Versão FINAL Dissertação

Rodrigo Saar Gomes
PAPEL DA e-NTPDASE DE Leishmania NOS
PROCESSOS DE ADESÃO, INTERNALIZAÇÃO
E MODULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE EM
MACRÓFAGOS
Dissertação apresentada à Banca
Examinadora
do
Mestrado
Acadêmico em Biotecnologia do
Núcleo de Pesquisa em Ciências
Biológicas
da
Universidade
Federal de Ouro Preto, como
exigência parcial à obtenção do
Título
de
Mestre
em
Biotecnologia, sob orientação do
Prof. Dr. Luis Carlos Crocco
Afonso.
OURO PRETO
2011
Trabalho desenvolvido no Laboratório de
Imunoparasitologia do Núcleo de Pesquisas
em Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, sob a orientação do
Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso e
coorientação da Profa. Dra. Juliana Lopes
Rangel Fietto, com auxílio financeiro da
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
Minas Gerais (FAPEMIG), Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES)
e
Conselho
Nacional
de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq).
II
G633p
Gomes, Rodrigo Saar.
Papel da e-NTPDase de Leishmania nos processos de adesão,
internalização e modulação da resposta em macrófagos [manuscrito] /
Rodrigo Saar Gomes. - 2011.
xi, 61f.: il.; graf.; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Luis Carlos Crocco Afonso.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a Processos e
ao Tratamento de Doenças.
III
Catalogação: [email protected]
IV
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho a meus pais, que me apoiaram em
todos os momentos de minha formação acadêmica
V
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a Deus, fonte inesgotável de inspiração. Á meus
pais e familiares, pelo apoio em todos os momentos durante minha formação. E àqueles
que participaram direta ou indiretamente de toda essa etapa de minha vida.
Agradeço ao Prof. Dr. Luis Carlos Crocco Afonso, pela orientação, paciência e
amizade. Mais que ensinamentos técnicos, ensina aos seus alunos importantes preceitos
de ética e amor a pesquisa.
Agradeço também à Profa. Dra. Juliana Lopes Rangel Fietto pela co-orientação e
importante colaboração nesse trabalho e ao seu aluno Raphael de Souza Vasconcellos
por ter colaborado e cedido proteína recombinante essencial no desenvolvimento dos
experimentos.
Agradeço ao Prof. Dr. Ricardo Gonçalves, pela colaboração do desenvolvimento
desse trabalho, seja nas sugestões e importantes discussões científicas e auxílio nos
experimentos que envolviam citometria de fluxo.
Agradeço à Profa. Dra. Leda Quércia Vieira, pela disponibilização do
laboratório para realização de experimentos de análise de citocinas e ao seu aluno
Mateus, que me ajudou nessa etapa.
Agradeço aos colegas de LIP, em especial Pauline, Tiago, Amanda e Míriam,
pelas sugestões, colaborações e participação nesse trabalho. E a todos do laboratório,
pela excelente convivência e amizade conquistada. Agradeço a aluna Márcia, que esteve
presente diretamente em grande parte dessa dissertação. E aos técnicos Marco e
Leandro, sem os quais, o bom andamento do laboratório seria difícil.
Agradeço aos professores, funcionários e colegas de outros laboratórios do
NUPEB. Aos amigos e companheiros que me apoiaram durante essa jornada e a
tornaram mais prazerosa.
VI
" Investir em conhecimentos rende sempre melhores juros. "
( Benjamin Franklin )
VII
RESUMO
As NTPDases são enzimas com a habilidade de hidrolisar nucleotídeos di e trifosfatados
sob estímulo de íons bivalentes (Ca2+ ou Mg2+) e são caracterizadas pela presença de
regiões altamente conservadas (ACR1 a ACR5). A maior parte dessas enzimas é
encontrada ligada à membrana e são conhecidas como ecto-nucleotidades. São
encontrados em inúmeros tipos celulares, incluindo protozoários, como parasitos do
gênero Leishmania. Possuem importante papel na modulação da resposta imune devido
à hidrólise de ATP, conhecida molécula inflamatória, e consequente acúmulo de
adenosina, pela ação subsequente da 5’-nucleotidase na quebra de AMP, que, por sua
vez, estimula resposta antiinflamatória. Sabe-se, ainda, do importante papel das
NTPDases no processo de adesão e internalização de parasitos em células hospedeiras.
O presente trabalho teve por objetivo avaliar o papel das e-NTPDases de Leishmania
nos processos de adesão, internalização e modulação da resposta em macrófagos.
Macrófagos provenientes do peritônio de camundongos C57BL/6 foram infectados com
L. amazonensis tratados com anticorpos anti-NTPDase, e os resultados demonstraram
redução na porcentagem de células contendo parasitos aderidos após 30 minutos. Além
disso, competição com e-NTPDase recombinante reduziu a adesão e internalização de
parasitos aos macrófagos. A modulação da expressão dessas enzimas através do
tratamento com adenina ou suramina no parasito também altera esses parâmetros. De
forma interessante, nas células que foram infectadas, o número de parasitos por célula é
o mesmo nos diferentes grupos, sugerindo que populações diferentes de macrófagos
possam ter níveis diferenciados de expressão de receptores desconhecidos pra eNTPDase. Para análise de modulação da resposta macrofágica, células foram incubadas
com e-NTPDase recombinante (rNTPDase). Os dados demonstram redução na produção
de óxido nítrico (NO) por células tratadas com rNTPDase. Além disso, observou-se
redução de citocinas como IL-10, IL-12 e aumento de TGF-β, demonstrando que a
ligação de e-NTPDase de Leishmania é capaz de modelar as diferentes funções do
macrófago. E, por fim, observou-se que células tratadas com rNTPDase perdem, após
30 minutos, a capacidade fagocítica. Conclui-se, portanto, que a e-NTPDase de
Leishmania é uma importante molécula de adesão e consequente internalização do
parasito pelos macrófagos e que essa ligação é capaz de alterar o padrão de resposta
dessas células, sendo indicativo de que a e-NTPDase é mais uma molécula de superfície
VIII
de Leishmania envolvida na subversão da resposta imune contra o parasito, e,
consequentemente, no favorecimento da infecção.
Palavras-chave: Leishmania, e-NTPDase, macrófago, óxido nítrico e citocinas
IX
ABSTRACT
NTPDases constitutes a family of enzymes with the ability to hydrolyze nucleotide di
and triphosphates under stimulation with bivalent cations (Ca2+ or Mg2+) and are
characterized by the presence of highly conserved regions (the ACR1 - ACR5). Most of
these enzymes are found membrane-bound and are known as ecto-nucleotidases. They
are found in numerous cell types, including protozoa, parasites such as the genus
Leishmania. They have an important role in modulating the immune response due to
hydrolysis of ATP, a known inflammatory molecule, and consequent accumulation of
adenosine, by subsequent action of 5'-nucleotidase in the breakdown of AMP, which in
turn, stimulates an anti-inflammatory response. NTPDases are also involved in the
adhesion and internalization of parasites to host cells. This study aimed to evaluate the
role of Leishmania’s E-NTPDase in the adhesion and internalization processes and
modulation of the response in macrophages. Peritoneal macrophages from C57BL / 6
mice were infected with L. amazonensis treated with anti-NTPDase, and the results
showed a reduction in the percentage of cells with adhered parasites after 30 minutes.
Moreover, competition with recombinant
E-NTPDase reduces the adhesion and
internalization of parasites to macrophages. The modulation of expression of these
enzymes in the parasite also alters these parameters. Interestingly, in cells that were
infected, the number of parasites per cell is the same in different groups, suggesting that
different macrophage populations may have different levels of expression of receptors
for unknown e-NTPDase. To analyze the modulation of macrophages, cells were
incubated with recombinant E-NTPDase (rNTPDase). The data demonstrate the reduced
production of nitric oxide (NO) by cells treated with rNTPDase. In addition, there was a
reduction of cytokines such as IL-10, IL-12 and TGF-β, showing that binding of
Leishmania e-NTPDase to the macrophage is able to interfere with macrophage
function. Finally, we observed that cells treated with rNTPDase lost after 30 minutes,
phagocytic capacity. Therefore, E-NTPDase of Leishmania is an important adhesion
molecule and subsequent internalization of the parasite by macrophages and this
binding can alter the response pattern of these cells, which could indicate that the ENTPDase is another surface molecule of Leishmania involved in subverting the immune
response
against
the
parasite,
thus
favoring
the
infection.
Keywords: Leishmania, e-NTPDase, macrophage, nitric oxide and cytokines.
