Resumo

Engenharia Genetica
Trabalhos TP2 e TP3
1º Semestre 2007/2008
Ana Rita Simões, nº55764, MEBiom
Gustavo Lopes, nº55741, MEBiom
Lígia Figueiredo, nº54781, MEBiom
tiAmplificação por PCR do gene
pgmG e pesquisa, por Hibridação de
Southern, deste gene no DNA
cromossómico de S. elodea ATCC
31461
RESUMO
Com este trabalho pretendeu-se verificar a presença do gene pgmG no genoma de S.
elodea através da técnica de hibridação de Southern. Utilizou-se, como sonda, um
fragmento de DNA, que se sabia conter o gene referido, previamente amplificado por PCR.
Na membrana de hibridação, colocaram-se os fragmentos resultantes da digestão do DNA
cromossómico de S. elodea e sujeitos a electroforese em gel de agarose. No final concluiu-se
que foi possível identificar o gene pgmG em DNA cromossómico de S. elodea, reconhecendo
a importância das técnicas utilizadas para atingir este fim.
1. TÉCNICAS EXPERIMENTAIS
1.1. PCR – Polymerase chain reaction
Esta técnica permite a amplificação de sequências de DNA por um factor bastante
elevado. Foi desenvolvida no princípio da década de 80, tendo, actualmente, diversas
aplicações, nomeadamente ao nível de diagnóstico pré-natal e em ciência forense. São
necessários, para a realização do PCR, dois primers, uma versão termoestável de DNA
polimerase – a Taq polimerase, os quatro tipos de dNTP e uma composição de tampão
adequada [1]. Relativamente à escolha dos primers, há diversas considerações que devem
ser tidas em conta. A mais óbvia está relacionada com a sequência nucleotídica destes, que
terá que ser determinada com base no fragmento a amplificar. Cada um dos primers deverá
ser constituído por 20/30 nucleótidos e não deverá conter repetições de sequências nem
regiões de intracomplementaridade. A utilização da Taq polimerase está relacionada com o
facto de, sendo resistente a elevadas temperaturas, não ser necessário repô-la ao fim de
cada ciclo de PCR, permitindo assim a automação deste método [2].
Cada ciclo efectuado pelo aparelho de PCR inicia-se com uma desnaturação da cadeia
de DNA, que é submetida a uma temperatura de aproximadamente 96ºC durante um
minuto. Posteriormente, procede-se à hibridação, a cerca de 61ºC e durante 30 segundos,
de cada um dos dois primers com as cadeias simples resultantes da desnaturação da cadeia
inicial. Finalmente, a elongação das cadeias por adição dos nucleótidos é efectuada pela Taq
polimerase a cerca de 72ºC [3].
Neste trabalho, após o passo da reacção de amplificação, as cópias obtidas são
digeridas e separadas em gel de agarose. Com base no padrão de pesos moleculares de
DNA, procede-se então à determinação da recta de calibração do gel e determina-se qual o
fragmento que apresenta um peso molecular semelhante ao desejado.
1.2. Electroforese em gel de agarose
Esta técnica é essencial em engenharia genética, uma vez que é através dela que,
correntemente, se visualizam directamente fragmentos de DNA. Baseia-se no facto de que
os ácidos nucleicos são polianiónicos a um pH neutro, i.e, transportam várias cargas
negativas devido à presença de grupos fosfato na cadeia dupla. Como tal, as moléculas
migram, quando sujeitas a um campo eléctrico, em direcção ao eléctrodo positivo. Como as
cargas negativas se encontram distribuídas uniformemente ao longo da molécula de DNA, a
razão carga/massa é constante e, como tal, a mobilidade depende apenas do tamanho do
fragmento em questão [1] (na verdade, a velocidade de migração do DNA no gel é
dependente também da sua conformação, mas, como apenas estão a ser considerados
fragmentos lineares em cadeia dupla, este factor não influenciará a mobilidade [2]).
A electroforese inicia-se com a colocação das amostras de DNA no gel (de agarose, no
caso deste trabalho) e na posterior aplicação de uma diferença de potencial entre as duas
extremidades deste. Os ácidos nucleicos, corados com brometo de etídio, serão, por fim,
visualizados por radiação UV [1]. Os pesos dos fragmentos obtidos poderão ser estimados
recorrendo a uma recta de calibração, construída a partir de um padrão de pesos
moleculares de DNA, em que se explicita que a distância de migração aumenta linearmente
com o logaritmo do número de pares de bases que constituem um determinado fragmento.
