avaliação do dimorfismo de candida albicans por macrófagos ativados

AVALIAÇÃO DO DIMORFISMO DE CANDIDA ALBICANS POR
MACRÓFAGOS ATIVADOS
Kamila Landucci Bonifácio (PIBIC/CNPq-UEL), Thais Herrero Geraldino
(Mestranda Patologia Experimental/UEL), Lorena Flor da Rosa Santos
Silva(Fundação Araucária/UEL), Ionice Felipe (Orientador), e-mail:
[email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Centro de Ciências Biológicas/Londrina,
PR
Ciências Biológicas/ Imunologia
Palavras-chave: Candida albicans, Concanavalina-A, fagocitose
Resumo
Neste trabalho foi investigado o possível aumento de eficácia de
macrófagos de camundongos pré-tratados com concanavalina-A (Con-A)
para fagocitar e destruir Candida albicans, além do dimorfismo durante os
ensaios fagocíticos.Os macrófagos peritoneais de camundongos prétratados por 3 dias com Con-A ou tampão fosfato (PBS) foram co-incubados
com isolados de C. albicans CR1, CR15 e 577 por 2h. Os macrófagos
ativados com Con-A fagocitaram significativamente mais em comparação
com os macrófagos tratados com PBS. A transição da forma leveduriforme
para filamentosa durante co-incubação por 2h com macrófagos controles foi
entre 73-80%, enquanto que na presença de macrófagos ativados com ConA, foi de 35-40%.Os resultados sugerem que pelo tratamento com Con-A
ocorreu a ativação dos macrófagos, os quais foram mais eficientes para
fagocitar e destruir C. albicans reduzindo significativamente o dimorfismo do
fungo.
Introdução
Candida albicans, são freqüentemente isolados das superfícies
mucosas de indivíduos saudáveis. Alterações que levam a injuria de
tegumento ou disfunções imunológicas propiciam colonização de tecidos por
este patógeno .
O dimorfismo de C. albicans compreende crescimento em levedura
(blastoconídeos) e forma filamentosa [1] multicelular e interfere na
patogenicidade. As hifas têm maior capacidade de aderir e penetrar nas
células epiteliais humanas do que os blastoconídios. [3].
A grande virulência atribuída à transição levedura- forma filamentosa
pode ser devido em partes a deficiência da indução para a síntese de IL-12
pelo hospedeiro. A IL-12 é considerada uma citocina importante na defesa
anti candidíase em níveis mucosos e sistêmicos. Experimentos evidenciaram
que leveduras induzem a produção de IL-12 e IL-10 e células do tubo
germinativo induzem predominantemente IL-10, citocina associada a
candidíase em camundongos .
Concanavalina-A (Con-A) é uma lectina mitogenica, isolada de
Canavalia ensiformis, e apresenta ampla ação biológica através da interação
com o sítios de açúcares, mimetizando a ativação por antígenos e induzindo
a ativação policlonal de linfócitos. Con-A liga-se diretamente as moléculas de
carboidratos do complexo de histocompatibilidade (MHC) e ao receptor de
linfócitos T (TCR), resultando na indução de resposta celular . A ativação de
células Th1 induz a produção de citocinas como IL-12, IFN-γ e TNF-α [2].
Materiais e Métodos
Animais
Foram utilizados camundongos suíços, machos, pesando entre 2832g e 6-12 semanas de idade e receberam ração estéril e água a vontade. O
trabalho recebeu aprovação do Comitê de Ética em experimentação animal
da Universidade Estadual de Londrina - UEL.
Isolados de Candida albicans
Isolados de C. albicans CR1 e CR15 foram obtidos da mucosa oral de
pacientes infectados pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) na
Faculdade de Odontologia e no Hospital Universitário da UEL. Após
crescimento em caldo Sabouraud dextrose, os isolados foram utilizados
após duas passagens em camundongos. C. albicans 577 foi isolada da pele
de paciente HIV-negativo.
Cultura de Candida albicans
Os isolados de C. albicans (CR1, CR15 e 577) foram mantidos em
ágar Saboraud destroxe em temperatura ambiente. Os blastoconídeos foram
obtidos por crescimento em caldo Saboraud dextrose por 24h a 28ºC e
lavadas 3 vezes com salina tamponada com fosfato (PBS).
Macrófagos e Ensaio fagocítico
Os camundongos foram tratados com dose única de 250μg de Con-A
(Sigma)/ 250μL de PBS, intraperitonealmente (i.p.) ou somente PBS. Após 3
dias os animais foram sacrificados em éter etílico, as células do exudato
peritoneal foram coletadas por lavagem da cavidade peritoneal com 3ml de
meio RPMI 1640 contendo 5% de SFB inativado por aquecimento.
As células foram ajustadas a 4X10 5 células/ml e adicionadas às
lamínulas (22x22mm) contidas em placas de cultivo celular de 6 poços e
incubadas por 1h a 37ºC. Após este período de incubação as células foram
lavadas com meio RPMI 1640, para remoção das células não aderentes.
Monocamadas de macrófagos peritoneais ativados com Con-A ou
PBS foram co-incubadas com C. albicans CR1, CR15 e 577 por 2h a 37ºC,
opsonizadas ou não-opsonizadas com soro fresco de camundongo nãoimune (2,5%) em uma proporção de 1:5. A porcentagem de macrófagos
fagocitando foi determinada após coloração das células com Giemsa pela
contagem de 10 campos em imersão.
Dimorfismo
O dimorfismo foi avaliado após 2h de coincubação de macrófagos
com C. albicans CR1, CR15 e 577. Leveduras e formas filamentosas foram
contadas dentro e fora dos macrófagos em imersão (10 campos), usando
microscópio Nikon Alphaphot YS.
