universidade ceuma-uniceuma gerência de pós

UNIVERSIDADE CEUMA-UNICEUMA
GERÊNCIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
DOMINGOS MAGNO SANTOS PEREIRA
Avaliação da Participação dos Receptores TRPC4 e TRPC5 na Resposta
Inflamatória Induzida por Lipopolissacarídeo
SÃO LUÍS
2015
DOMINGOS MAGNO SANTOS PEREIRA
Avaliação da Participação dos Receptores TRPC4 e TRPC5 na Resposta
Inflamatória Induzida por Lipopolissacarídeo
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
como
parte
dos
requisitos
para
a
obtenção do título de Mestre em Biologia
Parasitária.
Orientador:
Profa. Dra Elizabeth Soares Fernandes
Co-orientador:
Prof. Dr. Marcos Augusto Grigolin
Gristotto
São Luís
2015
DOMINGOS MAGNO SANTOS PEREIRA
Avaliação da Participação dos Receptores TRPC4 e TRPC5 na Resposta
Inflamatória Induzida por Lipopolissacarídeo
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
como
parte
dos
requisitos
para
a
obtenção do título de Mestre em Biologia
Parasitária.
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia
Parasitária, em sessão pública realizada no dia
/
/
, considerou o(a) candidato(a)
(
) APROVADO
(
) REPROVADO
1) Examinador _______________________________________
2) Examinador ________________________________________
3) Examinador ________________________________________
4) Presidente (Orientador)________________________________
A minha mãe, por mesmo de longe me proteger
com suas orações e renovar minhas energias
a cada vez que ouço sua voz
pelo telefone.
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me dado força e saúde para superar minhas dificuldades e lidar
com esse desafio que foi o mestrado.
A universidade Ceuma e todo o corpo docente do mestrado em Biologia
Parasitária por abrir uma janela que me proporcionou uma visão infinitamente
superior de ciência, ética e moral; por ter sido minha casa até mesmo em
muitas noites e fins de semana.
A uma pessoa de coração extremamente amoroso e bondoso que é minha
orientadora Drª Elizabeth Soares Fernandes, por me aceitar como orientando
mesmo sem me conhecer em um momento onde passava por problemas
familiares; por não deixar eu desacreditar na minha capacidade e por me
receber sorrindo todos os dias no laboratório de imunologia; por nunca me
constranger pelos meus erros na frente dos outros e sempre me indicar o
caminho certo; por perdoar meus descuidos e meu sono pesado durante as
manhãs por não conseguir dormir a noite; pelas brincadeiras para tirar minha
tensão e eu poder encontrar dentro de mim mesmo o meu melhor; por me
orientar não somente na minha pesquisa, mas também mostrar que
caminhadas difíceis levam a lugares altos. Obrigado professora por me ensinar
verdadeiramente o que é ética profissional sem abrir mão de humildade e um
sorriso no rosto. Obrigado pelo incentivo e por me fazer perceber que não devo
parar por aqui, mesmo que a saudade da minha família seja grande, assim
como as dificuldades para uma pessoa que saiu do interior. Por sua causa,
hoje já me sinto um mestre e um futuro doutorando. E desculpa por até hoje
não conseguir chamar você de senhora!
Agradeço ao meu Co-orientador Professor Dr. Marcos Augusto Grigolin Gristto
por todas as orientações na minha pesquisa e também pela segurança que me
passou no laboratório; pelas brigas em inglês que sempre me ensinavam algo
a mais e que me faziam concluir que o laboratório de imunologia é cheio de
pessoas não só capacitadas, mas também especiais, cada um do jeito.
Obrigado aos meus colegas da turma VII do mestrado: Adrielle (Zag Zag),
Aruanã, Camilla, Cristiane, Ennio, Enzo, Erika, João, Mariana, Matheus, e
Tiago. Por todo esse convívio eu poderia falar um pouco de cada um, mas
quero resumir apenas em dizer que vocês são especiais e que também foram
como professores pra mim!
Aos meus pais (Luis Gonzaga Martins Pereira e Maria Aparecida de Sá Santos
Pereira), pelo amor, incentivo e apoio incondicional; pelas ligações de todos os
dias de minha mãe perguntando se eu já tinha jantado e se tava bem.
Aos meus irmãos (Cleiton Santos Pereira e Alexandra Mourão), só por vocês
existirem, a cada dia sinto minhas forças revigoradas.
A todos os meus amigos e alunos de iniciação científica, por fazer meus dias
melhores.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Maranhão (FAPEMA) pela bolsa de
mestrado e financiamento do projeto, assim como também à CAPES e CNPq.
A Universidade Federal de Rondônia - UNIR e ao professor Dr. Roberto
Nicolete e sua esposa Profª Larissa Nicolete, por me permitir aprender novas
técnicas de pesquisa, abrindo as portas de seu laboratório.
“Acalente sonhos. Seu futuro está em suas mãos.”
Masaharu Taniguchi
RESUMO
Os canais TRPCs são membros da família dos TRPs. São canais catiônicos
não seletivos para o Ca++ e podem ser ativados por produtos endógenos
oriundos de uma lesão tecidual, como estresse oxidativo. O TRPC4 e o TRPC5
são membros da subfamília de TRPCs e podem está envolvidos em uma
variedade de funções fisiológicas e patológicas, estão presentes em diferentes
tecidos e podem formar homodímeros e heterodímeros na membrana das
células, embora a função destes ainda não esteja elucidada. Um papel
relevante para outros membros da família TRP foi sugerido no controle da
síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SRIS) desencadeada por
infecções bacterianas. No entanto, não existem relatos acerca da relevância
dos receptores TRPC4 e TRPC5 para a SRIS. Assim, o objetivo deste trabalho
foi caracterizar a relevância dos receptores TRPC4/C5 na SRIS induzida pela
endotoxina bacteriana, lipopolissacarídeo (LPS), através da utilização do
antagonista seletivo para estes receptores, ML204, e de camundongos com
deleção gênica para o TRPC5. De forma geral, o bloqueio dos receptores
TRPC4 e TRPC5 agravou o quadro séptico a aumentou a mortalidade dos
animais. Observou-se ainda, que o antagonismo desses receptores causa uma
maior perda de temperatura e pode modular outros mecanismos da SRIS tanto
à nível local, quanto sistêmico. De fato, o bloqueio dos receptores TRPC4/C5,
reduziu tanto os níveis peritoneais quanto sistêmicos de IL-10, além de
aumentar os níveis circulantes de IL-17. Por outro lado, o tratamento com
ML204 não afetou a falência múltipla de órgãos, embora os níveis de lipase
tenham tendido a serem reduzidos. No entanto, animais com deleção gênica
para o TRPC5 tiveram os níveis de ureia aumentados, podendo, este receptor,
exercer uma função protetora renal. Ainda, o bloqueio dos receptores
TRPC4/C5 exacerbou a produção de óxido nítrico em animais sépticos sem, no
entanto, modular a produção de peróxido de hidrogênio e a atividade da SOD.
Ainda, embora o antagonismo do TRPC4/C5 pelo ML204 diminua o número de
células mononucleares circulantes, a ativação endógena desses receptores
não parece contribuir para as alterações das populações de leucócitos
peritoneais em animais sépticos. Este trabalho apresenta as primeiras
evidências de que a ativação por agonistas endógenos para os receptores
TRPC4/C5 pode regular vias inflamatórias associadas à SRIS decorrente de
infecções bacterianas. Algumas destas vias sugerem a relevância específica do
TRPC5 para a proteção de órgãos vitais, como os rins. Por outro lado, pouco
se sabe acerca do impacto da ativação destes receptores por agonistas
exógenos associados à infecções, como a tioredoxina derivada de
microrganismos. Sugere-se então que estes receptores podem ter um papel
ainda mais complexo na resposta do paciente, dependendo da fonte de
agonistas capazes de ativá-los.
PALAVRAS-CHAVES: TRPC4/TRPC5, SIRS/SEPSE, ANTAGONISMO, LPS
ABSTRACT
TRPC channels form the subfamily of channels related to TRP channels. They
are cationic channels non-selective for Ca++ and can be activated by
endogenous products from tissue injury, such as oxidative stress. The TRPC4
and TRPC5 are members of the TRPC subfamily and can be involved in a
variety of physiological and pathological functions, they are present in different
tissues and may form homodimers and heterodimers on the cell membrane,
although the function of them have not yet been elucidated. A role for other
members of the TRP family was suggested in controlling systemic inflammatory
response syndrome (SIRS) triggered by bacterial infections. However, there are
no reports about the relevance of the TRPC4 and TRPC5 receptors for SIRS.
The aim of this study was to characterize the significance of the TRPC4/C5
receptors on SIRS induced by bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS),
through the use of selective antagonist for these receptors, ML204, and mice
with gene deletion for TRPC5 (TRPC5KO). In general, the blockage of the
TRPC4 and TRPC5 receptors worsened the sepsis and increased the animal
mortality. It was also noted that the antagonism of these receptors causes a
greater loss of temperature and can modulate other mechanisms of SIRS both
in local and systemic levels. In fact, the blockade of the TRPC4/C5 receptors
reduced both peritoneal and systemic levels of IL-10 and increased the
circulating levels of IL-17. On the other hand, the treatment with ML204 did not
affect the multiple organ failure, although the lipase levels have tended to be
reduced. However, TRPC5KO animals had the urea levels increased and may
play a protective role for kidney. Furthermore, the TRPC4/C5 blockage
exacerbated nitric oxide production in septic animals without, however,
modulate the production of hydrogen peroxide and SOD activity. Although the
antagonism of the TRPC4/C5 receptors with ML204 decreased the number of
circulating mononuclear cells, the endogenous activation of these receptors do
not seem to contribute to the changes of the peritoneal leukocyte populations in
septic animals. This work presents the first evidence that the TRPC4/C5
activation by endogenous agonists for these receptors may regulate
inflammatory pathways associated with SIRS resulting from bacterial infections.
Some of these pathways suggest the specific relevance of the TRPC5 for the
protection of vital organs such as the kidneys. Moreover, little is known about
the impact of the activation of these receptors by exogenous activation such as
bacteria-derived thioredoxin. It is possible that these receptors may play a more
complex role in patient response, depending on the source of the agonists
activating them.
KEYWORDS: TRPC4/TRPC5, SIRS/SEPSIS, ANTAGONISM, LPS.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) na severidade, sobrevivência, peso e temperatura corporal em animais
com sepse induzida pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS)................................................................................................49
Figura 2: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) nos níveis plasmáticos dos marcadores de falência de órgãos, AST
(aspartato amino-transferase, marcador de falência hepática), creatinina (rins) e lípase
(pâncreas) em animais com sepse induzida pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25
milhões de unidades de endotoxina/Kg em PBS).........................................................52
Figura 3: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) nos níveis plasmáticos de citocinas em animais com sepse induzida pela
injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de endotoxina/Kg em
PBS)..............................................................................................................................54
Figura 4: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) em células leucocitárias circulantes obtidas de animais com sepse induzida
pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de endotoxina/Kg em
PBS)..............................................................................................................................56
Figura 5: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) na concentração peritoneal de citocinas em animais com sepse induzida
pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de endotoxina/Kg em
PBS)..............................................................................................................................58
Figura 6: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) na produção de mediadores inflamatórios peritoneais em animais com
sepse induzida pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS)................................................................................................60
Figura 7: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) em células peritoneais obtidas de animais com sepse induzida pela injeção
intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de endotoxina/Kg em
PBS)............................................................................................................................. 61
Figura 8: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) na fagocitose mediada por macrófagos peritoneais em animais com sepse
induzida pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS)...............................................................................................62
Figura 9: Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 na severidade, peso,
temperatura e pressão sanguínea de camundongos com sepse induzida pela
administração intraperitoneal (i.p) de LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS)................................................................................................64
Figura 10: Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 na falência múltipla de
órgãos de camundongos com sepse induzida por LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS, i.p)..........................................................................................66
Figura 11: Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 na produção dos
mediadores inflamatórios plasmáticos NO e H2O2 na sepse induzida pela
administração intraperitoneal (i.p) de LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS)................................................................................................68
Figura 12: Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 na produção dos
mediadores inflamatórios NO (óxido nítrico) e H2O2 (peróxido de hidrogênio) no sítio
local da inflamação (lavado peritoneal) e na fagocitose mediada por macrófagos
peritoneais, na sepse induzida pela administração intraperitoneal (i.p) de LPS (11,25
milhões de unidades de endotoxina/Kg em PBS).........................................................70
LISTA DE ABREVIATURAS
ACCP
Do inglês American College of Chest Physicians
AIDS
Síndrome da imunodeficiencia adquirida
AST
Aspartato aminotransferase
BASES
Do Inglês Brazilian Sepsis Epidemiological Study
BH4
Tetraidrobiopterina
CASP
Introdução de cateter no cólon ascendente
CLP
Ligadura e perfuração do ceco
DMSO
Dimetilsulfóxido
FAD
Flavina adenia dinucleotídeo
FMN
Flavina mononucleotídeo
H2O2
Peróxido de Hidrogênio
ICAM-1
Molécula de adesão intracelular
IL-1
Interleucina 1
IL-4
Interleucina 4
IL-6
Interleucina 6
IL-8
Interleucina 8
IL-10
Interleucina 10
IFN- γ
Interferon-gama
LPS
Lipopolissacarídeo
MHC
Complexo principal de histocompatibilidade
MSR
Do inglês Macrophage Scavenger Receptor
NADPH
Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
NFB
Fator nuclear kappa B
NK
Células Natural Killer
NO
Óxido nítrico
NOD
Proteína Contendo Domínio de Oligomerização Nucleotídica
NOS
Óxido nítrico sintase
PMA
Forbol miristato acetato
PAF
Fator de ativação plaquetária
PAMPs
Padrões Moleculares Relacionados a Patógenos
pH
Potencial hidrogênico
RNA
Ácido ribonucleico
ROS
Espécies Reativas de Oxigênio
RRP
Receptores de reconhecimento de padrões
SIRS
Síndrome de Resposta Inflamatória Sistêmica
SOC
Canais operados por estoque
SOD
Superóxido dismutase
TGF-𝛽
Do ingles tumoral growth factor 𝛽
TH-1
Células T helper tipo 1
TH-2
Células T helper tipo 2
TLR
Receptores Semelhantes a Toll
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
TRP
Receptores de potencial transitório
TRPC
Receptores de potencial transitório canônico
TRPV
Receptores de potencial transitório vanilóide
TRPM
Receptores de potencial transitório melastatina
TRPP
Receptores de potencial transitório policistina
TRPML
Receptores de potencial transitório mucolipina
TRPA
Receptores de potencial transitório anquirina
UTI
Unidade de terapia intensiva
VCAM-1
Molécula de adesão vascular
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................16
1.1 Sepse..........................................................................................................16
1.2 Resposta Celular Inata na Sepse................................................................17
1.3 Mediadores inflamatórios............................................................................20
1.4 Modelo de endotoxemia..............................................................................27
1.5 Família dos receptores de potencial transitório...........................................29
1.6 TRPC4 e TRPC5.........................................................................................33
1.7 Antagonistas dos receptores TRPC4 e TRPC5..........................................36
2 OBJETIVOS...................................................................................................39
2.1 Geral............................................................................................................39
2.2 Específicos..................................................................................................39
3 METODOLOGIA............................................................................................40
3.1 Animais........................................................................................................40
3.2 Tratamento farmacológico...........................................................................40
3.3 Modelo de endotoxemia..............................................................................41
3.4 Temperatura e peso....................................................................................42
3.5 Avaliação de danos em múltiplos órgãos....................................................42
3.6 Dosagem de ureia.......................................................................................42
3.7 Análise do sangue e lavado peritoneal........................................................43
3.8 Dosagem de NOx.........................................................................................43
3.9 Dosagem de H2O2.......................................................................................44
3.10 Dosagem da superóxido-dismutase (SOD) ..............................................44
3.11 Dosagem de citocinas...............................................................................45
3.12 Fagocitose “Ex vivo” .................................................................................45
3.13 Drogas e reagentes...................................................................................46
3.14 Análise estatística......................................................................................46
4 RESULTADOS...............................................................................................47
4.1 Score de severidade, mortalidade, peso e temperatura corporal................47
4.2 Efeito do ML204 nos marcadores de falência de órgãos ...........................51
4.3 Efeito do ML204 na produção de citocinas plasmáticas.............................53
4.4 Efeito do ML204 no perfil de células sanguíneas........................................55
4.5 Efeito do ML204 na produção de citocinas no lavado peritoneal...............57
4.6 Efeito do ML204 na produção de NO, H2O2 e atividade da SOD................59
4.7 Efeito do ML204 no perfil de células peritoneais.......................................61
4.8 Efeito do ML204 na fagocitose mediada por macrófagos .........................62
4.9 Efeito da deleção gênica para o TRPC5 no score Severidade, peso e
temperatura em camundongos.........................................................................63
.
4.10 Efeito da deleção gênica para o TRPC5 nos marcadores de falência
múltipla de órgãos.............................................................................................65
4.11 Efeito da deleção gênica para o TRPC5 na produção plasmática de NO e
H2O2...................................................................................................................67
4.12 Efeito da deleção gênica para o TRPC5 na produção peritoneal de NO,
H2O2 e fagocitose mediada por macrófagos....................................................69
6 DISCUSSÃO.................................................................................................71
7 CONCLUSÃO...............................................................................................87
REFERÊNCIAS................................................................................................89
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 Sepse
A sepse pode ser definida como síndrome da resposta inflamatória
sistêmica (SRIS), podendo ser desencadeada em resposta a diferentes
agentes infecciosos como bactérias, fungos e vírus (WARD, 2012). As
infecções causadas por bactérias Gram-negativas são as mais frequentes,
apesar de nos últimos anos ter sido observado um aumento de casos de sepse
causada por bactérias Gram-positivas (BENJAMIN, 2001). Usualmente, o início
do quadro clínico se manifesta com alterações inespecíficas e sutis dos sinais
vitais como taquicardia e taquipnéia (KNOBEL, 2005) e evolui clinicamente sob
diferentes formas: i) a sepse grave, a qual encontra-se associada à disfunção
de órgãos, hipoperfusão e hipotensão; ii) o choque séptico, associado a
hipoperfusão e hipotensão persistente; e iii) a síndrome da disfunção de
múltiplos órgãos, a qual pode representar o estágio final da resposta sistêmica
grave à infecção (CARVALHO et al., 2010).
A resposta inflamatória sistêmica característica da sepse ocorre de
forma descontrolada e é caracterizada pela produção desbalanceada de
mediadores
inflamatórios,
excessiva
vasodilatação,
extravazamento
plasmático, hipotensão, lesão tecidual e, finalmente, a falência de múltiplos
órgãos, responsável pela letalidade da sepse (DEVESA et al., 2011).
Clinicamente, pelo menos duas das seguintes alterações devem estar
presentes: hipertermia ou hipotermia, aumento ou redução da frequência
cardíaca, diminuição da frequência respiratória e alterações na contagem de
células brancas do sangue (leucopenia, leucocitose ou presença de formas
celulares imaturas maior que 10%). Sendo assim, de acordo com uma
conferência realizada pela American College of Chest Physicians e a Society of
Critical Care Medicine em agosto de 1991, a SRIS é uma resposta inflamatória
a uma grande variedade de condições clínicas severas. Essa resposta é
manifestada por duas ou mais das seguintes condições: 1) temperatura > 38 oC
ou < 36oC; 2)freqüência cardíaca > 90 bpm; 3) freqüência respiratória > 20 ipm
17
ou pCO2 < 32 mmHg; 4) contagem de glóbulos brancos > 12.000/ mm 3 ou <
4.000/mm3 ou bastonetes > 10% (BONE et al., 1996).
