A atividade das enzimas e o seu controlo na regulação do fluxo das

A atividade das enzimas e o seu controlo na regulação do fluxo
das vias metabólicas
Índice
1.
A atividade das enzimas cujas reações são fisiologicamente reversíveis é controlada pelas concentrações dos
seus reagentes e produtos
1
2. A atividade das enzimas cujas reações são fisiologicamente irreversíveis é controlada por efetores que podem
não ser os reagentes e os produtos da reação em que são catalisadores
2
3. A atividade enzímica aumenta proporcionalmente com a quantidade de enzima
2
4. A modulação da atividade das enzimas pode ser feita por substâncias que se ligam, de forma não covalente e
reversível, ao centro ativo ou a um centro alostérico
4
5. A existência nas células de atividade simultânea em enzimas que têm papéis biológicos opostos levou à
cunhagem da expressão “ciclos fúteis” que uma análise mais atenta mostrou ser inadequada
6
6. A regulação da atividade das enzimas pode envolver modificações de tipo covalente catalisadas por outras
enzimas
7
7. A atividade das enzimas pode ser afetada pela concentração do substrato na sua vizinhança podendo esta
depender da atividade de transportadores ou de enzimas que afetam o transporte transmembranar
8
8. O pH tem um papel menor na regulação do metabolismo normal
10
9. A temperatura tem, no homem, um papel menor na regulação do metabolismo normal
10
10. A atividade das enzimas pode ser afetada por múltiplos fatores numa teia de interferências muito complexa
11
11. Anexos
12
1.1 Exemplo de estudo do efeito de uma hormona na atividade de uma enzima cuja síntese é reprimida
12
1.2 A fosforilação/desfosforilação de uma proteína com atividade catalítica pode alterar não só a velocidade da
catálise como a própria natureza da reação catalisada
13
1.3 O controlo da oxidação dos ácidos gordos
14
12. Bibliografia
15
1. A atividade das enzimas cujas reações são fisiologicamente reversíveis é controlada pelas
concentrações dos seus reagentes e produtos
Numa determinada via metabólica há enzimas cuja atividade é tão elevada que as reações por elas
catalisadas se encontram próximas do equilíbrio químico (ΔG≈0; Keq/QR≈1; constante de equilíbrio/quociente
de reação ≈1), ou seja, as velocidades das reações direta e inversa, embora com sinais contrários, têm valor
absoluto parecido. Nestas enzimas, quer o sentido em que a reação se desenvolve, quer a velocidade efetiva
da reação são controladas por variações no valor do QR, ou seja, pelo valor das concentrações dos reagentes e
produtos na vizinhança da enzima. Estas enzimas são dramaticamente controladas pelos intermediários do
metabolismo com que diretamente interagem (reagentes e produtos da reação) de tal forma que o próprio
sentido da reação se pode inverter. Têm também um papel determinante na manutenção das concentrações
estacionárias desses intermediários do metabolismo já que, se os reagentes aumentarem de concentração
dentro da célula, o aumento da velocidade no sentido direto fará com que o valor da sua concentração desça
para um valor mais próximo do original.
No entanto, sendo controladas apenas pela “lei da ação das massas”, têm um papel que se crê ser
irrelevante na velocidade de fluxo (J) das vias metabólicas em que intervêm. Porque a atividade destas
enzimas é muito maior que a das enzimas da mesma via metabólica que catalisam reações fisiologicamente
irreversíveis, crê-se que variações não demasiado drásticas na sua atividade (os que poderão ser causadas por
fisiológicas na concentração de enzima, por exemplo) não perturbarão de forma apreciável o fluxo na via
metabólica em questão. Se a atividade de uma enzima cuja reação já se encontra próxima do equilíbrio
químico aumentar, o resultado desse aumento será nulo no fluxo da via metabólica em questão: os
incrementos nas velocidades direta e inversa terão o mesmo valor e o fluxo (a diferença entre essas
velocidades) num dos sentidos manter-se-á o mesmo.
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Só poderá haver diminuição do fluxo se a atividade dessa enzima diminuir a ponto de se acumularem
reagentes e já não se poder dizer que a enzima catalisa uma reação fisiologicamente reversível. Isto poderá
acontecer em situações de défice enzimático provocado por mutações nos genes que as codificam.
2. A atividade das enzimas cujas reações são fisiologicamente irreversíveis é controlada por
efetores que podem não ser os reagentes e os produtos da reação em que são catalisadores
Existem enzimas cuja atividade é relativamente baixa na célula, de tal forma que a reação por elas
catalisada se encontra afastada do equilíbrio químico (ΔG<<0 e Keq>>QR). Ou seja, as velocidades das
reações direta (v1; A→B) e inversa (v2; B→A) são muito diferentes entre si, v1>>v2 e a reação evolui
sempre no sentido A→B. Se o QR é, para todas as situações metabólicas possíveis no ser vivo, sempre
inferior à Keq, a reação A→B é fisiologicamente irreversível. São estas enzimas que determinam o sentido e a
velocidade de fluxo (J) numa determinada via metabólica. Variações na atividade destas enzimas, a que
poderíamos chamar enzimas “marca-passo”, têm como resultado modificações na velocidade de fluxo das
vias metabólicas. O controlo da velocidade de fluxo nas diferentes vias metabólicas é uma condição
indispensável à sobrevivência e não deve surpreender-nos que, nas enzimas “marca-passo” e nos genes que
as codificam tenham sido selecionadas características específicas que os tornam sensíveis a modificações na
célula que não são meras variações da concentração dos seus reagentes e produtos. As enzimas “marcapasso” e os genes que as codificam funcionam como sensores da concentração de determinadas substâncias
(efetores) aumentando ou diminuindo a sua atividade em função da concentração dessas substâncias. Direta
ou indiretamente, a concentração desses efetores é um indicador do estado metabólico da célula (alta
concentração de AMP como indicador de alta velocidade de consumo de ATP, por exemplo) ou do
organismo como um todo (glicemia alta ou baixa, insulinemia alta ou baixa, etc.).
Por processos mais ou menos complexos a atividade de uma enzima “marca-passo” de uma
determinada via metabólica vai variar de tal forma que a velocidade de fluxo nessa via metabólica se adapta
às distintas condições metabólicas da célula e do organismo onde existe. As modificações na atividade
dessas enzimas (e no fluxo da via metabólica) tendem a corrigir as variações de concentração dos compostos
que estiveram na origem da modificação da atividade e, por isso, se diz que têm um papel homeostático.
Algumas enzimas “marca-passo” de vias metabólicas onde são oxidados os nutrientes são ativadas
pelo AMP cuja concentração aumenta nas células musculares esqueléticas sempre que há aumento da
velocidade de hidrólise do ATP (aquando do exercício). O aumento de concentração de AMP que é o
resultado da ação sequencial das ATPases estimuladas aquando do exercício físico (ATP + H2O → ADP +
Pi) e da cínase do adenilato (ADP ↔ AMP + ATP) tende a ser corrigido pela ativação da oxidação dos
nutrientes e pelo concomitante aumento da velocidade de síntese de ATP. O efeito do AMP e de outros
efetores (como o Ca2+) na regulação do fluxo das vias onde se dá a oxidação dos nutrientes permite
compreender que a concentração de ATP dentro das células se mantenha estacionária mesmo quando o
exercício físico é violento.
