O DNA cromossómico de S. elodea foi restringido com as

Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica
Engenharia Genética
TP2: Amplificação do gene pgmG a partir do
DNA cromossómico de S. elodea ATCC 31461 por
recurso à técnica de PCR
TP3 e TP4: Hibridação de Southern utilizando
sondas não radioactivas
Docentes: Miguel Teixeira, Sandra Santos, Sandra Cabo Verde, Nuno Mira
Dezembro de 2014
75559, Ana Palma
75720, Diogo Cardoso
75726, Bernardo Noronha
Dezembro de 2014
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Índice
1.
Resumo ............................................................................................................................................................ 2
2.
Resultados ...................................................................................................................................................... 3
3.
Discussão ........................................................................................................................................................ 9
4.
Referências .................................................................................................................................................. 12
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1. Resumo
O objectivo dos trabalhos práticos realizados foi o de detectar a existência do gene
pgmG no DNA cromossómico de S. elodea ATCC 31461 através do método de hibridação de
Southern, com uso de uma sonda não radioactiva.
Para obtenção da sonda recorreu-se à técnica de PCR para amplificar parte do gene
pgmG. Correu-se o produto de PCR num gel de agarose para confirmação do fragmento
amplificado. Verificou-se que este não corresponde ao suposto, o que significa que ocorreu
um erro na preparação do PCR pelo que não foi possível ao turno 2C obter a sonda.
O DNA cromossómico de S. elodea foi restringido com as enzimas BamHI, EcoRI,
HindIII e PstI e posteriormente separado electroforeticamente. Seguidamente transferiuse por capilaridade o DNA fragmentado do gel de restrição para uma membrana de nylon.
Previu-se ainda, através de ferramentas in silico, o tamanho do fragmento com que a sonda
hibridaria.
A etapa final foi a de hibridação DNA-DNA - hibridou-se a sonda (obtida por outros
grupos) com o DNA fixo na membrana de nylon. Após uma série de lavagens restringentes
detetou-se o sinal obtido: devido a um erro na preparação do gel de restrição, o marcador
de pesos moleculares usado também se encontra num dos poços com o DNA
cromossómico digerido, sendo que este forte sinal de hibridação (e a baixa concentração
de sonda em relação ao marcador) mascara o sinal de hibridação da sonda com os
fragmentos que contém o gene pgmG, pelo que este último sinal não é visível.
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2. Resultados
Esta secção encontra-se organizada em três subsecções de forma a facilitar a
leitura e compreensão do relatório, sendo que as subsecções a) e b) se referem aos passos
preparativos para a técnica de hibridação de Southern enquanto que a subsecção c) se
refere à hibridação em si.
a) Criação da sonda a usar na técnica de Southern por recurso à técnica de PCR
e electroforese
Para usar como sonda na hibridação de Southern procurou-se amplificar um
fragmento do gene pgmG de S. elodea recorrendo à técnica de PCR.
Para confirmação (e com vista à posterior obtenção) do produto de PCR, correu-se
o obtido num gel de agarose. Após realização de electroforese, não foi possível observar o
produto do processo de PCR no gel de agarose em nenhum dos poços, impossibilitando a
sua posterior purificação e recuperação para ser usada como sonda.
Esta é, portanto, a razão de não se apresentarem resultados referentes ao PCR
nesta secção.
b) Separação em gel de agarose e visualização do DNA cromossómico de S.
elodea ATCC 31461 hidrolisado com BamHI, HindIII, EcoRI e PstI
Digeriu-se o DNA cromossómico de S. elodea ATCC 31461 com a enzima BamHI.
Seguidamente colocou-se o DNA fragmentado num gel de agarose e fez-se electroforese,
pelo que estes ficaram separados pelos seus pesos moleculares. O resultado obtido foi
registado num sistema de aquisição de imagem para documentação de géis (Bio-Rad)[1]. O
gel obtido encontra-se na figura 1, apresentada em seguida.
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1-
Marcador
de
pesos
moleculares (NZYDNA ladder III [1])
2-
DNA restringido por BamHI
3-
DNA restringido por HindIII
4-
DNA restringido por EcoRI
5-
DNA restringido por PstI
Fig. 1 - Gel de restrição com os fragmentos de DNA cromossómico de S. elodea restringidos pelas enzimas
indicadas
Observa-se um arrastado nos poços 2, 4 e 5. Já no poço 3 observa-se um
arrastamento no fundo semelhante ao dos outros poços, sobreposto com uma escada de
bandas (bandas bastante definidas e com pesos moleculares suficientemente distantes
para aparecerem separadas após a separação eletroforética em gel de agarose). Esta
escada está algo difusa na parte mais superior do gel o que não permite, nesta zona, a sua
comparação com o marcador de pesos moleculares no poço 1. Contudo, a parte inferior do
poço está menos esbatida e as bandas parecem coincidir com as do poço 1.