A sepse possui uma incidência relativamente alta, sendo a principal
causa de morte nas unidades de terapia intensiva (UTI) (MARTIN, 2003).
Países como a Finlândia apresentam cerca de 38 casos de sepse por 100.000
habitantes (KARLSSON et al., 2007). Da mesma forma, a incidência da sepse
por cada 100.000 habitantes é de 51 casos na Inglaterra, Gales e Irlanda do
Norte (PADKIN, 2003), 77 casos na Oceania (FINFER et al., 2004), 81 casos
nos EUA (MARTIN et al., 2003), e 95 casos na França (BRUN-BUISSON et al.,
2004). A taxa de mortalidade da sepse pode variar de 20% a 80% dependendo
da rapidez de diagnóstico e tratamento (ANDRADE et al., 2006). No Brasil, o
estudo BASES (Brazilian Sepsis Epidemiogical Study) (SILVA et al., 2004),
desenvolvido em cinco UTI dos estados de São Paulo e Santa Catarina,
mostrou uma incidência de sepse, sepse grave e choque séptico de 46,9%,
27,3% e 23%, respectivamente, com taxa de mortalidade de 33,9%, 46,9% e
52,2%. Um estudo posterior avaliou a incidência da sepse em 75 UTI em todas
as regiões do país. Em uma população de 3.128 pacientes, 16,7%
apresentaram sepse, com uma mortalidade geral de 46,6%. Quando
discriminados em sepse, sepse grave e choque séptico, a incidência foi 19,6%,
29,6% e 50,8% e a mortalidade foi 16,7%, 34,4% e 65,3%, respectivamente
(SALES et al., 2006). Outro estudo realizado na região sul do Brasil em
pacientes com choque séptico admitidos em UTI, durante os anos de 2003 e
2004, mostrou incidência de 30% e mortalidade de 66,5% (DIAS et al., 2007).
1.2 Resposta Celular Inata na Sepse
As células do sistema imune (tais como neutrófilos, macrófagos, células
dendrídicas, linfócitos T reguladores e células natural killers) formam a frente
inicial de defesa do organismo frente a infecções, exercendo funções
importantes como fagocitose, ação microbicida, produção de mediadores
inflamatórios, apresentação de antígenos e subsequente ativação da resposta
imune específica ao microrganismo invasor (LUKAS et al., 2015). O
reconhecimento do microrganismo pelo hospedeiro é realizado através de
18
receptores específicos, chamados receptores de reconhecimento de padrões
(RRP), os quais são capazes de reconhecer padrões moleculares associados à
patógenos (PAMPs) (EASTON et al., 2009). Os PAMPs incluem proteínas, RNA,
DNA, sacarídeos, lipídios, dentre outras moléculas derivadas do microrganismo
invasor (MOGENSEN, 2009). Já a família de RRPs engloba receptores do tipo
Toll (TLR; do inglês Toll-like receptors), esses receptores foram descobertos
durante estudos com a resposta imune inicial em cepas de Drosophila
(HANSSON et al., 2005). Estes estudos apontaram que esses receptores eram
capazes de reconhecer fragmentos de bactérias, fungos ou vírus, iniciando
assim a resposta imune inata. Antes da descoberta desses receptores,
acreditava-se que a produção de mediadores inflamatórios se dava apenas
após a fagocitose, o que levou a comunidade científica a investir em pesquisas
tomando por objetivo principal, buscar algo semelhante em humanos. Logo
após, o primeiro TLR foi caracterizado em humanos, o TLR4 (MEDZHITOV et
al., 1997b). Com o avanço das pesquisas, mais de 10 tipos desses receptores
foram caracterizados, cada um apresentando especificidade para diferentes
PAMPs, tais como: TLR1 é responsável pelo reconhecimento de lipopeptídeos
bacteriano; TLR2: peptídeoglicanos; TLR3: dsRNA (RNA dupla fita); TLR4:
lipopolissacarídeo; ácido lipoteicóico; TLR5: flagelo bacteriano; TLR6: diacillipopeptídeos; TLR7: ssRNA (RNA fita simples, regiões ricas em uracila); TLR8
ssRNA (RNA fita simples, regiões ricas em guanina); TLR9: CpG DNA
(MEDZHITOV et al., 2000).
Após a caracterização desses receptores, os TLRs receberam
importante atenção devido a sua capacidade de reconhecer moléculas que
desencadeiam a resposta imunológica. O TRL4 (também conhecido como
CD284) reconhece moléculas como o LPS, uma endotoxina presentes em
bactérias Gram-negativas e iniciam a resposta inflamatória da sepse, mediada
por citocinas pró-inflamatórias (OKLA et al., 2015). Outros receptores também
estão envolvidos com o reconhecimento de PAMPS, tais como moléculas de
superfície, como o receptor de macrófagos scavenger (MSR; do inglês
Macrophage Scavenger Receptor), CD11b/CD18, canais iônicos (COHEN,
2002) e outros receptores intracelulares como o NOD1 e NOD2
que
reconhecem microrganismos que penetram no citoplasma celular, como
19
algumas espécies de bactérias intracelulares ou
detectam produtos que
podem ser liberados dentro do citoplasma decorrentes dos processos de
fagocitose e degradação de micróbios (WILLMENT & BROWN, 2008).
Recentemente foi demonstrado que membros da família de Receptores de
Potencial Transitório (do inglês Transient Receptor Potential Channels) também
podem ser ativados por compostos microbianos, como o LPS (MESEGUER et
al., 2014).
Quando ocorre a infecção ou bacteremia, a primeira linha de defesa do
hospedeiro é realizada por células fagocitárias (macrófagos, monócitos e
granulócitos polimorfonucleares) que reconhecem e destroem esses patógenos
(LUKAS et al., 2015). Os componentes dos patógenos, como o LPS
desencadeiam uma cascata inflamatória, estimulando as células a produzirem
e liberarem mediadores inflamatórios como interleucinas, quimiocinas,
moléculas de adesão, radicais livres de oxigênio, óxido nítrico, dentre outros;
além de expressarem diferentes receptores, ocasionando assim, a amplificação
do processo inflamatório (BALDWIN, 2001). À medida que a inflamação local
progride, novas células são recrutadas, inclusive à partir da medula óssea,
sendo comum a presença de células não maduras no siítio de inflamação
(ARLETE et al., 2009). Em alguns casos, a inflamação local passa a tomar
dimensões sistêmicas, uma vez que a proliferação de bactérias e/ou a
liberação e disseminação de componentes bacterianos na circulação acarreta
um processo inflamatório generalizado, e provocando assim, alterações da
perfusão e consequentemente falência de órgãos vitais, podendo levar ao óbito
do paciente.
Neste contexto, os macrófagos exercem um papel primordial. Estas
células, residentes em diferentes tecidos e mucosas, são capazes de fagocitar
microorganismos e/ou antígenos, apresentar antígenos bacterianos aos
linfócitos T, e subsequentemente estimular uma resposta específica ao
estímulo infeccioso. Desta forma, a próxima seção detalhará a relevância da
resposta imune como maquinaria para a produção de mediadores inflamatórios
e seu impacto na resposta a infecções bacterianas.
20
1.3 Mediadores inflamatórios
Durante a sepse há uma produção excessiva de mediadores
inflamatórios, principalmente citocinas, quimiocinas, mediadores lipídicos e
radicais de oxigênio e nitrogênio. Normalmente, durante a resposta
inflamatória, essas moléculas são necessárias para aumentar a infiltração de
leucócitos no sítio da infecção, na tentativa de destruir o patógeno invasor e
reparar danos teciduais (DEVESA et al., 2011).
O quadro séptico induz nos macrófagos, um aumento do consumo de
glicose e oxigênio, capacitando-os para matar microorganismos e células
tumorais. Os macrófagos também são um dos mais potentes reconhecedores
de LPS, sendo altamente ativados em contato com essas moléculas (GYORFY
et al., 2013). Durante a fagocitose, Macrófagos e Neutrófilos produzem espécies
reativas de oxigênio (EROs), devido à estimulação com vários agentes através
da ativação do complexo de enzimas NADPH (Nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato reduzida) oxidase (FORMAN & TORRES, 2002).
A produção biológica de EROs está diretamente relacionada com
diversas funções biológicas, tais como a ativação transcricional, proliferação
celular e apoptose (FORMAN & TORRES, 2002). Esse processo de produção
de ERO é chamado de burst oxidativo, devido ao consumo transitório de
oxigênio e é considerada um importante evento durante a fagocitose, tendo
efeitos bactericida (FORMAN & TORRES, 2002).
A ocorrência do busrt oxidativo é observada em resposta à ativação de
neutrófilos e macrófagos por mediadores inflamatórios solúveis específicos ou
particulados e está associado com um aumento do consumo de oxigênio de 2 a
20 vezes e também ao aumento do metabolismo da glicose, dependendo da
célula e da natureza do estímulo, sendo o LPS uma importante molécula para a
ativação de macrófagos e burst oxidativo (GRAHAM et al., 2015). Durante o
burst oxidativo, as moléculas de oxigênio (02) sofrem redução a ânions
superóxidos (O2-). O complexo NADPH age como doador de elétrons, sendo a
enzima flavocitocromo oxidase b558 (Componente do NADPH) que medía essa
reação. O superóxido formado é, então, convertido em H2O2 com a ajuda da
enzima superóxido dismutase (SOD) (FANG, 2004). O peróxido de hidrogênio
21
exerce diversas funções no organismo humano, dentre elas, atua como
molécula sinalizadora, é um agente citotóxico no sistema de defesa e também,
em alguns casos, pode causar doenças (FORMAN & TORRES, 2002;
HALLIWELL et al., 2004).
A produção de óxido nítrico ocorre a partir da oxidação do átomo de
nitrogênio do aminoácido L-arginina, mediada pela enzima óxido nítrico sintase
(NOS). Logo em seguida o NO é convertido em nitrito (NO2-). Atualmente
existem três isoformas de NOS conhecidas e foram descritas baseadas nas
características gênica de cada uma, sendo duas isoformas constitutiva (cNOS),
as quais são sensíveis à estimulação pelo cálcio, denominadas óxido nítrico
sintase endotelial (eNOS) e óxido nítrico sintase neuronal (nNOS). Ainda, uma
forma induzida de óxido nítrico sintase (iNOS) exerce um papel essencial na
produção de NO durante processos inflamatórios
(PACHER et al., 2007). A
cNOS é responsável pela produção de pequenas concentrações de NO, nano
ou picomols e sua ativação é dependente da interação com a calmodulina e é
controlada pelos níveis de Ca++ (ALDERTON et al., 2001). A iNOS está presente
nos macrófagos, é cálcio dependente e sua atividade é induzida por citocinas,
como o fator de necrose tumoral - Alfa (TNF-α), a interleucina-1 (IL-1) e o
interferon-gama (IFN- γ), além de também ser induzida por componentes
estruturais microbianos, como o lipopolissacarídeo, presente na parede celular
de bactérias gram-negativas (FÖRSTERMANN
et al., 2012). A iNOS é
responsável por uma maior produção de NO e a síntese desse mediador
inflamatório dura até a completa depletação de L-arginina e dos co-fatores
necessários para sua produção, ou até ocorrer a morte celular, cessando a
infecção/inflamação (FÖRSTERMANN et al., 2012).
A síntese de NO envolve duas etapas, a hidroxilação de um dos
nitrogênios guanidinos da L-arginina para gerar NG-hidroxi-L-arginina (NHA),
reação mediada pelo complexo NADPH e O2 e, provavelmente, envolve o
complexo heme da NOS. Após essa reação, ocorre a conversão da NHA em
nitrito (NO) e L-citrulina. Os co-fatores utilizados nesta reação são: Flavina
adenia
dinucleotídeo
(FAD),
flavina
tetraidrobiopterina (BH4) (YAMASAKI, 2000).
mononucleotídeo
(FMN)
e
a
22
O NO tem um vasto papel no organismo, desempenhando uma
variedade de processos fisiológicos, como a regulação do sistema imune
(PEREIRA et al., 2011). O óxido nítrico também atua na imunidade inata, tendo
um potencial microbicida, antibacteriano, antiviral e antiparasitária, atuando em
altas concentrações e sendo tóxico para microorganismos invasores. Em
concentrações mais elevadas o NO pode desenvolver toxicidade às células do
hospedeiro (PEREIRA et al., 2011).
No processo inflamatório, o NO tem um duplo papel. Quando secretado
em altas concentrações pelos macrófagos, possui um importante papel na
defesa contra microorganismos e células tumorais (RAFIEE et al., 2003). Por
outro lado, a produção exacerbada de NO, necessária para os efeitos próinflamatórios, estão relacionados a diversas doenças como o choque séptico,
doenças auto-imunes e cardiovasculares (FÖRSTERMANN et al., 2012).
O NO também pode sofrer um processo oxidativo com espécies reativas
de O2, formando outros intermediários ativos, como o peroxinitrito, capaz de
reagir com a tirosina e cisteína das proteínas. Longa exposição a grandes
concentrações de NO (como ocorre quando a iNOS é ativada) inibe a atividade
de diversas enzimas, como a aconitase, citocromo C oxidase e ribonucleotídeo
redutase, sendo assim, o óxido nítrico pode se tornar citotóxico ou citoestático.
No entanto, em concentrações não tão altas o NO se torna uma molécula
sinalizadora útil em diversos eventos fisiológicos, como a ativação de alguns
receptores presentes em diversas células, inclusive endoteliais (ACHIKE &
KWAN, 2003).
Elevadas concentrações de NO sintetizadas por macrófagos pode
contribuir para a capacidade de essas células suprimirem a proliferação
linfocitária. As citocinas produzidas por linfócitos ativados regulam a síntese de
NO nos macrófagos (MOILANEN & VAPAATALO, 1995).
Dentre os mediadores inflamatórios produzidos durante a sepse
ressaltam-se as citocinas TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 e IL-10. Após o
reconhecimento dos PAMPs e ativação das células do sistema imune, ocorre a
translocação do NFB ao núcleo e a expressão gênica dessas moléculas é
aumentada (BALDWIN et al., 2001). As citocinas pró-inflamatórias aumentam a
expressão de moléculas de adesão em leucócitos e células endoteliais.
23
Embora os neutrófilos ativados destruam microorganismos, eles também
causam aumento da permeabilidade vascular, ocasionando edema tecidual.
Além disso, as células endoteliais ativadas liberam óxido nítrico, um potente
vasodilatador que tem papel fundamental na patogênese do choque séptico
(RUSSEL, 2006). A ativação dos monócitos e macrófagos e a intensa ação dos
mediadores iniciais acarretam a síntese de outras citocinas, como IL-6, IL-10,
com vários efeitos sinérgicos e antagônicos na resposta inflamatória. A
secreção de IL-6 leva à reprogramação da expressão gênica hepática, a
chamada “resposta de fase aguda”, caracterizada pela produção de proteínas
de fase aguda como a proteína C reativa e a supressão das proteínas
negativas de fase aguda, como a albumina (KORTEGEN et al., 2006).
A produção de TNF-α na sepse é ativada em monócitos/macrófagos
pelo LPS, e também por mediadores endógenos, como a interleucina-1 (IL-1).
Uma alta concentração de TNF pode ser encontrada no plasma em diversas
doenças inflamatórias e infecciosas, como sepse, meningite bacteriana, malária
cerebral, síndrome da angústia respiratória do adulto, Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (AIDS) e artrite reumatóide (PLODER et al., 2006). O
papel do TNF-𝛼 e da IL-1 na sepse foi demonstrado em diversos estudos,
incluindo estudos em modelos de animais experimentais de choque séptico e
sepse em humanos. A administração de LPS (proveniente de bactérias gramnegativas, como a E. coli) resulta em uma produção e liberação de TNF-𝛼 e IL1 no sistema circulatório, onde o pico de concentração é detectado entre 60 e
90 minutos após a administração de LPS. Uma vez liberadas, TNF-𝛼 e IL-1
agem em diferentes células alvo, tais como macrófagos, células endoteliais e
neutrófilos. O TNF-𝛼 leva o aumento da produção de macrófagos nas células
progenitoras (SENCHINA et al., 2007) e promove a ativação, diferenciação e
aumenta a capacidade de sobrevivência dessas células (CONTE et al., 2006).
O TNF-𝛼 estimula linfócitos T e B, induz a febre, estimula hepatócitos a
produzirem proteínas de fase aguda e ainda suprime a lipase lipoproteíca,
contribuindo para a caquexia (SCHULTE et al., 2013). Nas células endoteliais, o
TNF-𝛼 aumenta a expressão de moléculas de adesão, tais como a molécula de
adesão intracelular (ICAM)-1, molécula de adesão vascular (VCAM)-1 e
quimiocinas (NAKAE et al., 1996; SHIMAOKA, 2008). Também aumenta a
24
expressão de integrinas e adesinas nos neutrófilos e promovem seu
extravasamento para os tecidos. Ambas TNF-𝛼 e IL-1 foram identificadas como
os principais mediadores da inflamação induzida por ativação da coagulação,
com o TNF-𝛼 tendo uma potente ação reguladora pro-coagulante na expressão
endotelial. Além disso, o TNF-𝛼 e a IL-1 amplificam cascatas inflamatórias de
forma autócrina e parácrina, ativando macrófagos que secretam outras
citocinas pro-inflamatórias (IL-6, IL-8 e MIF), mediadores lipídicos e espécies
reativas de oxigênio e hidrogênio (COHEN, 2002; SCHULTE et al., 2013),
levando a disfunção de órgãos. Devido a sua capacidade única de modular a
liberação de todas estas citocinas, o TNF-𝛼 é considerado o "regulador mestre"
na produção de citocinas pro-inflamatórias (PARAMESWARAN & PATIAL,
2010).
A expressão de TNF-α também é dependente da ativação do fator de
transcrição NFκB (EIGLER et al., 1997; SCHULTE et al., 2013), um fator de
transcrição que possui um papel crítico na expressão de mediadores
inflamatórios. Esse fator está sequestrado no citosol, formando um complexo
com seu inibidor, o IκB (FORMAN & TORRES, 2002). O NFκB possui uma
variedade de função quando comparado a outros fatores de transcrição até
então caracterizados.Isto é devido a variados estímulos capazes de o ativarem,
bem como a inúmeros genes e fenômenos que ele regula. Entre esses
estímulos estão os neurotransmissores (como o glutamato), neurotrofinas,
proteínas neurotóxicas (como a β-amilóide), citocinas (IL-1 e TNF-α),
glicocorticóides, ésteres de forbol, peptídeo natriurético atrial, ceramidas,
produtos provenientes de vírus e bactérias, irradiação ultravioleta, produtos de
reações de enzimas como a iNOS e a ciclooxigenase tipo 2 (COX-2).
Independendo do estímulo, parece haver participação de espécies reativas de
oxigênio (estresse oxidativo) e o aumento de cálcio intracelular para a ativação
do NFB. A implicação desse fator de transcrição como alvo terapêutico é
decorrente da variedade de genes que sofrem regulação pelo fator NF-B,
envolvidos em vários processos celulares, tais como desenvolvimento,
plasticidade, morte e defesa celular. Entre tais genes, podem ser citados os
envolvidos na produção de enzimas, como a iNOS, a COX-2 e a SOD, e de
citocinas, como o TNF-α (GLEZER et al., 2000).