A regulação da glicemia é também importante na sobrevivência dos seres vivos: porque os neurónios
usam glicose como combustível e têm baixas reservas de glicogénio a formação de ATP depende de níveis
adequados de fornecimento de glicose. O fígado desempenha um papel determinante na manutenção da
glicemia normal porque, em situações em que a entrada de glicose do exterior não ocorre (jejum, por
exemplo), estão ativadas as vias metabólicas que levam à formação e libertação de glicose para o sangue
(glicogenólise e gliconeogénese) e menos ativas as que levam à sua oxidação (glicólise) ou armazenamento
(glicogénese). Neste processo têm um papel importante hormonas que, ligando-se em recetores da membrana
do hepatócito, levam a modificações marcadas na atividade de enzimas “marca-passo” destas vias
metabólicas.
3. A atividade enzímica aumenta proporcionalmente com a quantidade de enzima
A quantidade de uma enzima pode, pelo menos teoricamente, ser medida em moles como qualquer
outro composto. Contudo, dado que as enzimas catalisam reações de forma altamente específica é frequente
tirar partido desta característica para o seu doseamento. Consideremos a reação A→B catalisada pela enzima
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E. Se em dois tubos de ensaio adicionamos a mesma quantidade de reagente A e a mesma quantidade de
enzima E é de esperar que, se as restantes condições (como temperatura, pH, volume, cofatores, etc.) forem
idênticas, a velocidade de conversão de A em B seja idêntica nos dois tubos. Mas, se a quantidade de enzima
E adicionada ao tubo 2 for o dobro da adicionada ao tubo 1 é de prever que também a velocidade de reação
(a atividade da enzima E) duplique; ver Fig. 1.
Fig. 1: A atividade enzímica (vo) é diretamente proporcional à quantidade total de enzima (Et). kcat é uma
constante que tem dimensões de tempo-1. Km é uma outra constante; é uma medida da afinidade da enzima pelo
substrato S e tem dimensões de concentração. kcat [S]/( Km + [S]) tem um valor constante se a concentração de
substrato ([S]) for constante.
Dentro das células a quantidade de uma determinada enzima E depende das suas velocidades de
síntese e de degradação (hidrólise). Se a velocidade de síntese e degradação forem iguais a concentração da
enzima E manter-se-á constante no tempo mas, se a primeira for superior à segunda, é de esperar que a
atividade aumente. Os processos de controlo da atividade enzímica em que os genes codificadores são
induzidos ou reprimidos conhecem-se melhor que os processos em que varia a velocidade de degradação e
por isso, não é de estranhar que, quando se discutem os mecanismos de regulação que envolvem a variação
da concentração de uma enzima nas células, se dê particular atenção aos processos de controlo da expressão
de genes.
Para que a indução de um gene se repercuta num aumento da atividade da enzima que é o produto
desse gene é necessário que a transcrição e a tradução (e eventual processamento pós-tradução) tenham lugar
e, por isso, estes mecanismos de regulação são de instalação lenta. Em geral, este mecanismo de regulação
das enzimas tem relevância no caso de enzimas que têm velocidades de degradação elevadas. De facto, se
uma enzima tiver uma baixa velocidade de degradação não é de esperar que a atividade seja facilmente
regulada por este processo. Se, por exemplo, for necessário esperar um mês para que metade das moléculas
existentes sejam degradadas então, na ausência de síntese, seria necessário esperar muito tempo para que a
atividade baixasse significativamente. Por sua vez, se o processo de degradação for lento, o aumento da
velocidade de síntese faria acumular enzima na célula que demoraria também muito tempo a voltar aos
níveis de partida.
A carboxicínase do fosfoenolpiruvato (oxalacetato + GTP → fosfoenolpiruvato + GDP + CO2) é
exemplo de uma enzima com velocidade de degradação rápida (algumas horas para que, na ausência de
síntese, a sua concentração desça a metade) e que é regulada ao nível da transcrição. Um outro exemplo é a
glicose-6-fosfátase (glicose-6-fosfato + H2O → glicose + Pi). Quer a glicose-6-fosfátase quer a carboxicínase
do fosfoenolpiruvato são enzimas “marca-passo” da gliconeogénese cuja síntese é induzida no fígado
quando, em consequência de valores de glicemia baixa, os níveis de glicagina são elevados e os de insulina
baixos. A indução dos genes respetivos tem um papel homeostático na glicemia: contribui para que a
velocidade da gliconeogénese aumente e, desta forma, se corrija a condição (hipoglicemia) que estava na
origem dessa indução.
Quando se estuda o efeito de uma determinada variável na atividade de uma enzima E e o estudo
inclui submeter animais de experiência a diferentes condições (jejum e dieta normal, por exemplo) e o
doseamento de E num órgão desse animal, na esmagadora maioria das vezes, o que estamos a estudar é,
simplesmente, o efeito dessas condições na concentração da enzima no órgão em questão. Aquando da
realização da homogeneização do órgão (e, se for o caso, do isolamento de frações celulares) e na montagem
do sistema de ensaio (adição ao meio de ensaio de tampões de pH, substratos, etc.) os eventuais efetores
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alostéricos ou isostéricos da atividade da enzima existentes nas células foram de tal forma diluídos que,
geralmente, deixaram de ter peso no doseamento efetuado. Ver Capítulo 1.1 para um exemplo.
4.
A modulação da atividade das enzimas pode ser feita por substâncias que se ligam, de
forma não covalente e reversível, ao centro ativo ou a um centro alostérico
Um outro fator que é de prever influenciar a velocidade de conversão de A em B é a presença do
produto B. B terá, se as condicionantes termodinâmicas da reação o permitirem, a capacidade de se ligar à
enzima no seu centro ativo e de interagir com esta gerando A mas, mesmo que a reação inversa seja
irrelevante, como acontece nas reações fisiologicamente irreversíveis, a mera presença de B no centro ativo
de algumas das moléculas da enzima impede a ligação de A nos centros ativos dessas moléculas. Por isso B
pode, se a sua concentração for suficientemente elevada, ser um inibidor da conversão enzímica A→B e,
porque se liga no centro ativo, diz-se um inibidor isostérico. Um exemplo deste tipo de inibição ocorre no
caso da desidrogénase da glicose-6-fosfato (glicose-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogliconolactona + NADPH;
a primeira enzima da via das pentoses-fosfato) onde o NADPH é um inibidor isostérico que compete com o
NADP+ pelo local de ligação deste composto na enzima. A concentração de NADPH condiciona a atividade
da desidrogénase da glicose-6-fosfato de tal forma que, se a sua concentração diminuir, a atividade da
enzima aumenta [1]. A via das pentoses-fosfato fica ativada sempre que o consumo (oxidação) do NADPH
aumenta.
Frequentemente, quando uma substância que não é o substrato (não tem de ser o produto, pode ser
um outro análogo estrutural do substrato, por exemplo) se liga de forma reversível ao centro ativo de uma
enzima ocorre um tipo de inibição que se diz competitiva. O que se passa é que a presença do inibidor
impede a ligação do substrato às moléculas de enzima que têm o inibidor ligado no centro ativo. No entanto,
tendo em conta que ambos, substrato e inibidor, competem pelo centro ativo, a probabilidade de uma
molécula de enzima estar ligada a uma molécula de inibidor depende quer da concentração de inibidor quer
da concentração de substrato. Se a concentração de substrato aumentar, a probabilidade de haver moléculas
de enzima que, em vez de estarem ligadas ao substrato, estão ligadas ao inibidor diminui. Na prática isto
significa que o grau de inibição exercido por uma determinada concentração de um inibidor competitivo
diminui quando a concentração de substrato aumenta. Na inibição de tipo competitivo, a presença do inibidor
não afeta o valor do Vmax mas faz aumentar o valor aparente do Km do substrato com o qual o inibidor
compete.
