FT(pHA010-3)

Relatório de Engenharia Genética
TP1 - Introdução de plasmídeos em bactérias
por conjugação triparental e
electrotransformação
Professora Cristina Viegas
Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica
Outubro de 2014
Trabalho realizado por:
75559, Ana Palma
75720, Diogo Cardoso
75726, Bernardo Noronha
Outubro de 2014
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MEBiom
Índice
1.
Resumo........................................................................................................................................................................................ 3
2.
Resultados.................................................................................................................................................................................. 4
2.1 Tratamento de resultados ................................................................................................................................................ 5
3. Discussão e conclusões…………………………………………..………………………………………..…………………………….6
4. Referências ..................................................................................................................................................................................... 9
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1. Resumo
O trabalho laboratorial realizado tem como objectivo comparar duas técnicas de introdução de
DNA em bactérias: a electrotransformação e a conjugação triparental. Para verificar a eficiência destas
técnicas, tentou-se repor o fenótipo mucoso de mutantes de S. elodea e P. aeruginosa tendo como base
mecanismos de complementação homóloga e heteróloga. Para a primeira técnica, utilizaram-se os
plasmídeos pBBR1MCS (vector vazio) e pHA010-3 (vector com o gene gelE), sendo que a frequência e
a eficiência de transformação obtidas para cada plasmídeo foram: FT(pBBR1MCS) = 6.3 × 10−7 ;
FT(pHA010-3) = 2.4 × 10−6; ET(pBBR1MCS) = 227.3 UFC/mL/µg; ET(pHA010-3) = 18023.3
UFC/mL/µg. Para a segunda técnica, utilizaram-se os plasmídeos pMMB66(HE) (vector vazio), pLC100
(vector com o gene pgmG), pNZ49 (vector com o gene algC) e pRK2013 (plasmídeo conjugativo). Os
resultados obtidos com a conjugação triparental foram inconclusivos uma vez que, para todos os
plasmídeos, o número de colónias era incontável.
Com este trabalho, pode-se concluir que ambas as técnicas de introdução de DNA em bactérias
são eficientes, sem se poder dizer qual a mais eficiente por falta de resultados relativos à conjugação
triparental. Podemos ainda afirmar que os processos de introdução de genes em estudo,
nomeadamente o de complementação homóloga e heteróloga, foram bem-sucedidos.
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2. Resultados
Uma vez que a actividade laboratorial se dividiu em duas partes, cada uma referente a uma
técnica diferente (electrotransformação e conjugação triparental), tanto a secção dos resultados como a
discussão encontram-se de igual forma compartimentadas.
1) Electrotransformação
Os resultados obtidos pelo grupo com esta técnica foram inconclusivos: observou-se que não se
desenvolveram colónias em nenhuma das placas de Petri preparadas durante a actividade laboratorial.
As razões que levaram a isto serão discutidas mais à frente, na secção “Discussão”.
De forma a possibilitar uma análise quantitativa da experiência foi fornecido um conjunto de
resultados, proveniente de outros grupos, que haviam desenvolvido a mesma actividade laboratorial.
Na tabela 1 encontram-se os números de colónias existentes em cada placa para diferentes
concentrações de suspensão celular original e para os diferentes plasmídeos que foram colocados nas
células. Registou-se ainda o fenótipo observado.
Tabela 1 - Número de colónias em cada placa. (1) -Fenótipo amarelo, com aspeto pouco mucoso; (2) – Fenótipo amarelo
com aspecto mucoso
Meio S + Cm
Diluição
Meio S
1:100
1:101
1:104
1:105
1:106
1:107
8 colónias (1)
----
Incontável (1)
127
---
---
Plasmídeo
pBBR1MCS
colónias (1)
pHA010-3
Incontável (2)
62 colónias
(2)
Incontável (1)
Incontável
(1)
256
colónias
--(1)
Os espaços não preenchidos na tabela referem-se a valores que não foram fornecidos.
O plasmídeo pBBR1MCS é o vector vazio, com marca de selecção CmR (resistente a clorofenicol),
servindo como controlo negativo. O plasmídeo pHA010-3 é o vector de clonagem no qual foi
previamente inserido o gene gelE.
O meio no qual foram plaqueadas as culturas obtidas através da actividade experimental é o
meio S. A esse meio adicionou-se clorofenicol (antibiótico para o qual o vector de clonagem apresenta
resistência) – meio S + Cm.
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2) Conjugação triparental
Mais uma vez os resultados obtidos não foram conclusivos: em todas as placas de Petri foram
observadas inúmeras colónias, impossíveis de contar. O meio de cultura utilizado foi o meio PIA
(Pseudomonas Isolation Agar). Não houve distinção aparente entre as placas com e sem o antibiótico
Carbenicilina (meio PIA + Carb e meio PIA, respectivamente) nem entre as colónias com origem em
células nas quais foram inseridos plasmídeos diferentes, usando a técnica em questão. Desta forma, não
há resultados disponíveis relativos à conjugação triparental.