Resultados
Diferenças morfológicas entre os três isolados de Candida albicans
Em tese de mestrado De Vito (2007) [6] demonstrou diferenças
morfológicas entre os três isolados utilizados neste estudo. Blatoconídeos de
C. albicans 577 são ovais, C. albicans CR1 são esféricas e pequenas e C.
albicans CR15 parece um grão de uva e são duas vezes maiores que CR1.
Efeito da administração de Con-A na fagocitose de Candida
A porcentagem de macrófagos fagocitando na ausência de soro
fresco de camundongo não imune foi significantemente maior nos
macrófagos de camundongos pretratados com Con-A, comparados ao
controle. A opsonização com soro fresco de camundongo não imune
aumentou a internalização dos três isolados testados, em ambas as
populações de macrófagos, os pretratados com Con-A ou PBS, sendo que a
internalização foi significantemente maior nos pretratados com Con-A que
nos pretratados com PBS.
Transição da forma de levedura para filamentosa durante coincubação
com macrófagos
A capacidade de C. albicans diferenciar-se rápida e reversivelmente
entre levedura e forma filamentosa, foi investigada durante co-incubação
com macrófagos pretratados com Con-A ou PBS. Após 2h de co-incubação
dos macrófagos com os três isolados, verificou-se que o dimorfismo foi maior
nos macrófagos dos camundongos pretratados com PBS comparados com
Con-A. (Tabela1).
Tabela 1. Transição para formas filamentosas durante coincubação de
blastoconídeos com macrófagos.
Con-A
PBS
Con-A+S
PBS+S
Isolados
Filamento Filamento
Filamentos
Filamentos
s
s
CR15
36.5±6.3
74.7±11.2*
30.9±4.5
70.6±12.1*
577
35.6±6.3
72.6± 2.3*
32.2±6.3
68.2±13.0*
CR1
40.2±9.4
78.1±10.7*
25.7±8.1
69.1±8,5*
C. albicans foram coincubadas com macrófagos a 37ºC por 2h. A análise foi
realizada através da contagem de dez campos em imersão e a porcentagem
de formas filamentosas foi determinada na presença (S) ou ausência de soro
fresco de camundongo não imune. Os resultados são média ± desvio padrão
para quatro experimentos. *P <0.01 em relação aos macrófagos pré-tratados
com Con-A.
Discussão
Os resultados dos ensaios fagocíticos mostraram que os macrófagos
pré-tratados com Con-A mantiveram um alto potencial para ingerir C.
albicans (CR1, CR15 e 577) comparado aos macrófagos pré-tratados com
PBS. A adição de soro fresco de camundongo aumentou a fagocitose em
ambas às populações de macrófagos, mas nos pre-tratados com Con-A foi
significantemente superior, comparado aos pré-tratados com PBS.
Evidências indicam que aumento na capacidade de macrófagos pré-tratados
com Con-A fagocitar e matar C. albicans (CR1, CR15 e 577) está
relacionada ao aumento da atividade dos receptores de manose nestes
macrófagos. Estes receptores desenvolvem um importante papel na defesa
do hospedeiro e providenciam um elo entre a imunidade inata e a imunidade
adaptativa porque estão associados com uma via de transdução de sinal
levando a produção de citocinas como IL-1β, IL-6 e TNF-α [5].
Em tese de Geraldino (2010) e publicado Geraldino et al.,(2010) [4]
foi verificado níveis elevado de TNF-α que correlaciona com o impedimento
da transição da forma leveduriforme para filamentosas em macrófagos
ativados com Con-A. Em contraste os macrófagos controle mantiveram
níveis basais de TNF-α, o que proporcionou um melhor ambiente para a
transição da forma mais agressiva, ou seja, de levedura para forma
filamentosa.
Conclusão
A ativação dos macrófagos com Con-A melhorou a capacidade de
fagocitar e matar C. albicans. Este fato pode ser devido ao aumento da
atividade dos receptores de manose, produção de TNF-α contendo o
desenvolvimento de fatores de virulência, como a transição da forma de
levedura para filamentosa, que seria crucial para a sobrevivência da
Candida.
Referencias Bibliográficas
1. Alvares, C. A.; Svidzinsk, T. I. E. e Consolaro, M. E. L.. Candidíase
Vulvovaginal: fatores predisponentes do hospedeiro e virulência das
leveduras. J Bras. Patol. Med. Lab. 2007, 43, 319.
2. Bertram, E. M.; Jilbert, A. R.; Kotlarki, L. Optimization of an in vitro assay
which measures the proliferation of duck T lymphocytes from peripheral
blood in response to stimulation with PHA and Con-A. Dev. Comp.
Immunol.1997, 21, 229.
3. Fé d`Ostiani, C et al.,Dendritic cells discriminate between yeasts and
hyphae of fungus Candida albicans: Implications for initiation of helper cell
immunity in vitro and in vivo. J. Exp. Med. 2000, 191, 1661.
4. Geraldino, T. H.; et al.; Increased tumour necrosis factor-α production,
higher mannose receptor activity to kill Candida by concanavalin-A activated
macrophages. FEMS Immun. Med. Microbiol. 2010, 59, 11.
5. Netea, M. G.; et al., Immune sensing of Candida albicans requires
cooperative recognition of mannans ang glucans by lectin and Toll-like
receptors. J. Clin. Invest., 2006, 116, 1642.
6. de VITO, E. Apoptose de macrófagos residentes e ativados por
Concanavalina-A após fagocitose de Candida albicans. Tese Mestrado,
Universidade Estadual de Londrina, 2007.