25
A IL-6 é uma glicoproteína produzida por uma grande variedade de
células, tais como células dendrídicas, macrófagos, linfócitos, células
endoteliais, fibroblastos e células do músculo liso em resposta à estímulo com
lipopolissacarídeo, IL1 e TNF-α (ROSSOL et al., 2011; SCHELLER & ROSEJOHN, 2006). Elevadas concentrações de IL-6 são detectadas em muitas
condições inflamatórias agudas, como queimaduras, cirurgias de grande porte
e sepse, tendo seu pico de concentração subsequente ao do TNF-α e IL-1
(MARÍA et al., 2012). Essas condições em que os níveis de IL-6 se mantêm
elevados são correlacionadas como indicadores de gravidade de muitas
doenças e escores clínicos (SEN et al., 2012), estresse pós-cirurgia
(CRUICKSHANK et al., 1990), trauma (BOTHA et al., 1994), falha múltipla de
órgãos e choque séptico (SADOWSKY et al., 2015) e mortalidade em geral
(SEN et al., 2011). A IL-6 tem uma variedade de efeitos biológicos, incluindo a
ativação de linfócitos B e T, o sistema de coagulação e a modulação da
hematopoiese (MARÍA et al., 2012). Em contraste com o TNF-α e IL-1, a
injeção de IL-6 por si só não pode produzir uma resposta inflamatória sistêmica
(PREISER et al., 1991). Uma de suas principais funções é a indução da febre
(DINARELLO, 2004) e a mediação da resposta da fase inflamatória aguda,
uma reação sistêmica devido a um estímulo inflamatório que é caracterizado
por febre, leucocitose e a liberação de proteínas hepáticas, tais como proteína
C-reativa, componentes do sistema complemento, fibrinogênio e ferritina
(HEINRICH et al., 1990). Embora suas propriedades pro-inflamatórias, a IL-6
também tem demonstrado promover respostas anti-inflamatórias, inibindo a
liberação de TNF-α e IL-1 (STARKIE et al., 2003), melhorando também os
níveis circulantes de mediadores anti-inflamatórios, como IL-1Ra, TNFRs, IL10, TGF-𝛽 e cortisol (STEENSBERG et al., 2003; XIAO et al., 2005). Em estudo
experimental, a IL-6 demonstrou um efeito protetor durante a endotoxemia,
causada por LPS, por exemplo (XING et al., 1998).
A IL-10 é produzida por diversos tipos de células do sistema
imunológico, como os monócitos, macrófagos, linfócitos B e T e células
assassinas naturais ou NK (LATIFI et al., 2002). Estudos funcionais revelaram
que a IL-10 possui funções anti-inflamatórias, inibindo a produção de
mediadores pro-inflamatórios, tais como TNF-α, IL-1, IL-6, IFN-γ e GM-CSF em
26
células do sistema imune (MALEFYT et al., 1991). Em contraste, a IL-10 não
possui nenhum efeito na expressão constitutiva de TGF-β, uma citocina
também com propriedades anti-inflamatórias. Além disso, a IL-10 estimula a
produção de IL-1Ra e sTNFRs, neutralizando assim as ações pro-inflamatórias
de IL-1 e TNF (SEITZ et al., 1995). Em um modelo experimental murino, a
administração de IL-10 recombinante protegeu os camundongos de uma
endotoxemia letal, mesmo quando a injeção de IL-10 foi injetada 30 minutos
após a administração de LPS (HOWARD et al., 1993). Em contraste, a
imunoneutralização dessa citocina resultou em níveis circulantes elevados de
TNF-α e IL-6 (HOWARD & O'GARRA, 1992) e inverteu a capacidade da IL-10
de proteger os animais contra uma endotoxemia letal (HOWARD et al., 1993).
Apesar dos efeitos protetores da IL-10 em patologias induzidas por LPS, suas
ações nem sempre foram benéficas no modelo de sepse polimicrobiana (CLP).
De fato, a inibição da IL-10 doze horas após a CLP, aumentou a sobrevivência
dos animais (SONG et al., 1999). No entanto, a administração de anticorpos
que neutralizam IL-10 no momento da CLP parcialmente agravou a mortalidade
(VANDERPOLL et al., 1995). Estes achados indicam que o tempo para
administração de anticorpo anti-IL-10 é crucial para o resultado e que a IL-10
pode apresentar efeitos protetores ou nocivos durante a sepse.
A interleucina-17 (IL-17) é uma citocina pró-inflamatória produzida por
células T (T helper 17), suas funções biológicas ainda são muito estudadas,
porém, sabe se que ela é responsável pela ativação e maturação de neutrófilos
e também estimula os macrófagos a produzirem e expressar outras citocinas
pró-inflamatórias, como o TNF-α. Estudos mais recentes comprovaram que a
IL-17 não era apenas uma, mas uma família (que inclui IL-17A a F) de citocinas
com efeitos semelhantes (ZRIOUAL et al., 2008; WRIGHT et al., 2008). As
células produtoras de IL-17, as Th17 foram descobertas em 2005/2006, como
células do tipo T CD4+, diferentes das demais já conhecidas (T helper 1 e T
helper 2), contribuindo assim, para a melhor compreensão da patogenia de
várias doenças autoimunes, como a artrite reumatoide, psoríase, doença de
Crohn, esclerose múltiplica, etc (IVANOV et al., 2009; HEO et al., 2010). Além
da produção de citocinas pro-inflamatórias e da ativação e maturação de
neutrófilos, a IL-17 também está envolvida nas interações entre células através
27
da expressão do Receptor Activator of Nuclear kB Ligand (RANKL)
(PARSONAGE et al., 2008).
Durante o quadro séptico, diversos parâmetros imunológicos são
ativados com a finalidade de proteger o organismo da infecção, no entanto, a
resposta imunológica exacerbada pode também contribuir para um pior
prognóstico do paciente, com isso, ao estudar a sepse, é importante a escolha
de um modelo experimental animal que desencadeie os mesmos mecanismos
da sepse humana; o modelo de sepse escolhido no presente trabalho será
explorado no próximo tópico.
1.4 Modelo de endotoxemia
Diferentes modelos experimentais têm sido empregados no estudo da
sepse, incluindo modelos animais. Dentre estes, destacam-se a inoculação de
bactérias ou endotoxinas por via intravascular ou intraperitoneal, a ligadura e
perfuração do ceco, introdução de cateter no cólon ascendente, modelos de
infecção de tecidos moles, modelos de pneumonia e de meningite (GARRIDO,
2004). Apesar de nenhum dos modelos de experimentação em animais ser
capazes de mimetizar todos os aspectos da sepse humana, eles são úteis em
fornecer informações acerca da fisiopatologia da síndrome da resposta
inflamatória sistêmica característica da sepse, e para o estudo de terapias
alternativas para o tratamento da mesma.
A escolha do modelo experimental para o estudo da sepse então, deve
levar em consideração os seguintes critérios: 1. Capacidade de prever os
resultados positivos e negativos de novos agentes terapêuticos; 2. Baixo custo;
3. Ser reprodutível dentro de um determinado laboratório; 4. Ser reprodutível
em diferentes laboratórios; 5. Ser humanitário; 6. Ser capaz de prever o ponto
de mortalidade; 7. Reproduzir os parâmetros hemodinâmicos, hematológicos e
bioquímicos de maneira similar ao observados na sepse humana (LIMA et al.,
2011). No presente estudo foi utilizado o modelo de sepse por injeção
intraperitoneal de lipopolissacarídeo (LPS), que será discutido a seguir.
O LPS é um componente bacteriano muito utilizado como modelo
experimental para induzir a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SRIS)
28
associada à sepse em animais (FINK, 2014). A administração de LPS pode ser
realizada por via endovenosa ou intraperitoneal. Após a administração da
endotoxina, a resposta inflamatória é iniciada a partir desse foco infeccioso,
mimetizando a sepse humana através da produção local e sistêmica de
mediadores inflamatórios como citocinas e quimiocinas. Assim, desencadeia
fenômenos inflamatórios sistêmicos, como a migração de células inflamatórias
para o local da inflamação, coagulação intravascular disseminada, disfunção
vascular e ocasionando falência múltipla de órgãos devido ao excesso de
mediadores da resposta inflamatória como os reativos de oxigênios que
diminuem a irrigação sanguínea dos órgãos devido a hipoperfusão (WARD,
2012). Uma das desvantagens deste modelo é devido ao início do processo
ocorrer de forma muito rápida, e não gradativa, como acontece na maioria dos
casos clínicos (NEMZEK, 2008).
A endotoxemia é um modelo experimental utilizado para mimetizar a
SRIS característica de quadros de sepse estéril, com vantagens sobre o
controle da dose e reprodutibilidade de resultados (THOMAS et al.,2014). No
entanto, este modelo experimental emprega frequentemente animais jovens ao
contrário da sepse humana, na qual a maioria dos casos é observada em
idosos e pacientes com outras doenças associadas, onde nem sempre o
agente causal é conhecido e as vezes é provocada por mais de uma bactéria
ou outros microrganismos, como fungos e vírus (LIMA et al., 2011). De forma
geral, apesar das diferenças em comparação com a sepse humana, o modelo
de endotoxemia tem contribuído bastante para o entendimento dos
mecanismos sistêmicos da sepse e do choque séptico; ainda, é útil para
compreender alguns aspectos clínicos da sepse humana, visto que, mesmo
após a morte da bactéria, as endotoxinas liberadas da parede celular desses
microorganismos ainda continuam desencadeando a SRIS no paciente, o qual
pode ir a óbito devido a essa resposta inflamatória continuada. Ressalta-se que
na sepse clínica mesmo após a morte bacteriana aproxidamente 50% dos
pacientes vão a óbito devido a inflamação causada por componentes/produtos
bacterianos como as endotoxinas presentes na circulação. Além do mais, o
modelo de endotoxemia, por não ter intervenção cirúrgica, é um modelo que
reduz o sofrimento animal. Visto que os mecanismos da sepse e dos modelos
29
experimentais são medeiados por diversos receptores presentes no organismo,
investigamos o papel de receptores ainda pouco conhecidos na modulação da
resposta imune; tais receptores serão descritos a seguir.
1.5 Família dos receptores de potencial transitório
Os canais TRPs foram descobertos em 1969 quando Cosens e Manning
identificaram uma variedade mutante de Drosophila melanogaster, um inseto
conhecido como mosca-da-fruta. Era observado que esses insetos mutantes
ficavam cegos quando eram expostos a intensa iluminação. Analisando o
sistema visual desses insetos, observou-se que as cepas mutantes de
Drosophila apresentavam respostas no eletroretinograma transitórias à
estimulação luminosa intensa prolongada, enquanto cepas com fenótipo normal
apresentavam uma resposta contínua. Assim, a denominação de receptor de
potencial transitório (TRP) foi designada ao fotoceptor desta variante mutante
do inseto, devido à resposta transitória a partir da exposição e estimulação com
luz intensa (NILIUS et al., 2011). Posteriormente, pesquisadores isolaram a
região do DNA que expressava o gene trp que, depois de clonado e
sequenciado, foi descrito como contendo 1275 aminoácidos e seis domínios
transmembrana (ISHIMARU et al., 2009).
A superfamília dos receptores TRPs (do inglês, transient receptor
potential) são canais iônicos que se diferenciam dos outros pela sua
seletividade de íons e modos de ativação. Nos mamíferos compreendem cerca
de 30 membros diferentes e estão divididos em sete subfamílias com base na
homologia de suas sequencias de aminoácidos: Canônica (TRPC; inclui
TRPC1-7), Melastatina (TRPM; inclui TRPM1-8), Vanilóide (TRPV; inclui
TRPV1-6), Policistina (TRPP; inclui TRPP1-3), Mucolipina (TRPML; inclui
TRPML1-3), Anquirina (TRPA; inclui TRPA1) e NOMPC (TRPN; expressos em
Drosophila sp, sapos, truta e vermes) (PEDERSEN et al, 2005). Seus membros
compartilham características comuns de seis domínios transmembranais,
variações nas sequências de aminoácidos e a permeabilidade iônica. As
regiões N- e C-terminal são voltadas para o meio intracelular e os domínios
transmembranais, em conjunto, formam um poro entre os domínios 5 e 6, por
30
onde ocorre o influxo de íons (CLAPHAM, 2003; LEVINE & ALESSANDRIHABER, 2007). A maioria dos TRPs são canais catiônicos não seletivos
expressos nas membranas celulares e apresentam índices de permeabilidade
variável para o Ca++. Eles medeiam funções sensoriais (Como a visão,
nocicepção, paladar, temperatura e sinalização de feromônio) e funções
homeostáticas (como liberação hormonal e osmorregulação, por exemplo),
sendo importantes sinalizadores em doenças inflamatórias (PREMKUMAR,
2014). Existe uma baixa homologia entre as diferentes famílias de TRP e por
isso os canais apresentam uma grande variedade de modos de ativação
(LEVINE & ALESSANDRI-HABER, 2007), tais como, mudanças de temperatura
(VAY et al., 2012), pH (WANG et al., 2013), estímulos mecânicos (PETER,
2011), hormônios (QIU et al., 2010), espécies reativas de oxigênio (NAYLOR et
al., 2010) e outros mediadores inflamatórios (FERNANDES et al., 2012); e
exógenos (como produtos derivados de plantas, fumaça de cigarro, poluição,
substâncias químicas, etc (BAHNASI et al., 2008; FERNANDES et al., 2012).
Os estímulos nociceptivos e vias de reconhecimento do processo
inflamatório ativam diferentes receptores compartilhados por diferentes células
do sistema imune e do sistema nervoso periférico. Em particular, os canais
TRPs reconhecem sinais exógenos, padrões moleculares relacionados ao dano
(DAMPs) no local da inflamação (por exemplo, calor, acidez, produtos
químicos) e sinais endógenos liberados durante o trauma ou lesão tecidual
(ATP, estresse osmótico, ácido úrico, etc). Além disso, outros estímulos
celulares (como o estresse mecânico) também podem ativar canais TRPs e
induzir a inflamação (CLAPHAM, 2003).
Dentre estes receptores, os mais bem estudados em relação às suas
interações com a resposta inflamatória são os canais TRPV1 e TRPA1. O
recente conhecimento de que estes receptores também encontram-se
expressos em células imunes, despertou o interesse da comunidade científica
em entender a relevância destes, na resposta imune à infecções. Este aspecto
será discutido ao longo desta seção.
As primeiras evidências de que os receptores TRP são moduladores da
resposta imune contra infecções foram obtidas de modelos experimentais em
animais tratados com antagonistas seletivos para o TRPV1, ou com deleção
31
gênica deste receptor. Os receptores TRPV1 geralmente são expressos em
fibras sensoriais, sendo importantes para a detecção de estímulos nocivos
(SZALASSI et al., 2007). Este receptor pode ser ativado por substâncias
exógenas, como a capsaicina (composto pungente da pimenta vermelha) e
resiniferatoxina (isolada da Euphorbia resinifera), por agentes inflamatórios
endógenos, e também por calor nocivo, maior que 43ºC (JARA-OSEGUERA et
al., 2008; Schumacher, 2010). Por ser um sensor de estímulos nocivos, que
podem ser ativados por diversos mecanismos, o TRPV1 está relacionado a
diferentes
patologias
dolorosas,
tais
como
dor
inflamatória,
visceral,
neuropática e também câncer (JARA-OSEGUERA et al., 2008; ADCOK, 2009;
PATAPOUTIAN et al., 2009).
O TRPV1 demonstrou ter um efeito protetor contra a hipotensão e
hipotermia em ratos com endotoxemia, enquanto o tratamento com capsaicina,
um antagonista deste receptor, aumentou a mortalidade dos animais (WANG et
al., 2008). A deleção gênica para o receptor TRPV1 aumenta os níveis de TNFα, NO e de marcadores de falência múltipla de órgãos durante a endotoxemia
(CLARK et al., 2007). Estes recentes achados indicam um efeito protetor do
TRPV1 no quadro séptico.
O TRPV1 tem sido sugerido como um dos moduladores da resposta
imune frente aos estímulos causados por bactérias, tornando-se um receptor
importante para a resposta inflamatória contra infecções (CLARK et al., 2007).
Na sepse, o tratamento com capsaícina (agonista do TRPV1) aumenta a taxa
de sobrevivência em ratos (BRYANT et al., 2003), diminui a febre em
camundongos (IIDA et al., 2005), ajuda a combater e controlar infecções
bacterianas (CLARK et al., 2007; FERNANDES et al., 2012), ameniza os níveis
plasmáticos de aspartato-amino transferase, um marcador de falência hepática
(CLARK et al., 2007). Outros trabalhos recentes demonstram que o TRPV1
também pode modular a resposta imune em camundongos infectados com o
parasito da malária.
Além do TRPV1, outros receptores da família dos TRPs também
contribuem para a resposta inflamatória contra infecções. O TRPA1 é o único
membro da subfamília TRPA, foi primeiramente descrito como um sensor para
o frio nocivo nas terminações periféricas de fibras sensoriais (STORY et al.,
32
2003). Este receptor é ativado por estímulos mecânicos e por várias
substâncias naturais e irritantes derivadas de plantas, como a alina, composto
presente no alho e o cinemaldeído, presente na canela (BANDELL et al., 2004;
JORDT et al., 2004). O TRPA1 está expresso em terminações nervosas e
corpos celulares de neurônios sensoriais, juntamente com o receptor TRPV1 e
com neuropeptídeos como a substância P e peptídeo relacionado ao gene da
calcitonina (CGRP). A ativação de tais terminações nervosas acarreta na
liberação de neuropeptídeos que podem induzir os sinais clássicos da
inflamação, causando um fenômeno denominado inflamação neurogênica, a
qual está envolvida no mecanismo de uma variedade de doenças inflamatórias,
como a dor neuropática, asma, enxaqueca e dermatite (INOUE et al., 1997;
PETERS et al., 2006). Além do mais, o TRPA1 pode ser ativado por uma
variedade de mediadores inflamatórios e substâncias oxidantes e eletrofílicas,
podendo participar da resposta inflamatória através do desencadeamento de
vários mecanismos devido aos múltiplos mediadores químicos e biológicos que
participam da sensibilização e ativação dos nociceptores primários durante a
injúria tecidual e inflamação (MEYER et al., 1991). Ambos o TRPV1 e o TRPA1
são considerados como sensores de estresse oxidativo, podendo ser ativados
por EROS e também são capazes de regular a produção destes radicais.
Estudos recentes têm demonstrado que a ativação do TRPA1 com seu
antagonista (cinemaldeído) possui efeitos protetores na sepse. A estimulação
desse receptor atenua a falência hepática e altera o perfil de células
inflamatórias circulantes e no foco infeccioso. O mesmo estudo demonstrou
que a estimulação do TRPA1 promove a diminuição dos níveis plasmáticos de
mediadores inflamatórios produzidos em excesso durante a sepse, dentre eles
a IL-1β e TNF-α. Níveis locais de óxido nítrico também foram reduzidos no foco
infeccioso utilizando o modelo experimental por administração intraperitoneal
de LPS. Tais dados sugerem que o TRPA1 modula alguns mecanismos da
resposta inflamatória sistêmica em modelos experimentais de endotoxemia em
camundongos (MENDES, 2015; SOUSA et al., 2015).
Ambos o TRPV1 como o TRPA1, são atualmente denominados como
sensores de estresse oxidativo, podendo ser ativados por produtos pró-
33
oxidantes derivados desta via; além de regularem a produção destes produtos
(KIM et al, 2013; MILLER et al, 2011).
Recentemente, sugeriu-se que outro membro da família TRP, o TRPC5,
pode ser ativado tanto por produtos pró- (H2O2) quanto anti-oxidantes
(tioredoxina; TRX), embora a relevância desta interação na sepse nunca tenha
sido avaliada, estes achados adicionam uma nova camada de complexidade
nas funções patofisiológicas dos receptores TRP.
