uso da pcr como diagnóstico diferencial das - evz - ppgca

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
USO DA PCR COMO DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DAS
PRINCIPAIS ENCEFALITES VIRAIS DE BOVINOS
Danilo Rezende e Silva
Orientador: Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo
GOIÂNIA
2012
ii
DANILO REZENDE E SILVA
USO DA PCR COMO DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DAS
PRINCIPAIS ENCEFALITES VIRAIS DE BOVINOS
Seminário apresentado junto à Disciplina
Seminários Aplicados do Programa de PósGraduação em Ciência Animal da Escola
de Veterinária e Zootecnia da Universidade
Federal de Goiás. Nível: Mestrado
Área de concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Linha de Pesquisa:
Patobiologia animal, experimental e comparada
Orientador:
Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo - EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Guido F. Coelho Linhares - EVZ/UFG
Prof. Dr. Paulo Henrique Jorge da Cunha – EVZ/UFG
GOIÂNIA
2012
iii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 2
2.1 Tipos de PCR .................................................................................................. 2
2.1.1 PCR convencional ......................................................................................... 2
2.1.2 Multiplex PCR ................................................................................................ 3
2.1.3 Transcrição reversa da PCR (RT-PCR) ........................................................ 4
2.1.4 Nested PCR (nPCR)...................................................................................... 4
2.1.5 PCR em tempo real (qPCR) .......................................................................... 4
2.2 Principais encefalites virais em bovinos ...................................................... 5
2.2.1 Raiva ............................................................................................................. 5
2.2.2 Meningoencefalite por herpesvírus bovino tipo-5 .......................................... 7
2.2.3 Febre catarral maligna................................................................................. 11
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 14
REFERÊNCIAS .................................................................................................... 15
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Eventos
que
ocorrem
durante
a
PCR,
nas
diferentes
3
temperaturas de cada etapa. Primeiro passo, desnaturação da
fita de DNA molde. Segundo passo, anelamento dos primers
selecionados, com as fitas do DNA. Terceiro passo, a enzima
Taq
polimerase,
promovendo
a
que
extensão
adiciona
da
fita.
nucleotídeos
Fonte:
(dNTP),
Adaptado
de
http://www.nlv.ch
Figura 2
Imagem de gel de agarose a 1,5% demonstrando PCR, animal 11
positivo para BoHV-5. O resultado da amplificação em amostras
extraídas de blocos de parafina do encéfalo de bovinos para o
gene que codifica a gC do BoHV-5 (159 pb). M = marcador de
100 pb (Low Ranger DNA Ladder - Norgen Biotek Corporation);
+ = controle positivo; 1 = Bulbo olfatório esquerdo; 2 = Bulbo
olfatório direito; 3 = Córtex frontal esquerdo; ‒ = controle
negativo. Fonte: CAGNINI, D. Q (2011).
Figura 3
Imagem de gel de agarose, nested PCR de amostras teciduais 13
de um bovino com febre catarral maligna no Estado do Mato
Grosso. M= marcador de peso molecular (100 base-pair Ladder);
N= controle negativo; 1= amostras positivas, DNA de OHV-2, de
fragmentos do baço; 2= amostras positivas, DNA de OHV-2, de
fragmentos do gânglio trigêmeo. Fonte: MENDONÇA et al.
(2008).
v
LISTA DE ABREVIATURAS
BoHV-1
Herpesvírus bovino tipo-1
BoHV-5
Herpesvírus bovino tipo-5
DICT
Dose infectante em cultivo tecidual
FCM
Febre catarral maligna
IC
Inoculação em camundongos
IFD
Imunofluorescência direta
IHQ
Imunoistoquímica
IV
Isolamento viral
LCR
Líquido cefalorraquidiano
nPCR
Nested PCR
OHV-2
Herpesvírus ovino-2
PCR
Reação em cadeia da polimerase
qPCR
PCR em tempo real
RT-PCR
Transcrição reversa da Reação em cadeia da polimerase
SNC
Sistema Nervoso Central
1 INTRODUÇÃO
As enfermidades virais que acometem o sistema nervoso central (SNC)
dos animais de produção são relativamente frequentes e devem ser consideradas
no diagnóstico diferencial das encefalopatias. As doenças virais do SNC (raiva,
meningoencefalite herpética e febre catarral maligna) possuem tratamento
limitado e alta letalidade (CALLAN & VAN METRE, 2004).