Há, contudo, outras substâncias que podem interferir com a velocidade de reação e que, de acordo
com as evidências experimentais, não se ligam no centro ativo da enzima mas num local diferente do centro
ativo: um sítio (ou centro) alostérico. Consideremos uma substância X que, quando adicionada ao meio de
ensaio enzímico, aumenta a velocidade da reação. O facto de o efeito ser ativador constitui desde logo uma
evidência contra a ideia de se ligar no mesmo sítio onde se liga o substrato; se fosse esse o caso devia
interferir com a ligação do substrato e inibir a reação. Neste caso podemos referir-nos a X como um ativador
alostérico porque se admite que se liga num local distinto do centro ativo: um sítio (ou centro) alostérico. Às
vezes, existem substâncias (Y) que são, estruturalmente, muito diferentes dos substratos e dos produtos e que
também inibem a reação enzímica. É de presumir, pelo menos numa primeira abordagem, que Y se ligue à
enzima num local distinto do centro ativo e que modificando de alguma maneira a sua estrutura secundária,
terciária ou quaternária interfira negativamente na capacidade da enzima para catalisar a reação. Y seria neste
caso um inibidor alostérico. Às vezes, os inibidores alostéricos competem com os ativadores alostéricos
pelo mesmo sítio alostérico mas, enquanto os ativadores induzem modificações na conformação da enzima
que a tornam mais ativa, os inibidores, ao impedir a ligação do ativador alostérico, impedem que essa
alteração conformacional tenha lugar. O inverso também é verdadeiro: a modificação alostérica que leva à
formação de uma conformação menos ativa por ligação a um inibidor pode ser impedida se, no mesmo local,
se ligar um composto que impede a ligação do inibidor e que será, consequentemente, um ativador alostérico.
Nos últimos anos, o reconhecimento da complexidade dos fenómenos de regulação da atividade
biológica das proteínas (não só enzimas mas também transportadores de membranas, canais iónicos ou
recetores de hormonas ou neurotransmissores) levou à generalização do uso da expressão “domínios
reguladores” para referir sítios na proteína alvo onde se podem ligar substâncias que, ao ligarem-se,
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induzem modificações conformacionais e alterações funcionais (ativadoras ou inibidoras) na proteína alvo.
Na verdade, quando a proteína alvo é uma enzima e os domínios reguladores interagem com ligandos de
forma reversível envolvendo ligações não covalentes podemos dizer que esses domínios reguladores
correspondem à designação clássica de sítios alostéricos.
Na regulação por ligandos (ativadores ou inibidores alostéricos e inibidores isostéricos
competitivos), a ligação entre a enzima e o ligando é de tipo não covalente envolvendo ligações facilmente
reversíveis (de van der Waals, iónicas ou de hidrogénio) e de estabelecimento rápido. Assim, a razão entre as
forma ligada e desligada é condicionada pelo equilíbrio químico na ligação ligando + Enzima ↔ ligandoEnzima que se estabelece de forma praticamente instantânea. Compreende-se por isso que quando a
concentração do ligando se modifica as modificações induzidas nas enzimas sejam imediatas.
É um exemplo clássico de regulação alostérica de enzimas a ação do AMP, do ADP e do ATP na
atividade da cínase 1 da frutose-6-fosfato [2] (ATP + frutose-6-fosfato → ADP + frutose-1,6-bisfosfato; ver
Fig. 2). Em princípio, não esperaríamos que o substrato de uma enzima pudesse agir como inibidor da
atividade dessa enzima mas, no caso da cínase da frutose-6-fosfato (cuja atividade tem uma enorme
importância na velocidade de fluxo na glicólise), parece ser exatamente isto que acontece. A cínase da
frutose-6-fosfato catalisa a transferência do fosfato γ do ATP para a frutose-6-fosfato originando frutose-1,6bisfosfato mas, estudos in vitro usando a enzima purificada mostraram que, para concentrações fisiológicas
dos substratos ela é, praticamente, inativa. Embora a concentração estacionária de ATP varie de célula para
célula, os valores fisiológicos são, dependendo da célula, de cerca de 1 a 5 mM, variando muito pouco ao
longo do tempo. Curiosamente, a atividade da cínase da frutose-6-fosfato aumenta com a concentração de
ATP quando as concentrações de ATP utilizadas em ensaios in vitro se mantêm abaixo de 1 mM mas, para
concentrações fisiológicas de ATP a atividade baixa de forma muito marcada. Curiosamente, o ADP (que é
um produto da atividade da cínase da frutose-6-fosfato) e o AMP (que se pode formar a partir do ADP por
ação da cínase do adenilato: 2 ADP → ATP + AMP) podem, em concentrações adequadas, contrariar o
efeito inibidor do ATP. Na origem destas ações está um sítio alostérico que, quando ligado ao ATP, induz
uma alteração conformacional inibidora e esta ação inibidora pode ser contrariada pela competição do AMP
e do ADP por esse centro alostérico.
Fig. 2: O gráfico atividade da cínase 1 da frutose-6-fosfato versus concentração de ATP tem o aspeto de um sino
na ausência de AMP e ADP, mas já tem um aspeto mais “normal” quando o meio de ensaio contém AMP (ou
ADP).
Uma reflexão sobre os fenómenos apontados acima pode revelar-se muito interessante. A glicólise é
uma via metabólica que inicia o processo de oxidação da glicose e que, mesmo em regime anaeróbio,
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permite a acoplagem da cisão da molécula de glicose com a da síntese de ATP. Numa fibra muscular
esquelética em atividade de contração rápida, a velocidade de hidrólise de ATP está muito aumentada e as
concentrações de ADP e a de AMP sobem relativamente à situação de repouso. Um animal só poderá fugir
aos seus inimigos ou agarrar a presa se conseguir manter a concentração de ATP em níveis fisiológicos
mesmo quando a velocidade de hidrólise do ATP no sistema contráctil actina-miosina está muito aumentada.
Nesta situação, fazem parte do sistema sensor-resposta homeostática o aumento da concentração de AMP e
ADP no citoplasma das células, a estimulação da cínase da frutose-6-fosfato pelo AMP e ADP com a
consequente estimulação da oxidação da glicose e fosforilação do ADP (formação de ATP). Sendo a cínase
da frutose-6-fosfato uma enzima reguladora da velocidade da glicólise pode já não parecer tão estranho que
uma enzima com um centro alostérico com as características apontadas tenha sido positivamente
selecionada.