Desta forma, a seguir, será discutida a importância do TRPC5, seja
como homodímero (TRPC5/TRPC5), ou heterodímero (TRPC4/TRPC5 e
TRPC1/TRPC5), em relação às suas conhecidas funções patofisiológicos, e
sua potencial relevância para a sepse e/ou a resposta inflamatória sistêmica
associada a esta síndrome; o TRPC4 também foi avaliado neste estudo devido
a sua capacidade de formar heterodímeros com o TRPC5, que é sensor do
estresse oxidativo, o qual se apresenta aumentado durante a sepse. Devido a
outros membros desta família de receptores participarem de mecanismos da
resposta inflamatória, pela primeira vez esses receptores foram estudados
como possíveis moduladores da resposta imune na sepse.
1.6 TRPC4 e TRPC5
Os canais TRPC formam uma das subfamílias dos TRPs e compartilham
características similares em suas estruturas. Eles contém 3 a 4 repetições de
anquirina e um domínio terminal C conservado (PHILIPP et al., 2000). São
canais de cátions não seletivos permeáveis ao cálcio e sódio, variando entre
seus diferentes membros. Muitas das subunidades dos TRPCs podem se
apresentarem juntamente expressos nas membranas celulares, formando
homômeros e heterômeros (NILIUS et al., 2007). Os TRPCs, assim como
outros membros das subfamílias dos TRPs, são classificados como canais
operados por estoque (SOC, do inglês, store-operated channels), canais que
são ativados quando as reservas intracelulares de cálcio se esgotam. Os
canais TRPCs predominantes no cérebro de mamíferos são os TRPC1, TRPC4
e TRPC5 e estão densamente expressos nas regiões corticolímbicas do
cérebro, como o hipocampo, córtex pré-frontal e septo lateral (MELISSA et al.,
34
2007; FOWLER et al., 2012). Canais TRPC1, C4 e C5 são ativados pelo
receptor metabotrópico de glutamato do grupo 1 DHPG (FOWLER et al., 2007).
De forma geral, os canais TRPCs podem ser ativados pela fosfolipase C e
alguns membros pelo diacilglicerol. O TRPC5 é ativado pela tiorredoxina
extracelular reduzida (XU et al., 2008).
Os canais TRPC são ativados através de receptores acoplados à
proteína G, incluindo receptores muscarínicos, adrenérgicos, serotonérgicos.
Os sete canais TRPCs são divididos em quatro subgrupos, TRPC1, TRPC2,
TRPC3/6/7 e TRPC4/5, baseado em suas sequencias de similaridades. TRPC4
e TRPC5 são homólogos próximos, compartilhando 64% de similaridade (KIM,
2012).
O TRPC5 é um dos sete canais TRPC presente em mamíferos. É uma
proteína de membrana não seletiva permeável ao Ca ++. Esse receptor possui
vários mecanismos de ativação, podendo ser estimulado de forma isolada na
membrana, formando homodímeros (TRPC5-TRPC5), e heterodímeros com os
receptores TRPC1 (STRÜBING et al., 2003; HOFMANN et al., 2002), TRPC3 e
TRPC4 (HOFMANN et al., 2002). Além do mais, esse receptor interage com
uma vasta quantidade de substâncias e proteínas, incluindo calmodulina,
CABP1, enkurin, Na+, proteína de ligação ao GTP induzida por interferon
(MX1), dentre outros (SOSSEY-ALAOUI et al., 1999). Os homômeros de
TRPC5 e heterômeros TRPC5-TRPC1 podem ser ativados por tioredoxina
extracelular reduzida e propofol (BAHNAS et al., 2008). O TRPC5 Está
predominantemente expresso no sistema nervoso central, incluindo o
hipocampo,
cerebelo,
amígdala,
neurônios
sensoriais,
retina
e
mais
restritamente na periferia, principalmente nos rins e no sistema cardiovascular.
São ativados principalmente pelos receptores acoplados às proteínas Gq,
fosfolipase C e/ou Gi. Há uma variedade de outros ativadores dos canais
TRPC5,
como
o
óxido
nítrico,
lisofosfolipídeos,
esfingosina-1-fosfato,
tiorredoxina reduzida, prótons, lantanídeos e cálcio. Muitos desses ativadores
do TRPC5, como o óxido nítrico, têm sua produção aumentada durante a
sepse e podem ativar o receptor diretamente (ZHOLOS, 2014). É conhecido
que a tiorredoxina aumenta a produção de alguns mediadores inflamatórios
importantes na sepse, como o peróxido de hidrogênio, já mencionado acima.
35
Embora as propriedades sejam similares com o TRPC4, os canais TRPC5 são
sensíveis ao frio e podem ser ativados por uma variedade adicional de
estímulos, como o aumento citosólico de Ca++ (BECK et al., 2013).
O TRPC4 está expresso em uma grande variedade de tecidos, incluindo
o cérebro e endotélio. No músculo intestinal liso o TRPC4 induzem a
despolarização, influxo de Ca++ e contração, assim, acelera a motilidade
intestinal, além disso, também exerce um importante papel em fenômenos que
participam de processos inflamatórios e infecciosos como na permeabilidade
endotelial, contribuindo para a migração de células do sistema imune para os
tecidos, em caso de infecções locais; vasodilatação, um importante fenômeno
vascular importante em processos inflamatórios tanto locais quanto sistêmico,
podendo influenciar em quadros graves como na sepse, por exemplo; liberação
de neurotransmissores e proliferação celular (BECK et al., 2013).
O TRPC4 existe em duas isoformas e estão expressos em diferentes
tipos de células e tecidos (PHILIPP et al., 1996; WALKER et al., 2001). O
TRPC4-α representa a forma completa do receptor, já o TRPC4-β falta um
segmento do amino ácido 84 do terminal carboxilo (MERY et al., 2001;
SCHAEFER et al., 2002). O TRPC4-α, originalmente clonado de retina bovina,
mostrou ser ativado com a administração de GTPγs ou depleção intracelular
dos estoques de cálcio (PHILIPP et al., 1996).
Uma série de funções fisiológicas foram atribuídos aos canais TRPC4
baseado
em
estudos
em
camundongos
TRPC4
knockout,
incluindo
vasodilatação mediada por células endoteliais aórticas (FREICHEL et al.,
2005), formação de fibras de actina e permeabilidade microvascular em células
endoteliais vasculares no pulmão (TIRUPPATHI et al., 2002), indução da
liberação dendrídica serotonina-dependente de ácido aminobutírico em
interneurônicos talâmicos (MUNSCH et al., 2003) e modulação da contração e
motilidade
intestinal
na
musculatura
lisa
(FREICHEL
et
al.,
2005;
TSVILOVSKYY et al., 2009)
Os heterodímeros formados pelo TRPC4/C5 apresentam sensibilidade
ao NO e quando ativados por esse mediador inflamatório conduzem a entrada
de Ca++ em células endoteliais e podem ter um papel determinante na
proliferação celular (YOSHIDA et al., 2006). Além disso, também tem sido
36
especulado o papel desses heterodímeros na integridade das junções celulares
das barreiras endoteliais (CIOFFI et al., 2006). Com base nessas informações,
sugere-se que durante a sepse a produção de NO é aumentada de forma
descontrolada, ocasionando uma maior ativação desses heterodímeros que,
por sua vez, pode acarretar uma maior vasodilatação e alterações vasculares,
podendo agravar ainda mais o quadro séptico.
1.7 ANTAGONISTAS DOS RECEPTORES TRPC4/TRPC5
A busca por antagonistas seletivos para receptores com funções
fisiológicas pouco conhecidas tem sido um alvo das pesquisas científicas. O
bloqueio seletivo de canais presentes em membranas celulares contribui para a
descoberta de suas funções e interações com outros complexos orgânicos. Por
serem estruturalmente parecidos, a maioria dos bloqueadores para os TRPCs
são não seletivos, ou seja, incapazes de bloquear apenas um tipo de receptor
dessa
subfamília.
Dentre
os
mais
comuns,
podemos
citar
alguns
antiinflamatórios, como o ácido flufenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico
e diclofenaco de sódio, que demonstraram inibição não seletiva dose
dependente dos canais TRPC4 e TRPC5 (JIANG et al., 2012). No entanto, a
caracterização funcional desses canais em tecidos nativos tem sido
prejudicada devido a falta de ferramentas farmacológicas específicas.
SKF96365, 2-aminoetoxidifenil borato, latânio e gadolíneo podem modular as
funções do TRPC4 e TRPC5, porém, não apresentam seletividade para esses
canais (MILLER et al., 2011).
Estudos
recentes
demonstraram
que
a
ligação
do
complexo
ca++/calmodulina com os canais TRPC3 e TRPC4 causa a inibição intrínseca
destes canais (TANG et al., 2001; ZHANG et al., 2001).
Muitos inibidores da atividade do TRPC5 têm sido utilizados, porém em
sua maioria, os mesmos bloqueiam outros canais além do TRPC5; tais como
SKF96356 e ácido flufenâmico, porém, esses compostos são moduladores
seletivos ainda mal conhecidos, podendo afetar outros canais de diferentes
subfamílias dos TRPs, dentre outros canais (INOUE et al., 2001). O 2-APB é
um inibidor do receptor inositol 1,4,5-trifosfato e também bloqueia o TRPC5 de
37
forma reversível e voltagem-dependente (XU et al., 2005), no entanto, não é
um receptor seletivo para a classe dos TRPCs, pois pode afetar também
receptores de outras subfamílias, como TRPV, TRPM e TRPP (XU et al.,
2005). Um estudo recente caracterizou o CH (do inglês; clemizole
hydrochloride), como um novo bloqueador dos canais TRPC5, bloqueando
esse receptor independente da atividade da fosfolipase C. O HC também
demonstrou ser eficiente no bloqueio de homômeros de TRPC5 e o heterômero
TRPC1-TRPC5 (RICHTER et al., 2014). Outros antagonistas não seletivos do
TRPC5 incluem: latânio e gadolínio (JUNG et al., 2003), ML204 (que vai ser
discutido mais abaixo) (Miller et al., 2011) e ATP interno (DATTILO et al.,
2008).
O ML204 foi sintetizado e caracterizado como um potente e seletivo
antagonista dos canais TRPC4 e TRPC5 através de um estudo realizado por
Miller et al., 2011, utilizando uma linhagem de células HEK293 expressando
alguns membros da família TRP e também neurônios ganglionais dorsais e
células do músculo liso obtidas de camundongos C57BL/6; utilizando métodos
eletrofisiológicos para caracterização do bloqueio dos receptores. Embora o
composto tenha alguns efeitos fracos sobre receptores muscarínicos e
receptores acoplados à proteína G, ele exibe, pelo menos, 20 vezes mais
seletividade para os canais TRPC4 sobre outros canais iônicos receptores,
incluindo o TRPC6, dentro da mesma família e outros membros das
subfamílias de TRPs, como TRPV1, TRPV3, TRPM8 e TRPA1. Este nível de
seletividade é muito superior à de outros bloqueadores farmacológicos
atualmente utilizados em pesquisa para canais TRPC e fornece bloqueio
seletivo dos canais TRPC4 e TRPC5 em tecidos nativos, realizados em
estudos fisiológicos. O ML204 é um bloqueado muito eficaz no estudo das
funções fisiológicas e fisiopatológicas dos TRPC4/C5, e deve facilitar o
desenvolvimento de novas terapias relacionadas a estes canais (MILLER et al.,
2011).
Os TRPs são uma família de receptores, cujas funções ainda não são
completamente elucidadas. Estudos recentes têm demonstrado que alguns
membros
dessa
família
de
receptores
demonstram
modular
alguns
mecanismos imunológicos durantes a sepse, como o TRPV1 que exerce uma
38
função protetora quando estimulado e o TRPA1 que causa um agravamento no
quadro séptico. Os TRPCs são canais que também fazem parte dessa família
de receptores e, assim como o TRPV1 e TRPA1, são conhecidos por serem
sensíveis ao estresse oxidativo, podendo, então, de forma semelhante outros
membros da mesma família, modular os mecanismos da sepse. Assim, o
objetivo desse estudo foi avaliar a participação dos receptores TRPC4 e
TRPC5 nos mecanismos da sepse utilizando um antagonista seletivo para
ambos os receptores, o ML204. Além do mais, a descoberta de novas drogas
que melhoram o quadro séptico seria uma alternativa para o tratamento
somente com antimicrobianos, visto que, a sepse bacteriana pode levar a
morte mesmo com o uso de antibióticos, principalmente em casos onde o
agente etiológico são bactérias gram-negativas, tendo o LPS estruturalmente
em sua parede celular, assim, o tratamento ideal para a sepse seria uma droga
que combatesse a bactéria e reduzisse a resposta inflamatória frente à toxinas
liberadas após a morte desses microorganismos.
39
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Caracterizar a relevância dos receptores TRPC4 e TRPC5 na sepse
induzida por LPS através do tratamento repetido com o antagonista seletivo
destes receptores o ML204, e do emprego de camundongos com deleção
gênica para o TRPC5.
2.2 Específicos
- Avaliar os efeitos do antagonista de receptores TRPC4 e TRPC5, ML204, e
da deleção gênica do TRPC5 sobre as alterações de peso e temperatura de
animais sépticos.
- Verificar o efeito do tratamento de camundongos com ML204 e da deleção
gênica para TRPC5 sobre os níveis de leucócitos sanguíneos e do lavado
peritoneal de animais sépticos.
- Estudar a liberação de mediadores inflamatórios (citocinas, NO, ROS)
circulantes e no lavado peritoneal de camundongos com sepse induzida por
LPS tratados ou não com ML204 e em camundongos com deleção gênica para
o TRPC5 (TRPC5KO).
- Analisar os efeitos do ML204 e da deleção gênica para o TRPC5 na falência
de múltiplos órgãos induzida por LPS através da dosagem de aspartato-amino
transferase, creatinina e lipase.
- Avaliar os efeitos do ML204 e da deleção gênica para o TRPC5 sobre a
fagocitose mediada por macrófagos.
40
3 METODOLOGIA
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos C57BL/6 (49 machos e 49 fêmeas, 3-4
meses de idade). Os animais foram mantidos em ambiente climaticamente
controlado (temperatura e umidade controladas; 22 ± 2 °C e ~60%,
respectivamente), em ciclo 12h claro/12h escuro e com água e ração ad
libitum. Os animais foram fornecidos pelo Biotério da Universidade Ceuma. Foi
utilizado tanto animais fêmeas quanto machos, na mesma quantidade com a
finalidade de observar as variações devido aos gêneros diferentes e melhor
mimetizar a doença humana. Todos os experimentos foram conduzidos de
acordo com os Princípios Éticos de Experimentação Animal adotado pela
Sociedade Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório (SBCAL) e
aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade
Ceuma através do protocolo 108/14.
Um outro grupo de animais de linhagem 129/SvImJ, porém, com deleção
gênica para o receptor TRPC5 (TRPC5KO, 12 machos/2 a 3 meses de idade) e
wild type (WT, 12 machos/2 a 3 meses de idade) (RICCIO et al., 2009),
também foram utilizados no presente estudo. Esses animais também foram
mantidos nas mesmas condições acima mencionadas e os procedimentos
foram realizados de acordo com o UK Home Office Animals (Scientific
Procedures) Act of 1986 e Comitê de Ética do King’s College London.
3.2 Tratamento farmacológico
Para avaliar a contribuição dos receptores TRPC4 e TRPC5 na sepse
induzida por LPS, os animais foram tratados com o antagonista seletivo para
estes receptores, ML204.
Para isto, os animais receberam ML204 por via
subcutânea (s.c.; 1 mg/kg; Miller et al., 2011), 2 vezes ao dia, por cinco dias.
Animais tratados com veículo (6% DMSO em PBS, 5 dias, 2 x ao dia, s.c.)
foram utilizados como controle.
41
3.3 Modelo de endotoxemia
Utilizou-se o modelo de sepse estéril de caráter leve ou moderada
induzida por LPS. Para isto, os animais receberam uma injeção intraperitoneal
de PBS contendo LPS (E. coli, sorotipo 0111:B4; 11,25 milhões EU/kg), 1h
após o último tratamento com ML204 ou veículo. 24 horas após a indução da
sepse, os animais foram anestesiados terminalmente com uma mistura de
cetamina e xilazina (75 mg/kg e 1 mg/kg, respectivamente) e então
exanguinados para coleta de sangue por punção cardíaca. Uma alíquota de
sangue foi separada para contagem de células totais e diferenciais, e o
restante do sangue utilizado para separação do plasma, o qual foi mantido em
freezer -80oC para análise posterior. Em seguida, a cavidade peritoneal foi
lavada com 3 ml de PBS estéril e o lavado peritoneal foi coletado por
laparotomia. Uma alíquota de lavado foi separada para contagem de células
totais e diferenciais e o restante foi mantido em freezer -80oC para análise
posterior de diferentes parâmetros.
Em um grupo separado de animais foi avaliado o impacto dos
receptores TRPC4/TRPC5 na severidade da sepse. Para isto, 20 animais
foram distribuídos em dois grupos; um grupo foi tratado com veículo e outro
com ML204 durante cinco dias, no sexto dia os dois grupos receberam LPS
(i.p) e foram observados por 72 horas. A cada 24 horas foram registrados peso,
temperatura e um escore foi atribuído para cada um dos seguintes parâmetros:
comportamento de limpeza (1-limpeza normal, 2-limpeza reduzida, 3-sem
limpeza), ambulação (1-ambulação normal, 2-parcialmente reduzida, 3ambulação prejudicada, 4-sem ambulação), piloereção (1-ausência, 2presença), secreção ocular (1-ausência, 2-presença). A soma das pontuações
atribuídas a cada um dos parâmetros para cada animal foi tomado como índice
de gravidade, com os escores mais altos correspondentes a piora da doença;
ainda, a taxa de mortalidade desses animais foram observadas por 72h após o
LPS (Mendes, 2015). Em um grupo separado de animiais, avaliou-se a
severidade da sepse em animais WT e TRPC5KO por 24h após a injeção de
LPS.
42
3.4 Temperatura e peso
Os animais foram pesados com uma balança de precisão (FILIZONAMF-6/1), antes do tratamento com o ML204 e veículo, 5 dias após o tratamento
e 24 horas após a indução da sepse por LPS (i.p); um outro grupo de animais
TRPC5KO e WT também tiveram o peso corporal registrados antes e 24h após
administração de LPS. A temperatura dos animais foi mensurada em graus
centígrados, antes do esquema de tratamento, no sexto dia antes da indução
da sepse por LPS (i.p) e 24 horas após; Animais TRPC5KO e WT também
tiveram a temperatura retal registrada antes e após o tratamento i.p de LPS.
Para isso foi utilizado um termômetro digital e vaselina sólida, a haste do
termômetro foi introduzida 1cm no reto do animal.
3.5 Avaliação de danos em múltiplos órgãos
A disfunção do fígado, rins e pâncreas foi avaliada por quantificação dos
níveis plasmáticos de aspartato-amino transferase (AST), creatinina e lipase
em animais sépticos e controles, tratados e não com o ML204. Os resultados
foram expressos em UI/L (lipase e AST) ou µmol/l (creatinina). Foi utilizado um
analisador automático LABMAX-240/Labtest no laboratório de bioquímica da
Universidade Ceuma, São Luís-MA; AST e creatinina também foram dosadas
pelo método citado acima em animais com deleção gênica para o receptor
TRPC5 e WT, tratados ou não com LPS (i.p, 24h).
3.6 Dosagem de ureia
A ureia plasmática foi determinada através do analisador automático
iSTAT (Abbott Point of Care, Princeton, NJ) de acordo com as instruções do
fabricante. Dez µl de sangue total obtidos de camundongos WT e TRPC5 KO,
tratados ou não com LPS; foram analisados em cartucho i-STAT CHEM 8+. Os
resultados foram expressos em mmol/l.