A raiva é a encefalopatia de maior ocorrência no Brasil e possui
destaque por ser uma zoonose (BRASÍLIA, 2005). A meningoencefalite causada
pelo herpesvírus bovino tipo-5 (BoHV-5) é a segunda causa mais frequente de
encefalite viral em bovinos no Sul do Brasil (SANCHES et al., 2000) e no CentroOeste (LEMOS, 2005). A febre catarral maligna (FCM) tem sido frequentemente
diagnosticada no Mato Grosso (MENDONÇA et al., 2008), Paraíba (MACÊDO et
al., 2007) e Rio Grande do Sul (RECH et al., 2005).
O diagnóstico molecular é uma ferramenta importante porque detecta o
agente etiológico de forma rápida e eficaz das principais doenças infecciosas dos
animais com sintomatologia clínica (YANG & ROTHMAN, 2004). Diversas
técnicas moleculares têm sido empregadas objetivando o estabelecimento dos
agentes virais das encefalopatias nos bovinos, tais como, reação em cadeia da
polimerase (PCR) (VOGEL et al., 2003; LUVIZOTTO et al., 2010; FAIZEE et al.,
2012), análise de restrição genômica (MEYER et al., 2001; D'ARCE et al., 2002) e
a hibridização in situ (PEREZ et al., 2003).
O diagnóstico das encefalites virais de bovinos pode ser feito
associando-se os dados epidemiológicos, os sinais clínicos e os resultados dos
exames laboratoriais ante-mortem e post-mortem (COLODEL et al., 2002; ELIAS
et al., 2004, RISSI et al., 2006). Porém, a semelhança clínica das encefalopatias
de origem viral tem exigido do médico veterinário a utilização de exames
laboratoriais, mais específicos e sensíveis, para detecção dos agentes etiológicos
como a reação em cadeia da polimerase (PCR).
Esse seminário tem o objetivo de realizar uma revisão dos tipos de
PCR aplicáveis ao diagnóstico diferencial das principais enfermidades virais que
acometem o SNC de bovinos.
2
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Tipos de PCR
2.1.1 PCR convencional
A informação armazenada no DNA é organizada em pequenas
unidades, denominadas genes, que controlam as características identificáveis de
um organismo. As moléculas DNA (ácido desoxirribonucleico) e RNA (ácido
ribonucleico) são formadas por polímeros, constituídos por uma base nitrogenada,
um açúcar e um grupo fosfato. As bases nitrogenadas são: adenina (A), guanina
(G), citosina (C), timina (T) e uracila (U), sendo que a base timina é encontrada,
somente, na molécula de DNA e a base uracila, na molécula de RNA. O DNA é
formado pelo açúcar desoxirribose e o RNA pela ribose (LODISH et al., 2004).
A PCR é um método in vitro de replicação específica da sequência do
DNA na região alvo que caracteriza molecularmente o agente. A reação ocorre
em três fases distintas: desnaturação do DNA extraído, anelamento dos primers e
extensão da fita (CRISAN & MATTSON, 1993; EVANS, 2009).
A extração do DNA pode ser realizada pela técnica do fenol-cloroformio
ou utilizando-se kits comerciais específicos para cada tipo de amostra. Em
microtubos
são
adicionados
a
enzima
Taq
DNA
polimerase,
o
desoxirribonucleotídeo fosfatado (dNTP), o cloreto de magnésio (MgCl2), os
primers “forward” e “reverse” (oligonucleotídeos iniciadores da reação) e a
amostra (DNA extraído). Os microtubos são colocados no termociclador e
mantidos a temperatura de 95ºC objetivando a desnaturação da fita dupla do DNA
extraído (Figura 1). Na fase seguinte ocorre o anelamento de cada primer com as
duas fitas do DNA, em uma temperatura entre 55ºC e 65ºC. Por último, a enzima
Taq DNA polimerase promove a extensão dos primers que irão se ligar nos
nucleotídeos da fita de DNA produzindo uma nova cópia (amplicon). Após vários
ciclos, serão criadas várias cópias do DNA alvo. Depois da amplificação, é
realizada a eletroforese das amostras em gel de agarose e a partir do peso
molecular do amplicon é possível especificar o agente etiológico (BARTLETT &
STIRLING, 2003).
