Devido ao uso crescente da “Polimerase Chain Reaction” ou PCR

BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
Ano Lectivo 2004-2005
Aula Prática 4L: AMPLIFICAÇÃO DE DNA POR PCR
Os avanços tecnológicos das últimas décadas possibilitaram o aparecimento de um novo ramo da
Ciência – a Biotecnologia, que transformou e revolucionou a investigação científica. Métodos engenhosos de
isolamento, análise e manipulação do DNA permitiram avanços no conhecimento dos processos biológicos, de
inúmeras doenças humanas e metodologias terapêuticas. Num futuro próximo, uma visita ao médico de família
poderá incluir uma bateria de testes de diagnóstico de DNA, pelo que se torna fundamental a compreensão destes
princípios.
Devido ao uso crescente da “Polimerase Chain Reaction” ou PCR na ciência e medicina modernas é
necessário compreender os princípios básicos e aplicações da PCR. Em 1983, Kary Mullis da Cetus Corporation
desenvolveu a técnica de biologia molecular que revolucionou a investigação genética e lhe valeu o prémio
Nobel em 1993. Esta técnica, a PCR, transformou a biologia molecular numa ferramenta de investigação
multidisciplinar nos 5 anos após a sua invenção. Grande parte das técnicas de biologia molecular antes da PCR
eram laboriosas, demoradas e requeriam um nível de conhecimento técnico elevado. Além disso, trabalhar com
quantidades mínimas de DNA tornava-se muito difícil em certas áreas, como a Patologia, Botânica, Zoologia,
Farmácia, etc.
A PCR teve um impacto enorme em quatro áreas principais da biotecnologia: mapeamento genético,
clonagem, sequenciação de DNA e detecção genética. A PCR é actualmente utilizada no diagnóstico médico
permitindo a detecção de mutações específicas que estão na base de certas doenças genéticas, em investigações
do foro criminal facultando identificação inequívoca de suspeitos a um nível molecular, e tornou-se a peça chave
na recente sequênciação do genoma humano.
O objectivo da PCR é produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de DNA a partir
de uma quantidade mínima, sendo considerada por este motivo uma técnica de clonagem genética. Isto significa
a amplificação controlada por enzimas do DNA molde (template), que contém o fragmento específico de DNA.
O molde pode ser qualquer forma de DNA de cadeia dupla, como o DNA genómico. Pode usar-se uma gota de
sangue, um fio de cabelo ou uma célula do epitélio oral e aplicar a PCR para gerar milhões de cópias do
fragmento de DNA de interesse. A capacidade que a PCR tem de amplificar uma sequência precisa de DNA está
na base do seu sucesso, que se alia à sua simplicidade e especificidade.
A PCR faz uso de dois dos princípios básicos da genética: a hibridação à cadeia complementar DNA e a
síntese de DNA pela DNA polimerase. No caso, da PCR, a hibridação da cadeia complementar tem lugar quando
dois primers de oligonucleótidos se ligam às sequências dos pares de bases complementares da cadeia molde. Os
dois primers são desenhados e sintetizados de modo a ligarem-se às extremidades opostas de cada uma das
cadeias do DNA molde que se pretende amplificar.
Para que uma determinada região de DNA seja amplificada, tem que se identificar e determinar a
sequência de DNA antes (upper) e depois (lower) da região de interesse. Estas sequências, são posteriormente
usadas para sintetizar primers de oligonucleotidos que servem como pontos de partida para a replicação do DNA.
Assim os primers upper e lower delimitam a sequência de DNA à amplificar. Estes primers são necessários
porque a DNA polimerase requer uma dupla cadeia de DNA para iniciar a replicação do DNA e sintetizar novas
cópias do DNA molde. No entanto, é necessário separar - desnaturar as cadeias da dupla hélice de DNA de
interesse, para que a ligação dos primers se efectue. A separação é conseguida através do calor. Por esta razão, a
DNA polimerase usada na PCR tem que ser estável ao calor, uma vez que os ciclos da PCR têm lugar a
temperaturas situadas entre os 64-95 ou mesmo 98ºC. Os ciclos de PCR consistem na alternância de diferentes
temperaturas que facultam as diferentes fases da técnica e desenvolvem-se num thermocycler ou termociclador.
A DNA polimerase termo-estável (Taq) que faz a polimerização durante a PCR foi isolada a partir da bactéria
termofílica, Thermus aquaticus, que vive em elevadas temperaturas, como é o caso dos famosos geysers do
Parque Nacional do Yellowstone (EUA).
Duas cadeias molde são sintetizadas a partir do fragmento original em cada ciclo completo da PCR. Isto
cria uma situação de crescimento exponencial do número de moléculas molde, ou seja, o número duplica em
cada ciclo. Ao fim de 30 ciclos haverá 230 vezes mais cópias que no início. Uma vez, o DNA de interesse
suficientemente amplificado, pode ser visualizado num gel de electroforese. Isto possibilita aos técnicos
determinar a presença ou ausência de certos produtos de PCR e determinar as semelhanças e diferenças entre
genes de diferentes indivíduos.
A técnica de PCR envolve uma série de ciclos repetidos, cada um consistindo na desnaturação do DNA
molde, ligação dos primers e extensão dos mesmos pela Taq DNA polimerase. Antes de se proceder à
amplificação do DNA, é necessário a preparação do DNA genómico oriundo das células epiteliais de cada aluno.