As razões para este insucesso e os resultados esperados serão igualmente apresentados na
secção “Discussão”.
2.1 Tratamento de resultados
Para calcular a eficiência (ET) e a frequência (FT) da electrotransformação, utilizaram-se as
seguintes fórmulas:
ET =
UFC/mL de electrotransformantes
FT =
UFC/mL de electrotransformantes
µg de DNA
UFC/mL de células viáveis totais
sendo que as UFC/mL, por exemplo, do meio S com a diluição de 1:105 e com o plasmídeo pBBR1MCS,
são 1270*105=1.27*108 UFC/mL.
A quantidade de DNA utilizada, para cada plasmídeo, foi:
pBBR1MCS1: 8µL de uma solução de 44ng/µL
8 × 44 = 352𝑛𝑔 = 0.352µ𝑔
pHA010-3:
9 × 38 = 342𝑛𝑔 = 0.342µ𝑔
9µL de uma solução de 38ng/µL
O número de UFC/mL para cada plasmídeo foi de 2560 × 106 = 2.56 × 109 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿 para o
plasmídeo pBBR1MCS e 1270 × 105 = 1.27 × 108 𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿 para o plasmídeo pHA010-3.
Assim,
80×100 UFC/mL
FT(pBBR1MCS) =
1.27×108 UFC/mL
ET(pBBR1MCS) =
FT(pHA010-3) =
80×100 UFC/mL
0.352 µg
= 6.3 × 10−7
= 227.3 UFC/mL/µg
620×101 UFC/mL
2560×106 UFC/mL
= 2.4 × 10−6
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ET(pHA010-3) =
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620×101 UFC/mL
0.342 µg
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= 18128.7 UFC/mL/µg
3. Discussão e conclusões
1) Electrotransformação
A ausência de quaisquer colónias visíveis nas placas de petri deve-se, provavelmente, a
problemas com o meio S. Os componentes utilizados na sua preparação não se encontravam bem
conservados acabando por enviesar o meio de cultura, impedindo que neste houvesse a taxa de
crescimento e replicação das bactérias esperada. O facto de se ter verificado estes resultados noutros
grupos que realizaram a experiência em simultâneo, onde o meio S utilizado havia sido preparado em
conjunto, corrobora esta explicação dos resultados obtidos.
Como referido na secção 2, utilizou-se os resultados de outros grupos aos quais a experiência foi
bem sucedida.
A verificação de fenótipo mucoso nas colónias de S. elodea mutantes onde foi inserido o
plasmídeo recombinante pHA010-3, que contém o gene gelE, é sinal da existência de gelano. Por outro
lado, nas colónias onde foi inserido o plasmídeo pBBR1MCS, não se verifica esse fenótipo, o que
significa que não há produção de gelano. Assim, pode concluir-se que o gene gelE é um gene essencial
para a produção de gelano na Sphingomonas elodea, ao codificar uma enzima essencial que regula a
actividade proteica (uma tirosina cinase, importante na extensão final do gelano e no seu transporte
para fora da célula). O mecanismo aqui apresentado é, portanto, o de complementação homóloga.
Em relação à eficiência de electrotransformação, sabe-se que varia inversamente com o
tamanho do fragmento de DNA a inserir(4). No entanto, tal não se verifica, apresentando uma maior
eficiência de electrotransformação o plasmídeo pHA010-3. Este resultado justifica-se com a diferença
de concentrações de células de S. elodea aquando da electrotransformação. Neste caso, sendo esse valor
superior para a electrotransformação do plasmídeo pHA010-3 é normal que este tenha um valor de
eficiência também superior. Passível de afectar também a eficiência de transformação é a duração do
pulso durante a electrotransformação, que no nosso caso variou entre 5.3 e 5.7ms. Uma vez que a
duração de pulso para o qual o processo está otimizado é 5ms, qualquer tempo de pulso mais elevado
provoca maior choque nas células, sendo mais provável a sua morte. Estes valores, naturalmente, não
nos permitem retirar conclusões pois referem-se a uma actividade laboratorial diferente da cujos
resultados estamos a analisar.
Quanto à frequência de electrotransformação, pode-se considerar que os valores obtidos são
próximos, sendo este valor ligeiramente maior para o plasmídeo pHA010-3, provavelmente por à
partida este ter uma concentração mais elevada.
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2) Conjugação triparental
Nesta actividade laboratorial foram introduzidos, pelo método de conjugação triparental, três
plasmídeos diferentes em células de Pseudomonas aeruginosa 8858 algC- (2):

pMMB66EM – vector de clonagem vazio (com marca de selecção AmpR);

pLC100 – vector de clonagem derivado do PMMB66EM que contém o gene pgmG clonado;

pNZ49 - vector de clonagem derivado do PMMB66EM que contém o gene algC clonado.