3
FIGURA 1 – Os diferentes passos que ocorrem durante a
PCR, nas diferentes temperaturas de cada
etapa. Primeiro passo, desnaturação da fita de
DNA molde. Segundo passo, anelamento dos
primers selecionados, com as fitas do DNA.
Terceiro passo, a enzima Taq polimerase, que
adiciona nucleotídeos (dNTP), promovendo a
extensão da fita.
Fonte: Adaptado de http://www.nlv.ch
2.1.2 Multiplex PCR
Na técnica de multiplex PCR ocorre amplificação simultânea de mais
de um DNA alvo de diferentes agentes. Isso acontece, com a utilização de
múltiplos pares de primers em uma única reação. Nesse método, cada par de
primer gera produtos com tamanhos diferentes (amplicon), que são diferenciados
na eletroforese. A desvantagem desta técnica é que, quando se utiliza mais de
quatro diferentes primers em uma única reação, ocorre uma diminuição da
sensibilidade e especificidade da reação, podendo gerar dificuldades na
interpretação dos resultados (EVANS, 2009).
4
2.1.3 Transcrição reversa da PCR (RT-PCR)
A transcrição reversa da PCR ou RT-PCR é uma técnica molecular
utilizada quando o agente possui RNA no genoma. Na primeira etapa da RT-PCR
ocorre a conversão do RNA extraído em uma fita simples complementar de DNA
(cDNA) porque a Taq DNA polimerase necessita de uma molécula de DNA como
substrato. Assim, a conversão é realizada por meio da enzima transcriptase
reversa, a qual substitui a base uracila do RNA por uma base timina. Concluída
essa etapa inicial, a sequência de cDNA é utilizada para proceder os demais
passos de uma PCR convencional com os primers específicos (EVANS, 2009).
2.1.4 Nested PCR (nPCR)
A técnica de Nested PCR é uma técnica da PCR convencional
modificada. O amplicon obtido da PCR convencional é utilizado como amostra em
uma segunda PCR, caracterizando a Nested PCR. Esse método promove o
aumento da sensibilidade e especificidade da PCR, porém pode proporcionar
altos índices de reação cruzada (BARTLETT & STIRLING, 2003).
2.1.5 PCR em tempo real (qPCR)
A PCR em tempo real (qPCR) utiliza termociclador especializado
acoplado a um computador com programa específico. No termociclador, a cada
ciclo são gerados sinais fluorescentes, que são demonstrados em gráficos. A
quantificação, das moléculas de DNA, pode ser realizada em todos os ciclos da
reação. Esse método possui o mesmo princípio da PCR convencional, porém
necessita utilizar um fluoróforo. Os dois tipos de fluoróforos empregados são
SYBR (SyberGreen) e Sondas TaqMan, os quais possuem a capacidade de se
ligar à molécula de DNA e liberar fluorescência, que é captada pelo laser do
termociclador. A eficácia da qPCR aproxima-se de 100%, por ser a mais sensível
e específica dentre as variações da PCR (EVANS, 2009).
5
2.2 Principais encefalites virais em bovinos
2.2.1 Raiva
A raiva é causada por um vírus RNA, envelopado, da ordem
Mononegavirales, família Rhabdoviridae e gênero Lyssavirus, e o vírus possui alto
potencial neurotrópico (WOLDEHIWET, 2002; SWANEPOEL, 2004; CONSALES
& BOLZAN, 2007).
A identificação laboratorial do vírus da raiva é realizada por métodos
auxiliares de diagnóstico, como a imunofluorescência direta (IFD) e a
imunoistoquímica (IHQ). A técnica de IFD é a mais utilizada e recomendada para
o diagnóstico da raiva pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
(SANTOS et al., 2006; PEDROSO, 2008; TEIXEIRA et al., 2008; STEIN et al.,
2010; FAIZEE et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2012).