43
3.7 Análise do sangue e lavado peritoneal
Foi realizada a contagem total de leucócitos (x10 6) a partir da diluição do
sangue total (1:1000) em azul de tripan e analisado na câmara de Neubauer
com auxílio de um microscópio óptico comum. A contagem diferencial de
leucócitos foi realizada em esfregaços sanguíneos corados com o corante
Panótico. O plasma foi obtido por centrifugação do sangue (Centrifuga
refrigerada, CT-500R) a 1500 rpm por 15 min, separado em eppendorfs para
quantificação de citocinas por Cytometric Bead Array (CBA, BD Biosciences) e
os marcadores de falência AST (fígado), creatinina (rim) e lipase (pâncreas).
Após a coleta do lavado peritoneal, uma alíquota de 20µl foi analisada
em câmara hemocitométrica tipo Neubauer para quantificação dos leucócitos
(x106), o lavado foi diluído (1:10) em azul de tripan. Outra alíquota de 20µl do
exsudato peritoneal foi utilizada para determinar a população de leucócitos
(Contagem diferencial) através da análise de esfregaço corado com kit
Panótico rápido. O restante do lavado foi dividido em 2 alíquotas, sendo uma
delas centrifugada (Centrifuga refrigerada, CT-500R) a 1500 rpm por 10 min,
para obtenção de lavado para análise de citocinas e SOD, H 2O2, NOX; e a outra
utilizada para análise de citometria de fluxo e quantificação da capacidade
fagocítica.
3.8 Dosagem de NOx
O conteúdo de NO2-/NO3- foi mensurado pelo ensaio de Griess, um
indicador da produção de NO obtidos do lavado peritoneal de animais
submetidos ao esquema de tratamento farmacológico acima. NO3- foi reduzido
para nitrito (NO2-) por incubação de 80µl de amostra com 20 µl de 1U/ml nitrato
redutase e 10 µl de 1mM NADPH por 30 min a 37ºC em placa de 96 poços.
Após, 100 µl de reagente de Griess (5% v/v H3PO4 contendo 1% de
sulfanilamida/0,1% de dihidrocloreto de naftileno) foi adicionado e incubado por
15 min a 37ºC. A absorbância foi determinada com filtro de 550 nm em
espectrofotômetro (MB-580/Heales); outro grupo de animais WT e TRPC5KO
44
tratados e não com LPS (i.p) também tiveram seus níveis de NOx quantificados
no plasma e lavado peritoneal pela mesma metodologia acima descrita
3.9 Dosagem de H2O2
A produção de H2O2 foi mensurada em amostras de lavado peritoneal
usando o kit de H2O2/ peroxidase (Sigma-Aldrich). O ensaio foi realizado em
placa de 96 poços conforme metodologia descrita por Fernandes et al., 2012,
modificada. Para isto, 50 µl foram incubadas com 46µl do tampão de ensaio,
2µl do substrato fluorescente de peroxidase e 2ul do substrato de H 2O2, em
seguida a placa foi incubada a 37ºC no escuro, após 3 min a absorbância
inicial foi determinada com um filtro de 570nm, medindo a cada 10 min até que
uma das amostras apresente leitura similar ou maior do que o maior ponto da
curva padrão; outro grupo separado de animais WT e TRPC5KO tratados e não
com LPS (i.p) também tiveram a concentração plasmática e no lavado
peritoneal mensuradas pelo mesmo método.
3.10 Dosagem da superóxido-dismutase (SOD)
A quantificação da superóxido-dismutase (SOD) foi realizada com o
lavado peritoneal de animais que receberam o esquema farmacológico acima,
para tal, foi utilizado o kit de ensaio para SOD (Sigma-Aldrich). O ensaio foi
realizado em placa de 96 poços, de acordo com as instruções do fabricante.
Para isto, foi utilizado uma alíquota de 20 µl de lavado com células, a amostra
foi sonicada (3 vezes por 10 segundos) e incubada por 20 min, a 37ºC com os
reagentes do kit. A absorbância foi determinada através de espectrofotometria
(MB-580/Heales) com filtro de 450nm. Os resultados foram expressos em % de
inibição da enzima.
45
3.11 Dosagem de citocinas
As citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL17 e IL-10) foram quantificadas no
plasma e no lavado peritoneal, através do kit CBA (Cytometric Bead Array)
utilizando citometria de fluxo, conforme as especificações do fabricante. Os
resultados serão expressos em picogramas/mililitro (pg/ml).
3.12 Fagocitose “Ex vivo”
A fagocitose foi analisada a partir de células peritoneais obtidas de
camundongos sépticos tratados ou não com ML204 e de camundongos com
deleção gênica para o TRPC5 e seus respectivos WT. Animais tratados com
veículo foram utilizados como controle. Para isto, 24 h após a indução da
sepse, a cavidade peritoneal foi lavada com 3 ml de PBS estéril. O lavado foi
então centrifugado (10 Min/1500RPM) e resuspenso em DMEM contendo 10%
SBF (v/v), glutamina (2mM), penicilina e estreptomicina (1x, Life Technologies).
Em seguida, as células (2 x 105 células/poço) foram incubadas em uma câmara
de cultura para células à 37 ºC por 2 horas, para permitir a adesão de células.
Em seguida, o sobrenadante (rico em células não aderidas) foi removido e as
células aderidas (macrófagos) foram incubadas na presença e ausência de
esferas (2 µm) fluorescentes de látex (1:100; 10 µl/poço) por 12 horas. Depois
do período de incubação, o meio de cultura foi removido e cada poço foi lavado
3 vezes com PBS. Os poços foram então fixados com paraformaldeído (PFA,
2%) por 10 minutos e lavados 3 vezes com 100 µL de PBS para remoção do
excesso de PFA. Em seguida, foram adicionados 10 µl de PBS em cada poço,
e a lâmina foi selada com lamínula de vidro e analisada em microscópio de
campo claro, com objetiva de 40x. Os resultados foram expressos como
percentagem de células contendo esferas de látex e como número de esferas
fogocitadas por 100 células.
46
3.13 Drogas e reagentes
Foram utilizados os seguintes reagentes da Sigma-Aldrich (Brasil): Azul
de tripan, PBS (pastilhas), DMSO, LPS e ML204. Outros reagentes incluem:
cetamina (Dopalen®, Ceva Santé Animale, Brasil), xilazina (Kensol®, König,
Brasil) e vaselina sólida (Uniphar, Brasil).
3.14 Análise estatística
Todos os valores foram expressos em média e
erro padrão com
exceção da curva de sobrevivência, expressa em porcentagem x tempo após
injeção de LPS; e dos resultados referentes à dosagens de citocinas e escore
de severidade, os quais estão expressos em mediana (mínimo-máximo).
Incialmente, foi feito o teste de normalidade de Shapiro-Wilk das variáveis
numéricas, aquelas que apresentaram distribuição normal a comparação entre
os grupos foi realizada através do teste de análise de variância (ANOVA),
seguido pelo teste de Bonferroni, para dados paramétricos. Aquelas variáveis
numéricas que não apresentaram normalidade foram comparadas pelo teste
não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn. Ainda, os dados
relativos à curva de sobrevivência foram analisados pelo teste Log-rank MantelCox no software estatístico GraphPad Prisma 5.0. O nível de signifcância
aplicado em todos os testes foi de 5%, ou seja, considerou-se significativo
quando p<0,05.
47
4 RESULTADOS
De acordo com o teste de normalidade de Shapiro-Wilk as variáveis de
peso e temperatura apresentaram distribuição normal, logo foram analisadas a
partir de testes paramétricos, enquanto que as demais variáveis não tiveram
distribuição normal, logo foram avaliadas através de testes não paramétricos.
4.1 Efeito do bloqueio dos receptores TRPC4 e TRPC5 com o antagonista
ML204 na severidade, mortalidade, peso e temperatura corporal em
animais com sepse induzida por LPS
Para determinar se o bloqueio dos receptores TRPC4/C5 tinha efeito
protetor ou agravante na sepse, foi realizada a curva de mortalidade, onde os
animais foram tratados com o ML204 e LPS, então foram acompanhados por
72 horas, sendo observados os sinais da sepse e feito um score de severidade,
onde quanto maior o score, mais grave é o quadro séptico. Foi também
registrada a morte para realização da curva de mortalidade, o peso e a
temperatura corporal dos animais (Figura 1). Como podemos observar na
figura 1A, nas primeiras 24 horas não houve diferenças entre animais sépticos
e animais sépticos tratados com o ML204, no entanto, após 48 horas depois da
indução da sepse com LPS, o ML204 agravou o quadro séptico, sendo os
parâmetros mais afetados: a maior diminuição na mobilidade e a presença de
secreção ocular nesses animais (tabela 1); após 72 horas não foi observada
nenhuma diferenças entre estes animais. Confirmando o agravamento de
animais sépticos pré-tratados com o ML204, observamos na figura 1B que, não
houve morte em nenhum dos grupos durante 24 e 48 horas, porém, após 72
horas da indução da sepse a sobrevivência dos animais sépticos tratados com
o ML204 começa a decair, chegando a diminuir 15% na sobrevivência após 96
horas em relação aos animais com sepse não tratados com esse antagonista
dos receptores TRPC4 e TRPC5. A figura 1D mostra que o tratamento repetido
com ML204 antes da administração intraperitoneal de LPS não afeta o peso
dos animais, porém, após a indução da sepse os animais perdem mais peso e
o bloqueio dos receptores TRPC4/C5 não influenciou nessa perda. De forma
48
semelhante, como mostra a figura 1D, o tratamento repetido com ML204 não
altera a temperatura dos animais antes da indução da sepse; no entanto após a
administração de LPS a sepse causou, de forma significante, hipotermia nos
camundongos (aumentou 1,03 vezes a queda de temperatura) com relação o
controle do mesmo grupo, de forma semelhante, o grupo de camundongos
tratados com ML204 também aumentou a perda de temperatura em relação ao
controle (1,06) e com relação ao grupo de animais sépticos não tratados com o
ML204 (1,02 vezes mais a queda de temperatura). Na figura 1E, confirmamos
que o tatamento com ML204 faz realmente com que animais sépticos percam
mais temperatura que animais sépticos não tratados com esse antagonista;
essa maior perda de temperatura é observada 24 e 48 horas após o LPS, no
entanto, após 72 horas os animais que sobreviveram não apresentaram mais
nenhuma diferença na temperatura corporal. Como mostra a figura 1F, o
bloqueio dos receptores TRPC4/C5 realmente não modula a perda ou ganho
de peso em animais sépticos em 24, 48 e 72 horas em relação a animais
sépticos não tratados com o ML204.
49
Figura 1: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) na severidade, mortalidade, peso e temperatura corporal em animais com
sepse induzida pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS). (A) Score de severidade (Quanto maior o score, mais grave é
o quadro séptico), onde foram observados os seguintes parâmetros e atribuído os
scores: Comportamento de limpeza (1-limpeza normal, 2-limpeza reduzida, 3-sem
limpeza), mobilidade (1-mobilidade normal, 2-parcialmente reduzida, 3-pobre
mobilidade, 4-sem mobilidade), piloereção (1-ausente, 2-presente) e secreção ocular
(1-ausente, 2-presente), (B) Curva de sobrevivência, (C) Peso corporal 24 horas após
LPS (g) e (D) Temperatura corporal 24 horas após LPS, (E) Temperatura corporal 24,
48 e 72 horas após LPS, (F) Peso corporal 24, 48 e 72 horas após LPS, em amostras
obtidas de animais tratados com veículo (6% DMSO em PBS Estéril), veículo + LPS e
ML204. *p<0,05, difere do grupo veículo. #p<0,05, difere do grupo veículo + LPS.
N=10/Grupo.
Porcentagem de sobrevivência
A
10
9
#
8
7
6
5
4
24h
48h
72h
120
100
80
LPS
LPS+ ML
60
40
20
0
24
Basal
Após tratamento repetido com ML204
24 Horas após LPS
40
#
*
35
*
30
25
20
Veículo + LPS
Veículo
96
ML204 + LPS
Basal
Após tratamento repetido com ML204
24 Horas após LPS
30
28
26
24
*
*
22
20
Veículo + LPS
Veículo
E
ML204 + LPS
F
LPS
ML204
LPS
ML204
30
Peso Corporal (g)
40
38
36
34
ML204
28
26
24
22
20
ML204
LPS
72
48
24
72
48
24
5
LPS
Tempo após
injeção de LPS (h)
0
18
32
0
72
D
Peso Corporal (g)
Temperatura Corporal
(ºC)
C
Temperatura Corporal
(ºC)
48
Tempo após a injeção com LPS (h)
5
Score de Severidade
Veículo + LPS
ML-204 + LPS
B
Tempo após
injeção de LPS (h)
50
Tabela 1: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) na severidade de animais sépticos tratados com véiculo + LPS e ML204 +
LPS. Parâmetros avaliados em 24, 48 e 72 horas: Comportamento de limpeza,
mobilidade, piloereção e secreção ocular. Resultados expressos em mediana (mínimamáxima). N=10/grupo.
24
Horas
48
Horas
72
Horas
Veículo + LPS
ML204 + LPS
Comportamento de Limpeza
2 (2-2)
2 (2-2)
Mobilidade
2 (2-2)
2 (2-4)
Piloereção
2 (2-2)
2 (2-2)
Secreção Ocular
1 (1-2)
1 (1-1)
Comportamento de Limpeza
2 (2-2)
2 (2-2)
Mobilidade
2 (1-2)
2 (2-3)
Piloereção
2 (1-2)
2 (2-2)
Secreção Ocular
1 (1-1)
1 (1-2)
Comportamento de Limpeza
2 (2-2)
2 (2-2)
Mobilidade
1 (1-1)
1 (1-2)
Piloereção
1 (1-2)
1 (1-2)
Secreção Ocular
1 (1-1)
1 (1-1)
51
4.2 Efeito do bloqueio dos receptores TRPC4 e TRPC5 com o antagonista
ML204 sobre marcadores plasmáticos de falência de órgãos, tais como
aspartato amino-transferase (AST), creatinina e lipase em animais com
sepse induzida por LPS
Sabe-se que o quadro séptico também é responsável pela falência
múltipla de órgãos em decorrência da produção descontrolada de mediadores
inflamatórios, dentre os órgãos mais afetados estão o fígado, rins e pâncreas.
O presente estudo também avaliou os níveis plasmáticos de marcadores de
dano a órgãos, como a enzima sérica aspartato-amino transferase (fígado),
creatinina (rins) e lípase (pâncreas) em animais com sepse induzida por LPS
tratados ou não com o antagonista ML204 dos receptores TRPC4 e TRPC5
como mostra a figura 2. Os níveis plasmáticos de AST não foram alterados
com o quadro séptico induzido pela administração de LPS em relação ao
controle e o tratamento repetido com o ML204 também não alterou os níveis
desta enzima (Figura 2A). Por outro lado, a enzima marcadora de falência renal
(creatinina) teve seus níveis significativamente aumentados (3,46 X) 24 horas
após o tratamento intraperitoneal com LPS em relação ao grupo tratado com
veículo. O bloqueio dos receptores TRPC4/C5 com o ML204 não apresentou
diferenças significativas em relação aos demais grupos (Figura 2B). As
concentrações
plasmáticas
da
lípase
não
apresentaram
diferenças
estatisticamente significativas em seus níveis em nenhum dos grupos
avaliados, embora os animais pré-tratados com ML204 parecerem ter uma
diminuição nos níveis desta enzima (Figura 2C).
52
Figura 2: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) nos níveis plasmáticos dos marcadores de falência de órgãos, AST
(aspartato amino-transferase, marcador de falência hepática), creatinina (rins) e lípase
(pâncreas) em animais com sepse induzida pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25
milhões de unidades de endotoxina/Kg em PBS). (A) AST (miliunidades/ml), (B)
creatinina (ng/µl) e (C) lipase (miliunidades/ml), em amostras obtidas de animais
tratados com veículo (6% DMSO em PBS Estéril; n=10), veículo + LPS (n=10) e
ML204 + LPS (n=7). *P<0,05, difere do grupo veículo.
A
B
Creatinina (ng / l)
40
800
600
400
200
*
30
20
10
C
10
8
6
4
2
LP
S
M
L2
lo
íc
u
Ve
04
+
+
LP
íc
ul
S
o
0
Ve
Lipase (Miliunidades/mL)
LP
S
S
+
LP
M
L2
04
+
o
íc
ul
Ve
Ve
M
L2
íc
ul
o
04
Ve
+
íc
u
LP
S
S
LP
+
íc
u
lo
0
lo
0
Ve
AST (Miliunidades/mL)
1000
53
4.3 Efeito do bloqueio dos receptores TRPC4 e TRPC5 com o antagonista
ML204 na produção de citocinas plasmáticas em animais com sepse
induzida por LPS
A produção plasmática de citocinas também foi quantificada durante este
estudo (Figura 3) para melhor entender os mecanismos que desencadeiam a
resposta imune durante a sepse induzida por LPS em camundongos tratados
ou não com o antagonista dos receptores TRPC4/C5, o ML204. O TNF-α teve
um aumento de 8,04 vezes na sua concentração (embora de forma não
significativa) em relação aos animais tratados com veículo e o bloqueio dos
receptores TRPC4/C5 não alterou esse aumento (figura 3A). Embora seja
conhecido que a sepse aumenta a produção de IL-1β, os níveis plasmáticos
desta citocina não apresentaram alterações significantes entre os grupos
avaliados (figura 3B). A produção de IL-6 foi, de forma não significativa,
aumentada durante a indução da sepse por LPS em relação ao grupo tratado
somente com veículo. O bloqueio dos receptores TRPC4/C5 não alterou essa
produção em relação ao grupo tratado com LPS (Figura 3C). Como mostra a
figura 3D, os níveis de IL-17 foram aumentados durante o quadro séptico em
relação ao grupo veículo, no entanto, esse aumento não foi significativo. Por
outro lado, o tratamento com ML204 aumentou significativamente os níveis
desta citocina (13,06 vezes) em relação ao grupo veículo. Embora seja
evidente o aumento da IL-10 em animais sépticos em relação ao grupo veículo,
esse aumento também não foi significativo, por outro lado, o tratamento com
ML204 diminuiu significativamente os níveis desta citocina durante a sepse em
relação a animais sépticos não tratados com esse antagonista dos receptores
TRPC4/C5 (figura 3E).
54
Figura 3: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) nos níveis plasmáticos de citocinas em animais com sepse induzida pela
injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de endotoxina/Kg em PBS).
Concentração plasmática (pg/ml) de (A) TNF-α, (B) IL-1, (C) IL-6, (D) IL-17 e (E) IL-10,
em amostras obtidas de animais tratados com veículo (6% DMSO em PBS Estéril),
veículo + LPS e ML204 + LPS. *p<0,05, difere do grupo veículo. #p<0,05, difere do
grupo veículo + LPS. N=10/grupo
B
IL-1 plasmática (pg/ml)
+
lo
cu
M
Ve
í
D
100
50
+
M
Ve
í
cu
L2
04
lo
+
Ve
í
cu
LP
S
lo
LP
S
0
E
3000
2000
1000
#
+
4
L2
0
M
Ve
íc
u
lo
+
cu
lo
LP
S
LP
S
0
Ve
í
IL-10 plasmática (pg/ml)
Ve
í
cu
lo
+
Ve
í
cu
LP
S
lo
0
*
150
LP
S
20000
200
+
40000
250
L2
04
60000
M
IL-17 plasmática (pg/ml)
C
IL-6 plasmática (pg/ml)
LP
S
o
Ve
í
cu
l
LP
S
M
Ve
í
cu
l
L2
0
4
o
+
Ve
í
0
+
LP
S
lo
0
20
LP
S
200
40
+
400
60
4
600
80
L2
0
800
cu
TNF- plasmático (pg/ml)
A
55
4.4 Efeito do bloqueio dos receptores TRPC4 e TRPC5 com o antagonista
ML204 sobre os níveis sanguíneos de leucócitos em animais com sepse
induzida por LPS
Para avaliar o perfil de células inflamatórias circulantes decorrente da
inflamação sistêmica causada pelo LPS, um outro parâmetro avaliado foi a
celularidade do sangue de animais com sepse induzida por LPS, tratados e não
com o ML204. Para isso, foram realizadas as contagens total e diferencial de
leucócitos sanguíneos (Figura 4). Apesar de haver uma tendência a diminuição
na população de leucócitos durante a sepse, essa diferença não foi significativa
(Figura 4A). Por outro lado, após ser realizada a contagem diferencial dessa
população leucocitária, foi observado que a sepse diminuiu a população de
células mononucleares em quase duas vezes em relação ao grupo tratado com
veículo (1,9 vezes), no entanto, essa alteração não foi estatisticamente
significativa. O grupo tratado com ML204 teve a população de células
mononucleares significativamente reduzidas em relação ao controle (3,39
veze), mas não houve diferenças entre o grupo de animais tratados com o
antagonista dos receptores TRPC4/C5 e o grupo tratado com LPS (Figura 4B).
