Investigação da identidade genética de fetos de uma

XI Salão de
Iniciação Científica
PUCRS
Investigação da identidade genética de fetos de uma fêmea híbrida
entre duas espécies de felídeos selvagens (Leopardus tigrinus e L.
geoffroyi, Carnivora-Felidae)
Livia Menger Lehugeur1, Tatiane Campos Trigo1, Alexsandra Schneider1, Eduardo Eizirik1
(orientador)
1
Laboratório de Biologia Genômica e Molecular, PUCRS
Resumo
O gênero Leopardus, que compreende uma linhagem de felídeos endêmica da região
neotropical, tem sido alvo de diversos estudos moleculares e evolutivos por parte de nosso
grupo de pesquisa. Recentemente, por meio de alguns destes trabalhos, foi descoberta a
ocorrência de eventos de hibridação entre algumas das espécies do gênero. Estes eventos têm
sido investigados por um conjunto diverso de marcadores moleculares que incluem genes do
DNA mitocondrial, segmentos ligados aos cromossomos X e Y e locos de microssatélites
autossômicos. Para uma destas zonas de hibridação, envolvendo as espécies Leopardus
tigrinus e L. geoffroyi, uma quantidade expressiva de dados foi gerada permitindo uma
avaliação detalhada da história evolutiva destas duas espécies. Os dados gerados até o
momento nos permitiram identificar um cenário de extensa hibridação e introgressão genética
bidirecional propiciado por algum nível de fertilidade e viabilidade dos híbridos. A fertilidade
dos híbridos pôde ser particularmente demonstrada devido à coleta de uma fêmea grávida,
vítima de atropelamento, identificada como híbrida pela análise conjunta dos marcadores
moleculares. A coleta deste exemplar constitui o foco específico deste estudo, pois gerou a
possibilidade da condução de testes genéticos para avaliar a possibilidade de obtenção do
DNA da prole e posterior investigação de sua composição genética. Os resultados obtidos a
partir desta análise permitirão identificar os alelos paternos presentes nos fetos, e assim
avaliar o tipo de cruzamento ocorrido neste caso (se envolvendo um cruzamento entre
híbridos ou um retrocruzamento entre a fêmea híbrida com uma das espécies parentais).
Durante a dissecção deste exemplar foram coletados três fetos que foram então submetidos a
análises genéticas. A metodologia em laboratório envolveu primeiramente a extração do DNA
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dos fetos em duas réplicas, uma da parte anterior e outra da parte posterior de cada um, como
mecanismo de controle para o monitoramento de contaminação com o DNA da mãe. A
primeira meta do estudo consistiu em confirmar a obtenção de DNA de cada fragmento dos
fetos, bem como avaliar sua qualidade e a viabilidade de amplificação por PCR (Polymerase
Chain Reaction) a partir deste material. O resultado da extração (evidenciado por análise em
gel de agarose 1%) foi positivo para todas as amostras, indicando a presença de DNA
detectável em todos os fragmentos investigados. Até o presente momento foram realizados
testes de amplificação por PCR de cada uma das amostras utilizando-se diferentes
concentrações do DNA extraído, além da adição de otimizadores de PCR, como Triton e
Betaína. Um segmento autossômico (CHRNA1) e outro ligado ao cromossomo X (BTK)
foram amplificados para todas as amostras, sendo os produtos de PCR verificados em gel de
agarose 1%. A condição experimental que demonstrou maior eficácia incluiu o uso de 4µl de
Betaína e 1µl de DNA (na concentração obtida diretamente da extração original), em um
volume total de 20 µl. No momento estão sendo realizadas as reações de PCR para todos os
marcadores previamente utilizados para a caracterização genética da fêmea, com o intuito de
iniciar a definição da paternidade dos fetos obtidos. Espera-se que esta investigação permita
uma inferência bastante rara quanto ao comportamento reprodutivo de híbridos naturais de
carnívoros, auxiliando assim na compreensão dos processos ecológicos, comportamentais e
evolutivos envolvidos neste fenômeno.
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