A PCR também pode ser utilizada para identificar o vírus da raiva e,
devido ao fato do material genético desse agente ser constituído por RNA, o tipo
de PCR mais empregado nessa enfermidade é a RT-PCR (CISTERNA et al.,
2005; ROJAS et al., 2006; ARAÚJO et al., 2008). Esse método é usado para
identificação viral em amostras em decomposição, de arquivos e para diferenciar
e comparar técnicas de diagnóstico (DAVID et al., 2002; BISWAL et al., 2007;
ARAUJO et al., 2008; WACHARAPLUESADEE et al., 2011; FAIZEE et al., 2012;
YANG et al., 2012).
Estudos de DAVID et al. (2002) relataram que em amostras
degradadas de até 36 dias à temperatura de 37ºC, a sensibilidade de detecção da
RT-PCR foi maior quando comparada às técnicas de imunofluorescência direta e
inoculação intracerebral. Vários outros autores compararam os resultados da RTPCR com a imunofluorescência direta em amostras em decomposição, avaliando
a queda de sensibilidade relacionada com o tempo de deterioração do tecido
cerebral (KAMOLVARIN et al., 1993; HEATON,1997; WHITBY et al., 1997).
BISWAL et al. (2007) utilizaram seis amostras de casos positivos para
raiva pela IFD e oito amostras negativas, tanto na IFD como na inoculação em
camundongos (IC). As amostras foram armazenadas a -20ºC, por cinco anos, em
solução salina de glicerol. Após realizarem a RT-PCR, identificaram RNA viral nas
6
seis amostras que foram positivas pela IFD. Porém, não foi amplificado RNA nas
amostras que foram negativas na IFD e na IC.
ARAUJO et al. (2008) analisaram 151 amostras do SNC de bovinos e
equinos. Estas amostras foram previamente submetidas ao diagnóstico, para
raiva, pela IFD. As amostras foram mantidas entre 20ºC e 30ºC por 72 horas e,
em seguida, foram submetidas às técnicas de RT-PCR e nested RT-PCR. Nas 48
amostras, que estavam em decomposição, 17 foram positivas pela RT-PCR e 36
positivas pela nested RT-PCR. Porém, nas 101 amostras, que foram negativas
pela IFD, não foi amplificado o RNA viral, tanto pela RT-PCR como nested RTPCR.
FAIZEE et al. (2012) analisaram 29 amostras do SNC, de várias
espécies
animais,
comparando
as
técnicas
de
IFD,
histopatologia,
imunoistoquímica (IHQ) e RT-PCR. Dentre os cinco casos de bovinos, três
tiveram identificação do RNA viral pela RT-PCR (Quadro 1). Os mesmos três
casos tiveram lesões histopatológicas indicativas de raiva. Os resultados da
técnica de IHQ indicaram dois bovinos positivos e, pela IFD, apenas um foi
positivo, sendo que os outros dois casos não foram avaliados por esta técnica.
QUADRO 1 – Resultados de cinco amostras do SNC de bovinos, submetidas a
quatro diferentes métodos de diagnóstico (IFD, histopatologia, IHQ
e RT-PCR), para o vírus da raiva.
IFD
Histopatologia
IHQ
RT-PCR
Bovino 1
Positivo
Discretos
Negativo
Negativo
Bovino 2
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Bovino 3
Não
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
avaliadas
Bovino 4
Não
avaliadas
Bovino 5
Positivo
IFD= imunofluorescência direta; IHQ= imunoistoquímica; RT-PCR= transcrição reversa da
reação em cadeia da polimerase.
Fonte: Adaptado de FAIZEE et al. (2012).
7
YANG et al. (2012) compararam quatro diferentes técnicas de
diagnóstico para raiva: IFD, isolamento viral (IV), RT-PCR e um kit comercial de
ensaio imunológico (RIDA). Os pesquisadores utilizaram 110 amostras do SNC,
sendo 84 de bovinos, 14 de guaxinim e 12 de cães. Pelos métodos de IFD, IV e
RT-PCR, 20 amostras foram positivas e 90 negativas. Já pelo Kit RIDA, 19
amostras foram positivas. A sensibilidade e especificidade do RT-PCR foi de
100%.