1.3. Hibridação de Southern
O método original de hibridação foi desenvolvido por Southern nos anos 70 para a
detecção de fragmentos, presentes num gel de agarose, complementares a uma
determinada sequência de RNA ou DNA. Nesta técnica, designada por Southern Blotting, o
gel de agarose é colocado num papel de filtro que, por sua vez, é mergulhado num
recipiente que contém o tampão de transferência. A membrana de hibridação, de nylon, é
colocada entre o gel e uma resma de papéis absorventes, que permitirão a transferência do
tampão por capilaridade através do gel. As moléculas de DNA são, assim, transportadas pelo
tampão de transferência e imobilizadas na membrana.
Para que esta técnica seja eficiente, é importante que se efectue um tratamento prévio
ao gel de agarose. Uma vez que se pretende que o tempo de transferência seja uniforme, e
como os fragmentos maiores tendem a demorar mais, o gel é sujeito a uma depurinação.
Este processo encurta os fragmentos de DNA em locais depurinados, já que consiste na
hidrólise alcalina nestas regiões da cadeia. Para além disso, é necessário que se promova a
desnaturação dos fragmentos imediatamente antes da transferência, garantindo que estes
se encontram na forma de cadeia simples e acessíveis à hibridação com a sonda. Por fim,
procede-se à neutralização do gel por recurso a uma solução ácida [2].
Após o processo de transferência dos fragmentos de DNA e posterior fixação, por
radiação UV, desses fragmentos na membrana, esta é sujeita a uma pré-hibridação com DNA
de esperma de salmão, de modo a minimizar eventuais posteriores ligações não-específicas
da sonda. Depois de ocorrer a hibridação, procede-se a uma série de lavagens da
membrana, designadas por restringentes (com soluções de baixa força iónica), responsáveis
pela quebra de ligações não-específicas.
Aos híbridos formados, liga-se um anticorpo de fluoresceína associado à enzima
fosfatase alcalina (método enzimático), responsável pela posterior catálise da produção de
luz através da decomposição enzimática de um substrato de dioxetano. A luz produzida
impressiona depois uma chapa fotográfica que é finalmente revelada e fixada [3].
2. RESULTADOS
2.1. Determinação dos primers necessários à amplificação, por PCR,
do fragmento de DNA contendo o gene pgmG
Recorreu-se a ferramentas bioinformáticas para a selecção dos iniciadores do PCR.
Obtiveram-se, para os primers codificante e não-codificante, respectivamente, as seguintes
sequências oligonucleotídicas:
PGMinc-UP: 5’ GCGCTGATCGAGGGCCTGAC 3’
PGMinc-LOW: 5’GCGTACTGGGCATCGTCGAA 3’
2.2. Separação e visualização, em gel de agarose, do produto de PCR
Após a amplificação da região do DNA cromossómico de S. elodea ATTCC 31461, por
recurso à técnica de PCR, procedeu-se à separação e à visualização em gel de agarose do
produto obtido, recorrendo a uma electroforese.
Tal como já foi indicado anteriormente, a electroforese é uma técnica que assenta na
migração de moléculas carregadas por aplicação de um campo eléctrico e, entre muitos
factores, essa migração está relacionada com o peso molecular dessas moléculas
(normalmente associado ao seu número de pares de bases – pb), da concentração da matriz
utilizada e do campo aplicado.
Neste caso a separação electroforética foi efectuada a 90V, em gel de agarose 0,8%
(p/v). Utilizaram-se 8 poços, nos quais 7 deles continham o produto do PCR, obtido pelos
diferentes grupos, e o outro uma amostra de DNA padrão em escada de 1000 pb (BRL). O
resultado obtido foi o seguinte (em que a visualização foi feita após se ter imergido o gel
numa solução de brometo de etídeo):
Figura 1. Resultado da electroforese do produto obtido por PCR.
Como podemos ver pela imagem da Figura 1, a migração ocorrida nos 7 primeiros
poços foi muito semelhante, obtendo-se uma banda, à mesma distância, em todos eles. Da
mesma forma, a migração registada no último poço também é muito semelhante àquela
outra que está identificada na figura padrão (Figura 1 em anexo), uma vez que nesse poço
foi colocada a mesma amostra de DNA que também corresponde a essa mesma figura.
Para determinar o peso molecular do conteúdo das 7 bandas iniciais é necessário, em
primeiro lugar, relacionar as distâncias percorridas no gel pelos diversos fragmentos da
amostra padrão com o peso molecular estabelecido para esses mesmos fragmentos (a partir
da Figura 1 em anexo). Estas distâncias foram determinadas manualmente e calculadas
entre o topo do gel e o centro da banda respectiva.