Por forma a prever o peso molecular da banda onde se espera que a sonda hibride,
utilizou-se ferramentas in silico e fez-se o mapa de restrição da região do genoma de S.
elodea onde se insere o gene pgmG, da forma indicada na página da cadeira de Engenharia
Genética.
Obteve-se a sequência do gene pgmG através do site NCBI
[3]
e fez-se um BLAST
com o genoma de S. elodea [4] de forma a encontrar a posição deste gene no cromossoma. O
gene pgmG encontra-se então entre as posições 15997 (STOP) e 17385 (START). Deu-se
uma margem de 15k p.b. para cada lado do gene para que se incluissem as zonas de
restrição das enzimas utilizadas no trabalho laboratorial. Ficou-se com uma sequência
desde a posição 997 à 32385. Através do site NEB Cutter simulou-se a sua digestão com a
enzima BamHI e analisou-se os fragmentos obtidos, escolhendo aquele que contém o gene.
Quando se colocou esta sequência no NEB Cutter, este assume o primeiro
nucleótido da sequência como estando na posição 1. Foi, portanto, necessário ajustar a
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posição do gene – este encontra-se agora entre as posições 15001 e 16390 (subtraiu-se
996 à posição original do gene no cromossoma).
Após a digestão com a enzima BamHI obteve-se a seguinte tabela referente aos
fragmentos obtidos:
Fig. 2 - Fragmentos de restrição da região genómica que contém o gene pgmG pela enzima BamHI [2]
Sombreado a laranja na tabela anterior encontra-se o fragmento que contém o
gene pgmG. Desta forma conclui-se que o tamanho esperado do fragmento de restrição
que hibride com a sonda é 5855 p.b. 15001 e 16390
Uma análise semelhante foi feita para as restantes enzimas de restrição utilizadas:
EcoRI, HindIII e PstI.
Fig. 3- Fragmentos de restrição da região genómica que contém o gene pgmG pela enzima EcoRI
fragmento que contém o gene a sombreado
[2],
com o
Fig. 4 - Fragmentos de restrição da região genómica que contém o gene pgmG pela enzima HindIII
fragmento que contém o gene a sombreado
[2],
com o
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Fig. 5 - Fragmentos de restrição da região genómica que contém o gene pgmG pela enzima PstI
fragmento que contém o gene a sombreado
[2],
com o
Prevê-se assim que o fragmento de restrição a hibridar no poço 3 (HindII) terá
14362 pb, o fragmento que hibrida no poço 4 (EcoRI) terá 16969 pb e o fragmento visível
no gel de hibridação no poço 5 (PstI) terá 2863 pb.
Na tabela seguinte encontram-se sistematizados estes resultados, para uma mais
fácil comparação com os pesos moleculares obtidos com a actividade laboratorial.
Tabela 1 - Tamanho dos fragmentos de hibridação consoante a enzima de restrição utilizada para disgestão do
DNA cromossómico de S. elodea
Poço
Enzima de restrição
Tamanho do fragmento
2
BamHI
5855
3
HindIII
14362
4
EcoRI
16969
5
PstI
2863
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c) Hibridação de Southern entre o produto de PCR (sonda) e o DNA
cromossómico restringido de S. elodea
Como não foi obtido produto de PCR, a sonda utilizada foi fornecida pela docente,
tendo sido uma mistura de todas as sondas obtidas pelos outros grupos (uma vez que foi
obtido pouco produto de PCR nos outros turnos). Os processos de pré-hibridação e
hibridação foram realizados na noite anterior pela docente. De seguida, foi efetuada uma
série de lavagens restringentes. Finalmente, foi possível detetar o sinal de hibridação,
apresentando-se o resultado na Fig. 6.
Fig. 6 – Sinal de hibridação na membrana de nylon
Vê-se que houve hibridação do marcador de pesos moleculares no poço 1 e 3 e não
foram detetados sinais de hibridação da sonda.
Para que se pudesse calcular o peso molecular de um fragmento que hibridasse
com a sonda, teria que se medir a distância percorrida por essa banda no gel de agarose. A
título de exemplo, desenhou-se a recta de calibração com as distâncias percorridas no gel
por cada banda do marcador de pesos NZYDNA LadderII, utilizando a informação
fornecida na página da cadeira.