2.2.2 Meningoencefalite por herpesvírus bovino tipo-5
A meningoencefalite por BoHV-5 é uma doença infecto-contagiosa,
aguda ou subaguda, que afeta principalmente o SNC de bovinos jovens e, na
maioria dos casos, é fatal. O BoHV-5 é classificado na família Hespesviridae e
sub-família Alphaherpesvirinae. Os vírus agrupados nessa sub-família possuem
DNA linear de fita dupla e envelope glicoprotéico (ROIZMANN et al., 1992).
O diagnóstico de meningoencefalite por BoHV-5 pode ser feito com
base nos achados epidemiológicos, clínicos, de necropsia e histopatológicos
(RISSI et al., 2006). As técnicas confirmatórias incluem o isolamento do vírus do
encéfalo ou de secreções nasais (D´OFFAY et al., 1995), identificação do agente
por anticorpos monoclonais (SOUZA et al., 2002; OLDONI et al., 2004), a
imunoistoquímica (HÜBNER et al., 2005; STEIN et al., 2010), técnicas
moleculares, como a PCR convencional (VOGEL et al., 2003; CAMPOS et al.,
2009; ISERNHAGEN et al., 2011; CARDOSO et al., 2012); multiplex PCR
(CLAUS et al., 2005; DIALLO et al., 2011; FONSECA JR et al., 2011) e Nested
PCR (DIEL et al., 2007).
VOGEL et al. (2003) inocularam experimentalmente o BoHV-5 em 20
bovinos divididos em três grupos. O grupo A era composto por quatro bovinos que
foram eutanasiados 55 dias pós-inoculação (p.i.). O grupo B foi constituído por
oito animais que receberam dexametasona e sacrificados 50 dias após reativação
viral. O grupo C foi composto por oito animais que receberam placebo (grupo
controle). A PCR convencional foi realizada de amostras do SNC dos bovinos
dos grupos A, B e C. Nas amostras encefálicas, do grupo B, dos lobos frontais e
parietais foram identificadas maiores quantidades de amostras positivas quando
8
comparadas ao grupo A, com isso nos animais que são submetidos a reativação
viral por dexametasona podem ser encontradas maiores quantidades de DNA
viral. Os autores não identificaram amostras positivas no grupo controle. Os
autores concluíram que existe relação entre a propagação do vírus após a
reativação e a quantidade de tecidos positivos pela PCR.
A utilização da PCR convencional também tem sido estudada em
amostras do SNC de bovinos provenientes de frigoríficos. CAMPOS et al. (2009)
coletaram 400 amostras de gânglio trigêmeo, em frigoríficos no Estado do Rio
Grande do Sul. As amostras foram submetidas à técnica de PCR para BoHV-5. O
DNA viral foi identificado em 299 amostras (74,8%), sendo que 82 amostras foram
negativas (20,5%) e 19 foram inconclusivas (4,7%).
CUNHA (2010) inocularam seis bezerros com o BoHV-5 pela via
intranasal com instilação de 0,5mL do inóculo em cada narina, totalizando uma
dose viral de 107,2 DICT50 (dose infectante em cultivo tecidual). Durante os 30 dias
de pós inoculação (p.i.) experimental, exames clínicos (temperatura retal,
frequência cardíaca e respiratória e motricidade ruminal) e laboratoriais
(hemograma, fibrinogênio plasmático e proteína total, pH fluido ruminal,
concentração do sulfeto de hidrogênio ruminal, líquido cerebrospinal e
histopatológico) foram realizados. A presença do vírus foi investigada em seis
porções do encéfalo, no gânglio do trigêmeo e no líquido cefalorraquidiano (LCR)
pela PCR. Um bezerro apresentou sinais neurológicos começando no 12º dia,
vindo a óbito após seis horas. Os outros cinco bezerros permaneceram
assintomáticos e foram eutanasiados no final do período experimental. O DNA
viral do BoHV-5 foi identificado em várias porções do encéfalo e nos gânglios do
trigêmeo e no LCR do bezerro no momento que apresentou encefalopatia.