Deste modo, obtém-se a seguinte tabela:
Tabela I. Distância percorrida pelos vários fragmentos de DNA padrão e respectivos pesos
moleculares e logaritmos decimais.
Distância (mm) Pares base (pb) Log (pb)
25,0
12000
4,079
37,0
5000
3,698
51,5
2000
3,301
54,5
1650
3,217
62,5
1000
3,000
65,5
850
2,929
69,0
650
2,813
72,5
500
2,699
75,5
400
2,602
77,5
300
2,477
84,0
100
2,000
Relacionando agora as distâncias com os respectivos valores de log (bp), que estão
presentes na tabela anterior, podemos construir a seguinte regressão linear (recta de
calibração) – o primeiro parâmetro está representado nas abcissas enquanto o segundo nas
ordenadas.
Figura 2. Recta de calibração obtida por regressão linear entre a distância percorrida pela
amostra padrão no gel da electroforese, e o logaritmo decimal dos pesos
moleculares associados a essas distâncias.
A equação característica é:
y = log(pb) = -0,0317x + 4,927
(1)
Uma vez calculada a distância percorrida pelos fragmentos, que foi aproximadamente
igual a 63,5 mm, é possivel, então, determinar o peso molecular dos mesmos, substituindo
essa distância na equação (1). O resultado obtido foi:
log(pb)=2,91435  pb =821
2.3. Separação e visualização do DNA cromossómico de S. elodea ATCC
31461
Na realização da hibridação de Southern utilizou-se como sonda o fragmento de DNA
que foi amplificado por PCR e como molécula alvo o DNA cromossómico de S. elodea, que foi
previamente digerido por enzimas de restrição.
Realizou-se uma nova electroforese para separar os fragmentos resultantes da hidrólise
do DNA cromossómico. O gel que daqui resultou foi tratado de modo a transferir-se os
fragmentos para uma membrana de nylon (para deste modo ser utilizada na hibridação de
Southern).
(2)
O resultado da electroforese está indicado na Figura 3. Neste caso, o conteúdo dos
poços foi o seguinte (da esquerda para a direita): (1) amostra DNA padrão; (2) DNA+BamHI;
(3) DNA+PstI; (4) DNA+HindIII; (5) DNA+PstI; (6) DNA+EcoRI.
Figura 3. Digestão do DNA cromossómico de S. elodea ATCC 31461 por 4 diferentes enzimas
de restrição
Não é fácil, a partir da imagem da Figura 3, identificar bandas características, ao
contrário do que se verificou no caso anterior (Figura 2), uma vez que as enzimas digeriram
cada amostra em diversos locais. Deste modo, não se vai proceder ao cálculo do peso
molecular do DNA cromossómico de S.elodea.
2.4. Detecção dos sinais da Hidridação de Southern
Após a realização de todos os passos necessários à hibridação de Southern, procedeuse à detecção numa chapa fotográfica dos híbridos de DNA que resultaram da ligação da
sonda a sequências homólogas do DNA cromossómico imobilizado na membrana de nylon.
Esta detecção baseou-se no método descrito anteriormente, e esperar-se-ia obter o
seguinte resultado:
Figura 4. Fotografia obtida no final da hibridação de Southern e que revela os locais onde
ocorreu essa hibridação
Há que notar que a figura anterior não representa a fotografia que foi por nós obtida,
uma vez que ela não permitia distinguir qualquer resultado de interesse. Assim, a professora
disponibizou uma imagem para que pudéssemos analisar um possível resultado da
hibridação.
Neste caso, as enzimas de restrição utilizadas em cada poço foram (da esquerda para a
direira): (1) HindIII; (2) PstI; (3) BamHI; (4) EcoRI. No último poço está presente a amostra de
DNA padrão.
Mais uma vez, vai-se calcular os pesos moleculares das bandas detectadas, recorrendo
a uma recta de calibração. O método utilizado é em tudo semelhante aquele que já foi
utilizado (e descrito) anteriormente, nesta secção.
Deste modo, comparando as bandas da figura em anexo com as que estão presentes no
último poço, vamos ter:
Tabela II. Distância percorrida pelos vários fragmentos de DNA padrão e respectivos pesos
moleculares e logaritmos decimais
Distância (mm)
Pares base (pb) Log (bp)
25,0
12000
4,079
47,0
2000
3,301
53,5
1650
3.217
62,5
1000
3,000
67,0
850
2,929
Nesta situação identificaram-se menos bandas já que era muito difícil comparar as
mesmas com as da amostra padrão (existe manchas na fotografia).