X
ÍNDICE
Dedicatória...................................................................................................................................III
Agradecimentos............................................................................................................................IV
Resumo.........................................................................................................................................VI
Abstract......................................................................................................................................VIII
Lista de Figuras.............................................................................................................................X
Lista de Siglas..............................................................................................................................XI
Introdução....................................................................................................................................13
As e-NTPDases...............................................................................................................14
Leishmania e Fatores de Virulência................................................................................16
Leishmania e macrófagos................................................................................................20
Justificativa......................................................................................................................23
Objetivos.......................................................................................................................................24
Material e Métodos.......................................................................................................................26
Animais............................................................................................................................27
Parasitos...........................................................................................................................27
Medida da atividade enzimática de hidrólise de nucleotídeos.........................................27
Dosagem de atividade nucleotidáscia de proteína...........................................................28
Obtenção de macrófagos peritoneiais..............................................................................28
Infecção de macrófagos peritoneais................................................................................29
Avaliação das taxas de infecção de macrófagos pré-tratados com rNTPDase................29
Avaliação do papel da e-NTPDase de Leishmania na modulação da resposta
macrofágica......................................................................................................30
Avaliação da capacidade fagocítica de macrófagos........................................................30
Análise estatística............................................................................................................30
Resultados e Discussão................................................................................................................31
1.
O bloqueio da e-NTPDase de Leishmania através de anticorpos anti-NTPDase
reduz a adesão dos parasitos à macrófagos peritoneais.................................32
2.
A modulação da expressão de e-NTPDase em Leishmania altera os
perfis de adesão e internalização do parasito em macrófagos......33
3.
Competição com NTPDase recombinante reduz a adesão e internalização de
Leishmania em macrófagos peritoneais......................................................36
4.
Incubação de macrófagos com rNTPDase de Leishmania reduz a produção de
óxido nítrico por essas células..................................................................39
5.
A incubação de macrófagos com rNTPDase de Leishmania é capaz de reduzir a
produção de IL-10 e IL-12 e aumentar a produção de TGF-β por essas
células.................................................................................................40
6.
A pré-incubação de macrófagos com rNTPDase reduz a capacidade fagocítica
dessas células.................................................................................................43
Sumário de Resultados.................................................................................................................47
Conclusão.....................................................................................................................................49
Referências Bibliográficas............................................................................................................51
XI
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1. Membros da família das NTPDases e suas diferentes topografias de membrana e
propriedades catalítica...................................................................................................15
Fig. 2: Pré-tratamento com anti-NTPDase reduz a adesão de Leishmania à
macrófagos.....................................................................................................................32
Fig. 3: Crescimento de Leishmania em meio contendo suramina aumenta a atividade
ectonucleotidásica do parasito e crescimento em meio contendo adenina reduz esse
parâmetro.........................................................................................................................34
Fig. 4: Tratamento com adenina reduz adesão e internalização de L. amazonensis em
macrófagos e tratamento com suramina aumenta essas taxas de infecção.....................35
Fig. 5: Pre-incubação de macrófagos com rNTPDase reduz a adesão e internalização de
L. amazonensis...............................................................................................................38
Fig. 6: Adesão de rNTPDase a macrófagos é capaz de reduzir a produção de NO por
essas célilas....................................................................................................................39
Fig. 7: Adiçãode rNTPDase a macrófagos reduz a produção de IL-12 e IL-10 por essas
células..............................................................................................................................41
Fig. 8: Adição de rNTPDase aumenta a produção de TGF-β por macrófagos................42
Fig.
9:
Pré-incubação
com
rNTPDase
reduz
a
capacidade
fagocítica
de
macrófagos.......................................................................................................................44
XII
LISTA DE SIGLAS
ADO: adenosina
ADP: difosfato de adenosina
AMP: monofosfato de adenosina
AMPc: AMP cíclico
ATP: trifosfato de adenosina
CD39: apirase
CD73: 5’-nucleotidase
DTH: hipersensibilidade do tipo tardia
E-NTPDase: ectonucleosídeo 5’-trifosfato difosfohidrolase
IFN-y: interferon gama recombinante
IL- interleucina
iNOS: enzima óxido nítrico sintase induzível
LACK: proteína homóloga de receptores de proteína quinase C ativada
LPG: lipofosfoglicano
MAC: complexo de ataque à membrana
MCP-1: proteína quimiotática para monócitos
mRNA: RNA mensageiro
NK: natural killer
NO: óxido nítrico
XIII
NTPDase: nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase
PBS: salina tamponada com fosfato
Pi: fosfato inorgânico
PPG: proteofosfoglicanos
SFB: soro fetal bovino
SFM: Sistema Fagocitário Mononuclear
TCR: receptor de célula T
TNF: fator de necrose tumoral
XIV
INTRODUÇÃO
15
As e-NTPDases
As NTPDases, ou ATP difosfohidrolases, são enzimas da família das apirases
com habilidade de hidrolisar nucleotídeos trifosfatados até a sua forma monofosfatada,
sob estímulo de íons bivalentes, como cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+). Esses enzimas
se caracterizam pela presença de cinco regiões altamente conservadas entre as espécies,
denonimadas ACRs (apyrase conserved regions) que são predominantemente as regiões
de maior importância para a atividade catalítica (Zimmermann, 2000; Handa e Guidotti,
1996).
Em mamíferos, as NTPDases se dividem em oito grupos. As NTPDases 1, 2, 3 e
8 são encontradas na superfície celular, ligadas a membrana. A maior parte é encontrada
ligada a membrana celular com o sítio ativo voltado para o meio extracelular, por isso
são denominadas ecto-NTPDases. Contudo, nem todos representantes dessa família de
enzimas são ectoenzimas, sendo que algumas são intracelulares, sendo encontradas no
lúmem de organelas como complexo de Golgi e reticulo endoplasmático. As NTPDases
4, 5, 6 e 7 são intracelulares, porém as NTPDases 5 e 6 podem ser secretadas após
expressão heteróloga (Robson e cols., 2006). A nomenclatura dessas enzimas é
complexa e envolve também a preferência por substrato, íon bivalente catalisador e até
mesmo o produto formado. A NTPDase 1 hidrolisa ATP e ADP de forma semelhante,
enquanto NTPDase 3 e 8 tem preferência pelo ATP como substrato (Kukulski e cols.,
2005; Zimmermann, 2001). NTPDases 1 e 2 são ativadas de forma preferencial por
Mg2+, enquanto as NTPDases 3 e 8 tem preferência pelo Ca2+. Tais diferenças entre os
subtipos de NTPDase e suas propriedes catalíticas são observadas devido a alterações
tanto na sequência primária dessas enzimas, quanto nas estruturas secundárias, terciárias
e quartenárias (Grinthal e cols., 2004) (Figura1).
16
Fig. 1. Membros da família das NTPDases e
suas diferentes topografias de membrana e
propriedades catalítica. (extraído de Zimmermann, 2000)
Em mamíferos, a CD39, protótipo das NTPDases, possui funções diversas, como
inibição da agregação plaquetária (Gayle e cols., 1998), efeitos na homeostase vascular
(Atkinson e cols., 2006) e na modulação da inflamação e resposta imune, por afetar a
concentração de ATP extracelular (Mizumoto e cols., 2002). O ATP extracelular
sinaliza através dereceptores purinérgicos do tipo P2, que modulam a resposta imune
através do aumento na produção de citocinas proinflamatórias, como IFN-y, TNF, IL-1
e IL-12 (la Sala e cols., 2003; Langston e cols., 2003) A hidrólise de ATP extracelular
pela NTPDase/CD39 reduz os estímulos inflamatórios e, por outro lado, o consequente
aumento na concentração de adenosina (ADO), através da ação da 5’-nucleotidase na
hidrólise de AMP, amplia a estimulação de receptores de adenosina ligados à inibição
de ativação de células T e supressão de citocinas proinflamatórias.
Os receptores purinérgicos são importantes na modulação da reposta imune,
sendo encontrados na superfície de inúmeras células. Esses receptores são divididos em
duas família: P1 e P2 (Burnstock, 2007). A família P1 possui quatro membros
conhecidos – A1, A2A, A2B e A3 – acoplados a proteína G e ativados pela ação de
adenosina (Fredholm e cols., 1994). Nos receptores A2A e A2B, em especial, a função
de modulação imune pela ação de adenosina é de extrema importância, envolvendo
aumento de AMP cíclico e consequente inibição da resposta imune das células. Essa
17
inibição da resposta se dá pela redução na produção de IFN-y, TNF-α e IL-12 pelas
células e aumento na produção de IL-10 (Raskovalova e cols., 2005; Lappas e cols.,
2005; Panther e cols., 2003). A1 e A3, por outro lado, inibem a produção de AMPc,
levando a um aumento na concentração de cálcio intracelular (Abbracchio & Ceruti,
2007)
Já os receptores P2 são dividos em duas subfamílias - P2X, ligados a canais
iônicos, e P2Y, associados a proteína G- estimulados por ATP. São conhecidos sete
membros da subfamília P2X e oito membros da subfamília P2Y. Estudos demonstram a
importância de membros da subfamília P2X em processos neurosensoriais, agregação
plaquetária, morte celular, ativação de IL-1β e TNF-α (Khakh e cols., 2001; North,
2002; Ferrari e cols., 2006). Por outro lado, P2Y está intimamente associado a
proliferação celular, apoptose, inflamação, maturação de células dendriticas e aumento
na produção de IL-13, dependendo do subtipo do receptor. (Abbracchio e cols., 1998;
Schnurr e cols., 2000).