Microscopicamente observaram-se necrose cerebrocortical, encefalite e meningite
não
supurativa.
A
infecção
experimental
com
BoHV-5
ocasionou
polioencefalomalacia nos bezerros, podendo ser assintomática.
ISERNHAGEN et al. (2011) analisaram experimentalmente a infecção
por BoHV-5 em sete bovinos. Os animais foram inoculados com o vírus BoHV-5 e,
após 30 dias da infecção, foram submetidos a necropsia. Diversas porções do
SNC foram coletadas e analisadas pelo método da PCR convencional. As
amostras dos animais, com sintomatologia clínica, foram positivas no córtex
9
frontal e occipital. Apenas em dois casos com sinais clínicos, foi identificado DNA
viral no cerebelo.
O método da PCR multiplex tem sido utilizado para diferenciar os tipos
de herpesvírus em bovinos, tipo 1 e 5. CLAUS et al. (2005) coletaram 14
amostras do SNC de bovinos, sendo sete de animais com sinais neurológicos e
sete de animais provenientes de frigoríficos. As 14 amostras foram submetidas à
IFD, cujo resultado foi negativo para raiva. Ao realizar a técnica de mutiplex PCR
para BoHV-5 e BoHV-1 foram identificadas três amostras positivas para BoHV-5
nos animais que tinham sinais de encefalite. Não foi amplificado DNA de BoHV-1
e BoHV-5 em nenhuma amostra proveniente dos frigoríficos.
DIALLO et al. (2011) compararam as técnicas da multiplex qPCR e
multiplex PCR em 13 amostras (swab nasal, traqueia, pulmão, SNC e sêmen)
para BoHV-1 e BoHV-5. Na multiplex PCR identificaram 11 amostras positivas
para BoHV-1 e todas amostras foram negativas para BoHV-5. No método de
multiplex qPCR, 13 amostras foram positivas para BoHV-1 e duas (sêmen e SNC)
positivas para BoHV-5.
O método de multiplex PCR também pode ser utilizado para detecção
de agentes virais em diferentes espécies. FONSECA JR et al. (2011) utilizaram 65
amostras de encéfalo de bovinos, 35 amostras de encéfalo de suínos e quatro
amostras de encéfalo de ovinos. Conforme apresentado no Quadro 2, das 65
amostras de encéfalo de bovinos, 10 foram positivas para BoHV-5, uma para
BoHV-1 e cinco para OHV-2.
QUADRO 2 – Resultados obtidos pela multiplex PCR, para detecção de BoHV-1,
BoHV-5, OHV-2 e SHV-2, a partir de amostras de encéfalos.
Amostra
Total
Positiva
Negativa
BoHV-1
BoHV-5
OHV-2
SHV-1
Encéfalo bovino
65
1
10
5
0
49
Encéfalo ovino
4
0
0
3
0
1
Encéfalo suíno
35
0
0
0
25
10
BoHV-1= herpesvírus bovino tipo-1; BoHV-5= herpesvírus bovino tipo-5; OHV-2=
herpesvírus ovino-2; SHV-1= herpesvírus suídeo-1
Fonte: Adaptado de FONSECA JR et al. (2011).
10
A técnica de PCR também permite a identificação de DNA viral em
amostras fixadas em formol e emblocadas em parafina. FERRARI et al. (2007)
analisaram, dos arquivos de patologia, 20 blocos de fragmentos de encéfalos
bovinos com histórico clínico de encefalite referente aos anos de 2004 a 2006. Os
pesquisadores procederam a técnica da PCR e identificaram DNA viral em 15
amostras, onde foram identificados no gel (eletroforese) fragmentos com tamanho
de 159pb, correspondentes à glicoproteína C do BoHV-5. Em cinco amostras não
foram identificados DNA viral.
