Marcador fAFLP na identificação da diversidade genética de mini

REVISTA DE BIOLOGIA E CIENCIAS DA TERRA
ISSN 1519-5228
Volume 6- Número 1 - 1º Semestre 2006
Marcador fAFLP na identificação da diversidade genética de mini-roseiras
Márkilla Zunete Beckmann1*, Francisco Joaci de Freitas Luz1, Kathia Fernandes Lopes Pivetta2
RESUMO
As variedades comerciais de mini-rosas no Brasil são diferenciadas apenas pela coloração das flores
e conhecidas por nomes populares, não se sabendo ao certo qual sua origem. Neste sentido, o
trabalho objetivou dar início ao estudo da diversidade genética existente entre mini-roseiras
utilizadas em cultivo comercial no Brasil mediante um teste de primers pelo marcador fAFLP. Foi
extraído o DNA de cinco acessos de mini-roseiras (“pink”, vermelha, branca, lilás e rosa claro).
Foram amplificadas 216 bandas, sendo 177 bandas polimórficas, com oito pares de primers, sendo
que destes, os melhores resultados foram E-ACA/M-CAG, E-ACA/M-CAC e E-ACA/M-CTG, com
36, 45 e 48 bandas polimórficas, respectivamente. A análise de agrupamento mostrou a formação de
um único grupo, sendo RB e RRc, os que apresentaram a maior similaridade genética (0,96).
Conclui-se a técnica fAFLP é eficiente na identificação da variabilidade genética existente entre
mini-roseiras, utilizando-se apenas três pares de primers.
Palavras-chave: Rosa sp., variabilidade genética, primers
ABSTRACT
Commercial varieties of miniature roses in Brazil are just differentiated by the flowers coloration
and known by popular names and not knowing for sure the origin. In these sense, the aim of the
study was to give beginning to genetic diversity of miniature rose used in commercial production in
Brazil by testing primers through fAFLP markers. The primers combination had detected 216
amplification bands and 177 were polymorphic, with eight primers pair and of these, the best results
were obtained by E-ACA/M-CAG, E-ACA/M-CAC e E-ACA/M with 36, 45 and 48 polymorphic
bands, respectively. The cluster showed only one group and RB and RRc presented the highest
similarity (0,96). The obtained results led to the conclusion that fAFLP markers is efficient to
identify the genetic variability among the miniature roses analyzed with only three primers pair.
Keywords: Rosa sp., fAFLP, genetic variability, primers
1 - INTRODUÇÃO
A roseira pertence ao gênero Rosa,
família Rosaceae, sendo cultivada desde os
tempos remotos. Segundo Boettcher (1991), o
gênero apresenta cerca de 200 espécies
silvestres e mais de 30000 mil variedades,
produtos de cruzamento e retrocruzamentos.
Dentre esta gama de variedades de
roseira, encontram-se o grupo das mini-rosas,
que são de crescimento compacto, floração
intensa e se destacam pela grande durabilidade
de suas flores, que tem tamanho de pequeno a
médio (Boettcher, 1991). Porém, em relação às
variedades utilizadas no cultivo comercial de
mini-roseiras no Brasil não se têm referências
sobre sua origem genética. O Catálogo de Flores
e
Plantas
Ornamentais
(VEILING
HOLAMBRA, 2002), destaca somente quatro
variedades de mini-roseiras, sendo diferenciadas
somente pela coloração das pétalas.
Segundo Cubero et al. (1995), as
variedades de roseiras normalmente são
identificadas visualmente por meio de
descrições morfológicas, porém requer-se muito
esforço e dedicação do avaliador, e a expressão
gênica pode estar sujeita às variações do
ambiente. Desta forma, métodos que não
139
dependam das condições ambientais e que
permitam a identificação e seleção de plantas,
redução de custo e de tempo são necessários.
Os marcadores moleculares têm sido
empregados extensivamente e com sucesso na
análise genética de plantas e na caracterização
da variabilidade existente entre os indivíduos.
Várias pesquisas que envolvem técnicas
moleculares têm sido realizadas com roseiras,
como RLFP por Ballard et al. (1995); RAPD
por Torres et al. (1993), Cubero et al. (1995),
Reynders-Aloisi & Bollereau (1995) e Gallego
& Martinez (1996); e AFLP por Debener &
Mattiesch (1999), Crespel et al. (2001), Zhang
et al. (1999) e Zhang et al. (2001).