As NTPDases são encontradas em inúmeros tipos celulares em diversos
organismos eucariotos. Entre os organismosque expressam genes da família das ENTPDases estão os protozoários, como Toxoplasma gondii (Asai e cols.,1995), ,
Leishmania (L.) amazonensis (Pinheiro e cols., 2006), Trichomonas vaginalis (Tasca e
cols.,
2003)
e
Trypanosoma
cruzi
(Meyer-Fernandes
e
cols.,
2004).
Em
tripanossomatídeos, as E-NTPDases tem papel fundamental na via de salvação de
purinas, visto que esses parasitos não possuem a capacidade de realizar síntese “de
novo” destes nucleotídeos (Marr e cols., 1978). Dessa forma, enzimas na superfície
desses parasitos, como a e-NTPDase, são responsáveis por degradar ATP até AMP,
gerando adenosina por ação sequencial da 5’-nucleotidase, que é, então, internalizada
por esses protozoários (Gordon, 1986).
Leishmania e Fatores de Virulência
As Leishmanioses são doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania,
compreendendo diferentes formas clínicas que variam de lesões cutâneas simples a
formas viscerais. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), as leishmanioses
18
atingem cerca de 12 milhões de pessoas, distribuídas em cerca de 90 países. Estima-se
que incidência anual da doença seja de 2 milhões de novos casos, colocando-a como
umas das 6 doenças tropicais de maior importância. Brasil, Índia, Nepal, Sudão e
Balgladesh são os países responsáveis por 90% dos casos de leishmaniose no mundo
(WHO, 2001).
O parasito é transmitido ao homem pela inoculação de formas promastigotas
metacíclicas durante o repasto sanguíneo das fêmeas de flebotomíneos (Ferro e cols.,
1995). Essas formas são fagocitadas por células do Sistema Mononuclear Fagocitário
(SMF), transformando-se em amastigostas sem flagelo externalizado. A multiplicação
das amastigotas no interior das células culmina com lise celular, que possibilita a
infecção de novas células ou infecção do inseto vetor, levando a manutenção do ciclo
biológico do parasito (Lainson & Shaw, 1988).
As leishmanioses têm sido classificadas com base na síndrome da doença.
Diferentes espécies de Leishmania são, geralmente, distinguidas pelas características
clínicas e geográficas. Existem quatro diferentes formas clínicas de leishmaniose que
variam de lesões cutâneas simples a formas viscerais (Convit e cols., 1972; Carvalho e
cols., 1994; Costa e cols., 1986; Galvao e cols., 1993; Leopoldo e cols., 2006; Turetz e
cols., 2002):
- Leishmaniose cutânea: formas que apresentam,exclusivamente lesões cutâneas,
ulcerosas ou não, porém limitadas. As principais espécies no Novo Mundo responsáveis
são L. (V.) braziliensis, L. (L.) amazonensis e L. (V.) guyanensis, L. major e L. tropica.
- Leishmaniose mucocutânea: formas que se complicam frequentemente com o
aparecimento de lesões destrutivas nas mucosas do nariz, boca e faringe. A principal
espécia causadora no Novo Mundo é L. (V.) braziliensis.
- Leishmaniose cutânea difusa: lesões não ulceradas distribuídas pelo corpo, que se
apresentam em indivíduos anérgicos.. Causada principalmente por L. (L.) amazonensis.
- Leishmaniose cutânea disseminada: Numerosas lesões ulceradas, distribuídas pelo
corpo. Causada por L. (V.) guyanensis e L. (V.) braziliensis.
19
- Leishmaniose visceral ou calazar: formas viscerais em que os parasitos apresentam
acentuado tropismo pelo SFM do baço, do fígado, da medula óssea e dos tecidos
linfóides. Principais espécies envolvidas são a L. donovani e L. (L.) infantun.
Pacientes com a forma cutânea localizada desenvolvem uma resposta do tipo Th1.
As lesões mucocutâneas, com destruição de mucosas, caracterizam-se por uma mistura
de resposta dos tipos Th1 e Th2, enquanto pacientes que possuem a forma difusa de
leihmaniose caracterizam-se, em geral, por uma ausência de resposta (Cáceres-Dittmar e
cols., 1993; Pirmez e cols., 1993).
Segundo a Organização Mundial de Saúde, as leishmanioses estão entre as cinco
doenças endêmicas de maior relevância e a profilaxia é a melhor estratégia para o
controle das doenças infecto-parasitárias. Sendo assim, é de fundamental importância o
conhecimento dos mecanismos de virulência do parasito para a aplicação deste em
mecanismos de imunoprofilaxia. Muitos estudos têm sido realizados com o objetivo de
encontrar e avaliar mecanismos que permitam a invasão do hospedeiro ou a evasão do
sistema imune. Algumas moléculas presentes na superfície dos parasitos do gênero
Leishmania têm sido relacionadas na interação celular parasito-hospedeiro. Alguns
fatores de virulência bem conhecidos atualmente são lipofosfoglicano (LPG) (Handman
& Bullen, 2002), a glicoproteína gp63 (Chang e cols., 1986) e as cisteíno-peptidases
(Buxbaum e cols., 2003).
As moléculas de superfície dos parasitos do gênero Leishmania pertencentes à
família de fosfoglicanos compreendem os glicolipídeos, assim como lipofosfoglicanos
(LPG), e as proteínas fosfoglicosiladas, assim como fosfatase ácida secretada e
proteofosfoglicanos (PPG). Acredita-se que LPG é um complexo glicolipídico que
esteja envolvido na invasão de promastigotas de todas as espécies de Leishmania e
também de amastigotas, que expressam uma forma estruturalmente distinta da molécula
(Handman e col., 1987; Turco, 1988; Glaser e cols., 1991, Moody e cols., 1993).
As glicoproteínas na superfície celular desempenham um importante papel na
interação célula-célula. Este tipo de interação ocorre em infecção intracelular de células
por parasitos como os do gênero Leishmania (Chang e cols., 1986). Outros estudos
mostraram que a gp63, especificamente, é um importante fator de virulência e devido à
20
sua abundância na superfície do parasito e à sua capacidade de mediar resistência contra
a resposta àinfecção de promastigotas, tendo sido sugerida como um candidato para
vacinação contra infecção por Leishmania (Handman e cols., 1990; Nascimento e cols.,
1990). Recentemente a gp63 foi apontadacomo responsável pela inibição da
proliferação de células NK por ligar-se diretamente a estas (Lieke e cols., 2008).
As cisteíno-peptidases foram apresentadas como um fator importante na evasão
da resposta imune por parasitos do gênero Leishmania. Estudos com camundongos
foram realizados para se entender porque espécies de Leishmania do complexo L.
mexicana no Novo Mundo causam lesões crônicas em humanos e espécies de
Leishmania no Velho Mundo podem causar lesões de cura espontânea em humanos.
Nestes estudos foi possível perceber que as cisteíne-peptidases podem suprimir a
apresentação de antígeno ou a proliferação de célula T e alterar a via Th1. (Buxbaum e
cols., 2003).
Dados do nosso laboratório demonstraram, ainda, a importância da enzima ATP
difosfohidrolase, também conhecida como NTPDase, no estabelecimento da infecção
(Maioli e cols., 2004; Marques-Da-Silva e cols., 2008; Souza e cols., 2010). Sugere-se
que a capacidade ectonucleotidásica esteja diretamente envolvida com a virulência e o
controle da resposta imune do hospedeiro pela Leishmania, por aumentar a inibição da
inflamação via ADO e diminuir o estímulo proinflamatório via ATP. Dessa forma, a
atividade ecto-nucleotidásica leva a uma maior capacidade de estabelecimento e
disseminação da infecção. Sabe-se, contudo, que o papel da e-NTPDase como fator de
virulência de Leishmania não se resume apenas a modulação da resposta imune, mas
sabe-se ainda doimportante papel das NTPDases no processo de adesão e internalização
de parasitos nas células hospedeiras. Bisaggio e colaboradores, 2003, mostraram que a
inibição da ecto-ATPase de T. cruzi leva a uma redução a adesão e fagocitose desses
parasitos por macrófagos e, mais recentemente, Santos e colaboradores, 2009,
comprovaram esse papel utilizando anticorpos anti-NTPDase de T. cruzi na inibição do
processo de adesão em células VERO.