Ainda, animais sépticos tratados e não com o ML204 tiveram suas populações
de polimorfonucleares levemente aumentadas, no entanto não foi um aumento
significativo e os grupos de animais sépticos tratados e não com o antagonista
dos receptores TRPC4/C5 não apresentaram nenhuma diferença entre si
(figura 4C).
56
A
60
40
20
S
LP
L2
0
M
10
0
LP
S
LP
S
M
L2
0
4
+
+
ul
o
S
LP
4
L2
0
M
ul
o
íc
Ve
+
+
íc
LP
S
ul
o
0
20
íc
*
10
30
Ve
20
40
cu
lo
30
C
Ve
í
40
Leucócitos Polimorfonucleares
sanguíneos (X 10 8)
50
Ve
4
ul
o
íc
Ve
B
Leucócitos Mononucleares
sanguíneos (X 10 8)
+
+
íc
LP
S
ul
o
0
Ve
Leucócitos Sanguíneos Totais
(X 10 8)
Figura 4: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) em células leucocitárias circulantes obtidas de animais com sepse induzida
pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de endotoxina/Kg em
PBS). (A) População total de leucócitos sanguíneos, (B) Células mononucleares e (C)
polimorfonucleares, em amostras obtidas de animais tratados com veículo (6% DMSO
em PBS Estéril; n=10), veículo + LPS (n=10) e ML204 + LPS (n=6). *p<0,05, difere do
grupo veículo.
57
4.5 Efeito do bloqueio dos receptores TRPC4 e TRPC5 na produção de
citocinas no lavado peritoneal em animais com sepse induzida por LPS
As citocinas apresentam um papel fundamental para desencadear o
início da resposta imune, sendo assim, foram avaliadas as concentrações a
nível peritoneal durante a sepse, com e sem o bloqueio dos receptores
TRPC4/C5 com o ML204 para analisar as alterações a nível local da
inflamação produzida pela administração de LPS. A figura 5A mostra que a
sepse
aumentou
(embora
não
de
forma
significativa)
levemente
as
concentrações do fator de necrose tumoral (TNF-α), porém, o grupo de animais
tratados com ML204 não alterou esse aumento a nível peritoneal, não
apresentando diferenças entre os grupos. Após 24 horas da administração de
LPS, os níveis de IL-1β não apresentaram diferenças entre os grupos avaliados
(figura 5B). Conforme a figura 5C, a IL-6 teve seus níveis significantemente
aumentados (547,72 X) durante o quadro séptico em relação ao controle. O
bloqueio dos receptores TRPC4/C5 com o ML204 embora tenha diminuído os
níveis desta citocina em relação aos animais tratados somente com LPS, essa
alteração não foi significante. Em relação aos níveis da IL-17, não foram
observadas alterações entre os grupos estudados (figura 5D). Como pode ser
visto de acordo com a figura 5E, os níveis da IL-10 foram aumentados 24h
após a administração de LPS, porém, não foi significante. Por outro lado,
animais sépticos pré-tratados com o antagonista dos receptores TRPC4/C5
diminuiu a concentração peritoneal dessa citocina em 9,44% em comparação
com animais sépticos tratados somente com o LPS.
58
Figura 5: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) na concentração peritoneal de citocinas em animais com sepse induzida
pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de endotoxina/Kg em
PBS). Concentração peritoneal (pg/ml) de (A) TNF-α, (B) IL-1, (C) IL-6, (D) IL-17 e (E)
IL-10, em amostras obtidas de animais tratados com veículo (6% DMSO em PBS
Estéril), veículo + LPS e ML204 + LPS. *p<0,05, difere do grupo veículo. #p<0,05,
difere do grupo veículo + LPS. N=10/grupo
*
6000
4000
2000
LP
+
o
ul
Ve
íc
10
5
#
S
LP
LP
S
o
0
ul
M
L2
04
+
+
o
ul
Ve
íc
S
S
o
ul
Ve
íc
+
04
M
L2
15
Ve
íc
LP
M
L2
0
E
IL-10 lavado peritoneal
(pg/ml)
+
+
5
S
LP
+
ul
o
Ve
íc
10
LP
S
ul
o
0
D
15
S
IL-17 lavado peritoneal
(pg/ml)
8000
Ve
íc
o
Ve
íc
M
L2
ul
04
+
Ve
íc
LP
+
o
ul
Ve
íc
C
IL-6 lavado peritoneal
(pg/ml)
LP
S
ul
o
S
0
LP
S
lo
0
50
LP
5
04
10
100
+
15
04
20
150
M
L2
IL-1 lavado peritoneal
(pg/ml)
B
25
Ve
íc
u
TNF- lavado peritoneal
(pg/ml)
A
59
4.6 Efeito do bloqueio dos receptores TRPC4 e TRPC5 com o antagonista
ML204 na produção de Óxido nítrico (NO), peróxido de hidrogênio (H2O2) e
superóxido dismutase (SOD) em animais com sepse induzida por LPS
Procurou-se
também
quantificar
a
produção
de
mediadores
inflamatórios, tais como óxido nítrico (NO), peróxido de hidrogênio (H2O2) e a
enzima superóxido dismutase (SOD) em animais com e sem o bloqueio dos
receptores TRPC4/C5 com o ML204 durante a sepse induzida por LPS na
inflamação local. A figura 6A mostra que não houve alteração nos níveis de
óxido nítrico em animais com sepse após 24 horas da administração de LPS.
Por outro lado, o bloqueio dos receptores TRPC4 e TRPC5 com o ML204
aumentou significativamente os níveis de NO (1,88 vezes) em relação ao grupo
veículo. A concentração de peróxido de hidrogênio local (a nível peritoneal) não
sofreu nenhuma alteração durante o tratamento com LPS ou com LPS +
ML204, como mostra a figura 6B. De forma semelhante, a figura 6C mostra que
os níveis da enzima superóxido dismutase (SOD) também não foram alterados
em animais sépticos tratados e não com o bloqueador dos receptores
TRPC4/5, o ML204.
60
Figura 6: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) na produção de mediadores inflamatórios peritoneais em animais com
sepse induzida pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS). (A) NOx (µM), (B) H2O2 (µM) e (C) SOD (% de inibição), em
amostras obtidas de animais tratados com veículo (6% DMSO em PBS Estéril), veículo
+ LPS e ML204 + LPS. *p<0,05, difere do grupo veículo. N=10/grupo
A
B
200
15
*
150
H2O2
(m)
100
5
50
20
15
10
5
LP
L2
04
M
Ve
í
+
S
LP
+
cu
lo
lo
S
0
Ve
íc
u
SOD (% de inibição)
25
+
L2
04
M
Ve
í
+
LP
S
C
LP
cu
lo
lo
Ve
íc
u
M
LP
S
+
L2
04
+
Ve
í
LP
cu
lo
lo
S
0
S
0
Ve
íc
u
NOx
(m)
10
61
4.7 Efeito do bloqueio dos receptores TRPC4 e TRPC5 com o antagonista
ML204 sobre os níveis sanguíneos de leucócitos em animais com sepse
induzida por LPS
Como mostra a figura 7, buscou-se avaliar o efeito do bloqueio dos
receptores TRPC4/C5 na sepse com o ML204 na migração leucocitária, sendo
assim, foi realizada a contagem total e diferencial de leucócitos peritoneais.
Não houve nenhuma alteração significativa na contagem de células totais e
diferencial de leucócitos peritoneais entre os grupos avaliados (Figura 7 A,B e
C).
Figura 7: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) em células peritoneais obtidas de animais com sepse induzida pela injeção
intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de endotoxina/Kg em PBS). (A)
Leucócitos totais, (B) Células mononucleares (C) Células polimorfonucleares, em
amostras obtidas de animais tratados com veículo 6% DMSO em PBS Estéril; n=10),
veículo + LPS (n=10) e ML204 + LPS (n=7).
250
200
150
100
50
LP
L2
04
+
+
cu
lo
M
Ve
í
Ve
í
LP
S
S
0
cu
lo
Leucócitos Peritoneais
(X 104)
A
+
LP
LP
S
S
0
M
L2
04
+
LP
S
L2
04
M
Ve
í
cu
lo
+
+
LP
cu
lo
S
0
50
cu
lo
20
100
Ve
í
40
150
cu
lo
60
200
Ve
í
80
Leucócitos polimorfonucleares
peritoneais (X 104)
C
100
Ve
í
Leucócitos mononucleares
peritoneais (X 104)
B
62
4.8 Efeito do bloqueio dos receptores TRPC4 e TRPC5 com o antagonista
ML204 na fagocitose de macrófagos peritoneais em animais com sepse
induzida por LPS
Outro parâmetro avaliado neste trabalho foi o efeito do bloqueio dos
receptores TRPC4/C5 na sepse com o ML204 na fagocitose mediada por
macrófagos peritoneais. Como mostra a figura 8, a sepse não alterou a
capacidade fagocítica dos macrófagos; o pré-tratamento com o ML204 antes
da administração de LPS também não influenciou esse resultado.
1500
1000
500
+
4
L2
0
M
LP
S
+
Ve
íc
u
LP
S
lo
0
Ve
íc
ul
o
Nº de beads/100 células
Figura 8: Efeito do tratamento repetido com ML204 (1mg/Kg, 100 uI/Animal s.c, 2x ao
dia/5 Dias) na fagocitose mediada por macrófagos peritoneais em animais com sepse
induzida pela injeção intraperitoneal de LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS), em amostras obtidas de animais tratados com veículo (6%
DMSO em PBS Estéril), veículo + LPS e ML204 + LPS. N=6/grupo
63
4.9 Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 na severidade, peso e
temperatura em camundongos com sepse induzida por LPS
Com a finalidade de avaliar o efeito da deleção gênica para o receptor
TRPC5 em parâmetros sistêmicos, foi realizado um score de severidade
(quanto maior o score, mais sadios são os camundongos) de animais com
sepse induzida por LPS e normais (tratados com veículo). Outros parâmetros
como peso e temperatura também foram registrados em animais sépticos e
não sépticos, para isso, foram utilizados dois grupos de animais, wild type
(selvagens) e TRPC5KO (knockout para o receptor TRPC5), como é mostrado
na figura 9. A figura 9A mostra que a sepse diminuiu o score de severidade em
ambos os grupos wild type e TRPC5KO (58,95% e 58,33%, respectivamente).
Animais TRPC5KO sépticos não apresentaram diferenças no score em relação
a animais wild type com sepse. A figura 9B mostra que a sepse induzida por
LPS aumentou significativamente a perda de peso em animais wild type (4,31
vezes); por outro lado, animais TRPC5KO sépticos não apresentaram
diferenças significativas na perda de peso corporal em relação ao grupo de
animais tratados com veículo. A figura 9C demonstra que o quadro séptico não
alterou a temperatura em animais wild type em relação ao controle; no entanto,
animais sépticos TRPC5KO tiveram um aumento significativo na perda de
temperatura corporal em relação ao controle (6,81 vezes) e em relação a
animais sépticos wild type (6,33 vezes).
64
Figura 9: Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 na severidade, peso,
temperatura e pressão sanguínea de camundongos com sepse induzida pela
administração intraperitoneal (i.p) de LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS). (A) Score de severidade (Quanto menor o score, mais grave
é o quadro séptico), onde foram observados os seguintes parâmetros e atribuído os
scores: Comportamento de limpeza (1-sem comportamento de limpeza, 2-reduzido, 3normal), ambulação (1-sem mobilidade, 2-pouca mobilidade, 3-parcialmente
diminuído, 4-normal), piloereção (1-presente, 2-ausente) e secreção ocular (1presente, 2-ausente), (B) Peso corporal (g), (C) Temperatura corporal (ºC), em animais
tratados com veículo (PBS), veículo + LPS, em animais wild type (selvagens) e
animais TRPC5KO (knockout para TRPC5). *p<0,05, difere do grupo veículo. #p<0,05,
difere do grupo veículo + LPS de animais wild type. N=12/grupo
A
B
Perda de peso corporal
(% em relação a basal)
20
15
*
10
*
5
0
*
15
10
5
0
Veículo
LPS
Veículo
WT
Veículo
LPS
TRPC5 KO
WT
C
Perda de temperatura corporal
(% em relação a basal)
Score de severidade
20
15
#
*
10
5
0
Veículo
WT
LPS
Veículo
LPS
TRPC5 KO
LPS
Veículo
LPS
TRPC5 KO
65
4.10 Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 em marcadores de
falência múltipla de órgãos em camundongos com sepse induzida por
LPS
Para avaliar o efeito da deleção gênica do receptor TRPC5 na falência
múltipla de órgãos em animais com sepse induzida por LPS em animais wild
type (selvagens) e TRPC5KO (knockout para TRPC5), foram mensurados os
níveis plasmáticos de aspartato-amino transferase (AST), para avaliar a
falência de células hepáticas; creatinina e ureia para avaliar a falência renal; e
lipase para avaliar a função pancreática, como mostra a figura 10. Animais
tratados com veículo (PBS) foram utilizados como controle nos dois grupos. De
acordo com a figura 10A, a sepse não alterou os níveis plasmáticos de AST em
nenhum dos grupos (wild type e TRPC5KO) em relação aos seus controles,
embora animais sépticos TRPC5KO parecerem ter os níveis desta enzima
aumentados. Os níveis de creatinina não foram alterados em nenhum dos
grupos (figura 10C). No entanto, como observamos na figura 06C, animais
sépticos TRPC5KO tiveram seus níveis de ureia significantemente elevados
(5,05 vezes), tanto em relação ao controle quanto em relação a animais
sépticos wild type. Os níveis de lipase não tiveram alterações significativas
entre os grupos de animais sépticos e não sépticos (Figura 10D).
66
A
250
200
150
100
50
0
Veículo
LPS
WT
Veículo
LPS
B
150
100
50
0
Veículo
TRPC5 KO
LPS
Veículo
WT
LPS
TRPC5 KO
#
*
40
30
20
10
0
Veículo
WT
LPS
Veículo
LPS
TRPC5 KO
Lipase (Miliunidades/mL)
D
C
50
Uréia (mmol/l)
Creatinina plasmática (g/ml)
Atividade da AST (milliunits/ml)
Figura 10: Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 na falência múltipla de
órgãos de camundongos com sepse induzida por LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS, i.p). (A) AST (miliunidades/ml), (B) creatinina (µg/ml), (C) ureia
(mmol/l) e (D) lipase (miliunidades/mL), em animais tratados com veículo (PBS),
veículo + LPS, em animais wild type (selvagens) e animais TRPC5KO (knockout para
TRPC5). *p<0,05, difere do grupo Veículo. #p<0,05, difere do grupo veículo + LPS de
animais wild type. N=12/grupo
5
4
3
2
1
0
Veículo
WT
LPS
Veículo
LPS
TRPC5 KO
67
4.11 Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 na produção dos
mediadores inflamatórios plasmáticos óxido nítrico (NO) e peróxido de
hidrogênio (H2O2) na sepse induzida por LPS
Os níveis plasmáticos de mediadores inflamatórios durante a sepse
também foram mensurados (Figura 11) para melhor compreensão do efeito da
deleção gênica do receptor TRPC5 (TRPC5KO) nas alterações sistêmicas
durante a sepse induzida por LPS. A figura 11A mostra que a sepse aumentou
a produção de NO a nível sistêmico em ambos os grupos wild type (822,31
vezes) e TRPC5KO (153,41 vezes) com relação a seus controles. Por outro
lado, a deleção gênica do TRPC5 não alterou esse aumento quando
comparados os animais sépticos de ambos os grupos. A concentração
plasmática de H2O2 não sofreu alterações em seus níveis durante a sepse em
animais wild type e TRPC5KO 24 horas após a administração de LPS (Figura
11B).
68
Figura 11: Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 na produção dos
mediadores inflamatórios plasmáticos NO e H2O2 na sepse induzida pela
administração intraperitoneal (i.p) de LPS (11,25 milhões de unidades de
endotoxina/Kg em PBS). (A) NO (µm), (B) H2O2 (µm), em animais tratados com veículo
(PBS), veículo + LPS, em animais wild type (selvagens) e animais TRPC5KO
(knockout para TRPC5). *p<0,05, difere do grupo veículo. N=12/grupo
A
NOx plasmático (M)
600
*
*
400
200
0
Veículo
LPS
WT
Veículo
LPS
TRPC5 KO
B
H2O2 plasmático (M)
500
400
300
200
100
0
Veículo
WT
LPS
Veículo
LPS
TRPC5 KO
69
4.12 Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 na produção dos
mediadores inflamatórios óxido nítrico (NO) e peróxido de hidrogênio
(H2O2) a nível local da inflamação (lavado peritoneal) e na fagocitose
mediada por macrófagos peritoneais durante um quadro séptico induzido
por LPS
Para uma melhor compreensão de como a resposta inicial à sepse foi
desencadeada, alguns mediadores inflamatórios tiveram suas concentrações
quantificadas no lavado peritoneal; também foi realizado o teste de fagocitose
com macrófagos obtidos do peritônio, 24 horas após administração de LPS
para indução da sepse, em animais wild type e TRPC5KO (knockout para o
receptor TRPC5), como mostra a figura 12. A figura 12A representa os níveis
locais de NO, mostrando que não houve nenhuma diferença nas concentrações
durante um quadro sépticos em animais wild type e TRPC5KO, nem em
animais tratados com veículo (PBS) nem em animais sépticos tratados com
LPS em ambos os grupos. De forma semelhante, como mostra a figura 1B, os
níveis de H2O2 também não mostraram diferenças entre animais sépticos e
normais em ambos os grupos wild type e TRPC5KO. Como observamos na
figura 12C, a sepse causou um pequeno aumento na fagocitose em relação a
animais tratados com veículos, no entanto, essa alteração não foi significante;
animais não expressando o TRPC5 também não tiveram a capacidade
fagocítica mediada por macrófagos alterada.
70
Figura 12: Efeito da deleção gênica para o receptor TRPC5 na produção dos
mediadores inflamatórios NO (óxido nítrico) e H2O2 (peróxido de hidrogênio) no sítio
local da inflamação (lavado peritoneal) e na fagocitose mediada por macrófagos
peritoneais, na sepse induzida pela administração intraperitoneal (i.p) de LPS (11,25
milhões de unidades de endotoxina/Kg em PBS). (A) NO (µM), (B) H2O2 (µM) e (C)
fagocitose, em animais tratados com veículo (PBS), veículo + LPS, em animais wild
type (selvagens) e animais TRPC5KO (knockout para TRPC5).
