atividade da creatina quinase em cérebro de ratos

UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
CURSO DE FARMÁCIA
CAROLINA DA ROSA DOS REIS
ATIVIDADE DA CREATINA QUINASE EM CÉREBRO DE RATOS
SUBMETIDOS A UM MODELO DE INSUFICIÊNCIA RENAL AGUDA
INDUZIDOS COM GENTAMICINA E CONTRASTE RADIOLÓGICO.
CRICÍUMA, JUNHO DE 2010.
CAROLINA DA ROSA DOS REIS
ATIVIDADE DA CREATINA QUINASE EM CÉREBRO DE RATOS
SUBMETIDOS A UM MODELO DE INSUFICIÊNCIA RENAL AGUDA
INDUZIDOS COM GENTAMICINA E CONTRASTE RADIOLÓGICO.
Projeto de trabalho de conclusão de curso,
apresentado ao Curso de Farmácia da
Universidade do Extremo Sul Catarinense,
UNESC.
Orientador: Prof. Emilio Luiz Streck
CRICIÚMA, JUNHO DE 2010.
Atividade da creatina quinase em cérebro de ratos submetidos a um
modelo de insuficiência renal aguda induzidos com gentamicina e
contraste radiológico.
Carolini R. Reisa, Gabriela K. Ferreiraa, Gislaine T. Rezina, Giselli Scainia,
Emilio Strecka.
a
Laboratório de Fisiopatologia Experimental- UNESC
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-graduação em
Ciências da Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade
do Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil
Telefone para contato: 55 48- 34312539
Autor Correspondente E-mail: [email protected]
RESUMO
A insuficiência renal aguda (IRA) é caracterizada pela rápida redução da taxa
de filtração glomerular que se mantém por períodos variáveis de tempo,
resultando na inabilidade dos rins para exercer algumas funções. Nos dias de
hoje, uma das etiologias mais freqüentes de IRA é a nefrotoxicidade por
farmácos (27%), onde os aminoglicosídeos são os mais nefrotóxicos. Outra
causa importante de IRA induzida é a toxicidade causada por contraste
radiológico, que ocorre após a administração intravascular do mesmo.
Considerando os efeitos gerados pela IRA, uma das formas de analisar o dano
renal após administração de gentamicina e contraste radiológico é através da
avaliação da atividade da creatina quinase (CK) do cérebro de ratos, pois tratase de uma enzima crucial para a manutenção da homeostase energética de
tecidos altamente metabólicos, como o cérebro. No presente estudo, foi
observado que os animais pertencentes aos grupos gentamicina e contraste
sofreram dano renal, pois os níveis de creatinina ficaram aumentados, quando
comparados ao grupo salina, e assim confirmando a indução já que este é
considerado um marcador de função renal. A atividade da enzima CK foi inibida
nas estruturas cerebrais como cerebelo e córtex pré-frontal, no grupo
administrado com gentamicina. No grupo administrado com contraste
radiológico, ocorreu a inibição da atividade da creatina quinase no cerebelo e
córtex cerebral. Contudo, a inibição da atividade da CK cerebral após a indução
da IRA pode estar associada a um dano neuronal como também pode estar
envolvida na patologia de algumas doencas.
Palavras-chave: insuficiência renal, creatina quinase, gentamicina, contraste
radiológico.
1. Introdução
A insuficiência renal aguda (IRA) é caracterizada pela rápida redução da
taxa de filtração glomerular que se mantém por períodos variáveis de tempo,
resultando na inabilidade dos rins para exercer as funções de excreção, manter
o equilíbrio ácido-básico e homeostase hidroeletrolítica do organismo, além de
gerar um acúmulo de marcadores comuns da função renal, como a uréia e
creatinina, e por vezes diminuir o volume urinário diário [7]. Este dano renal
pode ocasionar o desenvolvimento de encefalopatia urêmica, podendo ocorrer
uma alteração do estado mental como déficit de atenção e memória, alterações
comportamentais, tremores de mãos e anorexia [22].
A perda de função renal desencadeia sérios problemas ao paciente,
como anemia, deficiência imunológica, tendência à hemorragia, distúrbio no
metabolismo de lipídios, carboidratos e proteínas e vários outros resultantes
das toxinas presentes no plasma ou nos fluidos corporais [5].
As principais causas de IRA são: (I) diminuição da perfusão renal sem
lesão celular, (II) um insulto isquêmico, tóxico ou obstrutivo do túbulo renal, (III)
um processo túbulo-intersticial com inflamação e edema, (IV) ou redução da
capacidade de filtração dos glomérulos [24].