Uma vez preparado o DNA genómico -DNA molde, os primers, a Taq polimerase, os 4 nucleótidos (A, T, G, C)
e o tampão são misturados num pequeno tubo, que é colocado no Termociclador. Este aparelho consegue
rapidamente aquecer a mistura (95ºC), provocando a separação da dupla cadeia molde de DNA – desnaturação.
Seguidamente, a temperatura desce rapidamente aos 64ºC permitindo a ligação dos primers à sequência
complementar das cadeias separadas – ligação (annealing). Por último, as amostras são aquecidas a 72ºC, de
modo a possibilitar a extensão dos primers pela enzima Taq, que assim sendo sintetiza duas novas cópias da
cadeia molde – extensão. A esta temperatura o grau de eficiência da enzima é máximo. As duas novas cópias
servem agora também como molde, podendo ser usadas no próximo ciclo do PCR (Figura 1).
Para esta reacção de polimerização usam-se 20 ciclos. No fim de cada ciclo, o número de molde
duplica, resultando num crescimento exponencial do número de cadeias de DNA molde. No final dos 20 ciclos
produzem-se 1.1x1010 cópias da molécula inicial.
A característica mais importante desta técnica é a síntese precisa de uma determinada sequência de
DNA. No primeiro ciclo, os dois primers diferentes ligam-se à extremidade oposta de cada uma das cadeias
separadas do DNA molde. No final do primeiro ciclo completo, as duas novas cadeias recém sintetizadas são
mais curtas que o molde original, mas ainda assim maiores que a sequência que se pretende amplificar. É só a
partir do terceiro ciclo completo que os fragmentos de tamanho específico são formados (Figura 2).
Nesta aula prática, serão amplificados fragmentos de DNA correspondentes ao gene
Drg11 e LacZ (codifica para a beta-galactosidase – um gene reporter), com cerca de 300pb e
200pb respectivamente. Para isso, utilizar-se-ão primers específicos para cada uma das
sequências. O DNA molde a utilizar será o DNA genómico extraído na aula laboratorial
anterior, a partir de fígado de ratinhos, cujo genótipo relativamente ao gene Drg11 era
desconhecido. Estes ratinhos são descendentes de um cruzamento entre progenitores
heterozigóticos (+/-), ou seja um alelo continha o gene Drg11 normal (alelo +), enquanto que
no outro o gene Drg11 tinha sido removido e substituído por um gene reporter LacZ (alelo -).
De acordo com a presença ou ausência de cada um dos fragmentos amplificados, será possível
determinar o genótipo destes ratinhos (Figura3).
+ -
+ -
X
Gene Drg11 (+)
Ratinhos KO
+ +
+ -
-
Gene LacZ (-)
-
Genótipo
Electroforese
Drg11 (300bp)
LacZ (200bp)
.
A separação, por electroforese em gel de agarose, dos fragmentos de DNA, e
correspondente análise, será efectuada na próxima aula laboratorial.
Protocolo:
1- Juntar, de acordo com a tabela, a quantidade correspondente dos seguintes reagentes em
dois tubos diferentes, rotulados como Master Mix (Mistura de PCR) Drg11 e Master Mix
LacZ:
Tampão salino 10X
dNTP mix (10mM)
MgCl2 (25mM)
Primer Drg11 upper
Primer Drg11 lower
Primer LacZ upper
Primer LacZ lower
Taq DNA polimerase
Água autoclavada
Master Mix Drg11
8ul
4ul
2ul
4ul
4ul
----2ul
48ul
Master Mix LacZ
8ul
4ul
2ul
----4ul
4ul
2ul
48ul
Nota: Os dNTP mix contem as 4 bases de nucleotidos individuais (A, T, G e C). Os iões
magnésio são co-factores necessários à actuação da DNA polimerase e o tampão salino
confere o ambiente iónico e pH óptimos para a reacção de PCR. Os primers, são
oligonucleótidos de cadeia simples (~23 bases), um complementar à cadeia 5’3’(primer
lower) e outro à cadeia 3’5’ (primer upper)do DNA molde. Os primers delimitam a região
de DNA a amplificar.
2- Colocar 18 l de Master Mix (Mistura de PCR) Drg11 em 4 tubos de PCR, rotulados como
Drg11, e 18 l de Master Mix LacZ para outros tantos, rotulados como LacZ.
3- Centrifugar as amostras de DNA genómico, extraídas na aula laboratorial anterior, a
13000rpm durante 5min.
Nota: Grande parte do material insolúvel corresponde à proteínas contaminantes. Pelo
contrário, o DNA genómico deverá encontrar-se no sobrenadante.
4- Pipetar 2 l do sobrenadante de cada amostra de DNA genómico, para um tubo Drg11 e
outro LacZ. Rotular convenientemente cada tubo.
5- Inserir os tubos no termociclador e correr a PCR.
O Termociclador é programado de modo a fazer 20 ciclos. A temperatura de desnaturação é
de 95ºC durante 30 segundos, seguida de 64ºC (30 segundos) para ligação dos primers e,
finalmente 72ºC (30 segundos) para polimerização pela Taq DNA polimerase. No final dos 20
ciclos, as amostras são mantidas a 4ºC.