H2O2 Lavado peritoneal ( M)
B
200
150
100
50
0
Veículo
WT
LPS
Veículo
LPS
15
10
5
0
Veículo
TRPC5 KO
WT
C
Número de Beads/100 células
NOx lavado peritoneal (  M)
A
300
200
100
0
Vehicle
WT
LPS
Vehicle
LPS
TRPC5 KO
LPS
Veículo
LPS
TRPC5 KO
71
6 DISCUSSÃO
Para melhor entender os mecanismos imunológicos e a participação dos
receptores TRPC4 e TRPC5 na sepse, utilizou se um antagonista seletivo para
estes receptores, o ML204 (MILLER et al., 2011). Ressalta-se que esta é o
primeiro estudo acerca da participação desses receptores na SRIS associada a
bactérias Gram-negativas.
Estudos apontam que outros canais da família dos TRPs, podem
influenciar fisiologicamente sistemas relevantes à resposta do hospedeiro
durante a sepse e assim, representam um potencial alvo terapêutico para a
SRIS (FERNANDES et al., 2012; MENDES et al., 2015; SAND et. al., 2015). O
presente trabalho avaliou a participação dos receptores TRPC4 e TRPC5 na
sepse induzida por LPS. Os resultados obtidos demonstram que o bloqueio
destes receptores agrava a severidade da sepse 48h após a injeção de LPS,
principalmente por diminuir a capacidade de ambulação e aumentar a ptose em
camundongos sépticos. Ainda, o bloqueio destes receptores induz uma taxa de
mortalidade de 15%, 72h após a sepse. Ressalta-se que o modelo de sepse
utilizado é considerado um modelo leve a moderado em termos de severidade,
uma vez que animais sépticos controle não vêm a óbito nas condições
experimentais utilizadas. Assim, sugere-se que os receptores TRPC4 e TRPC5
venham a desempenhar um papel protetor na sepse. Um papel protetor para
outro membro da família TRP foi recentemente descrito. De fato, a ativação do
TRPV1 acarreta em proteção a diversos aspectos da resposta inflamatória à
bactérias, e também é capaz de influenciar a taxa de sobrevivência relacionada
a esta síndrome (WANG et al., 2013). De forma semelhante, Sand et. al., 2015
demonstraram que animais TRPV4KO apresentam uma severidade da sepse
aumentada em relação a animais wild type. Neste caso, o efeito protetor deste
receptor na sepse parece estar associado à sua expressão no endotélio
vascular, e subsequente importância na manutenção do tônus vascular (SAND
et. al., 2015). Por outro lado, a deleção gênica para o TRPC5 não alterou a
severidade da sepse quando avaliada no tempo de 24 horas. No entanto, não
se pode descartar que a deleção gênica para o TRPC5 possa afetar a
severidade da sepse em tempos posteriores. Com isso, outros parâmetros
72
devem ser avaliados para a melhor compreensão da piora no quadro séptico
pelo bloqueio dos receptores TRPC4/C5 e deleção gênica para o TRPC5, como
a perda de peso e temperatura corpal, que serão discutidas a seguir.
A perda de peso em camundongos sépticos tratados com LPS foi
significativa neste estudo, o que já se esperava devido à vasta literatura que
condiz com esses dados (SAND et al., 2015; FERNANDES et al, 2012;
MENDES et al, 2015). Porém, o tratamento com ML204 ou a deleção gênica
para o TRPC5 não interferiram nesse parâmetro, sugerindo que a ativação
destes receptores não exerce papel relevante no controle do peso ponderal em
quadros de sepse. No entanto, estudos demonstram que outros membros da
família TRP podem modular o peso de animais sépticos como o TRPV4, uma
vez que animais sépticos tratados com o antagonista de TRPV4, o HC-067047
ou TRPV4KO apresentam menor perda de peso quando comparados a animais
controle (SAND et al., 2015).
No presente estudo, também investigamos os efeitos do bloqueio dos
receptores TRPC4/TRPC5 ou da deleção gênica para o TRPC5, nas alterações
de temperatura corporal de animais sépticos Como esperado, a injeção de LPS
promoveu hipotermia, sendo esta resposta exacerbada em animais tratados
com o antagonista para TRPC4/C5,, ML204. De forma similar, animais
TRPC5KO injetados com LPS, exibiram acentuada hiportemia em comparação
com animais wild type. Estes resultados permitem sugerir que a regulação da
temperatura em animais sépticos é mediada pelo receptor TRPC5. Estudos
recentes sugerem um papel similar sobre a regulação da temperatura corporal
para outros TRPs, como o TRPV1 (FERNANDES et al., 2012) e TRPV4 (SAND
et al., 2015). É possível que os canais TRPV1, TRPV4 e TRPC5 atuem em
conjunto modulando a temperatura corporal em animais com sepse; ainda que
por mecanismos intermediários distintos. Por outro lado, novos estudos são
necessários para a maior compreensão dos mecanismos associados à
regulação da temperatura corporal pelo TRPC5.
Durante a sepse, ocorre alteração funcional das células endoteliais, as
quais desempenham um importante papel nos distúrbios da circulação. A
endotoxemia é apontada como responsável por diversas patologias, incluindo
desordens na microcirculação e resultando em falência múltipla de órgãos
73
(ODA et. al., 2000). Avaliou-se o impacto do bloqueio dos canais
TRPC4/TRPC5 e da deleção gênica para o TRPC5 nos níveis circulantes de
marcadores de falência hepática (AST), renal (creatinina e ureia) e pancerática
(lipase). A injeção intraperitoneal de LPS em camundongos não alterou os
níveis circulantes de AST em relação à animais controle. Ainda, demonstrou-se
que este parâmetro não foi alterado pelo tratamento com ML204 nem pela
deleção gênica do TRPC5, 24h após a injeção de LPS. Um estudo realizado
por Matsuzaki et al., 2001 também demonstrou que os níveis de AST não são
alterados em camundongos, 24 horas após a administração de LPS. No
entanto, deve se levar em consideração que a falência múltipla de órgãos é
relatada em quadros de sepse grave (SCIENTIA MEDICA, 2009) e que o
modelo utilizado no presente estudo foi de sepse leve ou moderada, sendo
assim, os animais não evoluíram para um estágio mais avançado da doença;
contudo, em acordo com a literatura publicada, outros órgãos além do fígado
são afetados pela resposta inflamatória sistêmica.
Durante a sepse, a produção exacerbada de mediadores inflamatórios
pode contribuir para a diminuição do fluxo sanguíneo nos rins. A lesão renal
aguda (LRA) durante a sepse está associada com 70% da mortalidade,
enquanto a mortalidade somente para a LRA é de 45% (RIEDMANN et. al.,
2003; SCHRIER et. al., 2004). A falha renal causada pela LRA é um dos
principais fatores para a mortalidade na sepse devido ao complexo mecanismo
pelo qual a síndrome da resposta inflamatória sistêmica leva a falha renal.
Estudos prévios demonstram que a administração de LPS como modelo
experimental da sepse causa a lesão renal aguda, devido a produção
aumentada de citocinas, óxido nítrico e outras alterações na imunidade
(SCHWARTZ et. al., 1997; KNOTEK et. al., 2001). Neste estudo, camundongos
C57BL/6 sépticos apresentaram níveis de creatinina aumentados em relação a
animais controle, o que está de acordo com outros estudos utilizando o mesmo
modelo experimental, (TAKAHASHI et. al., 2012). Animais sépticos tratados
previamente com o ML204 apresentaram uma diminuição, embora não
significativa, dos níveis plasmáticos de creatinina em relação a animais
tratados somente com LPS. Entretanto, os níveis de creatinina permaneceram
inalterados em animais sépticos TRPC5KO quando comparados a WT. Por
74
outro lado, animais sépticos TRPC5KO apresentaram uma elevação na
secreção de ureia em relação a animais WT, denotada pelo aumento nos níveis
circulantes deste marcador. A ureia e a creatinina são substâncias produzidas
pelo fígado resultantes da metabolização de proteínas que circulam no sangue
e são úteis para avaliar a função dos rins (órgão responsável pela eliminação
de ambas). Elevações nos níveis desses metabólitos são um sinal de mau
funcionamento dos rins. O monitoramento da creatinina é um indicador
importante, mais específico e confiável para avaliação da função renal. No
entanto, o clearance da ureia, além de indicar distúrbios de filtração glomerular,
também pode indicar alterações metabólicas associadas à sepse (PATELA et
al., 2015). Essas alterações metabólicas ocorrem não somente para manter o
gasto energético mas também para proteger o organismo da translocação de
bactérias para outros órgãos (MICHIE, 1996). Recentemente, demonstrou-se a
expressão de TRPC5 em células renais (Wong, 2010). No presente estudo a
deleção gênica do TRPC5 aumentou os níveis circulantes de ureia, sem alterar
os níveis de creatinina. Sugere-se que este receptor esteja envolvido na
homeostasia das alterações metabólicas e renais decorrentes da sepse,
podendo exercer um papel protetor neste órgão vital. Estudos recentes
demonstram uma função protetora similar para outros canais TRPs, como o
TRPV1 (WANG et. al., 2013); sugerindo que mais uma vez, estes receptores
possam exercer papéis complementares na homeostasia.
A lipase é uma enzima sérica que tem sido utilizada largamente como
marcador de inflamação pancreática. Contudo, o aumento dos níveis desta
enzima nem sempre predizem uma doença pancreática (BYRNE et. al., 2002),
pois pode estar aumentada em outras situações que mimetizam a pancreatite
aguda e outras doenças intra-abdominais como doenças do trato biliar,
processos de oclusão ou isquemia intestinal, apendicite aguda, dentre outros
(BYRNE et. al., 2002; OTSUKI et al., 2013). Neste estudo, observamos que
animais tratados com LPS não apresentaram diferenças na quantificação
plasmática da lipase. De forma semelhante, o tratamento prévio de animais
sépticos com o antagonista dos receptores TRPC4/C5 também não
apresentaram diferenças nas concentrações desta enzima em relação ao
controle e a animais sépticos não tratados com o ML204; animais sépticos
75
TRPC5KO também não tiveram os níveis plasmáticos de lipase alterados em
comparação com animais WT. Em contrapartida com esses resultados, estudos
têm demonstrado o aumento dos níveis plasmáticos de lipase em
camundongos com sepse induzida por LPS, 24 horas após a administração
intraperitoneal (FERNANDES et al., 2012); No entanto, deve se levar em
consideração que, neste estudo, os animais sépticos não evoluíram para o
quadro de sepse grave, não podendo ser descartada a possibilidade de lesão
pancreática
nesse
modelo.
Contudo,
tanto
animais sépticos tratados
previamente com o antagonista dos receptores TRPC4/C5 e animais
TRPC5KO pareceram ter uma leve diminuição nos níveis desta enzima, porém,
por não ser uma diminuição significativa, mais estudos são necessários para se
afirmar que esses receptores exercem uma possível proteção pancreática
durante a sepse.
As citocinas são produtos derivados de células imunológicas ativadas
por microorganismos ou componentes microbrianos (PAMPs). Elas formam um
grupo heterogênio de mediadores inflamatórios e apresentam um papel
essencial na patogenia da sepse e disfunção múltipla de órgãos, bem como na
produção de outros mediadores inflamatórios (radicais reativos de oxigênio,
nitrogênio e mediadores lipídicos) importantes no processo infeccioso
(CHAUDHRY et al., 2013). Dentre as mais estudadas na sepse, destacam-se o
TNF-α e a IL-1, por serem consideradas as primeiras citocinas a serem
produzidas durante a resposta inflamatória inicial.
O TNF-α representa uma das principais citocinas pró-inflamatórias para
induzir a resposta imunológica após o contato com o foco infeccioso. São
responsáveis por diversos efeitos no processo inflamatório, incluindo apoptose,
proliferação e diferenciação celular, aumento de moléculas de adesão
endotelial, replicação viral, dentre outros. Alguns estudos demonstram que
anticorpos anti-TNF-α agem como protetores contra endotoxinas ou bactérias
vivas na corrente sanguínea de animais (CHAUDHRY et al., 2013). Utilizando o
modelo de sepse por endotoxemia, o presente estudo demonstrou que após a
administração de LPS houve um aumento na secreção das citocinas TNF-α e
IL1-β, tanto a nível local da inflamação (peritônio) quando nos níveis
plasmáticos. Tais dados estão de acordo com vários estudos na literatura, onde
76
a presença de endotoxinas ocasiona a liberação de TNF-α e IL-1 (CHANDRA
et al., 2006; COCA et al., 2009). O bloqueio dos receptores TRPC4/C5 com o
ML204 não alterou os níveis circulantes e peritoneais de TNF-α e IL-1β em
animais sépticos. Estudos envolvendo a participação dos receptores TRPC4 e
TRPC5 na produção/inibição do TNF-α e IL-1β no quadro séptico ainda não
foram publicados na literatura, sendo este o primeio estudo a relatar esses
dados. No entanto outros receptores da família dos TRPs vêm sendo
estudados na resposta imune e produção de mediadores inflamatórios. Estudos
utilizando camundongos knockout para o receptor TRPV1 demonstraram que
animais TRPV1KO tiveram os níveis de TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentados
durante a endotoxemia por LPS, tendo como consequência a maior produção
de outros mediadores inflamatórios e aumentando ainda mais o dano causado
por eles. (CATERINA et al., 1997; JULIUS et al., 2001; WIMALAWANSA et al.,
1996). Sendo assim, os dados publicados na literatura confirmam que outros
TRPs podem modular a síntese de TNF-α e IL-1β, no entanto, os receptores
TRPC4/C5 não interferem na produção das mesmas.
A IL-6 é uma citocina que estimula a síntese de proteínas de fase aguda
pelo fígado (PCR, amilóide, etc), proliferação e diferenciação de linfócitos T e B
e de células natural killer, dentre outros. Ela pode ser secretada por linfócitos T,
linfócitos B, macrófagos, monócitos, fibroblastos, células endoteliais, dentre
outras células (ŁUKASZEWICZ et al., 2007). Altas concentrações desta citocina
durante a sepse indicam maior gravidade da doença e disfunção múltipla de
órgãos. A persistência de níveis elevados de IL-6 está associada ao
prognóstico letal da doença (WU et al., 2009). Este estudo demonstrou que a
IL-6 teve seus níveis locais (peritoneais) aumentados de forma significativa
durante o quadro séptico; os níveis plasmáticos também foram aumentos, mas
não de forma significativa. Tal resultado condiz com uma vasta quantidade de
estudos publicados na literatura, onde é bem definido o aumento da Il-6 nos
modelos de sepse que utilizam o LPS (CHAUDHRY et al., 2013; HOCH et al.,
2008). Essa citocina, em conjunto com outras, tais como TNF-α e IL-1β ativam
sistemas celulares (fagócitos e endotélio) e humoral (rotas de coagulação,
ativação de complemento, e mediadores de baixo peso molecular) os quais são
primariamente orientados para eliminação dos agentes agressores (bactérias,
77
por exemplo), mas ocasionalmente se tornam mediadores de uma inflamação
generalizada auto-destrutiva com consequências sistêmicas e falência múltipla
de órgãos (LIEN et al., 2002; RYAN et al., 1992). Por outro lado, este estudo
demonstrou que o pré-tratamento com ML204 não modulou a produção desta
citocina em animais sépticos; vale ressaltar que este é o primeiro estudo
demonstrando o papel dos receptores TRPC4/C5 na produção/inibição desta
citocinas na sepse. No entanto, a literatura reporta que outros canais TRPs são
ativados pelo LPS, aumentado os níveis plasmáticos de citocinas próinflamatórias, como o TRPA1. Um estudo realizado por Meseguer et al., 2014
utilizando camundongos knockout para o TRL4 (TRL4KO) demonstrou que a
molécula de LPS pode ser reconhecida pelo TRPA1, induzindo os sinais da
inflamação e o consequente aumento da produção sistêmica de IL-6 e outras
citocinas. Além do TRPA1, estudos também comprovam a participação de
outros TRPs na produção de mediadores inflamatórios, como o TRPV1, onde
animais tratados com capsaicina (agonista do TRPV1) tiveram a secreção
sistêmica de algumas citocinas pro-inflamatórias aumentadas, como a Il-6 e Il-8
(ZHANG et al., 2007). No entanto, com base nos dados obtidos no presente
trabalho, o TRPC4/C5 não modula a produção de IL-6 no quadro séptico.
A primeira citocina da família da il-17 foi descrita em 1995, sendo
expressadas em células T ativadas (YAO et al., 1995). Apesar de suas funções
biológicas não serem ainda bem conhecidas, sabe-se que ela é responsável
pela ativação e maturação de células do sistema imune, como os neutrófilos e
também estimula macrófagos a produzirem outros mediadores inflamatórios
(ZRIOUAL et al., 2008). No presente estudo foi demonstrado que a
administração de LPS em camundongos eleva os níveis plasmáticos de IL-17,
tanto no lavado peritoneal quanto no plasma (embora estatisticamente não
significativo), esse resultado condiz com muitos estudos publicados, onde esta
citocina tem sua concentração elevada no quadro séptico (FREITAS et al.,
2009). Esta pesquisa demonstra que a nível local da infecção, o ML204 não
alterou os níveis desta citocina em animais sépticos; por outro lado, a nível
sistêmico, o bloqueio dos receptores TRPC4/C5 aumentou de forma
significativa a síntese de IL-17 em relação ao grupo de animais tratados
somente com veículo, exacerbando essa produção em relação a animais
78
sépticos sem o tratamento prévio com antagonista desses receptores, o
ML204. Este é o primeiro estudo demonstrando o papel desses receptores na
produção de IL-17, no entanto, muitos estudos na literatura demonstram que
outros membros da família TRP atuam como moduladores na secreção e
produção de citocinas (ZHANG et al., 2007; JULIUS et al., 2001; MESEGUER
et al., 2014); ressalta-se ainda, que a literatura a qual relata o papel da IL-17 na
sepse ainda é muito limitada, bem como a modulação dos TRPs na sua
produção/inibição. O presente estudo demonstra que os receptores TRPC4/C5
pode exercer um papel na produção de IL-17 durante a sepse, no entanto,
necessita-se mais pesquisas para melhor compreender os mecanismos pelo
qual estes receptores atuam na produção desta citocina.
Após a eliminação e morte de microorganismos o organismo produz
mediadores cujo papel é inibir o processo inflamatório que produz dano ao
organismo, caso continue sendo estimulado por mediadores pró-inflamatórios.
Tal papel é exercido por diversas substâncias endógenas, entre elas a IL-10.