Como referido na secção 2, os resultados obtidos pela técnica de conjugação triparental foram
inconclusivos, pois as colónias eram incontáveis e cresceram indiscriminadamente, tanto no meio PIA
como no meio PIA com carbenicilina. Supõe-se que isto se deva a uma concentração demasiado baixa de
antibiótico - o suposto era ao meio PIA ter sido adicionado 500mg/L de carbenicilina. Uma
concentração abaixo deste limite não garante a morte das colónias de Pseudomonas aeruginosa
sensíveis à carbenicilina, pelo que não há distinção entre as células nas quais foi bem sucedida a
introdução do plasmídeo e as células nas quais esta transformação não teve sucesso.
Pensa-se que a diminuta concentração de antibiótico adicionada ao meio PIA se deva ao facto de
a Carbenicilina existente no laboratório estar húmida, e como tal ser mais pesada do que o suposto.
Desta forma, a massa de antibiótico necessária para perfazer a concentração desejada teria que ser
superior ao normal, contudo não foi isto que aconteceu.
Utilizou-se o meio PIA por forma a eliminar as estirpes de E.Coli responsáveis pela conjugação
triparental (estirpe dadora e ajudante, sendo que esta última possui o plasmídeo conjugativo
pRK2013). Através deste mecanismo foram introduzidos em células mutantes de P. aeruginosa os três
plasmídeos recombinantes anteriormente mencionados.
As células de P. aeruginosa são naturalmente resistentes à ampicilina pelo que não se pode
utilizar este antibiótico como marca de selecção. Estas células são, no entanto, sensíveis à carbenicilina.
Esta é análoga à ampicilina e o gene existente no vector de clonagem que confere resistência a Amp
também confere resistência a Carb
(1);
como tal utilizou-se a carbenicilina como marca de selecção.
Desta forma, iriam sobreviver apenas as colónias nas quais tivesse sido introduzido com sucesso o
plasmídeo respectivo (fosse ele o pMMB66EM, pLC100 ou pNZ49). Era expectável que este número
fosse diminuto e, portanto, contável. Assim, as placas com meio PIA conteriam bastante mais colónias
que as do meio PIA + Carb. Poder-se-ia, então, calcular a frequência de conjugação, que, como já foi
referido, se esperaria ser tanto mais alta quanto menor o tamanho do plasmídeo. Assim, a maior
frequência de conjugação seria a do vector vazio pMMB66EM, que é o de menor dimensão (8.9 kb),
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seguida da do pLC100 (10.3 kb) e, finalmente, a menor FC seria a do pNZ49, o maior plasmídeo (11.6
kb) visto que o gene algC é maior que o pgmG.
Quanto ao fenótipo observado, esperar-se-ia que muitas das colónias do meio PIA + Carb
tivessem uma aparência mucosa e as do meio Pia uma aparência maioritariamente não mucosa. Isto
porque tanto o gene pgmG como o algC codificam uma enzima com actividade de PGM que cataliza a
reacção de conversão de glucose-6-fosfato em glucose-1-fosfato (passo essencial na produção de
exopolissacáridos como o alginato). Contudo, o gene pgmG provém de uma estirpe de Sphingomonas
elodea enquanto que o algC de uma estirpe de P. aeruginosa, sendo um homólogo funcional do pgmG.
Assim, ao ser introduzido este último gene em células mutantes de P. aeruginosa algC e obtendo um
fenótipo mucoso (ou seja, havendo produção de alginato) pode-se concluir que estes são efectivamente
homólogos, tendo-se assim demonstrado a complementação heteróloga(3).
Nas colónias em cuja unidade formadora tivesse sido introduzido o vector de clonagem vazio
pMMB66EM observar-se-ia um fenótipo não mucoso, o que seria uma dupla confirmação da
importância da enzima codificada pelos genes referidos na produção do exopolissacárido alginato.
Finalmente, por forma a obter os resultados esperados, ter-se-ia que repetir a actividade
laboratorial, utilizando desta vez a quantidade certa de carbenicilina.
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4. Referências
(1)
https://worldwide.promega.com/resources/pubhub/enotes/can-carbenicillin-be-substitutedfor-ampicillin-when-selecting-for-the-pgem-vectors/
(2)
Guia de trabalhos laboratoriais de Engenharia Genética, Mestrado em Engenharia Biológica,
Mestrado em Engenharia Biomédica, TP1- Introdução de plasmídeos recombinantes em bactérias,
Moreira, L. M., Viegas, C. A., Fialho, A., Leitão, J. H., Sá-Correia, I. , Área de Ciências Biológicas, IST,
2013/2014
(3)
Powerpoints das aulas teóricas de Engenharia Genética, The A1 Lab Class, Prof. Nuno Mira, IST,
2014
(4)
Electroporation theory_BioRad manual_2013
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