, 96-well microtiter
plates were coated with 100 µL of rLc9 (5 µg/mL) by overnight incubation in 0,1M carbonatebicarbonate buffer pH 9,6. For total IgG detection serum samples were diluted 1:5.000. Next,
goat anti-mouse IgG-peroxidase was used. For measurement of IgG1 and IgG2a antibodies,
samples were diluted to 1:350.000 followed by biotin-conjugated rat anti-mouse IgG1 or antimouse IgG2a and avidin-peroxidase incubation. Color development was done with substrate
buffer containing TMB-H2O2 and optical density at 450 nm was determined. Each sample was
examined in duplicate. Results are expressed as the mean ± SD. Cellular immune response was
evaluated with 4 weeks after the final injection. Individual spleen cell suspension was obtained
and cultured for lymphoproliferative response assay and cytokine production measurement. For
cell proliferation (A), 3 x 105 cells/well were cultured, in triplicate, in a 96-wells plate with
supplemented culture medium alone or with rLc9 (0,1 µg/mL) for 5 days at 37oC in a humidified
193
ambient with 5% CO2. Cell proliferation was measured by more 18 h incubation of cells with 3Hthymidine. The results are presented as the mean of Stimulation Index (SI) ± standard deviation
of each group. To cytokine production evaluation, splenocytes were cultured in a 24-wells, 9 x
105 cells/well, in the presence of rLc9 (10 µg/mL) for 48 h. Then, supernantants were collected
and used in a capture ELISA to detect IFN-gamma and IL-5 as described in Material and
Methods. Individual samples were tested to IFN-gamma and pooled samples to IL-5
measurement. The IFN-γ values are represented as the mean ± SD of each group. * ANOVA and
Tukey, p < 0.05 compared to controls groups.
FIG 4. Specific immune response in mice after Lc9 encoding DNA plasmid injection.
BALB/c mice (six/group) were injected s.c.3 times at 3-week intervals with saline, saponin, pBKCMV empty plasmid, rLc9/sap or pBK-CMV-Lc9. Another group received two initial injection
of pBK-CMV-Lc9 followed by a rLc9/sap booster at the third injection. Plasmid DNA was
injected intramuscularly followed by electroporation. Mice were bled 10 day following the final
injections and serum from the mice in each group was evaluated individually. For indirect ELISA
assay, 96-well microtiter plates were coated with 100 µL of rLc9 (5 µg/mL) by overnight
incubation in 0,1M carbonate-bicarbonate buffer pH 9,6. For total IgG detection serum samples
were diluted 1:5.000. Then, goat anti-mouse IgG-peroxidase was used. To measurement of IgG1
and IgG2a, samples were diluted to 1:350.000 followed by biotin-conjugated rat anti-mouse IgG1
or anti-mouse IgG2a and avidin-peroxidase incubation. Color development was done with
substrate buffer containing TMB-H2O2 and optical density at 450 nm was determined. Each
sample was examined in duplicate. Results are expressed as the mean ± standard deviation.
Cellular immune response was evaluated with 4 weeks after the final injection. Individual spleen
cell suspension was obtained and cultured for lymphoproliferative response assay and cytokine
production measurement. For cell proliferation (A), 3 x 105 cells/well were cultured, in triplicate,
in a 96-wells plate with supplemented culture medium alone or with rLc9 (0,1 µg/mL) for 5 days
at 37oC in a humidified ambient with 5% CO2. Cell proliferation was measured by more 18 h
incubation of cells with 3H-thymidine. The results are presented as the mean of Stimulation
Index (SI) ± SD of each group. To cytokine production evaluation, splenocytes were cultured in a
24-wells, 9 x 105 cells/well, in the presence of rLc9 (10 µg/mL) for 48 h. Then, supernatants were
collected and used in a capture ELISA to detect IFN-gamma and IL-5. Individual samples were
194
tested to IFN-gamma and pooled samples to IL-5 measurement. The IFN-γ values are represented
as the mean ± SD of each group. * ANOVA and Tukey, p < 0.05 compared to controls groups.