21
Leishmania e macrófagos
O sucesso da infecção de Leishmania em macrófagos depende da capacidade do
parasito em aderir à essas células por receptores de membrana e, dessa forma, serem
fagocitados (Alexander & Russel, 1992). A gp63, abundante molécula de superfície de
Leishmania é capaz de ligar-se a inúmeros receptores de macrófago, como Mac-1
(CD11b/CD18), receptores para fibronectina e CR3 e essa ligação é mais eficientena
presença de proteínas do complemento (Brittingham e cols., 1999). Já o LPG pode
interagir com receptores p150/95 e CR3. Dentro nos vacúolos parasitóforos, as
promastigotas transformam-se em amastigotas, que são resistentes ao pH ácido e à ação
das enzimas lisossomais no interior do macrófago (Bogdan & Rollinghoff, 1998).
Dentre as funções do LPG, destaca-se, ainda, a importância dessa molécula na inibição
da fusão do fagossomo-endossomo, o que garante a sobrevivência do parasito no
interior dos macrófagos (Desjardins e cols., 1997). A opsonização das formas
metacíclicas com C3b ou C3bi, componentes do sistema complemento, pode facilitar a
ligação das formas metacíclicas com os receptores do complemento CR1 e CR3,
respectivamente, o que facilita sua adesão ao macrófago e consequentemente, a
internalização dos parasitos. Outros receptores envolvidos na ligação do parasito ao
macrófago do hospedeiro são os receptores que reconhecem padrões moleculares dos
parasitos, como, por exemplo, receptor para fucose-manose,
receptor para
fribronectina, receptor para a porção Fc dos anticorpos e o receptor para proteína C
reativa. Todos esses receptores de macrófago facilitam a entrada da forma promastigota
metacíclica, geralmente de forma silenciosa, na célula hospedeira (Naderer e cols.,
2008)
O macrófago pode controlar e eliminar o parasito através de inúmeros
mecanismos que envolvem a produção de IL-12, que, por sua vez, estimula linfócitos e
células NK a produzirem IFN-y, que age em sinergismo com TNF na estimulação dos
próprios macrófagos a produzirem reativos de oxigênio que são tóxicos para o parasito
(Gorak e cols., 1998; Kane & Mosser, 2000). A morte do parasito foi, por muito tempo,
associada apenas à produção de ânios superóxido (O2-) e peróxido de hidrogênio (H2O2)
durante a explosão respiratória de macrófagos ativados em resposta a fagocitose
(Channon e cols., 1984; Murray, 1982). Sabe-se hoje, contudo, que isso é dependente do
estágio biológico do parasito, sendo que promastigotas são susceptíveis à óxido nítrico,
22
mas formas metacíclicas e amastigotas são mais susceptíveis à ROS (Bogdan e cols.,
1990; Bogdan e cols., 1999). O óxido nítrico, por sua vez, é gerado só após o estímulo
de macrófagos por IFN-y e TNF e é uma das principais moléculas envolvidas na
atividade leishmanicida (Grantt e cols., 2001; Green e cols., 1991; Mauel e cols., 1991).
O óxido nítrico (NO) envolvido na resposta imune contra patógenos é proveniente da
NOS (óxido nítrico sintetase) II, conhecida como NOS induzível ou iNOS. A produção
de NO por iNOS é dependente de inúmeras citocinas inflamatórias como IFN-y, TNF,
IL-1 e IL-2 e essa produção pode ser inibida por citocinas anti-inflamatórias como IL-3,
IL-4 e IL-10 (Ferric, 1997; Jorens e cols., 1995).
O mecanismo exato pelo qual o NO é capaz de eliminar o parasito não é
totalmente conhecido, mas acredita-se que o NO reaja com ferro intracelular levando à
inibição de enzimas que possuam o ferro no núcleo do seu grupo prostético. Isso pode
ocasionar a inibição de enzimas envolvidas na síntese de DNA, como a ribonucleotídeo
redutase,
na respiração mitocondrial e nas atividade metabólicas do parasito
(Bourguinon e cols., 1997; Lepoivre e cols., 1994; Nathan & Xie, 1994).
Numerosos estudos demonstraram a importância do iNOS e NO no controle de
parasitos do gênero Leishmania. Camundongos knockout para iNOS infectados com L.
major desenvolveram formas disseminadas da doença (Evans e cols., 1993) e observouse aumento de iNOS em infecção in vitro de macrófagos humanos com L. chagasi
(Grantt e cols., 2001). Esses estudos indicam que o NO é uma molécula envolvida na
viabilidade dos parasitos no interior de macrófagos.
Além da função microbicida, o macrófago tem como função a presentação de
antígenos aos linfócitos que, em geral, são as células efetoras na morte de patógenos e
na produção de moléculas envolvidas no estímulo de outras células, até mesmo do
macrófago, como já citado (Stites e cols, 2000). A apresentação de antígeno envolve o
processamento desses e a ligação dos peptídeos antigênicos a moléculas de MHC II.
Sabe-se que parasitos podem levar à inibição da apresentação de antígeno e,
consequentemente, da estimulação de células T. Essa inbição pode se dar tanto pela
supressão, internalização e degradação de moléculas de MHC II (Bogdan &
Rollinghoff, 1998; Cunningham, 2002) Estudos demonstram ainda que a expressão de
moléculas co-estimuladoras da apresentação de antígeno, como CD40, CD80 e CD86
23
são importantes na resposta imune contra Leishmania. Já foi demonstrado que o
bloqueio dessas moléculas leva a uma inibição de IFN-γ, IL-5 e IL-12 (Brodskyn e
cols., 2001).
Outras citocinas estão envolvidas na resposta imune contra Leishmania. A
resposta imune é dependente do perfil de citocinas produzidas pelas células dendríticas
e macrófagoss, direcionando, assim, para um perfil Th1 ou Th2 (Green e cols, 1990;
Mosser e cols., 1999). Macrófagos de camundongos CBA/J infectados com L.
amazonensis e L. major apresentam um aumento na expressão de mRNA para TNF-α
(Gomes e cols., 2003). Como já citado, o TNF é importante mensageiro de ativação de
macrófagos, inclusive, para que essas células produzam NO e outras moléculas
leishmanicidas. TGF-β e IL-10 também são envolvidas na resposta imune à infecção por
Leishmania. O TGF suprime a expressão de iNOS, apesar de estudos controversos que
demonstram também o efeito dessa citocina na ativação de resposta Th1 (Swain e cols.,
1991; Barral e cols., 1993; Barral e cols., 1995; Gantt e cols., 2003). Já a citocina IL-10
é capaz de exacerbar a infecção por parasitos. Observou-se aumento da expressão de
mRNA para IL-10 durante a infecção por L. donovani e, esse aumento foi capaz de
exacerbar a doença (Melby e cols, 1998; Goto e cols, 2004).
Salienta-se que inúmeros estudos demonstram o papel de Leishmania na
supressão da resposta imune do macrófago após a fase inicial de infecção. Na presença
de estímulo inflamatório, a infecção de macrófagos com Leishmania é capaz de reduzir
a produção de inúmeras citocinas proinflamatórias, como IL-12, IL-1α e TNF-α. Por
outro lado, observa-se estímulo de outras citocinas pró-inflamatórias e algumas
quimiocinas, como o MCP-1, quimiotático para monócitos (Lapara III & Kelly, 2010).
Observa-se ainda, que a infecção por Leishmania também é capaz de inibir a síntese de
NO por macrófagos (Balestieri e cols., 2002). Essas alterações são benéficas para a
sobrevivência do parasito no interior de macrófagos, garantindo a continuidade da
infecção. Dessa forma, a Leishmania é capaz de subverter a resposta imune, escapando
dos mecanismos microbicidas do macrófago.
24
Justificativa
Sabe-se da importância do conhecimento dos marcadores de virulência no
entendimento dos mecanismos imunoparasitológicos da infecção por parasitos do
gênero Leishmania e no consequente desenvolvimento de vacinas e estratégias
diagnósticas. Trabalhos do nosso grupo já demonstraram a importância das e-NTPDases
de Leishmania na modulação da resposta imune celular pela ação dessas enzimas na
degradação de ATP e acúmulo de AMP, que pode ser degradado pela 5’-nucleotidade,
levando à geração de adenosina. Trabalhos de outros grupos, contudo, sugeriram
também um papel na adesão dos parasitos às células hospedeiras. Esse trabalho visou
fortificar o entendimento desse papel das e-NTPDases de Leishmania no processo de
adesão ao macrófago, principal célula hospedeira desse parasito.
Experimentos anteriores demonstraram que parasitos com maior atividade
ectonucleotidásica, e possivelmente maior expressão das enzimas na sua superfície,
eram capazes de infectar com maior facilidade as células hospedeiras e, além disso, os
macrófagos não eram capazes de destruir os parasitos internalizados e combater assim a
infecção. Tais dados nos levaram a sugerir que além da função de adesão ao macrófago,
as e-NTPDases de Leishmania podem ter importante papel na modulação da resposta
imune pelo simples contato com a célula hospedeira, e, não só, por modulação da
resposta por acúmulo de adenosina
Em suma, o presente trabalho visa entender mais profundamente o mecanismo
pelo qual as e-NTPDases favorecem a infecção por parasitos do gênero Leishmania. A
comprovação do papel em adesão e modulação imune dos parasitos por macrófago abre
possibilidades
para utilização dessas enzimas como alvos quimioterápicos e/ou
estratégias vacinais.