Porém, dentre todas estas, AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism ou
Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos
Amplificados) tem sido utilizada com muito
sucesso, devido às vantagens que apresenta para
estudos sistemáticos: ela é reproduzível, rápida
e confiável, além de haver um número ilimitado
de marcadores (Kardolus et al., 1998). Com o
desenvolvimento dessas ferramentas para as
análises genéticas em nível molecular, tornou-se
possível examinar em maiores detalhes a origem
evolucionária dos genomas vegetais, assim
como acessar o grau de variabilidade genética
relatado em grupos de plantas.
Neste sentido, este trabalho teve como
objetivo dar início ao estudo da diversidade
genética existente entre mini-roseiras utilizadas
em cultivo comercial no Brasil mediante um
teste de primers pelo marcador fAFLP.
2 - MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido no
Laboratório
de
Micropropagação
do
Departamento de Produção Vegetal e
Laboratório de Bioquímica de Microorganismos
e Plantas do Departamento de Tecnologia da
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias
da Universidade Estadual Paulista (UNESPFCAV), Jaboticabal, SP. O material vegetal foi
coletado de plantas presentes no Viveiro
Experimental de Plantas Ornamentais e
Florestais da UNESP-FCAV, oriundos de
Holambra-SP. Os acessos utilizados estão
identificados na Tabela 1.
Tabela 1. Identificação dos 5 acessos de mini-roseiras utilizados na análise de fAFLP. Jaboticabal-SP, 2005.
Amostra
1
2
3
4
5
Descrição
Rosa sp. “Pink”
Rosa sp “Vermelha”
Rosa sp. “Branca”
Rosa sp. “Lilás”
Rosa sp. “Rosa Claro”
Foram coletadas, aleatoriamente, 10 a 20
folhas jovens e sadias de uma planta de cada
acesso. A extração do DNA genômico foi
realizada de acordo com a metodologia descrita
por Ferreira & Grattapaglia (1998). A
quantificação do DNA das amostras foi
realizada com auxílio de biofotômetro. Além da
concentração de DNA, observou-se a relação
entre as absorbâncias 260 e 280nm (ácidos
nucléicos/proteínas) para a verificação da
qualidade do DNA. Foi realizada também a
verificação da integridade do DNA das amostras
por meio dos testes em gel de agarose 0,8%.
A análise com marcadores fAFLP
(técnica AFLP com a utilização de iniciadores
com corantes fluorescentes) foi realizada de
acordo com o AFLP "Plant Mapping Protocol"
da Applied Biosystems (1997), seguindo quatro
etapas: 1) Digestão: o DNA foi digerido a partir
Código
RP
RV
RB
RL
RRc
Origem
Holambra-SP
Holambra-SP
Holambra-SP
Holambra-SP
Holambra-SP
da reação com enzimas de restrição utilizandose 500ng de DNA (10µL). Foram adicionados
1,25µL de tampão React 1 (500mM Tris-HCl
pH 8,0; 100mM MgCl2), 5U de EcoRI (0,5µL) e
1,5U de MseI (0,3µL). A reação foi incubada no
termociclador por 14h a 37°C e, após esse
período, as enzimas foram inativadas a 65°C por
10min. 2) Ligação dos adaptadores: retiraramse 3,67µL da reação de digestão e
acrescentaram-se 1µL de tampão T4DNA ligase,
0,5 µL da enzima T4DNA ligase, 0,33µL do
adaptador para o corte da EcoRI e 0,33µL do
adaptador para o corte da MseI (ambos
previamente pareados a 95°C por 5min). A
ligação ocorreu por 2h a 20°C, no termociclador
e, em seguida, a amostra foi diluída em 10
vezes. 3) Amplificação pré-seletiva: das
amostras diluídas preparadas a partir das
reações de digestão e ligação dos adaptadores,
140
retiraram-se 2µL e acrescentaram-se 0,5µL da
mistura dos primers pré-seletivos AFLP EcoRI
e MseI e 7,5µL de AFLP Core Mix. As amostras
foram colocadas no termociclador com o
seguinte programa: um ciclo de 2’ a 72°C;
seguido de 20 ciclos de 20” a 94°C + 20 ciclos
de 30” a 56°C + 20 ciclos de 2’ a 72°C;
finalizando com um ciclo de 30’ a 60°C. Os
produtos amplificados na reação pré-seletiva
foram diluídos 2 vezes. 4) Amplificação
seletiva: retirou-se 1,5µL da reação pré-seletiva
diluída e acrescentaram-se 7,5µL do AFLP Core
Mix, 0,7µL do primer AXX da EcoRI (marcado
por fluorescência) e 0,7µL do primer CXX da
MseI (não marcado por fluorescência). Após o
preparo das reações, as amostras foram
colocadas no termociclador com o seguinte
programa: 1º) um ciclo de 2’ a 94°C; 2°) um
ciclo de 20” a 94°C + um ciclo de 30” a 66°C +
um ciclo 2’ a 72°C; 3°) um ciclo de 20” a 94°C,
30” a 65°C e 2’ a 72°C, sendo que até o 10°
passo foram marcados pela diminuição em 1°C
do ciclo intermediário da fase anterior até
chegar à temperatura de 57°C, e o restante igual;
11°) 21 ciclos de 20” a 94°C, 30” a 56°C e 2’ a
72°C; finalizando com um ciclo de 30’ a 60°C.