A IRA é classificada em pré-renal, renal e pós-renal, podendo também
ser classificada quanto à etiologia, como insuficiência renal aguda isquêmica,
nefrotóxica e multifatorial [1].
Nos dias de hoje, uma das etiologias mais freqüentes de IRA é a
nefrotoxicidade por farmácos (27%), onde os aminoglicosídeos como
gentamicina, tobramicina e amicacina são os mais nefrotóxicos [6,8]. A
gentamicina é um antibiótico de largo espectro, extremamente eficaz na
infecção por gram-negativos, com atividades também contra microorganismos
gram-positivos [21,18,15]. A toxicidade deste fármaco é dose-dependente e
tem
efeito
cumulativo,
logo,
as
doses
devem
ser
cuidadosamente
administradas.
Sabe-se que na constituição da molécula dos aminoglicosídeos, há um
número maior de grupamentos amina, atribuindo para maior toxicidade sobre
os rins. Assim, verifica-se maior toxicidade renal da gentamicina quando
comparada a outros fármacos, por exemplo, a tobramicina [18]. Pode ocorrer
agravamento e precipitação da lesão renal, quando há fatores de risco
envolvidos, como insuficiência renal pré-existente, idade avançada, associação
com anfotericina B, furosemida, contrastes radiológicos, desidratação, isquemia
renal e acidose metabólica [29].
Outra causa importante de IRA induzida é a toxicidade causada por
contraste radiológico, que ocorre após a administração intravenosa do mesmo,
mais conhecida como nefropatia induzida por contraste (NIC). A evidência
laboratorial caracteriza-se pelo aumento nos níveis séricos de creatinina 48 a
72 horas após a administracão do contraste, com retorno aos valores basais
entre o 7º e 10º dia pós-exposição [14].
A incidência de pacientes de alto risco para NIC está aumentando
mundialmente [27]. Cerca de 40% dos pacientes com insuficiência renal
crônica, diabetes mellitus, síndrome metabólica, hipertensão e com idade
acima de 70 anos, desenvolvem NIC [19,2] quando expostos ao meio de
contraste.
A creatina quinase (CK)
é uma enzima que possui um papel
fundamental no metabolismo energético, principalmente para tecidos com alta
demanda energética, como cérebro, músculo cardíaco e esquelético, onde
funciona como um efetivo sistema de tampão para os níveis celulares de ATP,
sendo assim é uma enzima de extrema importância na homeostase energética,
ou seja, atuando como um sistema auxiliar de manutenção energética [4].
Alguns acontecimentos como perda de polaridade celular, perda de
interação célula-célula, alterações de pH e produção de espécies reativas de
oxigênio, levam ao organismo a retenção excessiva de produtos do
metabolismo das proteínas que podem danificar o néfron e reduzir a excreção
de creatinina e de outros produtos do metabolismo das proteínas [22]. A
insuficiência renal induzindo a uremia afeta quase todas as funções corporais,
mas a fisiologia do cérebro parece ser particularmente vulnerável à toxicidade
urêmica [30]. A falha renal resulta no acúmulo de numerosas substâncias
orgânicas que podem agir como neurotoxinas urêmicas, mas nenhum
metabólito sozinho foi identificado como a única causa da encefalopatia
urêmica [30]. Desta forma, a encefalopatia urêmica é caracterizada por
alterações intelectuais, de memória e posteriormente a alterações motoras,
convulsões e coma, que representam os eventos terminais graves e de risco
clínico . Considerando os efeitos gerados pela IRA, uma das formas de analisar
o dano renal é através da avaliação da atividade da creatina quinase do
cérebro de ratos, após indução de IRA por gentamicina e contraste [13].
Este trabalho tem como objetivo avaliar atividade da CK em cérebro de
ratos submetidos a um modelo de IRA induzidos com gentamicina e contraste
radiológico.
2. Metodologia
2.1. Animais: Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 250 e 300
g, provenientes do Biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense, e
aprovado pelo Comite de Ética em Pesquisa da Unesc. Os animais foram
mantidos em ambiente climatizado (22oC) com ciclos claro-escuro de 12 horas,
com água e alimentação padrão livres.