25
OBJETIVOS
26
Objetivo Geral:
Avaliar o papel da e-NTPDase de Leishmania nos processos de adesão, internalização e
modulação da resposta em macrófagos peritoneais
Objetivos Específicos:
1. Verificar o papel da e-NTPDase de Leishmania no processo de adesão e
internalização do parasito em macrófagos
2. Avaliar o papel da NTPDase na modulação da resposta imune do macrófago
pela análise da produção de NO, IL-12, IL-10 e TGF-β por essas células.
3. Avaliar se a NTPDase tem algum papel na alteração da capacidade fagocítica
dos macrófagos.
27
MATERIAL E
MÉTODOS
28
Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6, com idade entre 4 e 8
semanas, obtidos do Biotério Central – Centro de Ciência Animal da UFOP onde
receberam ração e água ad libidum.
Parasitos
Culturas de L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) foram cultivadas em meio Grace
(GIBCO BRL, Grand Island, N.Y., USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino
inativado (SFB; Cripion, Andradina, SP, Brazil), L-glutamina 2 mM (GIBCO BRL) e
penicilina G 100 U/mL (USB Corporation, Cleveland, OH, USA), pH 6,5, a 26 °C.
Parasitos foram crescidos por 5 dias e então submetidos a duas lavagens com NaCl a
0,9% para posterior utilização nos experimentos.
Culturas de L. amazonensis também foram crescidas por no mínimo 3 passagens
em meio suplementado com adenina 5 mM ou suramina 20 µM para a tentativa de
modulação da atividade e expressão. Sabe-se, da literatura, que o crescimento de
parasitos em adenina reduz a atividade ectonucleotidásica e em suramina aumenta essas
taxas.
Medida da atividade enzimática de hidrólise de nucleotídeos
As atividades de hidrólise de trifosfato de adenosina (ATP), difosfato de
adenosina (ADP) e monofosfato de adenosina (AMP) foram medidas pela incubação de
parasitos intactos por 1 h a 30 °C em tampão de reação (NaCl 116,0 mM, KCl 5,4 mM,
D-glicose 5,5 mM, MgCl2 5,0 mM e tampão hepes-tris 50,0 mM, pH 7,2), na presença
de ATP, ADP ou AMP (SIGMA) 5,0 mM. A reação foi interrompida pela adição, na
proporção 1:1, de HCl 0,2 mM resfriado em gelo (Fietto e cols., 2004). Hidrólise não
específica foi determinada pela adição de parasitos após o HCl 0,2 mM ser adicionado.
As suspensões foram centrifugadas e alíquotas dos sobrenadantes foram usadas para a
quantificação do fosfato inorgânico (Pi) liberado adicionando-se, na proporção 1:1, uma
mistura contendo FeSO4.7H2O 8,8%, H2SO4 163,0 mM e 53,0% de uma solução de
molibdato de amônio 2%/H2SO4 5,55% (adicionada imediatamente antes do uso). Foi
feita uma curva padrão utilizando diferentes concentrações de soluções de Na3PO4,
reagindo com a mesma mistura descrita acima. A quantificação do fostato liberado foi
29
feita por espectrofotometria sob comprimento de onda de 650 nm (Taussky & Shorr,
1953) e a atividade enzimática, indiretamente determinada pela quantidade de Pi
liberado, foi calculada pela subtração da hidrólise não específica e ajustada para valores
gerados por 1,0 x 108 parasitos/h.
Dosagem de atividade nucleotidáscia de proteína
As atividades de hidrólise de trifosfato de adenosina (ATP), difosfato de
adenosina (ADP) e monofosfato de adenosina (AMP) por proteínas foram medidas pela
incubação de 0,5 µg de proteína em tampão de reação (50mM de Tris pH, 3mM de
MgCl2, 116mM de NaCl, 5,4mM de KCl pH 7,2), na presença de ATP, ADP ou AMP
(SIGMA) 5,0 mM por 30 minutos a 37 ºC. A reação foi interrompida pela adição, na
proporção 1:1, de HCl 0,2 mM. As alíquotas foram usadas para a quantificação do
fosfato inorgânico (Pi) liberado adicionando-se, na proporção 0,5:1, uma mistura
contendo 3 mL de solução de verde de malaquita em 37 mL de Molibdato de Amônio
10% em HCl 4M. Foi feita uma curva padrão utilizando diferentes concentrações de
soluções de Na3PO4, reagindo com a mesma mistura descrita acima. A quantificação do
fostato liberado foi feita por espectrofotometria sob comprimento de onda de 650 nm
(Taussky & Shorr, 1953) e a atividade enzimática, indiretamente determinada pela
quantidade de Pi liberado, foi calculada pela subtração da hidrólise não específica.
Obtenção de macrófagos peritoneiais
Camundongos C57BL/6 foram inoculados intraperitonealmente com 2 mL de
uma solução de Meio Tioglicolato a 3% (Biobrás, Montes Claros, MG, Brazil) e, após
5 dias, o peritôneo foi lavado, as células contadas em Câmera de Neubauer por exclusão
por Azul de Tripan e plaqueadas em placas de 24 poços contendo lamínulas de vidro
com 5.105 células/ml de meio DMEM (Gibco BRL) suplementado com 10% de soro
fetal bovino inativado (SFB; Cripion, Andradina, SP, Brazil), L-glutamina 2 mM
(GIBCO BRL) e penicilina G 100 U/mL (USB Corporation, Cleveland, OH, USA). AS
células foram incubadas overnight à 37 ºC em ambiente com 5% de CO2. Células não
aderentes foram retiradas no momento do experimento por lavagem com PBS.
30
Infecção de macrófagos peritoneais
L. amazonensis foi cultivada e lavada conforme descrito e incubadas com
diferentes quantidades de anticorpo policlonal anti-NTPDase de L. chagasi, gentilmente
cedido pela Profa. Dra. Juliana Lopes Rangel Fietto (UFV). Parasitos foram adicionados
a cultura de macrófagos, previamente tratadas com 1 µg de anticorpo Fc Block, numa
taxa de 5 parasitos por célula e incubados por 30 minutos ou 3 horas a 37 ºC/5% CO2.
Após os diferentes tempos, as culturas foram lavadas com PBS para remoção de
parasitos não aderidos ou internalizados e as lamínulas foram fixadas com metanol
(Vetec Fine Chemistry) por 10 minutos e, então, coradas com o kit Panótico Rápido
(Laborclin, Pinhais, PR, Brasil), conforme instruções do fabricante. A análise foi
realizada pela contagem de células contendo parasitos aderidos ou internalizados
utilizando microscópio óptico Olympus BX50 (Olympus, Center Valley, PA, USA).
Foram avaliados a porcentagem de macrófagos contendo parasitos aderidos ou
internalizados e o número de parasitos por célula. Foram avaliados pelo menos 200
células.
Os mesmo testes foram realizados com parasitos crescidos em adenina ou
suramina, sendo que, entretanto, os macrófagos não foram pré-tratados com anticorpo
Fc Block.
Avaliação das taxas de infecção de macrófagos pré-tratados com
rNTPDase
Macrófagos peritoneais já plaqueados numa concentração de 5.105 células/ poço
foram pré-incubados por 30 minutos com diferentes quantidades de NTPDase de L.
infantum recombinante (rNTPDase), gentilmente cedidos pela Profa. Dra. Juliana L. R.
Fietto (UFV). Os macrófagos foram então infectados com uma taxa de 5 parasitos por
célula e incubados por 30 minutos ou 3 horas a 37 ºC/5% CO2. Após os diferentes
tempos, as culturas foram lavadas com PBS para remoção de parasitos não aderidos ou
internalizados e as lamínulas foram fixadas com metanol (Vetec Fine Chemistry) por 10
minutos e, então, coradas com o kit Panótico Rápido (Laborclin, Pinhais, PR, Brasil),
conforme instruções do fabricante. A avaliação da infecção foi realizada conforme já
descrito.
31
Avaliação do papel da e-NTPDase de Leishmania na modulação da
resposta macrofágica
Macrófagos peritoneais já plaqueados numa concentração de 5.105 células/ poço
foram incubados com diferentes quantidades de rNTPDase e incubados por 48 horas a
37 ºC/5% CO2. Após esse período o sobrenadante das culturas foi coletado e submetido
a avaliação da resposta macrofágica. A quantificação do óxido nítrico produzido pelas
células foi realizada pelo método indireto de Greiss , mensurado pela formação do
nitrito (NO2-), um produto estável ( Green e cols., 1982). A produção das citocinas IL10 (PeproTech, Inc.), IL-12 (R&D Systems, Inc.) e TGF-b (R&D Systems, Inc.) foi
avaliada por ELISA indireta, conforme especificações do fabricante.