ARRUDA et al. (2010) analisaram 76 encéfalos bovinos com doença
neurológica emblocadas em parafina. As amostras foram separadas em um grupo
com lesões histológicas de meningoencefalite necrosante não-supurativa (grupo
1) e amostras com meningoencefalite inespecífica (grupo 2). O material
emblocado foi submetido à PCR para detecção de BoHV-1 e BoHV-5. Não foi
detectado DNA de BoHV-1 em nenhuma das amostras de ambos os grupos. No
entanto, no grupo 1 foram detectadas 16 (40%) amostras positivas para DNA de
BoHV-5 e, no grupo 2, foram encontradas 12 (33,3%) amostras positivas.
CAGNINI (2011) analisou 18 áreas dos encéfalos, emblocados em
parafina, de seis bezerros inoculados experimentalmente com BoHV-5, utilizando
a técnica de PCR convencional. O autor comparou as regiões dorsais e cranias,
com as demais regiões (diencéfalo, tronco encefálico, cerebelo e medula
cervical), encontrando maior quantidade de áreas positivas nas regiões dorsal e
cranial dos encéfalos. No total, foram 108 áreas analisadas, sendo que 38
(35,19%) foram positivas para o DNA de BoHV-5 (Figura 2).
11
FIGURA 2 – Imagem de gel de agarose a 1,5%
demonstrando PCR, animal positivo para BoHV-5.
O resultado da amplificação em amostras extraídas
de blocos de parafina do encéfalo de bovinos para
o gene que codifica a gC do BoHV-5 (159 pb). M =
marcador de 100 pb (Low Ranger DNA Ladder Norgen Biotek Corporation); + = controle positivo; 1
= Bulbo olfatório esquerdo; 2 = Bulbo olfatório
direito; 3 = Córtex frontal esquerdo; ‒ = controle
negativo.
Fonte: CAGNINI (2011).
2.2.3 Febre catarral maligna
A febre catarral maligna (FCM) é uma doença infecciosa viral,
pansistêmica, fatal, com distribuição geográfica ampla. O “grupo de vírus” da FCM
possui fita dupla de DNA e pertence ao gênero Rhadinovirus da família
Gammaherpesvirinae (COULTER et al., 2001; GARMATZ et al., 2004). Foram
identificados quatro vírus que causam FCM em animais. A forma africana (FCM
gnu-associada) é induzida pela cepa alcelaphine herpesvírus 1 (AHV-1). Em
locais onde não há gnus, ocorre a forma FCM ovino-associada, pois os ovinos
são portadores do herpesvírus ovino-2 (OHV-2), sendo observada em ovinos e
bovinos (LI et al., 2000; CRAWFORD et al., 2002; LI et al., 2003).
12
Os sinais clínicos e as alterações anatomopatológicas são indicativos
para o diagnóstico da FCM, porém, métodos auxiliares são necessários para
detecção do agente etiológico, como a técnica da PCR (GARMATZ et al., 2004;
MENDONÇA et al., 2008; LUVIZOTTO et al., 2010; FONSECA JR et al., 2011;
ABABNEH et al., 2012). MULLER-DOBLIES et al. (1998) realizaram um estudo
retrospectivo, entre 1995 e 1996, onde foram analisadas amostras sanguíneas, de
44 casos espontâneos de FCM em bovinos. O material foi submetido à técnica de
Nested PCR, identificando DNA de OHV-2 em 39 (88%) amostras sanguíneas.
A detecção do OHV-2, em bovinos, tem sido feita de forma
experimental e em casos naturais. GARMATZ et al. (2004) estudaram a FCM em
bovinos infectados naturalmente e em cinco animais, cujo OHV-2 foi inoculado
experimentalmente. Amostras do encéfalo, rim, bexiga, fígado, linfonodos e rete
mirable carotídea foram coletadas e submetidas à Nested PCR. Dos 14 bovinos
com alterações clinicopatológicas, 10 (71,42%) foram positivos para OHV-2 pela
técnica de Nested PCR. Em relação aos casos experimentais, somente amostras
de dois animais foram positivas para OHV-2.