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Tabelas 2 - Distância relativa percorrida no gel de agarose por cada banda do marcador de pesos moleculares
(dist. rel.) e respectivo logaritmo do peso (Log(pb))
Dist. rel.
0.365591 0.419355 0.462366 0.494624 0.537634 0.586645 0.623656 0.666667
Log(pb)
4
3.875061 3.778151
3.69897
3.60206
3.477121
3.39794
3.30103
Tabela 3- Continuação da tabela 2
Dist. rel
0.741935
0.806452
0.849462
0.903226
0.946237
1
Log(pb)
3.146128
3
2.90309
2.778151
2.60206
2.30103
A distância relativa é a distância percorrida pela banda durante o processo de
electroforese . Está expressa em relação à distancia percorrida pela banda mais leve, pelo
que não tem unidades. Log é o logaritmo de base 10.
Com esta informação desenhou-se a recta de calibração, apresentada na figura 7.
Log(pb)
5
4
y = -2.4524x + 4.923
R² = 0.9869
Log(bp)
3
2
Linear (Log(bp))
1
0
0
0.5
1
1.5
Fig. 7 - Recta de calibração obtida através do marcador de pesos moleculares. Distância relativa percorrida em
função do logaritmo do peso molecular
Fica-se então com a equação
𝐿𝑜𝑔(𝑝𝑏) = −2.4524 ∗ 𝐷𝑖𝑠𝑡. 𝑟𝑒𝑙. +4.923
Que permite calcular o peso molecular de uma banda, sabendo a distância que
percorreu no gel de agarose. Utilizando a informaçao obtida in silico, podemos prever, por
exemplo, que o fragmento de hibridação no poço 2, de tamanho 5855 pb, teria andado no gel
uma distância relativa de 0.47116.
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3. Discussão
a) Criação da sonda a usar na técnica de Southern por recurso à técnica de PCR
e electroforese
A não observação de uma banda correspondente ao fragmento do gene pgmG
amplificado no gel de agarose, após electroforese, significa que o processo de PCR não se
deu de acordo com o esperado, não tendo havido amplificação do fragmento de DNA
previsto.
Não foi possível apurar a causa desta ocorrência, no entanto, salienta-se que se
verificou este resultado para todos os grupos do turno 2C, sendo assim improvável que o
erro provenha de um mau seguimento dos processos estabelecidos no protocolo aquando
da preparação da sonda. O mais provável é ter sido originado por algum reagente do PCR
que estivesse em más condições, como o tampão, por exemplo, uma vez que todos os
outros parâmetros que afectam o PCR (como a temperatura de hibridação, por exemplo) já
estão escolhidos de forma a optimizar o processo.
Esperar-se-ia que se tivesse obtido apenas uma banda de 100-1000 pb (o tamanho
de uma sonda na hibridação de Southern). Para saber o tamanho exacto teria que se
conhecer a sequência dos primers utilizados no PCR – o tamanho do fragmento
amplificado é o número de pares de base entre eles. Provavelmente, ver-se-ia mais do que
uma banda no gel de agarose – estas bandas “extra” representam produtos de PCR
resultantes de ligações inespecíficas e seriam eliminadas por uma purificação do produto
de PCR. Contudo, a falha no processo de produção da sonda impossibilitou a purificação da
mesma, o que levou à não execução deste último passo.
Finalmente, seria necessário retirar a banda correspondente à sonda, depois de
purificada, do gel de agarose. Este passo também não pôde ser realizado pelas razões
acima descritas. Para que fosse possível a conclusão dos trabalhos laboratoriais, foram
fornecidos fragmentos de DNA, resultantes de outros grupos, que pudessem ser utilizados
como sonda do gene pgmG na Hibridação de Southern.
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b) Separação em gel de agarose e visualização do DNA cromossómico de S.
elodea ATCC 31461 hidrolisado com BamHI, HindIII, EcoRI e PstI
Uma análise da figura 1 (gel de restrição com os fragmentos de DNA
cromossómico de S. elodea restringidos pelas várias enzimas utilizadas no trabalho
prático) permite inferir que no poço 3 possa ter ocorrido um erro, pois não apresenta
apenas um arrastamento como os restantes poços onde foi colocado o DNA de S. elodea
digerido: é também visível uma escada de DNA que parece ser semelhante ao marcador de
pesos moleculares colocado no poço 1.