Avaliação da capacidade fagocítica de macrófagos
Macrófagos peritoneais foram incubados overnight em tubos de poliestireno com
5.105 células/mL a 37 ºC / 5% CO2. Foram adicionados diferentes quantidade de
rNTPDase de L. infantum por 30 minutos e, então, adicionados beads de latex ligados a
CFSE em uma proporção de 20 beads:macrófago. Após 2 horas de incubação, os tubos
foram lavados por duas vezes com PBS suplementados com 5% de BSA e fixados em
solução tampão para fixação. A fagocitose foi avaliada por citometria de fluxo.
Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise estatístico por Teste t de Student. Foram
considerados estatisticamente significativos os valores comparados ao nível
de
significância de p< 0,05.
32
RESULTADOS E
DISCUSSÃO
33
1. O bloqueio da e-NTPDase de Leishmania através de anticorpos
anti-NTPDase
reduz
a
adesão
dos
parasitos
à
macrófagos
peritoneais.
Para se avaliar a participação das e-NTPDases de Leishmania no processo de
adesão do parasito à macrófagos, incubou-se L. amazonensis com diferentes
quantidades de anticorpo policlonal anti-NTPDase por 30 minutos. Em paralelo, 1 x 105
macrófagos obtidos de lavagem de peritôneo de camundongos C57BL/6 foram
incubados em placas de 24 poços contendo lâminulas de vidro e pré-tratados por 30
minutos com anticorpo Fc block. Em seguida, os macrófagos foram infectados numa
taxa de 5 parasitos por macrófago por 30 minutos e então lavados, fixados e corados pra
contagem em microscópio óptico. Os resultados demonstram que o bloqueio da eNTPDase pelo anticorpo anti-NTPDase reduz a porcentagem de macrófagos contendo
parasitos aderidos na superfície das células (Fig. 2a). Observa-se que essa redução é
dose-dependente, sendo que maiores quantidades de anticorpo determinam menor
porcentagem de células contendo parasitos aderidos à sua superfície. Por outro lado,
entre os macrófagos contendo parasitos aderidos, não houve diferença na quantidade de
Leishmania aderida por célula (Fig. 2b)
A
B
Fig. 2: Pré-tratamento com anti-NTPDase reduz a adesão de Leishmania à macrófagos. Macrófagos
peritoneais pré-tratados com Fc Block foram infectados por 30 minutos com promastigotas de L.
amazonensis (5 parasitos / célula) tratadas com anticorpo policlonal anti-NTPDase. (A) Porcentagem de
células infectadas (B) Número de parasitos associados por macrófago infectado. * p˂ 0,05, conforme
teste t de Student, em relação ao controle.
34
Os dados acima corroboram Pinheiro e cols, 2006 e Santos e cols., 2009, que
demonstraram a inibição de adesão e internalização de Leishmania e T. cruzi,
respectivamente, após tratamento dos parasitos com anti-NTPDase. Os dados
confirmam que o aparente bloqueio estérico dessa enzima é capaz de reduzir a
capacidade de adesão do parasito à célula hospedeira, demonstrando assim o papel da eNTPDase no processo de adesão de Leishmania a macrófagos peritoneais. De forma
interessante, nos macrófagos que continham parasitos aderidos não houve diferenças no
número de parasitos aderidos por célula.
2. A modulação da expressão de e-NTPDase em Leishmania altera os
perfis de adesão e internalização do parasito em macrófagos.
O crescimento de tripanossomatídeos em meio contendo suramina, um inibidor
das ectonucleotidases, é capaz de aumentar a atividade NTPDásica em comparação com
parasitos crescidos em meio sem suramina (Bisaggio e cols., 2003). Provavelmente isso
advém do aumento da expressão de e-NTPDase na superfície do parasito como forma
de feedback devido a utilização de
vias de salvação de purinas pelos
tripanossomatídeos que são incapazes de fazer síntese de novo de purinas (Marr e cols.,
1978). Por outro lado, o crescimento desses parasitos em meio contendo adenosina é
capaz de reduzir a atividade ectonucleotidásica desses parasitos, indicando uma possível
redução na expressão dessas enzimas. Assim, decidimos investigar se essa possível
alteração na atividade ectonucleotidásica de Leishmania é capaz de alterar a capacidade
de adesão e internalização dos parasitos em macrófagos peritoneais, confirmando assim
a importância da enzima no processo de infecção à macrófagos. Para isso, promastigotas
de L. amazonensis foram crescidas por 3 passagens em cultura contendo suramina ou
adenina e, então, utilizadas para infecção de macrófagos peritoneais numa taxa de 5
parasitos por célula. A avaliação da atividade ectonucleotidásica desses parasitos
confirma os dados da literatura, mostrando um aumento na atividade de parasitos
crescidos em meio contendo suramina e redução na atividade de parasitos crescidos em
meio contendo adenina (Fig. 3).
35
Fig. 3: Crescimento de Leishmania em meio contendo suramina aumenta a atividade
ectonucleotidásica do parasito e crescimento em meio contendo adenina reduz esse parâmetro.
Cultura de L.amazonensis foi crescida por no mínimo 3 passagens em meio contando adenina 5 mM ou
suramina 20 µM. Os parasitos foram incubados com os nucleotídeos por 1 hora a 30 ºC e a atividade
enzimática foi avaliada pela quantidade de fosfato inorgânico liberado. * p˂ 0,05, conforme teste t de
Student, em relação ao controle.
Os resultados das taxas de infecção confirmam a participação da e-NTPDase na
adesão e internalização das células por demonstrarem um aumento na porcentagem de
macrófagos infectados quando o parasito foi crescido em meio contendo suramina e
diminuição das taxas de infecção após crescimento do parasito em meio com adenina
(Fig 4, A e C). De forma semelhante à Fig. 1, o número de parasitos associados aos
macrófagos infectados não se alterou entre os grupos controle e tratados (Fig. 4, B e D).
36
A
B
C
D
Fig. 4: Tratamento com adenina reduz adesão e internalização de L. amazonensis em macrófagos e
tratamento com suramina aumenta essas taxas de infecção. Macrófagos peritoneais foram infectados
por com L. amazonensis (5 parasitos/célula) crescidos com Adenina ou Suramina. (A) Porcentagem de
células com parasitos aderidos após 30 minutos (B) Número de parasitos associados por macrófago
infectado após 30 minutos . (C) Porcentagem de células infectadas após 3 horas. (D) Número médio de
amastigotas por macrófago infectado após 3 horas. * p<0.05 Teste t de Student, em relação ao controle.
Os dados confirmam o que já demonstrado por Bisaggio e cols., em 2003, em
que o tratamento a longo prazo com suramina pode aumentar a atividade
ectonucleotidásica de parasitos. O mesmo trabalho demonstrou que para T. cruzi o
aumento da atividade enzimática por suramina se correlacionava com um aumento na
adesão desse parasito a macrófagos. O aumento da atividade pode ser devido a um
aumento na expressão dessas enzimas na superfície do parasito. Já foi demonstrado que
diferentes espécies de Leishmania que possuem diferentes níveis de atividade
enzimática possuem diferenças na expressão da enzima avaliada por western blotting. L.
amazonensis, que possui considerável atividade sobre nucleotídeos, expressa NTPDase
em sua superfície. Já L. major e L. braziliensis, que possuem atividade reduzida em
37
comparação com L. amazonensis, não expressam níveis significativos dessa enzima
(Marques-da-Silva e cols., 2008). Não podemos, entretanto, afirmar que a modulação da
atividade nucleotidásica pelo tratamento com suramina e adenina foi necessariamente
por aumento ou diminuição, respectivamente, da expressão de NTPDase. Inúmeros
trabalhos demonstram que a mutagênese em sítios específicos da estrutura das eNTPDases podem determinar alterações importantes na atividade nucleotidásica da
enzima e até mesmo na preferência por diferentes nucleotídeos. (Smith e cols., 1999;
Yang e cols., 2001; Kirley e cols., 2001). Acredita-se que o tratamento com suramina e
adenina não sejam responsáveis por mutagênese na enzima, em especial no caso da
adenina, que é uma molécula essencial ao parasito.
Admitindo que há uma modulação na expressão da enzima, esses dados,
associados aos dados da Fig.1, nos permite concluir que há um importante papel da eNTPDase de Leishmania no processo de adesão do parasito ao macrófago. Nos dois
experimentos, de forma interessante, nos macrófagos que continham parasitos aderidos
não houve diferenças no número de parasitos aderidos por célula. Esse resultado sugere
que o fenômeno de bloqueio da adesão é do tipo “tudo ou nada”, onde populações de
macrófago parecem responder de forma diferente ao tratamento, indicando a possível
existência de receptores para e-NTPDase nos macrófagos, que podem ser expressos de
forma diferencial.
3. Competição
com
NTPDase
recombinante
reduz a
adesão
e
internalização de Leishmania em macrófagos peritoneais.