A recta de calibração e a equação a ela associada foram, respectivamente:
Figura 5. Recta de calibração obtida por regressão linear entre a distância percorrida pela amostra padrão
no gel da electroforese, e o logaritmo decimal dos pesos moleculares associados a essas distâncias
y = -0,0275x + 4,7065
(3)
Assim sendo, a partir da equação anterior, é possível determinar, para cada poço
(representado pelas respectivas enzimas), os pesos moleculares dos fragmentos que
sofreram hibridação. Deste modo, obtém-se:
Tabela III. Relação existente entre a distância percorrida por cada fragmento sujeito à
hibridação, em cada poço, e os pesos moleculares dos mesmos.
Enzima
Distância
(mm)
Peso Molecular
(pb)
HindIII
15,5
19065
PstI
54,0
1665
BamHI
39,0
4305
EcoRI
22,0
12633
3. DISCUSSÃO
A electroforese do produto de PCR revela, tal como esperado, que se obteve o gene
pgmG, ou parte desse gene, pertencente a uma região do DNA cromossómico de S. elodea
ATCC 31461. Isto é confirmado tanto pela distância percorrida por todas as amostras
analisadas, que apresentavam a mesma migração ao longo do gel de agarose, assim como
do valor obtido para o peso molecular desses vários fragmentos. Este foi, no caso da nossa
experiência, de 821 pb, enquanto aquele que está presente na literatura é de 839 pb [3].
A ligeira diferença entre aqueles dois valores pode estar relacionada com o facto de,
por vezes, ser difícil estimar a relação existente entre as bandas da amostra padrão de DNA
no gel com aquelas que estão identificadas na figura padrão, assim como cumprir sempre o
mesmo critério no cálculo das distâncias percorridas pelos vários fragmentos ao longo do
gel. Assim, pode ter-se construído uma recta de calibração errónea e, consequentemente,
este aspecto poderá ter influenciado o cálculo do valor do tamanho do produto de PCR.
Um outro factor poderá estar ligado com questões experimentais, nomeadamente com
uma incorrecta introdução das várias amostras nos diversos poços do gel da electroforese,
podendo ter ocorrido perdas dessas mesmas amostras.
Apesar de tudo, esta técnica revela grande eficácia na identificação de fragmentos,
confirmando, neste caso, que se tinha obtido o gene pgmG. Assim, utilizou-se o fragmento
correcto na sonda de DNA na hibridação de Southern.
Relativamente ao PCR efectuado, e uma vez que se obteve, de facto, uma aplificação
do fragmento pretendido, poderá concluir-se, por um lado, que a escolha dos primers foi a
acertada e, por outro, que as condições de temperaturas e duração dos vários passos do
ciclo terão sido as adequadas. Confirmou-se, portanto, a importância de algumas
características dos primers utilizados neste método de amplificação, nomeadamente o
número de nucleótidos que os constituem (neste caso, vinte) e o elevado conteúdo GC.
Analisando, agora, o resultado da electroforese do DNA cromossómico de S. elodea
ATCC 31461, quando sujeito à acção das 4 diferentes enzimas de restrição (HindIII; PstI;
BamHI; EcoRI), verificamos que todas elas reconhecem o DNA cromossómico da bactéria e,
para além disso, reconhecem diversos locais desse DNA, já que se obtiveram fragmentos de
diversos tamanhos, ao longo do gel de agarose, resultantes da digestão das enzimas.
Uma observação mais cuidada da figura que está ser analisada nesta fase, – Figura 3 –
permite identificar, e aproximadamente ao mesmo nível (na parte superior do gel), duas
bandas mais intensas nos poços que tinham as enzimas BamHI e PstI, e uma banda menos
intensa no poço que continha a enzima HindIII. Este facto revela a presença de fragmentos
de grandes dimensões, pois, tal como foi explicado teoricamente, a migração dos
fragmentos de grandes dimensões é menor. Este facto pode estar relacionado com algum
erro experimental, como por exemplo uma incorrecta introdução das diversas enzimas nos
eppendorf’s que continham o DNA cromossómico da bactéria, ou uma possível
contaminação das mesmas.