MENDONÇA et al. (2008) analisaram quatro casos espontâneos de
FCM em bovinos no Estado do Mato Grosso. Após realizarem exame
necroscópico, os pesquisadores coletaram amostras do SNC e realizaram a
Nested PCR. Os resultados indicaram amplificação (231pb) de DNA para OHV-2
(Figura 3) em todas as amostras dos quatro casos estudados.
FONSECA JR et al. (2011) avaliaram 65 amostras de encéfalo bovino
com sinais neurológicos e em amostras negativas para raiva por meio da técnica
de multiplex PCR para BoHV-1, BoHV-5, OHV-2 e SHV-2. Os resultados
indicaram reações positivas para DNA de OHV-2.
O diagnóstico da FCM foi realizado em amostras provenientes de
frigoríficos, por meio da PCR por KOJOURI et al. (2009). Durante o periodo
experimental amostras de linfonodos e baço de 68 bovinos e 82 ovinos originários
foram submetidas à técnica de PCR. O método DNA viral de OHV-2 em 20 (29%)
amostras de bovinos e 9 (11%) amostras de ovinos.
13
FIGURA 3 – Imagem de gel de agarose, Nested PCR de
amostras teciduais de um bovino com febre
catarral maligna no Estado do Mato Grosso.
M= marcador de peso molecular (100 basepair Ladder); N= controle negativo; 1=
amostras positivas, DNA de OHV-2, de
fragmentos do baço; 2= amostras positivas,
DNA de OHV-2, de fragmentos do gânglio
trigêmeo.
Fonte: MENDONÇA et al. (2008).
ABABNEH et al. (2012) realizaram Nested PCR em diversas amostras
sanguíneas e teciduais (fígado, baço, linfonodos, rim e SNC) de 14 bovinos com
suspeita de FCM. Nas amostras sanguíneas não foi amplificado DNA viral de
OHV-2, mas em duas amostras de linfonodos e uma do baço foram detectados
DNA para OHV-2.
A identificação do vírus também pode ser feita, pela PCR, em material
emblocado em parafina. CRAWFORD et al. (1999) relataram que em 20 animais
saudáveis, sem lesões histológicas, não foram identificadas amostras positivas
para OHV-2 pela técnica da PCR. Entretanto, em 37 bovinos com resultados
indicativos de FCM, pelo exame clínico e pelas lesões histopatológicas, houve
identificação do DNA viral em 34 (92%) amostras, pela técnica da PCR.
14
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O diagnóstico diferencial das enfermidades virais do SNC necessita de
métodos laboratoriais porque somente os dados epidemiológicos e os exames
clínicos não permitem a identificação do agente etiológico envolvido. A
compreensão do que coletar, como armazenar e qual a técnica a ser realizada, é
de suma importância para o médico veterinário.
Os médicos veterinários, no Estado de Goiás, necessitam de apoio
laboratorial para o diagnóstico dessas doenças, principalmente porque envolvem
questões de saúde pública. A técnica da PCR, para o diagnóstico das encefalites
virais de bovinos ainda é realizada por poucos laboratórios.
Os laboratórios de patologia animal podem adotar a técnica de PCR,
como uma ferramenta auxiliar no diagnóstico das principais enfermidades
infecciosas, principalmente em amostras fixadas em formol e emblocadas em
parafina. A associação dos resultados dos exames anatomopatológicos com a
detecção dos agentes pela PCR melhora a qualidade do diagnóstico. Entretanto,
é importante salientar que nenhuma técnica laboratorial é eficiente sem
correlacionar com os dados epidemiológicos e os exames clínicos.
As técnicas moleculares
são um desafio
para
estudantes e
profissionais da medicina veterinária. Esses métodos são poucos explorados nos
cursos de graduação e poucos profissionais dedicam-se ao estudo e
compreensão dessas técnicas.
No ano de 2009 o MAPA decretou uma instrução normativa de número
34, que estabelece os procedimentos de vigilância agropecuária nas exportações
de produtos de origem animal. A identificação desses agentes virais em rebanhos
bovinos é essencial, pois o Serviço de Inspeção Federal (SIF) realiza fiscalização,
inspeção e controle da sanidade do rebanho, bem como da produção de carne,
especialmente nas propriedades exportadoras de carne bovina.
15
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