Se macrófagos contem receptores para e-NTPDase de Leishmania, conforme a
nossa hipótese, espera-se que a competição com NTPDase recombinante (rNTPDase)
reduza a adesão e internalização de parasitos nesses macrófagos já que a enzima
recombinante se associaria aos possíveis receptores, impedindo a ligação da e-NTPDase
do parasito aos mesmos. Realizamos um teste de atividade enzimática de rNTPDase
sobre ATP, ADP e AMP para verificar que a enzima tem baixa atividade e assim excluir
a possibilidade de modulação da resposta por degradação de ATP e acúmulo de
adenosina. Os resultados (Tabela 1) demonstram que a atividade nucleotidásica da
proteína recombinante é muito baixa quando comparada à apirase de batata, que é
38
conhecida por sua estabilidade mesmo quando estocada a baixas temperaturas,
mantendo atividade por muito tempo. Os dados de atividade nos leva a excluir qualquer
participação da modulação de ATP/Adenosina nos resultados.
Tabela 1: Atividade nucletotidásica de NTPDase recombinante e Apirase de Batata
ativa
nmol Pi/0,5mg proteína30 min
rNTPDase
Apirase de Batata
ATP
0,019
ADP
0,503
AMP
0,000
ATP
53,155
ADP
39,647
AMP
62,660
Para verificar se a competição com rNTPDase altera a adesão e internalização de
Leishmania, macrófagos peritoneais foram incubados por 30 minutos com rNTPDase e,
em seguida, infectados com L. amazonensis em uma taxa de 5 parasitos por macrófago.
Os resultados demonstram que a incubação com rNTPDase reduz a porcentagem de
macrófagos com parasitos aderidos (30 minutos) e infectados (3 horas) (Fig. 5, A e C).
De forma semelhante aos outros resultados, nenhuma alteração foi observada no número
médio de parasitos associados por célula infectada (Fig. 5, B e D).
39
B
A
C
D
Fig. 5: Pre-incubação de macrófagos com rNTPDase reduz a adesão e internalização de L.
amazonensis. Macrófagos peritoneais foram tratados com rNTPDase e infectados por 30 minutos ou 3
horas com promastigotas de L. amazonensis (5 parasitos/célula). (A) Porcentagem de células com
parasitos aderidos após 30 minutos (B) Número de parasitos associados por macrófago infectado após 30
minutos. (C) Porcentagem de células infectadas após 3 horas. (D) Número médio de amastigotas por
macrófago infectado após 3 horas. * p<0.05 Teste t de Student, em relação ao controle.
Esse conjunto de dados nos permite concluir que a e-NTPDase de Leishmania
tem participação na adesão e consequente internalização de parasitos em macrófagos. A
incubação de macrófagos com rNTPDase parece competir com a enzima do parasito
pelo sítio de ligação no macrófago, impedindo a adesão da Leishmania à célula, e, de
forma sinérgica, dificultando a penetração do parasito.
40
4. Incubação de macrófagos com rNTPDase de Leishmania reduz a
produção de óxido nítrico por essas células.
Demonstrado o papel da e-NTPDase de Leishmania nos processos de adesão e
internalização do parasito a macrófagos, resolvemos verificar se essa ligação é capaz de
alterar a resposta da célula à infecção. Souza e cols., 2010, demonstraram que, em
infecção experimental de macrófagos com parasitos que possuem maior atividade
ectonucleotidásica, e, possivelmente, maior expressão da enzima, as células não são
capazes de eliminar a carga parasitária. Esses dados são indicativos de que a e-NTPDase
pode ser ainda uma molécula envolvida na subversão da resposta macrofágica. Sabe-se
que Leishmania é capaz de inibir inúmeras funções do macrófago (Racoosin &
Beverley, 1997; Matte & Olivier, 2002; Japara & Kelly, 2010). A produção de óxido
nítrico (NO) é um dos principais mecanismos do macrófago para destruir o parasito
(Liew e cols., 1990) e L. amazonensis induz a inibição da síntese de NO por macrófagos
de maneira dependente da inativação de iNOS (Balestieri e cols., 2002). Dessa forma,
decidimos investigar se a e-NTPDase de Leishmania pode alterar a produção de NO por
macrófagos. Para isso, macrófagos peritoneais foram incubados com rNTPDase de
Leishmania e a produção de NO avaliada após 48h pelo método indireto de Greiss. Os
resultados demonstram que a simples incubação do macrófago estimulados com IFN-y e
LPS com 5 µg da proteína recombinante (rNTPDase) de baixa atividade é capaz de
reduzir de forma significativa a produção de NO por essas células (Fig. 6).
Fig. 6: Adesão de rNTPDase a macrófagos é capaz de reduzir a produção de NO por essas
célilas. Macrófagos peritoneais estimulados com IFN-y e LPS foram tratados com rNTPDase de
baixa atividade por 48 horas e o sobrenadante utilizado para mensurar a produçãode NO pelo
método de Greiss. * p<0.05 Teste t de Student, em relação ao controle.
41
A sobrevivência desses parasitos na célula hospedeira depende de sua habilidade
em controlar a resposta dessa célula e o controle da produção de NO é fator chave na
sobrevivência da Leishmania. Os mecanismos que levam à inibição da produção de NO
ainda não são totalmente claros mas sabe-se da importância de moléculas como LPG e
GIPLs nesse processo. Essa moléculas de superfície levam a perda da capacidade
macrofágica em induzir iNOS ou gerar NO em resposta ao estímulo com IFN-y e LPS
(Proudfout e cols., 1996). Sugere-se, agora, que a e-NTPDase de Leishmania é uma
molécula importante na subversão da resposta de macrófagos e, consequentemente,
contribui no estabelecimento da infecção pelo parasito, sendo assim, mais uma molécula
com importância na indução da redução de síntese de NO por macrófagos. A forma
como essa redução acontece ainda é desconhecida, mas sabe-se que envolve a inibição
da atividade de iNOS e não a redução da expressão de mRNA para a enzima (Balestieri
e cols., 2002). Futuramente, pretende-se investigar os mecanismos pelos quais a eNTPDase reduz a produção de NO.
5. A incubação de macrófagos com rNTPDase de Leishmania é capaz
de reduzir a produção de IL-10 e IL-12 e aumentar a produção de
TGF-β por essas células.
Com o objetivo de investigar mais profundamente a capacidade da e-NTPDase
de Leishmania em modular a resposta de macrófagos, avaliamos a produção das
interleucinas IL-12 e IL-10 por macrófagos peritoneais estimulados com IFN-y e LPS
incubados com rNTPDase de Leishmania após 48 horas. Os resultados demonstram
uma diminuição da produção das duas interleucinas por macrófagos incubados com 5
µg rNTPDase (Fig. 7)
42
Fig. 7: Adiçãode rNTPDase a macrófagos reduz a produção de IL-12 e IL-10 por essas células.
Macrófagos peritoneais foram tratados com rNTPDase e após 48 horas o sobrenadante das culturas foi
utilizado para avaliação de IL-12 (A) e IL-10 (B) por método de ELISA. * p<0.05 Teste t de Student, em
relação ao controle.
Inúmeros estudos demonstram que a produção de IL-12 é suprimida por
Leishmania (Cameron e cols, 2004; Belkaid e cols., 1998). Sabe-se que IL-12 tem um
papel crítico na regulação da resposta imune, por ser uma citocina envolvida na ativação
de linfócitos T e, consequentemente, no estímulo a produção de IFN-y, que, por sua vez,
estimula macrófagos a produzirem NO. Logo, a indução de uma redução na síntese de
IL-12, conhecida citocina pró-inflamatória, sugere, mais uma vez, que a e-NTPDase de
Leishmania é uma importante molécula envolvida na modulação da resposta
macrofágica de forma a permitir o estabelecimento da infecção pelo parasito. O
mecanismo pelo qual essa redução acontece ainda não está claro. Sabe-se, contudo, que
moléculas como o LPG de Leishmania e receptores de complemento no macrófago são
capazes de reduzir a produção dessa citocina (Piedrafita e cols., 1999; Marth e cols.,
1997). Já foi demonstrado que essa redução parece ser independente de NF-kB e,
possivelmente, está associada a um aumento na fosforilação de ERK1/2 (Feng e cols.,
1999). Pode-se agora associar também a redução de IL-12 com a presença de eNTPDase na superfície do parasito, e, essa diminuição da citocina por explicar os
resultados obtidos de redução da produção de NO por células tratadas.
Por outro lado, IL-10, uma citocina marcadamente supressora da resposta,
também teve sua produção reduzida. Esse resultado vai em desencontro com as
observações de Japara & Kelly em 2010, onde notava-se aumento da produção de IL-10
por infecção de macrófagos com Leishmania. IL-10 é capaz de inibir a morte do
parasito mediada por IFN-γ (Kane & Mosser, 2001; Vouldoukis
e cols., 1997) e
43
favorecer o crescimento do parasito no interior dos fagolisossomos através da produção
de poliaminas (Iniesta e cols., 2001; Iniesta e cols., 2002; Iniesta e cols., 2005). Sabese que o aumento na produção de IL-10 por macrófagos infectados com Leishmania
parece estar associado com a ativação de receptores Fcγ (Sutterwala e cols., 1998).