Há que notar que nenhuma enzima, das que foram utilizadas, corta regiões no interior
do gene pgmG (ver Figura 2 em anexo), o que torna este método muito útil na hibridação de
Southern, já que é a partir do gel de agarose, que contém os fragmentos de DNA
cromossómico resultantes da digestão por estas enzimas, que se vai obter a membrana de
nylon a ser utilizada na hibridação. Deste modo, como o objectivo principal da hibridação é
reconhecer os locais de ligação da sonda às sequências homólogas do DNA cromossómico
imobilizado na membrana, e que contêm o gene pgmG, é importante ter este gene intacto
nesta fase, após a digestão das enzimas (isto será confirmado de seguida).
Finalmente, podemos ver o resultado da hibridação de Southern na Figura 4. Esta figura
diz respeito a uma fotografia que foi revelada depois de ser ter introduzido um anticorpo
(conjugado de anti-fluoresceína-fosfatase alcalina), em solução, na membrana de nylon, e
após ter já ocorrido a hibridação. Deste modo, e após incubação, este anticorpo vai ligar-se
aos hibrídos formados, permitindo a produção de luz que, por sua vez, vai impressionar uma
chapa fotográfica.
Deste modo, o que se vai ver naquela imagem é unicamente os locais de ligação da
sonda à membrana, e como se identificaram em todos os poços uma banda, correspondente
àquele fenómeno, então conclui-se que a hibridação ocorreu com sucesso, confirmando a
presença do gene pgmG na membrana e, consequentemente, no genoma de S. Elodea ATCC
31461. Conclui-se ainda que as enzimas de restrição utilizadas anteriormente, na digestão
do DNA cromossómico da bactéria, não cortaram, de facto, locais no interior do gene (caso
contrário, ter-se-iam obtido, em cada poço, duas ou mais bandas).
Depois do cálculo dos pesos moleculares das 4 bandas detectadas na fotografia, cujos
valores estão indicados na Tabela III, verifica-se que no primeiro e último poços se obtêm
valores fora da gama dos pesos da amostra padrão, o que terá possivelmente originado
erros significativos, inerentes à extrapolação efectuada, na determinação da recta de
calibração.
Para além disto, verificou-se que todos aqueles 4 valores são muito diferentes entre si.
Este último facto é indicador de que as enzimas de restrição não cortam fragmentos (que
contêm o gene pgmG) do mesmo tamanho.
Os pesos moleculares dos fragmentos detectados na fotografia também podem estar
influenciados por erros cometidos na realização da recta de calibração, e que já foram
discutidos anteriormente, nesta secção.
4. CONCLUSÃO
Esta actividade experimental possibilitou um contacto mais aprofundado com algumas
das técnicas utilizadas correntemente em engenharia genética: amplificação por PCR,
electroforese e hibridação de Southern. Relativamente à primeira, verificou-se ser de
simples execução e bastante eficiente, desde que se assegurem algumas condições, tanto na
escolha das sequências iniciadoras como em aspectos mais práticos referentes à
temperatura e à duração das diversas fases do ciclo de amplificação. O resultado do PCR
realizado foi comprovado pelo recurso a outra técnica experimental, a electroforese
(efectuada, no caso particular deste trabalho, em gel de agarose), que demonstrou ser um
método igualmente simples e eficaz, capaz de separar fragmentos de DNA de acordo com os
respectivos pesos moleculares. Em relação à hibridação de Southern, trata-se de uma
técnica de execução elaborada e que requer mais experiência por parte de quem a utiliza.
No entanto, possibilitou, apesar de tudo, a verificação da presença do gene pgmG em DNA
cromossómico de S. elodea. Reconhece-se, portanto, a importância que esta técnica assume
na pesquisa genómica, revelando assim utilidade em inúmeras aplicações, nomeadamente
em investigação clínica.
BIBLIOGRAFIA
[1] Desmond S. T. Nicholl, “An Introduction to Genetic Engineering”, Cambridge University
Press, Cambridge, 2005.
[2] Sandy B. Primrose, Richard M. Tayman, Robert W. Old, “Principles of Gene Manipulation
– 6th Edition”, Blackwell Publishing Ltd., Nova Iorque, 2004.
[3] Arsénio Fialho, Jorge Leitão, Leonilde Moreira, e Isabel Sá-Correia. Guia de Trabalhos
Laboratoriais de Engenharia Genética. Lisboa: Secção de Folhas da AEIST, 2007.
ANEXOS
Figura 5. Electroforese de uma amostra de DNA conhecida (é possível relacionar os
diferentes pesos moleculares com as distância percorridas por cada um deles).
Figura 6. Mapa de restrição do fragmento de DNA contendo o gene pgmG de Sphingomonas
elodea.