Retirou-se 1,5µL da reação seletiva e foi
adicionado 1,6µL de um mix contendo 1,5µL de
formamida deionizada, 0,9µL de blue dextran e
0,3µL do padrão interno de peso molecular
GeneScan-500
[ROX]
marcado
por
fluorescência vermelha. No termociclador,
desnaturou-se a reação a 95°C por 5min. Foi
aplicado 1,5µL de cada amostra num gel 5%
desnaturante Long-ranger usando como tampão
de corrida TEB 1x. Os pares de primers
utilizados no teste de primers encontram-se na
Tabela 2.
Tabela 2. Combinação de primers (EcoRI-MseI) utilizados na técnica fAFLP para caracterização de mini-rosas.
Jaboticabal-SP, 2005.
Combinação EcoRI-MseI Combinação EcoRI-MseI Combinação EcoRI-MseI
FAMa
NEDb
JOEc
E-ACA
M-CAA
E-AGC
M-CAA
E-AGG
M-CAA
E-ACA
M-CAC
E-AGC
M-CAC
E-AGG
M-CAC
E-ACA
M-CAG
E-AGC
M-CAG
E-AGG
M-CAG
E-ACA
M-CTG
E-AGC
M-CTG
E-AGG
M-CTG
a
FAM = fluorescência azul; bNED = fluorescência amarela; cJOE = fluorescência verde;
O desenvolvimento da eletroforese para
visualização dos fragmentos de DNA foi
realizado no seqüenciador ABI PRISM 377
DNA Sequencer. Após a amplificação, os dados
foram obtidos por meio do software “Gene-Scan
Analysis” (Applied Biosystems®). Para
avaliação da distância genética entre os acessos,
foi construída uma tabela binária, analisando-se
a presença (1) e ausência (0) de bandas com
auxílio do software “Genotyper DNA Fragment
Analysis” (Applied Biosystems®). Em seguida,
construiu-se uma matriz de distância com
auxílio do software Paup [4.0b10] com
bootstrap de 1000 vezes. Com esta matriz, foi
plotado o dendrograma pelo padrão de
agrupamento “Neighbor-Joining” por meio do
software Mega (Kumar et al., 2004), para
verificar a diversidade genética entre os
materiais.
.
3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos doze pares de primers utilizados no
trabalho em apreço, oito combinações revelaram
um total de 216 bandas amplificadas que
variaram de 50 a 500 pb, das quais 177 foram
polimórficas, o que representa 82% de
polimorfismo. Observa-se que o primer EcoRI
tem importante função na qualidade do perfil
gerado pela técnica fAFLP, o que pode ser
detectado na Tabela 3, em que somente uma
combinação do primer E-AGC mostrou bandas
polimórficas. Os primers E-ACA e E-AGG
apresentaram o maior número de combinações
que amplificaram fragmentos, no entanto,
somente três combinações de primers
mostraram valores significativos que possam
acessar o polimorfismo entre os acessos de
mini-roseiras do presente estudo.
141
Tabela 3. Combinação de primers (9) que produziram o melhor perfil nos acessos de mini-roseiras, por meio do
fAFLP. Jaboticabal-SP, 2005.