2.2. Administração de Gentamicina: Os animais foram divididos em 2 grupos
com 7 animais para cada grupo. O primeiro grupo recebeu apenas solução
salina (NaCl 0,9%), enquanto que o segundo grupo recebeu administrações de
gentamicina (70 mg/kg i.p.) num intervalo de 12 horas durante 7 dias. Após os
7 dias, os animais foram mortos por decapitação, o cérebro foi rapidamente
removido e suas estruturas (cerebelo, córtex cerebral, córtex pré-frontal,
estriado, hipocampo) foram isoladas e armazenadas no freezer -80°C até que
estas fossem homogeneizadas e utilizadas para dosagem de CK. Além disso, o
sangue foi coletado para avaliar os níveis séricos de creatinina.
2.3. Administração de Contraste Radiológico: Os animais receberam o
contraste metaglumina/diatrizoato sódico na dose de 6mL/kg através da veia
caudal. A partir de 24h antes da administração do contraste foi restringido aos
animais o acesso a água retornando o acesso após esse período, logo antes
da administração do mesmo. Os animais em estudo foram divididos em 2
grupos com 7 animais para cada grupo (n=7). O primeiro recebeu apenas
salina e o segundo grupo recebeu a injeção de contraste na dose já
mencionada. Passados os 6 dias, os animais foram sacrificados por
decapitação, e o cérebro rapidamente removido. As estruturas cerebrais
armazenadas a -80ºC e as dosagens bioquímicas foram realizadas conforme
métodos descritos na literatura. As estruturas cerebrais foram homogeneizadas
no tampão correspondente de cada método. Os níveis séricos de creatinina
foram dosados a fim de comprovar a existência da insuficiência renal.
2.4.
Preparacão do tecido: Os animais foram mortos por decapitação, o
cérebro foi rapidamente removido e suas estruturas (cerebelo, córtex cerebral,
córtex pré-frontal, estriado, hipocampo) foram isolados e armazenadas no
freezer -80°C até que estas fossem homogeneizadas e utilizadas para
dosagem de CK. Além disso, o sangue foi coletado para avaliar os níveis
séricos de creatinina.
2.5.
Preparação
das
amostras:
As
amostras
foram
pesadas
e
homogeneizadas em tampão SETH em uma proporção de 1:10, pH 7.4 (250
mM de sacarose, 2 mM de EDTA, 10mM Trizma base, 50IU/ml de heparina).
Os homogenados foram centrifugados a 800 x g durante 10 minutos, sendo
posteriormente separado o sobrenadante em duplicata quando possível para
dosagem de CK.
2.6. Creatina quinase: A estrutura cerebral foi homogeneizada em solução
salina (1:10, p/v), o homogeneizado centrifugado a 800 x g por 10 minutos e o
sobrenadante utilizado para determinação da atividade da CK. O meio de
incubação é composto por fosfocreatina, ADP e glutationa reduzida. A
formação de creatina foi utilizada para medir a atividade enzimática [11].
2.7. Dosagem de Creatinina: A creatinina sérica foi dosada por kit da Labtest.
2.8. Análise Estatística: Os dados foram analisados pela análise da variância
(ANOVA) de uma via, seguido pelo teste de Tukey quando F foi significativo e
foi expresso por média +/- desvio padrão. Todas as análises foram realizadas
utilizando o programa SPSS (Statistical Package for the Social Science).
3. Resultados
No presente estudo, ratos adultos foram submetidos à IRA por
gentamicina e contraste radiológico. Através deste modelo de indução de IRA,
pode-se observar que os animais pertencentes aos grupos gentamicina e
contraste sofreram dano renal, pois os níveis séricos de creatinina ficaram
aumentados, quando comparados ao grupo salina, e assim confirmando a
indução já que este é considerado um marcador de função renal (Figura 1 e 2).
Posteriormente, foi observado se houve alterações na atividade da CK
nas regiões do cérebro. Os resultados mostraram que a atividade desta enzima
foi inibida nas estruturas cerebrais como cerebelo e córtex pré-frontal, no grupo
administrado com gentamicina (Figura 3). Neste mesmo grupo as estruturas
como hipocampo, estriado e córtex cerebral, não obtiveram alterações
significativas (Figura 3).
No grupo administrado contraste radiológico, ocorreu a inibição da
atividade da CK no cerebelo e córtex cerebral (Figura 4). Nas outras estruturas
como estriado, córtex pré-frontal, hipocampo não houve alteração significativa
na atividade da enzima CK (Figura 4).
4. Discussão
A IRA é caracterizada por um dano na função renal, impossibilitando que
o rim exerça funções básicas de excreção e manutenção do equilíbrio ácidobásico e hidroeletrolitico [14,7,10]. Apesar de todos os avanços terapêuticos e
de diagnósticos, sua mortalidade ainda permanece elevada nas últimas
décadas, atingindo diversas camadas da população [1,31].
