Pré TP1 (Ricardo Fundão Belo).

PRÉ-RELATÓRIO – TP1 –
INTRODUÇÃO DE PLASMÍDEOS EM
BACTÉRIAS POR CONJUGAÇÃO
TRIPARENTAL E
ELECTROTRANSFORMAÇÃO
INTRODUÇÃO
A actividade a realizar em laboratório tem como objectivo primordial a introdução
de plasmídeos recombinados em bactérias. As bactérias em estudo serão a Sphingomonas
elodea ΔGelE (SpLM21-4), na qual será introduzido o plasmídeo pHA010-3, contendo o
gene gele, e a Pseudomonas aeruginosa, na qual será introduzido um plasmídeo
recombinado contendo o gene pgmG, hospedado numa estirpe mutante para a actividade
de PGM dessa mesma bactéria.
Estes dois processos visam avaliar a reposição do fenótipo mucoso dos respectivos
mutantes através, quer da electrotransformação, quer da conjugação triparental.
ELECTROTRANSFORMAÇÃO
Neste primeiro processo, também designado de complementação homóloga,
submetem-se as células a um campo de alta voltagem num espaço curto de tempo,
permitindo uma electropermeabilização reversível das membranas das células, facilitando
assim a entrada de macromoléculas, como por exemplo, DNA plasmídico. Este campo tem
de ser muito superior ao utilizado em células de mamíferos e protoplastos de plantas
devido às dimensões das bactérias.
A electrotransformação permite o uso, com idêntica eficiência de transformação,
quer de células frescas, quer após congelação. Existem assim dois conceitos de interesse
inerentes a esta técnica: a eficiência de electrotransformação (nº de transformantes / μg
DNA) e a frequência de electrotransformação (nº de transformantes / nº de células viáveis
após electrotransformação), que naturalmente são dependentes de condições
experimentais como fase da curva em que as células são recolhidas, a concentração das
células, as variáveis associadas ao aparelho de electroporação (intensidade do campo
eléctrico e duração do pulso), a dimensão do DNA a introduzir e o sistema de modificaçãorestrição da estirpe hospedeira.
Para permitir a viabilidade das células, é necessário que se mantenham as mesmas
em meio não selectivo durante o tempo de uma geração. Isto possibilita a síntese de
proteínas codificadas pelos genes relacionados com as marcas selectivas associadas ao
plasmídeo, o que faz com que seja possível distinguir as células que o têm das que não têm,
através da resistência a antibióticos.
1
CONJUGAÇÃO TRIPARENTAL
O segundo processo de introdução de plasmídeos é chamado de conjugação
triparental e devido à produção de alginato por parte das células da estirpe Pseudomonas
aeruginosa 8858, que possuem uma mutação no gene algC, que codifica para a actividade
de fosfoglucomutase/ fosfomanomutase, é esperado o fenómeno de complementação
heteróloga através da reposição do fenótipo mucoso.
A conjugação triparental prevê que exista contacto directo entre as células
envolvidas, neste caso um dador (Escherichia Coli), um receptor (Pseudomonas
aeruginosa) e um ajudante, de modo a que os plasmídeos sejam transferidos de uma
estirpe para outra.
Todo este processo é possível graças à mobilização dos plasmídeos, bem como à
síntese de estruturas auxiliares que possibilitam o contacto directo, sendo estas
propriedades concedidas, respectivamente, pelo gene mob e tra.
Os plasmídeos inerentes a esta actividade (pMMB66(HE), o pLC100 e o ppNZ49)
apresentam o gene que lhes confere mobilidade (mob), mas não são autotransmissíveis,
isto é, não possuem o gene tra, sendo assim necessário recorrer a um plasmídeo ajudante,
plasmídeo esse que se encontra na bactéria Escherichia Coli e que media a transferência de
plasmídeos mobilizáveis por conjugação. O plasmídeo referido é denominado pRK2013.
Acerca da técnica acima descrita, é importante referir que Escherichia Coli não
cresce em meio PIA, e que a Pseudomonas aeruginosa tem uma resistência inerente à
ampicilina. Deste modo, as culturas serão criadas num meio que contém carbenicilina de
maneira a selecionar os transconjugantes de Pseudomonas aeruginosa que contêm os
plasmídeos de interesse.
Serão também adicionados antibióticos aos vários meios de cultura que se irão
preparar, de modo a observar e selecionar as estirpes que conseguiram efectuar a
conjugação de maneira satisfatória.
Documento realizado por:
Ricardo Ferreira 69407
Guilherme Freches 69569
João Belo 69606
Para a disciplina de Engenharia Genética no ano lectivo de 2012/2012
2