É portanto possível que no poço 3 tenha sido colocado o marcador de pesos
moleculares em vez do corante de corrida (que confere cor ao DNA colocado no gel de
agarose, para que se possa ver as bandas formadas e para que o DNA afunde no poço), pois
ambos têm cor azul. Outra hipótese é que de alguma forma tenha havido contaminação
entre o corante de corrida (loading buffer) e o marcador de pesos moleculares no gel de
restrição.
De referir que nos restantes poços se vê um arrastado, o que significa que neles
existem muitos fragmentos de pesos que diferem pouco do anterior e seguinte, resultantes
da digestão do DNA cromossómnico de S. elodea. O gel de agarose não tem resolução
suficiente para separar completamente estes fragmentos de forma a que se distingam
bandas individuais.
c) Hibridação de Southern entre o produto de PCR (sonda) e o DNA
cromossómico restringido de S. elodea
Após a obtenção do gel de agarose, procedeu-se à depurinação (quebra das
ligações entre purinas e açúcares presentes nas moléculas de DNA para se obter
fragmentos mais pequenos, de modo a serem melhor transferidos por capilaridade para a
membrana), desnaturação (separação em cadeias simples, o que permite haver hibridação
e uma mais fácil transferência para a membrana) e neutralização (uma vez que a
transferência para a membrana é desfavorecida a pH alto, é necessário neutralizá-lo
devido à prévia subida do pH quando foi adicionado NaOH) do DNA.
Após os passos referidos transferiu-se o DNA para a membrana, pois a técnica de
Southern Blot só ocorre se o DNA estiver fixo. É de referir que a membrana foi colocada
em contacto com DNA de esperma de salmão para a bloquear e impedir a formação de
ligações inespecíficas.
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Como foi dito na secção 2, a sonda utilizada foi a obtida por outros turnos. A
marcação da mesma com digoxigenina (DIG) foi feita previamente pela docente, sendo que
o marcador de pesos moleculares foi também marcado com DIG. Assim, é possível detetar
na membrana os fragmentos de DNA onde a sonda hibrida assim como o marcador de
pesos moleculares recorrendo a um processo de imunodeteção enzimática. Este processo
consiste na ligação de um anticorpo conjugado anti-DIG-fosfatase alcalina. O anticorpo
anti-DIG deteta a DIG e a fosfatase alcalina atua como enzima repórter pois catalisa a
formação de cor azul a partir dos substratos colorimétricos NBT/BCIP.
Analisando a Fig. 6, observa-se que, tal como foi sugerido na subsecção b), o poço 3
foi contaminado com o marcador de pesos moleculares. Não é possível detetar locais onde
a sonda possa ter hibridado devido ao sinal muito intenso, no poço 3, da hibridação do
marcador de pesos moleculares que não deveria ter havido e devido à baixa concentração
de sonda relativamente ao marcador.
Seria de esperar que a sonda tivesse hibridado com o fragmento de DNA
cromossómico que contivesse o gene pgmG. No gel de hibridação ver-se-ia, portanto,
apenas uma banda em cada poço, de tamanhos diferentes, uma vez que cada enzima tem
locais de restrição diferentes. Como o marcador de pesos moleculares também é
detectável na membrana de hibridação, pelas razões anteriormente explicadas, poder-seia calcular o peso molecular de cada um destes fragmentos e comparar com o obtido in
silico, como confirmação da técnica, utilizando a recta de calibração apresentada na figura
7.
Os resultados obtidos foram muito pobres ou inexistentes, levando inclusive à
conclusão errada de que o gene pgmG não faz parte do genoma da S. elodea, uma vez que
não se observou hibridação da sonda no gel de hibridação (figura 6). Contudo, os erros que
ocorreram ao longo dos trabalhos práticos têm origem, principalmente, na inexperiência
dos alunos, pelo que, logicamente, com o trabalho prática realizado não se pode retirar
conclusões sobre a utilidade da técnica de hibridação de Southern para confirmação da
presença, ou não, de um gene no genoma de um organismo.
Pode-se afirmar, contudo, que uma possível desvantagem desta técnica é o facto de
demorar muito tempo a realizar, como se pôde constatar durante os trabalhos práticos.
Quando o genoma do organismo já é conhecido, como é o caso de S. elodea, é mais prático
recorrer a ferramentas in silico, por exemplo.
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4. Referências
Guia de laboratório TP3 e TP4 – Hibridação de Southern utilizando sondas não
radioactivas
[1]
[2]
http://tools.neb.com/NEBcutter2/
[3] www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF167367.1?&feature=CDS#feature_6103618_CDS_0
[4]
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=sphingomonas+elodea
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