EcoRI Primers
E-ACA
E-AGC
E-AGG
M-CAA
9
Os pares de primers que apresentaram os
melhores resultados foram E-ACA/M-CAG, EACA/M-CAC e E-ACA/M-CTG. O número de
bandas polimórficas geradas foi de 36, 45 e 48
bandas, respectivamente.
Estes resultados estão de acordo com
Zhang et al. (2001) em que realizaram um
estudo com 106 variedades modernas de roseira.
Também confirmaram a importância do primer
EcoRi na detecção do polimorfismo, pois as
combinações com E-AGC e E-AAG não
produziram nenhuma marca polimórfica. Dentre
os 11 pares de primers que selecionaram para
realizar o trabalho, também fizeram uso do EACA/M-CAG, E-ACA/M-CTG e E-ACA/MCAC, que amplificaram 28, 38 e 45 bandas
polimórficas.
Crespel et al. (2001) estimaram a
heterogozidade em duas espécies de rosas com a
técnica AFLP, utilizando oito combinações de
primers, dentro estes, também E-ACA/M-CAG,
E-ACA/M-CTG e E-ACA/M-CAC.
Os dados do presente trabalho mostram
a eficiência do marcador fAFLP em detectar alto
nível de polimorfismo molecular entre os
acessos de mini-roseiras, com média de 43
bandas/par de primer, assim como é
MseI Primers
M-CAC M-CAG
9
9
9
9
9
M-CTG
9
9
comprovado por Zhang et al. (1999) e Zhang et
al. (2001) quando obtiveram médias de 27 e 36
bandas polimórficas por combinação de primer,
respectivamente. De acordo com Vos et al.
(1995), um grande número de bandas
polimórficas evidencia a potencialidade do
marcador AFLP em detectar a variabilidade
genética existente entre os indivíduos.
A eficiência da técnica AFLP também
pode ser confirmada em trabalhos realizados
com outras culturas, como girassol (Hongtrakul
et al., 1997), milho (Marsan et al., 1998) e
maracujazeiro-amarelo (Ganga et al., 2004).
Quanto ao alto polimorfismo detectado
entre os acessos de mini-rosas, também pode ser
confirmado por outras técnicas moleculares ao
serem aplicadas em espécies de rosas, como
RLFP (Hubbard et al., 1992) e RAPD (Cubero
et al., 1995).
A análise de agrupamento com base nas
distâncias genéticas (Figura 1), a partir dos três
melhores pares de primers, mostrou a formação
de um único grupo, porém, observa-se que os
acessos codificados como RB e RRc, foram os
que apresentaram a maior similaridade genética
(0,96). Possivelmente, estes dois acessos
possuam um ancestral em comum.
Figura 1. Dendrograma de 5 acessos de mini-roseiras, baseado na técnica fAFLP, utilizando o padrão de agrupamento
“Neighbor-Joining”. Jaboticabal-SP, 2005.
Face ao exposto, este estudo de
diversidade genética entre acessos de mini-rosas
permitiu a obtenção de informações úteis ao seu
manejo, pois na literatura não há relatos sobre
trabalhos que tenham quantificado a
variabilidade existente entre mini-roseiras com
142
técnicas tão consistentes, gerando resultados
precisos por não terem influencia do meio
ambiente. Tais resultados poderão auxiliar na
definição de estratégias mais eficientes para
serem
utilizados
em
programas
de
melhoramento genético.
4 - CONCLUSÕES
A técnica molecular AFLP é eficiente na
identificação da variabilidade genética existente
entre mini-roseiras.
Três pares de primers (E-ACA/M-CAG,
E-ACA/M-CAC e E-ACA/M-CTG) são
suficientes para caracterizar mini-roseiras.
5 - AGRADECIMENTOS
Ao Laboratório de Micropropagação, do
Departamento
de
Produção
Vegetal
(Horticultura) e ao Laboratório de Bioquímica
de Microrganismos e Plantas da UNESP-FCAV,
em especial a Profa. Leila Trevizan Braz e
Profa. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos, pela
infra-estrutura fornecida para a realização do
estudo em apreço.
6 - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
APPLIED BIOSYSTEMS – PE. 1997. AFLP
Plant Mapping Protocol. 45p.
BALLARD, R.E.; RAJAPAKSE, S.; ABBOTT,
A.G.; BYRNE, D. DNA markers in rose and
their use for cultivar identification and genome
mapping. Acta Horticulturae, Leuven, n.424,
p.265-268, 1995.