No presente trabalho, o modelo utilizado para se obter IRA nos animais,
induzida por gentamicina e contraste radiológico, mostrou resultados
satisfatórios, visto que após a indução, os níveis séricos de creatinina
apresentaram-se elevado quando comparado aos animais do grupo controle.
Sabe-se que este metabólito é considerado marcador de função renal, pois o
mesmo é excretado pelos rins, e sua elevação é sinal de que o sistema como
um todo está perturbado, por algum agente tóxico ou não, que justifica a má
filtração destes e causando acúmulo no organismo, e assim podendo gerar
complicações secundárias à doença renal [29].
A CK é uma enzima que está presente no cérebro e em outros tecidos
com alta e variável taxa de metabolismo de ATP [32]. Esta enzima tem o papel
importante
no
metabolismo
energético,
pois
catalisa
a
transferência
metabolicamente reversível de um grupamento N-fosforil da fosfocreatina para
o ADP, regenerando o ATP, e assim facilitando a transducão de energia
intracelular
[17,4,11,26].
Sabe-se
que
alterações
no
circuito
creatina/fosfocreatina pode ser um passo para problemas neurodegenerativos
que levam a perda neuronal no cérebro [4].
Os resultados mostraram que a atividade da CK foi inibida nas regiões
do cerebelo e córtex pré-frontal, após a indução de IRA por gentamicina. Nas
regiões do hipocampo, estriado, córtex-cerebral, não houve alterações
significativas.
Baseado em diversos estudos, pode-se hipotetizar que a IRA leva a um
aumento de toxinas, estas por mecanismos ainda não conhecidos que se
dirigem ao cérebro. Estas toxinas em excesso podem levar a uma diminuição
das defesas antioxidantes, provocando uma disfunção mitocondrial pelo
acúmulo de espécies reativas de oxigênio e contribuindo com o estresse
oxidativo [20].
Sabe-se também que a CK pode estar envolvida em algumas condições
patológicas relacionadas com déficit de energia cerebral e devido à energia
cerebral ser necessária para o desenvolvimento e a regulação das funções
cerebrais, foi postulado que o prejuízo na função da CK pode ter um papel
critico no processo neurodegenerativo que leva à perda neuronal. Alem disso, a
baixa atividade desta enzima também pode estar associada a fatores
neurodegenerativos, como por exemplo, doença de Alzheimer, isquemia
cerebral, transtorno bipolar e outros estados patológicos [24].
A NIC representa uma importante causa de IRA. Recentemente,
preconiza-se como padrão para definir seu diagnóstico, uma redução abrupta
da função renal a qual caracteriza–se pelo aumento nos níveis séricos de
creatinina [14]. A gentamicina é um dos aminoglicosídeos que é mais
nefrotóxico ao rim, induzindo a IRA [18].
A CK é reconhecida como um regulador de metabolito importante entre a
saúde e a doença [20]. Neste estudo, esta enzima foi inibida nas frações
cerebrais do cerebelo e córtex cerebral. Sabe- se alguns compostos que
causam hipóxia e dano celular renal, também podem causar lesão celular em
outros órgãos afetados por IRA, por exemplo lesão celular no tecido cerebral
[25].
5. Agradecimentos
Esta pesquisa foi realizada por concessões do Laboratório de
Fisiopatologia Experimental- Universidade do Extremo Sul Catarinense
(UNESC) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq).
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7. ANEXOS
Figura 1: Níveis de creatinina no sangue de ratos submetidos à IRA com
gentamicina. Dados analisados pelo teste de variância ANOVA de uma via seguido
pelo teste de Tukey, *p>0,01 (em relação ao grupo SHAM).
Figura 2: Níveis de creatinina no sangue de ratos submetidos à IRA com
contraste radiológico. Dados analisados pelo teste de variância ANOVA de uma via
seguido pelo teste de Tukey, *p>0,01 (em relação ao grupo SHAM).
Figura 3: Atividade da CK nas estruturas cerebrais de ratos submetidos à IRA
com gentamicina. Dados analisados pelo teste de variância ANOVA de uma via
seguido pelo teste de Tukey, *p>0,01 (em relação ao grupo SHAM).
Figura 4: Atividade da CK nas estruturas cerebrais de ratos submetidos à IRA
com contraste radiológico. Dados analisados pelo teste de variância ANOVA de
uma via seguido pelo teste de Tukey, *p>0,01 (em relação ao grupo SHAM).