195
Table 1. Immunization protocols
Immunization
protocol
1
Prime
Boost
Day 0
Day 21
Day 42
saline
saline
saline
rLc9
rLc9
rLc9
rLc9 CFAa
rLc9 IFAb
rLc9 IFA
rLc9 sapc
rLc9 sap
rLc9 sap
rLc9 alum
rLc9 alum
rLc9 alum
rLc9 peanut oil
rLc9 peanut oil
rLc9 peanut oil
rLc9 pIL-12 (50 µg)
rLc9 pIL-12
rLc9 pIL-12
2
sap
sap
sap
rLc9 sap
rLc9 sap
rLc9 sap
rLc9 sap + pIL-12 (50 µg)
rLc9 sap
rLc9 sap
rLc9 sap + pIL-12 (10 µg)
rLc9 sap
rLc9 sap
rLc9 sap + pIL-12 (2 µg)
rLc9 sap
rLc9 sap
rLc9 sap + pIL-12 (0.4 µg)
rLc9 sap
rLc9 sap
3
pBK-CMV empty
pBK-CMV empty pBK-CMV empty
pBK-CMV-Lc9
pBK-CMV-Lc9
pBK-CMV-Lc9
pBK-CMV-Lc9
pBK-CMV-Lc9
rLc9 sap
Protocols used for BALB/c mice immunization. protocols followed for BALB/c mice. Animals
were primed by injecting s.c. with 100 µg of rLc9 in combination with different adjuvant or i.m.
with 50 µg of plasmid pBK-CMV-Lc9. The animals were boosted as indicated 21 or 42 day later.
The control group Saline was repeated in all the immunization protocols tested. Furthermore, the
saponin and rLc9 sap injected groups (included in the protocol number 2) were used as a control
group in immunization protocol 3.
a
Complete Freund´Adjunt
b
Incomplete Freund´Adjuvant
c
saponin (Quilaja bark-Sigma)
Santos, L.R.; Fraga, R.E; Pinheiro, C.G.M.; Rodrigues, M.; dos Santos, W.L.C.; Pontes-deCarvalho, L.C.; Oliveira, G.G.S.
196
A
B
KDa
KDa
20 0
116
9 7 ,4
66
200
C
KDa
200
116
9 7 ,4
45
116
9 7 ,4
66
31
66
45
45
2 1 ,5
29
29
1 4 ,4
6 ,5
L a ne s:
1
2
3
4
5
6
1
2
3 4 5
1
2
3
4
FIG 1
Santos, L.R.; Fraga, R.E; Pinheiro, C.G.M.; Rodrigues, M.; dos Santos, W.L.C.; Pontes-deCarvalho, L.C.; Oliveira, G.G.S
197
IgG
60
p<0,05
2
Lymphoproliferation
*
p<0,05
*
*
1
Index
*
*
*
IgG1
2
*
*
*
IFN-γ
*
*
p<0,05
4.0
ng/mL
*
1
*
2.0
0.0
p<0,05
2.0
/P
n
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Lc
il
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9
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Lc
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IL A3
-1 .1
2
-
1
IL-5
Lc
9
*
Sa
lin
IgG2a
Lc
9/
0
2
20
0
0
ng/mL
Optical density (450 nm)
*
40
FIG 2.
Santos, L.R.; Fraga, R.E; Pinheiro, C.G.M.; Rodrigues, M.; dos Santos, W.L.C.; Pontes-deCarvalho, L.C.; Oliveira, G.G.S.
Sa
lin
e
Sa
Lc
p
9/
o
Lc
ni
pc
Lc
9/
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*
*
*
*
*
*
IgG1
*
*
IgG2a
*
p<0,05
*
*
*
1
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*
*
1
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*
*
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cm
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IL
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2
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µg
2
)
(0
,4
µg
)
2
IgG
ng/mL
3
ng/mL
Optical density (450 nm)
198
60
0.8
Lymphoproliferation p<0,05
40
IFN-γ
*
p<0,05
8
4
0
1.0
IL-5
0.6
0.4
0.2
FIG 3.
Santos, L.R.; Fraga, R.E; Pinheiro, C.G.M.; Rodrigues, M.; dos Santos, W.L.C.; Pontes-deCarvalho, L.C.; Oliveira, G.G.S
199
IgG
15
p<0,05
Lymphoproliferation
*
Index
2
*
1
p<0,05
10
*
5
*
0
0
IgG1
ng/mL
*
1
0
2
IFN-γ
30
p<0,05
*
p<0,05
10
4
2
0
1.0
p<0,05
IgG2a
0.8
1
*
*
0
IL-5
0.6
0.4
0.2
on
in
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KCM
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V
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Sa
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ni
n
KCM
pB
VKLc
CM
9
VLc
9/
Lc
9
2
ng/mL
Optical density (450 nm)
*
FIG 4.
Santos, L.R.; Fraga, R.E; Pinheiro, C.G.M.; Rodrigues, M.; dos Santos, W.L.C.; Pontes-deCarvalho, L.C.; Oliveira, G.G.S.O.