DEBENER, T.; MATTIESCH, L. Construction
of a genetic linkage map for roses using RAPD
and AFLP markers. Theoretical and Applied
Genetics, Berlin, v.99, n.5, p.891-899, 1999.
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D.
Introdução ao uso de marcadores moleculares
em análise genética. 3.ed. Brasília: EmbrapaCenargen, 1998. 220p.
GALLEGO, F.J.; MARTINEZ, I. Molecular
typing of rose cultivars using RAPDs. Journal
of Horticultural Science, Warnick, v.71, n.6,
p.901-908, 1996.
GANGA, R.M.D.; RUGGIERO, C.; LEMOS,
E.G.M.; GRILI, G.V.G.; GONÇALVES, M.M.;
CHAGAS, E.A.; WICKERT, E. Diversidade
genética em maracujazeiro-amarelo utilizando
marcadores moleculares fAFLP. Revista
Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v.26,
n.3, p.494-498, 2004.
HONGTRAKUL, V.; HUESTIS, G.M.;
KNAPP, S.J. Amplified fragment length
polymorphisms as a tool for DNA fingerprinting
sunflower germplasm: genetic diversity among
oilseed inbred lines. Theoretical and Applied
Genetics, Berlin, v.95, p.400-407, 1997.
HUBBARD, M.; KELLY, J.; RAJAPAKSE, S.;
ABBOTT, A.G.; BALLARD, R.E. Restriction
fragment length polymorphisms in rose and
their use for cultivar identification. HortScience,
Alexandria, v.27, p.172-173, 1992.
BOETTCHER, A. Sítios e jardins: rosas. São
Paulo: Editora Europa, 1991. 87p.
KARDOLUS, J.; ECK, H.; BERG, R. The
potential of AFLP in biosystematics: a first
application in Solanum taxonomy. Plant
Systems Evolutive, v.2, p.87-103, 1998.
CRESPEL, L.; ZHANG, D.; MEYNET, J.;
GUDIN, S. Estimation of heterozygosity in two
botanic rose species using AFLP markers. Acta
Horticulturae, Leuven, n.546, p.187-191, 2001.
KUMAR, S. et al. Mega3: integrated software
for molecular evolutionary genetics analysis and
sequence alignment. Briefing in Bioinformatics,
5:2, 2004 (In Press).
CUBERO, J.I.; MILLAN, T.; OSUNA, F.
Varietal identification in Rosa by using isozyme
and RAPD markers. Acta Horticulturae,
Leuven, n.424, p.261-264, 1995.
MARSAN, P.A.; CASTIGLIONI, P.; FUSARI,
F.; KUIPER, M.; MOTTO, M. Genetic diversity
and its relationship to Irbid performance in
maize as revealed by RFLP and AFLP markers.
Theoretical and Applied Genetics, Berlin, v.96,
p.219-227, 1998.
143
REYNDERS-ALOISI, S.; BOLLEREAU, P.
Characterization of genetic diversity in genus
Rosa by random amplified polymorphic DNA.
Acta Horticulturae, Leuven, n.424, p.253-260,
1995.
TORRES, A.M.; MILLAN, T.; CUBERO, J.I.
Identifying rose cultivars using random
amplified
polymorphic
DNA
markers.
HortScience, Alexandria, v.28, n.4, p.333-334,
1993.
VEILING HOLAMBRA. Catálogo de flores e
plantas ornamentais. Holambra: Veiling
Holambra, 2002.159p.
ZHANG, D.; GERMAIN, E.; REYNDERSALOISI, S.; GANDELIN, M.H. Development
of amplified fragment length polymorphism
markers for variety identification in rose. Acta
Horticulturae, Leuven, n.508, p.113-120, 1999.
ZHANG, D.; BESSE, C.; CAO, M.Q.;
GANDELIN, M.H. Evaluation of AFLPs for
variety identification in modern rose (Rosa
hybrida L.). Acta Horticulturae, Leuven, n.546,
p.351-357, 2001.
1
Pós-graduandos(a) em Agronomia (Produção
Vegetal), Universidade Estadual Paulista
(UNESP), Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias (FCAV), Depto. Produção Vegetal,
Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane,
s/n, CEP 14884-900, Jaboticabal-SP, Brasil. Email: [email protected]; *Autor
correspondente.
2
Prof. Dra. Titular, Depto. de Produção Vegetal,
UNESP-FCAV, Jaboticabal-SP, Brasil.
144