No caso do fígado, onde não ocorrem variações marcadas na velocidade de hidrólise do ATP, as
variações nas concentrações estacionárias de AMP e ADP são mais discretas mas a atividade da cínase da
frutose-6-fosfato pode, também aqui, sofrer marcadas variações de atividade. O mais importante regulador
da cínase da frutose-6-fosfato no fígado é a frutose-2,6-bisfosfato que é o produto da atividade de uma outra
cínase da frutose-6-fosfato existente nas células. Para as distinguir passou a associar-se o número 1 à
primeira (a cínase 1 da frutose-6-fosfato forma frutose-1,6-bisfosfato e é uma enzima da glicólise) e o 2 à
segunda [a cínase 2 da frutose-6-fosfato forma frutose-2,6-bisfosfato (ATP + frutose-6-fosfato → ADP +
frutose-2,6-bisfosfato) e não é uma enzima da glicólise]. Ver Capítulo 1.2.
Quando se realiza um estudo para provar se uma enzima é afetada por um determinado ligando
(efetor isostérico ou alostérico) é necessário realizar, pelo menos, dois ensaios em tudo idênticos (pH,
temperatura, concentração de substratos e de enzima, etc.) exceto no que respeita ao ligando em estudo: um
dos ensaios é feito na presença do ligando e o outro na sua ausência. A observação de diferenças na atividade
da enzima nas duas condições apenas mostra que a enzima pode ser afetada pela presença desse ligando. A
relevância biológica da observação dependerá das concentrações de ligando usadas no ensaio e da sua
aproximação às concentrações que se creem existir na vizinhança da enzima na célula viva. No entanto,
apesar de alguns ligandos com ação inibidora ou ativadora não existirem sequer nas células não transforma a
observação em irrelevante: eventualmente esse ligando poderá ser usado como um fármaco modulador da
atividade dessa enzima ou num importante instrumento no estudo experimental da atividade da enzima em
análise ou no estudo do metabolismo. Às vezes, a relevância biológica da descoberta pode não ser evidente
numa primeira análise, mas descobrir-se depois que, afinal, a substância existe nos seres vivos ou que é um
análogo de uma substância que existe nos seres vivos ligando-se no mesmo sítio onde se liga o composto
natural ainda por descobrir.
5.
A existência nas células de atividade simultânea em enzimas que têm papéis biológicos
opostos levou à cunhagem da expressão “ciclos fúteis” que uma análise mais atenta
mostrou ser inadequada
De facto, a ativação induzida pelo AMP e pelo ADP na cínase da frutose-6-fosfato não é suficiente
para explicar o aumento explosivo da velocidade de fluxo na glicólise nas fibras musculares esqueléticas
aquando do exercício físico. Apesar de as variações de concentração de AMP e ADP serem apreciáveis os
aumentos observados são mais modestos que os que teriam de existir para explicar o aumento da velocidade
de fluxo na glicólise nessas condições.
Curiosamente, uma das explicações para o aumento da velocidade de fluxo na glicólise tem por base
um fenómeno que, quando observado pela primeira vez, pareceu tão estranho que os seus autores o
apelidaram de “fútil”. Na maioria das células, incluindo as fibras musculares esqueléticas, estão
simultaneamente ativas a cínase-1 da frutose-6-fosfato (ATP + frutose-6-fosfato → ADP + frutose-1,6bisfosfato) que catalisa a conversão de frutose-6-fosfato em frutose-1,6-bisfosfato e uma outra enzima, a
frutose-1,6-bisfosfátase, que tem um papel biológico oposto: a hidrólise da frutose-1,6-bisfosfato (frutose1,6- bisfosfato + H2O → frutose-6-fosfato + Pi). O somatório dos dois processos leva, simplesmente, à
hidrólise de ATP o que, à primeira vista, parece não fazer nenhum sentido. Se em cada 10 moléculas de
frutose-6-fosfato que se converteram em frutose-1,6-bisfosfato por ação da cínase, 9 voltarem a formar
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frutose-6-fosfato por ação da frutose-1,6-bisfosfátase então, 9 em cada 10 moléculas de ATP gastas na ação
da cínase foram desperdiçadas aquando da ação da fosfátase. Se a atividade da cínase for de 10 μmoles/min e
a da hidrólase de 9 μmoles/min a velocidade de fluxo na glicólise será de 1 μmol/min. Se a atividade da
cínase, estimulada pelo AMP aumentar de 10 μmoles/min para 90 μmoles/min o aumento na atividade da
cínase foi apenas de 9 vezes mas o aumento de fluxo na glicólise aumentou de 1 μmol/min para 81 (90-9)
μmoles/min: um aumento de 81 vezes na velocidade de fluxo foi conseguido com uma variação muito mais
modesta (9 vezes) na atividade da enzima (a cínase da frutose-6-fosfato) que catalisa a conversão da frutose6-fosfato em frutose-1,2-bisfosfato. Esta potenciação dos efeitos da variação da atividade de uma enzima
componente de um ciclo “fútil” no fluxo de uma via metabólica explica porque é que estes ciclos se tenham
deixado de chamar fúteis e se passassem a chamar “ciclos de substrato”.
Na realidade, no caso do ciclo de substrato frutose-6-fosfato/frutose-1,6-bisfosfato, o AMP é não só
ativador da cínase-1 da frutose-6-fosfato mas também inibidor da frutose-1,6-bisfosfátase e os dois efeitos
antagónicos nas duas enzimas do ciclo potenciam-se mutuamente permitindo um aumento no fluxo da
glicólise muito superior ao que seria de prever tendo em conta o efeito do AMP em cada uma das duas
enzimas analisadas isoladamente.
O mesmo ciclo de substrato frutose-6-fosfato/frutose-1,6-bisfosfato também existe no fígado e
também aqui a atividade das duas enzimas que o compõem é regulada de forma antagónica pelo composto
regulador hepático pertinente: a frutose-2,6-bisfosfato. Já foi referido (ver Capítulo 4) que a frutose-2,6bisfosfato é ativador da cínase-1 da frutose-6-fosfato mas este composto é, simultaneamente, inibidor da
frutose-1,6-bisfosfátase. No fígado, a diminuição de concentração de frutose-2,6-bisfosfato que ocorre
durante o jejum faz com que o somatório (de sinais opostos) das atividades da cínase-1 da frutose e da
frutose-1,6-bisfosfátase inverta o sentido do fluxo: quando a concentração de frutose-2,6-bisfosfato está
baixa nos hepatócitos a velocidade de fluxo passa a favorecer a formação de glicose (gliconeogénese). A
regulação da concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato, complementando a informação apresentada
nos Capítulos 4 e 6, é explicada no Capítulo 1.2.´
6. A regulação da atividade das enzimas pode envolver modificações de tipo covalente
catalisadas por outras enzimas
A conformação das proteínas e em particular das enzimas depende do ambiente em que existem e em
particular da ligação não covalente de substâncias nos seus centros alostéricos ou no seu centro ativo. No
entanto, algumas vezes, as modificações sofridas pelas enzimas podem ser menos subtis e envolverem
modificações de tipo covalente. Muito frequentemente, essas modificações são fosforilações catalisadas por
cínases de proteínas (enzima E + ATP → enzima E-fosforilada + ADP) ou desfosforilações catalisadas por
fosfátases de proteínas (enzima E-fosfato + H2O → enzima E + Pi). Se a forma fosforilada da enzima E for
mais (ou menos) ativa que a forma desfosforilada então a cínase terá um papel ativador (ou inibidor) da
enzima E e a fosfátase o papel inverso. Consideremos que a enzima E só tem atividade catalítica quando
contém grupos fosfatos ligados num determinado resíduo (por exemplo o resíduo serina14) e que uma outra
enzima C pode catalisar a transferência do fosfato γ do ATP para o resíduo serina14 de E. A enzima C seria
uma cínase de E e, se adicionarmos a enzima C e ATP a um meio de ensaio contendo a enzima E, é de
esperar um aumento da velocidade da reação A→B catalisada pela enzima E. Se pelo contrário existe uma
enzima F capaz de catalisar a hidrólise da ligação serina14 – P então a adição da enzima F (fosfátase de E) ao
sistema reverteria a ativação acima referida. Para designar a porção da proteína onde ocorre a
fosforilação/desfosforilação também se usa, frequentemente, a mesma expressão a que já nos referimos a
propósito da regulação alostérica: domínio regulador (ver Capítulo 4).
