Biologia Molecular

Biologia Molecular
Grupo: Bárbara Ávila, Luciana Rabello, Marina Ferreira, Rafael Almeida.
1. a)
5’ _________________________________________________________________
ATGTTAGGGCAATGCTAGCGACCAGTTACGCCATTG
CGATGA
____________________________________________________________________
TATACCGCTAGTAGGGTACCCGATAAATGCGCATACGC
CAATTA
_______________________________________________________________
G C C A A T G C A C C T A G A C A T G C T A A C G C C C A T C T A G 3’
b) 5’ ATGTTAGGGCAATGCTAGCG 3’
2. 5’ CTAGATGGGCGTTAGCATGT 3’
- Construir uma seqüência que não forme estruturas em forma de grampo (isso
aconteceria caso o nucleotídeo de uma extremidade pareasse com o da outra
extremidade).
- Um primer não pode ser complementar a outro, caso contrário, haverá a possibilidade
de eles se parearem.
3. Primers, dNTPs, Taq DNA polimerase, tampão com Mg+2, H20
4. Um desoxinucleotidio trifosfato com o fosfato alfa radioativo (pois este na será
clivado) pode ser utilizado, sendo o mais comum o dCTP:
O fosfato vermelho é o alfa.
5. Para clonar o fragmento amplificado pela PCR no sitio de enzima de restrição EcoRi
de um plasmidio, utiliza-se o adaptador GATTC. Incuba-se o adaptador com ligase e o
primer ficará apropriado para a clonagem.
6. Inseriria um plasmídeo na levedura.
Selecionam-se plasmídeos com 2 origens de replicação, uma reconhecida por leveduras,
e uma reconhecida por bactérias. Cultivam-se essas bactérias, pois sua taxa de
crescimento é exponencial, o que permite obtenção de grande quantidade desse DNA,
que será posteriormente, introduzido na levedura.
Um exemplo de seleção dessas bactérias é o caso da enzima β-galactosidase: através de
técnicas da engenharia genética, adicionou-se a um plasmídeo o gene Lac-Z, que produz
a enzima β-galactosidase. Este é o plasmídeo de interesse neste caso.
Para inserir um inserto (fragmento de DNA que não pertence ao plasmídeo) no
plasmídeo, primeiro corta-se o plasmídeo com uma enzima de restrição “x”, e utiliza-se
a mesma enzima para cortar o inserto que se pretende introduzir. Dessa forma, o
plasmídeo e o inserto irão possuir extremidades coesivas, ou seja, com fragmentos de
DNA que são complementares, e uma vez juntos, se complementarão.
Mas o sítio de restrição da enzima utilizada para cortar o plasmídeo se localiza
exatamente na região onde está o gene que codifica a β-galactosidase. Então, ao se
cortar o plasmídeo para introdução do inserto, o gene que expressa a enzima em questão
é destruído.
Portanto:
* Bactérias que não contém o plasmídeo com inserto: em presença do composto X-gal,
produzem colônias azuis, pois a β-galactosidase quebra o composto, obtendo como
subproduto, uma molécula de coloração azul.
* Bactérias que contém o plasmídeo com o inserto: em presença do composto X-gal,
ficam brancas, pois não quebram este composto.
Assim, selecionam-se apenas as bactérias brancas, pois são as que possuem o plasmídeo
de interesse para ser inserido numa levedura.
7. Alem dos reagentes utilizados na PCR normalmente (Primers, dNTPs, Taq DNA
polimerase, tampão com Mg+2, H20) é necessário utilizar também didesoxinucleotideos
(ddNTPs) que não apresentam Hidrolixa (OH) na extremidade 3`. Assim a
polimerização do DNA será interrompida diversas vezes, produzindo varias moléculas
com tamanhso diferentes. Após esse processo, realiza-se uma eletroforese para
determinar a seqüência do fragmento de acordo com o tamanho das diversas moléculas
produzidas.