Essa citocina é produzida por monócitos e linfócitos, leva à inibição da
produção de citocinas pró-inflamatórias, da expressão do complexo de
histocompatibilidade principal tipo II (MHCII), fagocitose mediada por
macrófagos, dentre outras funções (OPAL et al., 2000). A IL-10 desempenha
um efeito protetor durante o quadro séptico, porém, altas concentrações desta
citocina juntamente com a IL-6 está relacionado com um pior prognóstico da
sepse (WU et al., 2009). No presente estudo observamos que após 24 horas a
sepse aumentou, porém de forma não significativa, as concentrações de IL-10
tanto a nível peritoneal quanto sistêmico. Em concordância com os dados do
presente trabalho, pesquisas demonstram que a produção de IL-10 é
aumentada em pacientes com sepse ou em modelos experimentais com a
função de contrabalancear as ações dos mediadores pró-inflamatórios, através
da redução da síntese e da liberação desses mediadores para antagonizar
seus efeitos; ainda, o aumento de IL-10 é fisiologicamente maior após o
processo inflamatório inicial, tendo um importante papel na homeostasia do
organismo (DINARELLO et al., 1997; SARAIVA et al., 2010). O bloqueio dos
receptores TRPC4/C5 diminuiu de forma significativa os níveis desta citocina
no lavado peritoneal e plasma em relação a animais sépticos não tratados com
79
o antagonista desses receptores. Levando em consideração que a IL-10
apresenta um efeito protetor tanto na sepse humana quanto em modelos
experimentais relacionado à inibição da produção de TNA-α e il-1β (GÉRARD
et al., 1993; HOWARD et al., 1993; OPAL et al., 2000; WAKABAYASHI et al.,
1991), os receptores TRPC4/C5 também podem exercer um efeito protetor no
quadro séptico, no entando, deve-se levar em consideração outros parâmetros
e que altos níveis de IL-10 também estão relacionados com uma piora da
sepse (GOGOS et al., 2000). Novamente ressalta-se que esta é a primeira
pesquisa relatando o papel desses receptores na modulação da produção
desta citocina durante o quadro séptico; no entanto, em contraste com esse
resultado, outros estudos demonstram que o pré-tratamento de camundongos
Balb/c com o cinemaldeído (agonista do TRPA1) é capaz de inibir a produção
de algumas citocinas séricas, dentre elas a IL-10 (LIAO et al., 2012) e inibição
do NFB, o fator de transcrição responsável pelo aumento da expressão gênica
de citocinas pró-inflamatórias (KWON et al., 2010). Com base nos dados
obtidos neste trabalho, observamos que os receptores TRPC4/C5 podem
modular a produção de diferentes padrões de citocinas na sepse, dentre elas, a
IL-10 foi a que mais demonstrou ter sua produção modulada por esses
receptores.
Após o LPS entrar em contato com as células do sistema imune inato,
estas células são ativadas e secretam uma série de mediadores inflamatórios
para combater a infecção e restaurar a homeostasia do organismo. Dentre
estes mediadores, podemos citar substâncias vasoativas, como o óxido nítrico,
um mediador pró-inflamatório produzido principalmente pela família das
enzimas NOS, principalmente a isoforma induzida (iNOS). Durante a sepse há
um conflito entre o sistema imune e o patógeno, isso induz a uma resposta
inflamatória intensa, fazendo com que as células do sistema imune inato
aumentem excessivamente a produção de óxido nítrico, o qual tem papel tanto
benéfico quanto prejudiciais ao organismo. O NO em concentrações
aumentadas provoca dano celular pela sua propriedade de espécie reativa e
pela interação com o superóxido formando o ONOO-, um potente oxidante e
também causando uma vasodilatação exacerbada nas células endoteliais
(JAVESGHANI et al., 2003).
80
O presente trabalho demonstrou que durante a sepse há um aumento na
produção de óxido nítrico peritoneal e que animais sépticos pré-tratados com o
ML204 exacerba significativamente essa produção. A concentração peritoneal
de NO em camundongos TRPC5KO não foi alterada em relação ao controle
nem a animais sépticos WT. Por outro lado, esses mesmos animais
(TRPC5KO) tiveram os níveis plasmáticos de NO aumentados com a
administração de LPS, porém, a deleção gênica para o TRPC5 não alterou
esse aumento. Esses resultados sugerem que a produção local aumentada de
NO pode está ligada ao bloqueio do TRPC4 ou do heterodímero TRPC4TRPC5 visto que animais TRPC5KO não sofreram alterações nos níveis
peritoneais de NO. Essa maior produção de NO, em alguns casos, pode ser
decorrente de uma maior produção pela enzima iNOS, o que condiz com um
estudo realizado por Groeneveld et al., 2003 onde relata que a persistência de
microorganismos ou de seus metabólitos faz com que o sistema imune
continue aumentando a produção de óxido nítrico e outros mediadores
inflamatórios, causando posteriormente o choque séptico no hospedeiro.
O NO em concentrações aumentadas provoca dano celular pela sua
propriedade de espécie reativa e pela interação com o superóxido, formando o
ONOO-, o qual é um composto oxidante que estimula a inflamação pela
ativação de fatores de transcrição, como o NF-B (COOKE et al., 2002). Victor
et al., 2009 em seu estudo “Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in
sepsis: a potential therapy with mitochondria-targeted antioxidants”, relata que
o óxido nítrico tem extensa atividade bactericida e que, quando produzido
através da enzima óxido nítrico sintase induzível, que está presente nas células
do sistema imune, como macrófagos e neutrófilos, pode conduzir à nitrozilação
da membrana bacteriana, causando sua morte e protegendo o hospedeiro.
A produção excessiva de óxido nítrico durante o quadro séptico, também
pode desencadear diversos outros efeitos no organismo, tais como hipotensão
severa resistente à terapia vasoconstritora, levando à insuficiência orgânica
generalizada (JEANNERET et al., 2011). Outros estudos demonstram outras
funções do óxido nítrico, como sua participação na temperatura corporal tanto
em condições fisiológicos quanto fisiopatológicas (PEREIRA et al., 2014).
Scammel et. al., 1996 demonstrou que o óxido nítrico atua como mediador na
81
indução da febre em ratos utilizando modelos com endotoxinas e que quando
administrado inibidores da síntese de óxido nítrico, a temperatura corporal é
reduzida. O presente trabalho relata prela primeira vez a influência do bloqueio
dos receptores TRPC4/C5, bem como a deleção gênica para o TRPC5 na
produção de óxido nítrico por células do sistema imune inato. No entanto, há
estudos comprovando a participação de outros TRPs na produção de NO,
como o estudo realizado por Lee, 2015, onde o pré-tratamento com um
agonista do TRPA1 reduziu a produção de NO em animais sépticos. Su et al.,
2014 demonstrou que o bloqueio parcial do TRPV1 é capaz de diminuir de
forma significativa a produção de NO em camundongos. Wuensch et al., 2010
afirma que a indução do estresse oxidativo pela administração de 100 mol/l
ONOO aumenta significativamente a expressão da proteína TRPC3 e TRPC6
em monócitos. O mesmo estudo demonstrou que, utilizando um bloqueador
para o TRPC, o 2-APB, o aumento de cálcio induzido pela administração de
ONOO foi significativamente atenuado. Balzer et al., 1999 sugeriu que os
canais TRPC são a base molecular da ativação de canais iônicos oxidantes em
células endoteliais. Poteser et al., 2006 reportou que a modulação no sistema
redox de canais TRPC são responsáveis pelas mudanças induzidas pelo
estresse oxidativo na sinalização mediada por cálcio citosólico. O óxido nítrico
representa um importante mediador durante o quadro séptico e diversos
estudos têm sido voltados para o conhecimento de sua produção e função,
neste estudo, observamos que o TRPC4 ou o heterodímero TRPC4-TRPC5
pode está parcialmente relacionado com a síntese de NO, visto que exacerbou
a produção desse mediador a nível peritoneal quando utilizado um antagonista
para esses receptores; no entanto, camundongos não expressando apenas o
TRPC5 não apresentou alterações nas concentrações de óxido nítrico nem a
nível local nem sistêmico.
O estresse oxidativo está quimicamente associado com a produção
excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS), ou a redução na
capacidade de defesa antioxidante (FINKEL et. al., 2000). Nos humanos, o
estresse oxidativo contribui para a patogênese de doenças sistêmicas,
metabólicas, cardiovasculares e neurodegenerativas (GIORDANO, 2005). O
ROS também tem sido fortemente implicado na patogênese da dor inflamatória
82
e neuropática (YOWTAK et al., 2011). Alguns membros da família dos TRPs
são considerados sensores do estresse oxidativo, como o TRPC5, que pode
ser ativado pelo óxido nítrico (ZHOLOS, 2014); além do mais, estudos
demonstram que o TRPV1 e TRPA1 modulam a produção de NO em
camundongos (LEE, 2015).
A sepse está muito relacionada com o aumento do estresse oxidativo e
o balanço entre o oxigênio disponível e o seu consumo, tendo uma redução na
extração do mesmo pelos tecidos associada a uma alteração importante na
regulação da microcirculação. Além disso, a produção exacerbada de alguns
reativos de oxigênio pode levar a uma vasodilatação periférica acentuada, que
é caracterizada pela baixa resistência vascular sistêmica (KVIETYS et al.,
2012).
O presente estudo também buscou investigar os níveis de H 2O2 no
lavado peritoneal de animais sépticos tratados e não com o antagonista dos
receptores TRPC4/C5; e de camundongos sépticos com deleção gênica para o
TRPC5 e WT. Os dados demonstraram que após a administração de LPS os
níveis de H2O2 no lavado peritoneal de camundongos sépticos tratados e não
com ML204 não apresentaram diferenças em comparação com o controle
(animais tratados com veículo); ainda, a sepse não alterou a concentração
desse mediador inflamatório no lavado peritoneal e plasma de animais sépticos
TRPC5KO em comparação com animais WT tratados e não com LPS. No
entanto, deve se levar em consideração alguns fatores para a não produção de
uma maior quantidade de H2O2 como a concentração de LPS injetada e o
período em que os parâmetros foram avaliados, visto que a literatura
demonstram que há um aumento da liberação de peróxido de hidrogênio
durante a sepse (HIMMELFARB, 2004), que é capaz de reagir com óxido
nítrico e formar moléculas tóxicas como o peroxidonitrito, que oxidam e lesam
as
proteínas
da
membrana
celular,
possuindo
grande
citotoxicidade
(REGUEIRA et al., 2011). Apesar de não modular a produção de H2O2, este é o
primeiro estudo relatando a participação dos receptores TRPC4/C5 na síntese
desse mediador inflamatório na sepse; no entanto, a literatura demonstra que
outros membros da mesma família desses receptores (TRPs) podem modular a
produção de H2O2. LIAO, 2012 relatou que a produção de H2O2 é diminuída
83
com a estimulação do TRPA1 pelo cinemaldeído (agonista desse receptor),
decorrente da redução da glutationa, um antioxidante hidrossolúvel que
metaboliza a molécula desse reativo de oxigênio. Um estudo recente realizado
por Mendes, 2015, demonstrou que animais sépticos pré-tratados com
cinemaldeído, agonista do TRPA1, também não apresentaram diferenças nas
concentrações de H2O2 no lavado peritoneal de camundongos. Sabe-se que o
H2O2 é uma molécula que pode estimular o TRPC5, no entanto, sabe-se muito
pouco a respeito da participação desse receptor (bem como do TRPC4 e
outros TRPs) na produção/inibição desse mediador inflamatório. No presente
estudo os receptores TRPC4/C5 não influenciaram na produção/inibição de
H2O2 durante a sepse.
A superóxido dismutase é uma enzima que, em células eucarióticas,
está localizada na membrana mitocondrial interna e é responsável pela
conversão do ânion superóxido em peróxido de hidrogênio e oxigênio celular. A
atividade da SOD está envolvida com o aumento do estresse oxidativo em
diversos modelos experimentais, provavelmente para produzir peróxido de
hidrogênio. Sendo assim, o aumento da atividade da SOD está ligada
diretamente com a produção do peróxido de hidrogênio (VALKO et al., 2015).
No presente estudo, investigou-se os níveis da SOD intracelular de macrófagos
peritoneais, os resultados mostram que houve um pequeno aumento na
atividade da SOD com a indução da sepse por LPS, no entanto esse aumento
não foi significante. Como o peróxido de hidrogênio não apresentou essa
diferença, sugere-se que esse aumento da atividade da SOD esteja
relacionado com o aumento na produção de NO nesses animais. Por outro
lado, em animais tratados com ML204, sugere-se que parte do NO gerado
nesses animais esteja relacionado ao aumento da atividade da SOD e também
pela produção desse mediador pela sua via clássica.
A sepse se desenvolve quando a resposta inflamatória inicial se
amplifica e é seguida de uma desregulação nessa resposta. Neste contexto, os
leucócitos desempenham uma função fundamental em reconhecer o estímulo
nocivo, ativar células e liberar mediadores inflamatórios iniciadores e
amplificadores desta resposta. As células do sistema imune inato em particular
reconhecem os componentes bacterianos (PAMPs) e ativam a resposta do
84
hospedeiro (MONNERET et al., 2015; RUSSEL, 2006). Investigou-se as
alterações celulares no lavado peritoneal e no sangue de animais sépticos e
saudáveis, tratados e não com o ML204. Os resultados deste estudo
demonstram uma tendência à diminuição no número de leucócitos totais após
tratamento com LPS. De fato, a injeção de LPS causa hipoperfusão, isto é,
vasoconstrição, dificultando a migração celular para leitos microvasculares,
como no caso, o leito mesentérico (ESMON, 2004); ainda, após estimulação
prolongada, o LPS leva à apoptose celular (SHARIFI et al., 2010); a nível
sistêmico, animais sépticos tiveram, embora de forma não significativa, uma
diminuição na contagem de células mononucleadas e um aumento nas células
polimorfonucleares; o pré-tratamento de animais sépticos com o ML204 não
alterou a população de polimorfonucleares, no entanto, diminuiu de forma
significativa as células mononucleares sanguíneas em relação a animais
tratados somente com veículo; no sítio da inflamação não houve diferença na
população de células mononucleares entre os grupos avaliados; no entanto,
células polimorfonucleares tenderam a diminuir, porém, não de forma
significativa. Alguns estudos demonstram que é característica da sepse as
alterações das populações de células inflamatórias circulantes, assim como
daquelas no sítio inicial da infecção como parte da resposta imune inata do
hospedeiro frente à infecção (WIERSINGA et al., 2011). De fato, a patogênese
da sepse está relacionada a uma disfunção generalizada da resposta
imune/inflamatória, sobretudo no âmbito celular, a qual implica no aumento da
morbidade dos pacientes acometidos (SIQUEIRA-BATISTA et al., 2012). Um
estudo realizado por Svanbom et al., 1980 demonstrou que em 35% dos
pacientes estudados, a sepse não apresentou uma resposta leucocitária, isto é,
uma leucocitose; trata-se, portanto, de um resultado semelhante aos achados
do presente trabalho. No entanto, deve se levar em consideração que, apesar
de mimetizar muitos aspectos da sepse humana, o presente trabalho avaliou
parâmetros de um modelo experimental de sepse por endotoxemia. O aumento
de células polimorfonucleares também é relatado no quadro séptico. No estágio
inicial da sepse há um aumento no número de neutrófilos circulantes
disponíveis para migração até o sítio da infecção, com consequência do
aumento de células polimorfonucleares tanto a nível local quanto sistêmico
85
(ALVES-FILHO et al., 2010). Este é o primeiro estudo demonstrando a
participação dos receptores TRPC4 e TRPC5 na sepse induzida por LPS; por
outro lado, estudos apontam que outros receptores TRPs são capazes de
modular a resposta celular em modelos de inflamação (NISSINI et al., 2012).
Estudos têm demonstrado que o TRPA1, o único membro da subfamília TRPA
dos TRPs é capaz de ser ativado por moléculas de LPS e induzir o processo
inflamatório. Dor e reações vasculares, incluindo inflamação neurogênica
causado pelo LPS são dependentes da ativação do TRPA1 em neurônios
sensoriais independente da ativação do TLR4 (MESEGUER et al., 2014).
Sendo assim, esse receptor pode também está diretamente ligado à resposta
celular na sepse por bactérias Gram-negativas. Um estudo realizado por
Miyake et al., 2015 demonstrou que o TRPV1 também está expresso em
células do sistema imune residente no cérebro (micróglias) e a ativação desse
receptor com capsaicina é capaz de promover a migração dessas células em
camundongos. O mesmo estudo demonstrou que a migração de micróglias
induzida pelo tratamento com capsaicina é significantemente reduzida quando
utilizado o antagonista do TRPV1 (SB366791). Os achados do presente
trabalho demonstraram que, apesar do grupo de camundongos pré-tratados
com ML204 apresentarem uma maior diminuição em células mononucleares
circulantes, o bloqueio dos receptores TRPC4/C5 parecem não influenciar na
celularidade leucocitária durante a sepse.
Investigou-se também a capacidade de fagocitose de macrófagos
peritoneais em modelo de sepse induzida por LPS em camundongos e da
participação dos receptores TRPC4 e TRPC5 nesse parâmetro. Os dados
demonstram que, embora não significativa, houve um aumento na taxa de
fagocitose (beads/célula) mediada por macrófagos em comparação com
animais controles não tratados com LPS. De forma similar, outros estudos
comprovam esse aumento na taxa fagocitária em macrófagos após
administração intraperitoneal de LPS (DANIKAS et al., 2008). O bloqueio dos
receptores TRPC4/C5 com o ML204 e a deleção gênica para o receptor
TRPC5 não alteraram o aumento dessa taxa. Alguns estudos demonstram que
em quadros mais graves de sepse a produção de citocinas anti-inflamatórias,
como a IL-10, pode suprimir a capacidade de eliminação de bactérias e
86
diminuir a fagocitose de macrófagos (SHUNG et al., 2007), diminuindo, assim,
a defesa do hospedeiro. Outros receptores da família dos TRPs são capazes
de modular a fagocitose mediada por macrófagos peritoneais, como o TRPV1
(Fernandes et al, 2012). No entanto, este estudo mostrou que o bloqueio do
TRPC4/C5 e a deleção gênica para o TRPC5 não interferiram na capacidade
fagocitária de macrófagos.
87
7 CONCLUSÃO
Os achados do presente estudo demonstram que os receptores TRPC4
e TRPC5, bem como suas variações expressas nas membranas celulares
(homodímeros e heterodímeros) exercem um efeito protetor durante a sepse
induzida por LPS, o bloqueio desses receptores com o ML204 aumentou a
gravidade e a mortalidade nesses animais; o receptor TRPC5 exerce um efeito
protetor para as células renais, visto que a deleção gênica para este receptor
aumentou os níveis plasmáticos de ureia. Embora nenhuma diferença
significativa tenha sido observada nos marcadores de falência múltipla de
órgãos com o bloqueio dos receptores TRPC4/C5, o ML204 pareceu reduzir os
níveis plasmáticos de lipase, podendo exercer um efeito protetor ao pâncreas
na sepse.
Ainda o tratamento com ML204 é capaz de mediar a regulação da
temperatura corporal e a produção de alguns mediadores inflamatórios, como o
óxido nítrico, o qual teve seus níveis locais exacerbados em relação a animais
sépticos sem o bloqueio dos receptores; a produção de citocinas também foi
modulada pelo antagonismo do TRPC4/C4, sendo que a IL-10 teve seus níveis
significativamente reduzidos tanto a nível local (peritônio), quanto sistêmico
(plasma) no quadro séptico em relação a animais com sepse sem o prétratamento com o ML204; a secreção plasmática de IL-17 foi significativamente
exacerbada em animais sépticos pré-tratados com esse antagonista. O
bloqueio dos receptores TRPC4 e TRPC5, apesar de ter causado uma
pequena redução na população de células mononucleadas circulantes, não
parece influencia na celularidade de camundongos sépticos no sítio da infecção
e a nível sistêmico. Neste estudo, esses receptores não influenciaram nos
níveis de outros mediadores inflamatórios durante a sepse como o H 2O2 e a
atividade da SOD, nem na fagocitose mediada por macrófagos peritoneais.
Este trabalho apresenta as primeiras evidências de que a ativação por
agonistas endógenos para os receptores TRPC4/C5 pode regular vias
inflamatórias associadas à SRIS decorrente de infecções bacterianas. Algumas
destas vias sugerem a relevância específica do TRPC5 para a proteção de
órgãos vitais, como os rins.
88
Por outro lado, pouco se sabe acerca do impacto da ativação destes
receptores por agonistas exógenos associados à infecções, como a tioredoxina
derivada de microrganismos. Sugere-se então que estes receptores podem ter
um papel ainda mais complexo na resposta do paciente, dependendo da fonte
de agonistas capazes de ativá-los. No entanto, mais estudos são necessários
para melhor compreender os mecanismos de ação desses receptores durante
a sepse.
89
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