Um exemplo clássico é a desidrogénase do piruvato (piruvato + NAD+ + CoA → acetil-CoA +
NADH + CO2) cuja atividade depende da fração de enzima que está no estado desfosforilado (a forma ativa)
e na forma fosforilada (a inativa). A distribuição entre as formas ativa e inativa (e, em última análise, a
atividade da enzima como um todo) depende das atividades relativas de uma cínase específica (a cínase da
desidrogénase do piruvato que catalisa a sua fosforilação e consequente inativação) e uma fosfátase
específica (a fosfátase da desidrogénase do piruvato que catalisa a sua desfosforilação e consequente
ativação). Por sua vez a atividade da cínase e da fosfátase depende de fatores a que já fizemos referência em
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capítulos anteriores (Capítulos 3 e 4). Quando uma fibra muscular é estimulada pelo seu nervo motor ocorre
um aumento na concentração intracelular de Ca2+ que é um estimulador alostérico da fosfátase da
desidrogénase do piruvato. De forma muito rápida ocorre um aumento na velocidade de desfosforilação da
desidrogénase do piruvato com a consequente ativação desta enzima: a atividade muscular contráctil ocorre
paralelamente com aumento da velocidade da oxidação do piruvato (e a subsequente síntese de ATP) [3]. A
insulina também estimula a oxidação do piruvato mas o mecanismo é de instalação lenta: a insulina reprime
a expressão do gene codificador da cínase da desidrogénase do piruvato desta forma diminuindo a velocidade
de fosforilação (inativação) da desidrogénase do piruvato [4].
O estudo da atividade “efetiva” (a que, num dado momento, existe num dado tecido) de enzimas
reguladas por fosforilação/desfosforilação tem particularidades que são uma consequência do facto de os
homogeneizados (ou frações de homogeneizados) dos tecidos onde se pretende medir a sua atividade conter
também as enzimas responsáveis pela sua ativação e inativação. Se, durante a colheita e o processo de
homogeneização dos tecidos, as cínases e fosfátases pertinentes continuarem ativas, a atividade que se vai
medir pode não coincidir com a atividade da enzima no momento da colheita do tecido. A cínase da
desidrogénase do piruvato é inibida pelo dicloroacetato e a fosfátase é inibida pelo fluoreto e, embora estas
substâncias não tenham nenhum papel fisiológico na regulação da desidrogénase do piruvato, são
importantes instrumentos no seu estudo. A adição de dicloroacetato e de fluoreto ao tecido em análise
durante o processo de homogeneização e ao meio de ensaio onde se doseia a atividade da desidrogénase
previne modificações nas proporções das formas ativa (desfosforilada) e inativa (fosforilada); ver Fig. 3 [5].
Se se quiser medir a atividade total, ou seja, a que corresponde à condição de todas as moléculas de
desidrogénase de piruvato estarem na forma desfosforilada, há que retirar o flureto do sistema mantendo o
dicloroacetato.
Fig. 3: Condições necessárias para permitir o doseamento da atividade efetiva (“atual”) da desidrogénase do
piruvato: presença de fluoreto e de dicloroacetato. Para dosear a atividade “total” há que inibir a cínase com
dicloroacetato e manter a fosfátase ativa.
7.
A atividade das enzimas pode ser afetada pela concentração do substrato na sua
vizinhança podendo esta depender da atividade de transportadores ou de enzimas que
afetam o transporte transmembranar
Se, no decurso do estudo de uma enzima (A→B), usarmos vários tubos de ensaio, adicionando
diferentes concentrações do substrato A e mantendo constantes todas as outras condições (incluindo a
quantidade de enzima E, obviamente) é de esperar que a velocidade de conversão de A em B aumente com a
concentração de A. Contudo, não é de esperar que, pelo menos para concentrações “altas” de A, esse
aumento seja proporcional à concentração de A. A partir de determinadas concentrações aumentos na
concentração de A não implicam variação significativa na velocidade de reação; à velocidade atingida nessas
concentrações de A chama-se Vmax (velocidade máxima; ver Fig. 4). É de notar que o valor de Vmax é apenas
um parâmetro que se obtém quando se estuda a velocidade de reação (ou transporte transmembranar)
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variando apenas a concentração de substrato, havendo diferentes valores de Vmax quando se modificam as
outras condições de ensaio. Quando a enzima tem vários substratos o que normalmente se faz é fixar a
concentração de todos os outros e obter o parâmetro Vmax para o substrato cuja concentração varia. É obvio
que o valor do Vmax depende de todas as outras condições fixadas (pH, temperatura, concentração de enzima,
etc.) incluindo a concentração dos outros substratos, podendo obter-se diferentes valores de Vmax se se
escolherem diferentes concentrações dos outros substratos.
Fig. 4: Variação da atividade de uma enzima em que o gráfico atividade versus [S] é uma hipérbole.
Na maioria das enzimas a representação gráfica dos resultados do estudo da atividade versus
concentração do substrato A resulta numa curva hiperbólica (ver Fig. 4) que passa pelo ponto 0,0 e em que o
valor no eixo que representa a atividade (tradicionalmente o das ordenadas) tende para um limite: o Vmax. Na
ausência de A a velocidade é nula e existe uma concentração de A em que a velocidade de reação é metade
de Vmax. À concentração de A que proporciona uma velocidade de reação que é igual a ½ de Vmax chama-se
Km de A. Em geral, a velocidade de uma reação enzímica é pouco sensível a variações de concentração de
substrato quando estes valores de concentração são substancialmente maiores (10 vezes ou superiores) que o
Km mas, quando as concentrações são mais baixas que o Km ou semelhantes ao Km a velocidade de reação
aumenta quando aumenta a concentração de substrato. Nas enzimas com “cinéticas de tipo hiperbólico” para
concentrações de substrato muito inferiores ao Km a atividade aumenta de forma quase proporcional com a
concentração de substrato (ver Fig. 4).
Apesar da importância que a análise do efeito da concentração do substrato tem na caracterização das
enzimas e no eventual efeito que este fator possa ter nas enzimas que catalisam reações fisiologicamente
reversíveis a observação de que as variações intracelulares dos intermediários do metabolismo são discretas
faz pensar que, in vivo, o efeito da concentração do substrato no controlo das enzimas “marca-passo” pode
ser muito menos importante que o que se possa pensar.
Contudo, em algumas vias metabólicas a concentração dos substratos na vizinhança de enzimas que
catalisam reações fisiologicamente irreversíveis pode ter um papel determinante na velocidade de fluxo das
vias metabólicas.
Exemplos óbvios são os que se relacionam com a atividade das enzimas envolvidas na conversão da
galactose e frutose da dieta: as velocidades de conversão da galactose em galactose-1-fosfato e de frutose em
frutose-1-fosfato (catalisadas respetivamente pelas cínases da galactose e da frutose) dependem da presença
ou ausência de galactose e frutose (ou dos seus precursores, a lactose e sacarose) na dieta.
Um outro exemplo é a atividade da síntase do ATP cuja atividade é afetada (estimulada) pela
concentração intramitocondrial de ADP [6].
Outro exemplo é a hexocínase IV (também designada por glicocínase) cujo Km para a glicose é cerca
de 10 mM. A hexocínase IV existe no fígado e a alta atividade do transportador para a glicose na membrana
citoplasmática dos hepatócitos (GLUT2) permite que as suas concentrações intracelulares sejam semelhantes
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às da glicemia na veia porta (a veia que drena o sangue que irriga o intestino). As variações de glicemia na
veia porta são muito mais marcadas que no sangue sistémico e as concentrações fisiológicas de glicose no
hepatócito são mais baixas ou próximas do Km: a atividade da hexocínase IV é influenciada pela
concentração de glicose. De facto, in vivo, o Km para a glicose pode ser ainda mais elevado do que apontado
acima tornando ainda mais acentuado o efeito da concentração intracelular de glicose na atividade da
enzima. Nos hepatócitos existe uma proteína (proteína reguladora da glicocínase) que tem um efeito inibidor
competitivo relativamente à glicose [7].
Um fator que pode influenciar de forma marcada a concentração de substrato na vizinhança de uma
enzima é o transporte transmembranar do substrato. Por exemplo, a atividade da hexocínase muscular
(hexocínase II) está dependente da entrada de glicose para dentro das fibras musculares esqueléticas sendo
este processo, por sua vez, dependente do número de transportadores para a glicose (no caso, GLUT4)
presentes na membrana citoplasmática. A insulina tem um importante papel na determinação da velocidade
de entrada de glicose para as fibras musculares porque promove a fusão de vesículas intracelulares que
contém GLUT4 com a membrana citoplasmática. Um fenómeno idêntico e independente da insulina ocorre
aquando do exercício muscular.
A velocidade da oxidação da glicose no músculo depende, como vimos, da velocidade de entrada da
glicose nas fibras musculares mas a oxidação dos ácidos gordos também é controlada através da regulação de
um sistema de transporte transmembranar; no caso concreto, o transporte de acis-CoA (também designados
de ácidos gordos ativados) através da membrana interna da mitocôndria. Este transporte é complexo,
designa-se sistema da carnitina e é através dele que os acis-CoA têm acesso às enzimas intramitocondriais
envolvidas na sua oxidação. Os níveis citoplasmáticos de um inibidor alostérico (malonil-CoA) da enzima
“marca-passo” do processo de transporte (carnitina palmitil-transférase I) regulam a velocidade de oxidação
dos acis-CoA: o acesso dos substratos (acis-CoA) à primeira enzima da oxidação em β (a desidrogénase de
acil-CoA, uma enzima intramitocondrial) depende da atividade do sistema de transporte dos acis-CoA do
citoplasma para a mitocôndria. No Capítulo 1.3 este mecanismo é explicado com mais pormenor.
8. O pH tem um papel menor na regulação do metabolismo normal
Embora a maneira como o pH afeta a atividade das enzimas seja um dos aspetos quase sempre
estudado quando o objetivo é caracterizar uma enzima, pensa-se que, pelo menos em situações normais, este
fator terá um papel menor na regulação do metabolismo. Apesar de a maioria das enzimas poder ser afetada
por alterações na concentração de protões na sua vizinhança, devido à existência de tamponamento, o pH no
citoplasma e nos diferentes organelos celulares varia pouco no tempo.
No entanto, admite-se que em certos aspetos do metabolismo, a modulação da atividade enzímica
pelo pH poderá ser importante. O exercício muscular de alta intensidade (correr rapidamente durante um
período curto de tempo, por exemplo) provoca uma alteração no tipo de nutriente que é oxidado no músculo
esquelético: mesmo que o indivíduo esteja em jejum e a oxidar ácidos gordos o exercício deste tipo provoca
um aumento da oxidação dos glicídeos mas, estranhamente, provoca também uma diminuição da oxidação
dos ácidos gordos. Tendo o aumento da velocidade de hidrólise de ATP um efeito estimulador no consumo
de O2, podia esperar-se que, na origem deste aumento de consumo de O2, estivesse um aumento na
velocidade de oxidação dos dois combustíveis mas não é isso que acontece. Admite-se que, na origem da
diminuição da velocidade de oxidação dos ácidos gordos, esteja a acidificação do citoplasma (provocada pela
estimulação da glicólise anaeróbia e consequente produção de ácido láctico) que inibiria a carnitina palmitiltransférase I (a enzima “marca-passo” do processo de transporte de acis-CoA para a matriz da mitocôndria)
e, portanto, a oxidação dos ácidos gordos [8].
9. A temperatura tem, no homem, um papel menor na regulação do metabolismo normal
Porque a temperatura corporal sofre, no homem, variações que são pouco marcadas, a temperatura é,
pelo menos no homem adulto, um fator relativamente pouco importante na regulação do metabolismo
normal.
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As reações químicas são, em geral, tanto mais rápidas quando maior é a temperatura, e o mesmo
acontece no caso das reações enzímicas. Quando ensaiada in vitro, a atividade enzímica de uma enzima E
também aumenta com a temperatura mas, porque a velocidade de desnaturação das proteínas também
aumenta com a temperatura, se o ensaio for feito a uma temperatura em que a velocidade de desnaturação da
enzima E é elevada observa-se uma diminuição (ou mesmo anulação) precoce da velocidade de reação.
Nestas condições a diminuição da velocidade de reação ao longo do tempo de ensaio não é causada por
consumo de substrato mas sim porque a enzima se desnaturou. O efeito da temperatura na velocidade dos
processos metabólicos (incluindo a hidrólise das proteínas e lipídeos das membranas) é explorado quando se
usam temperaturas baixas durante o transporte de órgãos que serão usados em transplantes.
Embora a temperatura corporal tenha um papel menor na regulação do metabolismo normal a inversa
não é verdadeira; quando os processos catabólicos são acelerados porque, por exemplo, resolvemos fazer
exercício físico, uma das consequências é o aumento da temperatura corporal. A oxidação dos glicídeos,
lipídeos e aminoácidos são processos exotérmicos e quando estes processos estão acelerados, há aumento da
velocidade de produção de calor pelo organismo.
Quando a temperatura do organismo baixa ocorrem respostas adaptativas do sistema nervoso que
contribuem para manter a temperatura corporal. Estas respostas têm repercussões na atividade das enzimas e
transportadores de membrana, mas não podem ser entendidas como uma ação direta da temperatura na
atividade dessas enzimas e transportadores. No caso dos bebés humanos (mas também em muitos adultos
[9]) o frio provoca um aumento do catabolismo dos nutrientes, mas não é a temperatura baixa que,
diretamente, ativa as enzimas envolvidas nos processos catabólicos. A estimulação dos processos oxidativos
ocorre no tecido adiposo castanho e resulta da estimulação da termogenina (também designada de UCP1,
uncoupling protein 1), um transportador de protões presente na membrana mitocondrial interna desse tecido.
Em situações de frio, o sistema nervoso simpático fica ativado e provoca estimulação da termogenina. Esta
estimulação permite dissipar o gradiente eletroquímico na membrana interna da mitocôndria provocando
estimulação da oxidação dos nutrientes (e a consequente produção de calor) num processo que não está
acoplado com a síntese de ATP e que, portanto, não depende da velocidade de hidrólise do ATP. Por esta
via, é possível aumentar a velocidade de oxidação dos nutrientes e, consequentemente, a produção de calor,
sem ser necessário fazer exercício físico.
10. A atividade das enzimas pode ser afetada por múltiplos fatores numa teia de
interferências muito complexa onde podem ter relevância hormonas e neurotransmissores
A atividade de uma enzima (a sua capacidade para catalisar a conversão A→B) depende de múltiplos
fatores de que destacamos a quantidade de enzima (ver Capítulo 3), a existência de modificadores alostéricos
ou isostéricos (ver Capítulo 4), processos de fosforilação e de desfosforilação catalisados por outras enzimas
(ver Capítulo 6) e a concentração de substrato na vizinhança da enzima que, eventualmente, está dependente
da atividade de transportadores de membrana (ver Capítulo 7). As variações na quantidade de enzima
dependem da variação da velocidade da sua síntese e/ou da sua degradação: nestes fenómenos entre a
emergência do fator desencadeante e a alteração da concentração de enzima (e consequente atividade) podem
mediar horas ou dias. Nos outros casos as modificações na atividade de uma enzima resultam da variação da
capacidade das moléculas de enzima pré-existentes para catalisarem a reação e, nestes casos, essas
modificações são extremamente rápidas.
Na origem das modificações que levam a alterações na atividade das enzimas e da consequente
alteração do fluxo nas vias metabólicas podem estar modificações que apenas refletem modificações na
célula onde o fenómeno ocorre. No entanto, o mais frequente é que essas modificações sejam mediadas por
fatores originados fora das células em questão, como hormonas e neurotransmissores.
Na realidade a própria síntese e libertação das hormonas pode ser uma consequência das alterações
metabólicas que ocorrem nas células endócrinas. O caso da libertação de insulina pelas células pancreáticas β
é um exemplo do que acabamos de escrever. Estas células têm, tal como os hepatócitos, GLUT4 e
hexocínase IV e, por isso, a velocidade de conversão da glicose em glicose-6-fosfato é sensível a variações
fisiológicas da concentração de glicose. Quando se ingerem hidratos de carbono, a glicemia aumenta e
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aumenta o catabolismo da glicose e da velocidade de síntese de ATP. Ao contrário do que acontece na
maioria das células do organismo, nas células pancreáticas β as variações da concentração de ATP podem ser
suficientemente marcadas para que ocorram variações na atividade de proteínas que são sensíveis ao ATP. A
subida da concentração do ATP leva ao bloqueio de um canal de K+ existente na membrana celular das
pancreáticas β que, por sua vez, vai estar na origem da despolarização da membrana (inversão de cargas; fica
positivo no interior e negativo no exterior). Esta despolarização induz a fusão de vesículas contendo insulina
com a membrana celular e a consequente libertação da hormona para o sangue. Espalhando-se pelo
organismo, a insulina vai, ligando-se a recetores da superfície celular, promover o consumo de glicose
(oxidação e armazenamento - síntese de glicogénio) e diminuir a sua síntese (gliconeogénese e
glicogenólise): a subida da concentração de glicemia vai ter efeitos que levam à correção homeostática da
subida da glicemia.
Mesmo quando considerada isoladamente, uma mesma enzima pode sofrer a influência de vários
fatores numa teia de interferências muito complexa. Alguns exemplos ilustrativos de fatores de regulação da
atividade de algumas enzimas assim como a sua importância na sobrevivência dos seres vivos já foram
apontados no texto acima e outros são desenvolvidos nos Anexos.
11. Anexos
1.1 Exemplo de estudo do efeito de uma hormona na atividade de uma enzima cuja síntese é reprimida
A glicose-6-fosfátase é uma enzima que catalisa a hidrólise da glicose-6-fosfato com formação de
glicose e Pi. O QR encontra-se muito afastado da Keq e crê-se que a reação é fisiologicamente irreversível. A
glicose-6-fosfátase existe no fígado e no rim (e no intestino), sendo um passo importante nos processos de
produção de glicose para o sangue, via conversão de aminoácidos, glicerol, glicogénio ou, eventualmente, a
partir da frutose ou galactose ingeridas. Após uma refeição contendo glicídeos a concentração de glicose no
sangue (glicemia) aumenta provocando a libertação de insulina nas células β dos ilhéus pancreáticos.
Embora, como pode ser demonstrado usando glicose marcada com isótopos de hidrogénio [9], o fígado
consuma e produza glicose ao mesmo tempo, a velocidade de produção diminui e a de consumo aumenta
nestas circunstâncias fazendo com que o balanço líquido favoreça o consumo. Após a ingestão de amido (ou
glicose) o fígado não funciona como um órgão secretor líquido de glicose mas, pelo contrário, capta glicose
do sangue. O contrário acontece durante os outros estados metabólicos, nomeadamente durante o jejum, em
que o fígado é um órgão que segrega glicose, ou seja, liberta mais glicose para o plasma sanguíneo que a que
consome.
Admitiu-se a hipótese de que a insulina podia, de alguma maneira, provocar diminuição da
quantidade de glicose-6-fosfátase no fígado e a hipótese foi testada experimentalmente. Para esse efeito, e
ainda nos anos 60, foram realizados estudos com ratos usando modelos de diabetes experimental [10]. Um
grupo de ratos foi tratado com drogas que provocavam a destruição das células β pancreáticas e, portanto,
incapacidade para produzir insulina (diabetes); outro grupo de ratos funcionou como controlo. Os ratos
foram mortos, os fígados destes foram homogeneizados e foi doseada a glicose-6-fosfátase nos
homogeneizados. Para este efeito mediu-se a velocidade de hidrólise da glicose-6-fosfato quando se
adicionava aos meios de ensaio contendo glicose-6-fosfato amostras dos referidos homogeneizados
correspondendo a uma mesma quantidade de tecido hepático em todos os casos. Observou-se que nos
ensaios em que o homogeneizado tinha sido obtido de ratos diabéticos, a velocidade de hidrólise da glicose6-fosfato era muito superior à dos ensaios com os homogeneizados dos controlos. Os dados faziam admitir
como altamente provável que na origem da diferença estaria uma quantidade aumentada de enzima nos ratos
diabéticos; ou seja, para uma dada massa de fígado havia mais moléculas de glicose-6-fosfátase se o fígado
fosse de um rato diabético. Também se admitiu que na origem deste fenómeno estaria um aumento da
velocidade de síntese da enzima nos ratos diabéticos e que a insulina teria um papel inibidor nessa síntese.
Contudo, só nos anos 90, depois do gene correspondente à glicose-6-fosfátase ter sido identificado, foi
possível confirmar essas suspeitas. De facto foi possível confirmar que a quantidade de RNA mensageiro
codificador da glicose-6-fosfátase estava aumentado no fígado dos ratos diabéticos e que a administração de
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insulina provocava diminuição da quantidade desse RNA mensageiro [11]. Variações na quantidade de RNA
mensageiro específico induzidas por variações de sinal inverso na quantidade de insulina circulante é uma
evidência muito forte a favor da ação inibidora desta hormona na expressão do gene codificador da glicose6-fosfátase e, portanto, na síntese desta enzima.
1.2 A fosforilação/desfosforilação de uma proteína com atividade catalítica pode alterar não só a
velocidade da catálise como a própria natureza da reação catalisada
Considerando o balanço global, o fígado funciona alternadamente como formador líquido de glicose
a partir de aminoácidos e glicerol durante o jejum (gliconeogénese) e como consumidor líquido de glicose
quando a glicemia aumenta após as refeições. Na regulação do processo desempenham um papel importante
a cínase-1 da frutose-6-fosfato (ATP + frutose-6-fosfato → ADP + frutose-1,6-bisfosfato) e a fosfátase da
frutose-1,6-bisfosfato (frutose-1,6-bisfosfato + H2O → frutose-6-fosfato + Pi) e, em parte, as velocidades da
glicólise e da gliconeogénese hepáticas dependem da atividade relativa destas enzimas que, por sua vez,
dependem da concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato.
A concentração da frutose-2,6-bisfosfato é, por outro lado, uma resultante das atividades relativas de
outra cínase da frutose-6-fosfato (a cínase-2 da frutose-6-fosfato) e de outra fosfátase (a fosfátase da frutose2,6-bisfosfato). Na realidade, as expressões cínase-2 da frutose-6-fosfato e fosfátase da frutose-2,6-bisfosfato
não se referem a enzimas independentes mas a duas atividades antagónicas de uma mesma enzima, que no
estado desfosforilado funciona como cínase e no fosforilado como fosfátase e se designa de “enzima
bifuncional”.
Quando a glicemia é elevada, a concentração de insulina aumenta no plasma e, ligando-se no seu
recetor na face exterior da membrana citoplasmática dos hepatócitos desencadeia uma série de fenómenos
que culminam na ativação de uma fosfátase de proteínas que catalisa a desfosforilação da “enzima
bifuncional”. A “enzima bifuncional” no estado desfosforilado funciona como cínase-2 da frutose-6-fosfato e
leva à formação de frutose-2,6-bisfosfato que, aumentando de concentração no citoplasma se liga, quer à
cínase-1 da frutose-6-fosfato, quer à fosfátase de frutose-1,6-bisfosfato, ativando a primeira e inibindo a
segunda. Ou seja, a glicemia alta vai ter como consequência uma série de fenómenos que culminam na
ativação da glicólise (onde se consome glicose) e na inibição da gliconeogénese (onde se forma glicose); ver
Fig. 5.
Fig. 5: A enzima bifuncional funciona como cínase-2 da frutose-6-fosfato no estado desfosforilado e como
fosfátase da frutose-2,6-bisfosfato no estado fosforilado. A PKA fica ativa quando a glicagina sobe o que, no
fígado, estimula a gliconeogénese e inibe a glicólise.
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Reciprocamente, quando a glicemia desce, a concentração de glicagina aumenta no plasma, liga-se
ao seu recetor na face exterior da membrana citoplasmática dos hepatócitos o que leva à estimulação da
adenilcíclase (ATP → AMP cíclico + PPi) e à acumulação intracelular de AMP cíclico. O AMP cíclico é
ativador alostérico da PKA (cínase de proteínas dependente do AMP cíclico) e um dos substratos desta
cínase de proteínas é a “enzima bifuncional” (“enzima bifuncional” + ATP → “enzima bifuncionalfosforilada” + ADP). A “enzima bifuncional” no estado fosforilado funciona como fosfátase da frutose-2,6bisfosfato e, consequentemente, a concentração de frutose-2,6-bisfosfato desce no citoplasma nestas
condições metabólicas. Esta descida de concentração vai ter consequências antagónicas às referidas no
parágrafo anterior: fica ativada a fosfátase de frutose-1,6-bisfosfato (ativação da gliconeogénese) e inibida a
cínase-1 da frutose-6-fosfato (inibição da glicólise). O fator que está na origem do processo (a glicemia
baixa) desencadeia uma complexa cadeia de eventos cujo resultado (a formação de glicose no fígado) corrige
o fator que está na sua origem; ver Fig. 5.
1.3 O controlo da oxidação dos ácidos gordos
A oxidação dos ácidos gordos ocorre na matriz mitocondrial (oxidação em β) e, no caso dos ácidos
gordos de cadeia longa, o passo limitante da velocidade do processo é o transporte de acis-CoA (“ácidos
gordos ativados”) através da membrana mitocondrial interna. Este processo de transporte é complexo e
envolve a ação de (1) uma transférase da membrana mitocondrial externa (carnitina palmitil-transférase I:
carnitina(fora da mitocôndria) + acil-CoA(fora da mitocôndria) → acil-carnitina(fora da mitocôndria) + CoA(fora da mitocôndria)) que
catalisa a transferência do acilo do acil-CoA para a carnitina, (2) um transportador da membrana
mitocondrial interna que é um trocador (troca acil-carnitina que entra por carnitina que sai; acil-carnitina(fora
da mitocôndria) + carnitina(matriz) → acil-carnitina(matriz) + carnitina(fora da mitocôndria)) e (3) uma outra transférase
(localizada na membrana interna da mitocôndria mas cujo centro ativo está voltado para a matriz) que reverte
o processo catalisado pela primeira transférase permitindo a formação de acil-CoA na matriz (carnitina
palmitil-transférase II: acil-carnitina(matriz) + CoA(matriz) → carnitina(matriz) + acil-CoA(matriz).
A enzima “marca-passo” do processo global é a carnitina-palmitil-transférase I. Esta enzima é
inibida pelo malonil-CoA que se forma no citoplasma por ação catalítica da carboxílase de acetil-CoA
(acetil-CoA + CO2 + ATP → malonil-CoA + ADP + Pi). A carboxílase de acetil-CoA é inibida quando
fosforilada por ação da cínase ativada pelo AMP (AMPK). A AMPK é ativada por fosforilação catalisada
por outra cínase de proteínas e a AMPK é melhor substrato dessa cínase quando está ligada ao AMP; por
outro lado o AMP é ativador alostérico da AMPK fosforilada. Quando a atividade de contração muscular
aumenta, aumenta a concentração de AMP que ativa a AMPK que catalisa a fosforilação e consequente
inativação da carboxílase de acetil-CoA. Esta inativação provoca diminuição na concentração citoplasmática
de malonil-CoA. A diminuição da concentração de malonil-CoA “desinibe” a carnitina-palmitil-transférase I.
A ativação (=desinibição) desta enzima permite a entrada dos acis-CoA para a mitocôndria e,
consequentemente, a oxidação em β fica estimulada [12]. Ver Fig. 6.
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Fig. 6: Síntese e inibição da síntese de malonil-CoA e sua ação no transporte transmembranar de acis-CoA nas
mitocôndrias.
12. Bibliografia
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12. Hardie, D. G., Hawley, S. A. & Scott, J. W. (2006) AMP-activated protein kinase--development of the energy
sensor concept, J Physiol. 574, 7-15.
Este texto foi, em novembro de 2008, escrito por Rui Fontes que agradece as críticas
([email protected]) que entenderem fazer. O texto foi revisto em outubro de 2009 e em
novembro de 2010 e 2011.
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