Nossos modelos experimentais são livres de soro de animal infectado, o que diminui a
possibilidade desse mecanismo acontecer, e que, em partes, pode explicar a ausência de
aumento na produção de IL-10 por e-NTPDase de Leishmania.
Para avaliar a produção de TGF-β, macrófagos peritoneais ativados por IFN-y e
LPS foram incubados mais uma vez com rNTPDase de Leishmania e o sobrenadante
utilizado pra dosagem de TGF-β pelo método de ELISA indireta. Os resultados
demonstram um considerável aumento na produção de TGF-β por essas células após
incubação com 5 µg de rNTPDase (Fig. 8)
Fig. 8: Adição de rNTPDase aumenta a produção de TGF-β por macrófagos. Macrófagos peritoneais
foram tratados com rNTPDase e após 48 horas o sobrenadante das culturas foi utilizado para avaliação de
TGF- β por método de ELISA indireta. * p<0.05 Teste t de Student, em relação ao controle.
O aumento de TGF-β pode ser o responsável pela redução de IL-10, já que sabese do papel dessa citocina em modular negativamente a produção de IL-10 pelas células
(Bogdan e cols., 1992). Além disso, o TGF-β tem conhecido papel no bloqueio da
ativação de linfócitos e fagócitos, contribuindo assim para a modulação da resposta
imune a favor do estabelecimento do parasito (Tsunawaki e cols., 1988) Sabe-se que
Leishmania é capaz de induzir a produção de TGF-β por macrófagos (De Freitas
Balanco e cols., 2001) e que essa citocina também é importante na inibição da morte do
44
parasito no interior das células (Kane & Mosser, 2001). O TGF-β correlaciona-se com
uma expressão retardada de iNOS, o que pode explicar também a diminuição de NO
observada na figura 5 (Scharton-Kersten e cols., 1995). Dessa forma, sugerimos que a
e-NTPDase de Leishmania também está associada ao aumento de TGF-β por
macrófagos, o que também pode ser um dos mecanismos utilizados pelo parasito na
subversão da resposta imune.
Esse conjunto de dados (Fig. 5, 6 e 7) nos permite sugerir que a e-NTPDase,
além de ser uma molécula envolvida na adesão do parasito a célula hospedeira, tem a
importante contribuição na modulação da resposta imune do macrófago, com redução
na produção de NO e IL-12 e aumento de TGF-β. Essa modulação permite que o
parasito evada a resposta do macrófago, favorecendo a infecção. Sugere-se, portanto,
que a e-NTPDase é uma importante molécula envolvida na subversão da resposta imune
por parasitos do gênero Leishmania .
6. A
pré-incubação
de
macrófagos
com
rNTPDase
reduz
a
capacidade fagocítica dessas células.
Os resultados da Fig. 4
nos trouxeram o questionamento se a ligação da
rNTPDase ao macrófago poderia reduzir a capacidade fagocítica dessa célula, o que
explicaria a redução na penetração de parasitos em macrófagos previamente tratados
com rNTPDase. Para avaliar se a NTPDase tem alguma função na alteração da
capacidade fagocítica dos macrófagos, as células foram pré-incubadas por 30 minutos
com rNTPDase e então incubadas por 2 horas com beads de látex ligados a FITC para
avaliação posterior em citômetro de fluxo. Os resultados demonstram que a rNTPDase é
capaz de reduzir a capacidade fagocítica do macrófago. Observa-se uma redução da
média de intensidade de fluorescência do macrófago tratado com 5µg de rNTPDase
(Fig. 9A). Além disso observa-se que redução nas células positivas para FITC (Fig. 9B).
Logo, conclui-se que menos células foram capazes de fagocitar os beads de latex após a
incubação com rNTPDase e, mesmo as que fagocitaram, tiveram número reduzido de
beads no seu interior.
45
A
B
Fig. 9: Pré-incubação com rNTPDase reduz a capacidade fagocítica de macrófagos.
Macrófagos peritoneais foram pré-incubados com rNTPDase por 30 minutos e, então,
incubados com beads de létex ligados a FITC por 2 horas e analisados por citometria de
fluxo. (A) Média de Intensidade de Fluorescência dos macrófagos. (B) Histograma de dois
experimentos independentes de células marcadas com FITC ( cinza – células sem marcação /
azul – controle positivo / vermelho – células préincubadas com rNTPDase) * p<0.05 Teste t.
Os dados demonstram que após 30 minutos de incubação, o macrófago perde em
parte sua capacidade de fagocitose. Isso sugere que a rNTPDase, após algum tempo,
pode ter um papel importante em desligar as funções básicas de fagocitose do
macrófago, contribuindo assim, mais uma vez, para o estabelecimento da infecção. Um
único experimento foi realizado utilizando rNTPDase no mesmo momento da incubação
dos beads e o resultado preliminar mostra que nesse caso a enzima não é capaz de
46
alterar a capacidade fagocítica dos macrófagos (dado não mostrado). Isso é importante,
pois a inibição da fagocitose no início do processo não seria interessante para o parasito.
Sugere-se, assim, que a e-NTPDase só é capaz de alterar resposta fagocítica após
entrada da enzima no macrófago, o que, no caso da infecção pelo parasito, só ocorre
concomitante a entrada do parasito. Outros resultados preliminares indicam uma
redução na expressão de CD11b em macrófagos incubados com rNTPDase. Sugere-se
que o CD11b seja internalizado junto com a enzima, podendo ser, inclusive, um dos
receptores para e-NTPDase no macrófago. Sabe-se da importância do CD11b junto com
o CD18 como complexo Mac-1 envolvido na fagocitose de partículas (Rosenthal e
cols., 1996; Mosser e Brittingham , 1997; Ehlers, 2000). Já foi demonstrado que a
expressão do complexo CD11b/CD18 é reduzida em infecção experimental com
promastigota de Leishmania, o que indica que esse complexo pode ser internalizado
junto com o parasito (Gonçalves e cols., 2005).
Podemos sugerir, assim, que a
internalização do CD11b junto com a NTPDase pode ser um dos possíveis macanismos
de redução da capacidade fagocítica de macrófagos infectados com Leishmania.
O conjunto de dados obtidos nos permite propor que a e-NTPDase de
Leishmania é uma molécula importante na adesão à célula hospedeira. Os dados
mostraram que o bloqueio da enzima e a tentativa de modulação da expressão da mesma
são capazes de alterar a adesão do parasito à macrofágos e, consequentemente, a
internalização desses. Essa enzima está, ainda, associada à uma redução da capacidade
microbicida do macrófago, de forma a alterar a produção de NO e citocinas pelo
macrófago. Além de observamos uma redução do NO, nossos dados indicam redução na
produção de IL-12 e IL-10 e uma significativo aumento de TGF-β. De alguma forma, a
presença de e-NTPDase na superfície do parasito é um fator importante na subversão da
resposta imune. A ligação e possível internalização da e-NTPDase pelo macrófago é
capaz, ainda, de alterar a capacidade fagocítica dessas células, o que nos leva a sugerir
que a presença dessa enzima é potente em alterar as funções mais básicas do macrófago.
Nossas perspectivas são descobrir o ligante para e-NTPDase nas células e entender
como essas alterações na capacidade macrofágica acontecem. Sugerimos que a eNTPDase liga-se a CD11b, se internalizando junto com ele, o que explicaria a redução
na capacidade fagocítica das células após incubação com rNTPDase. Dentro do
macrófago, acreditamos que a e-NTPDase é capaz de alterar a produção de citocinas e
NO por envolvimento direto em mecanismos de sinal de transdução envolvendo
citocinas, como os de proteína quinase C (PKC), tirosina quinase e JAK/STAT, ligadas
47
à produção de IL-12, fagocitose, expressão de MHC II e moléculas co-estimuladoras e
produção de ROS (Denkers & Butcher, 2005). Essa proposta de mecanismo será
investigada futuramente.
48
SUMÁRIO DE
RESULTADOS
49
1. A incubação de Leishmania com anticorpo anti-NTPDase reduz a capacidade de
adesão dos parasitos em macrófagos.
2. Leishmania crescida em suramina possui maior capacidade de aderir e
internalizar em macrófagos, enquanto que Leishmania crescida em adenina tem
essa capacidade reduzida.
3. A competição de rNTPDase com Leishmania pelo um possível receptor da
enzima em macrófago reduz a capacidade de adesão e internalização dos
parasitos.
4. A incubação de macrófagos com rNTPDase reduz a produção de NO por essas
células
5. A incubação de macrófagos com rNTPDase reduz a produção de IL-12 e IL-10 e
aumenta a produção de TGF-β por essas células
6. A pré-incubação de macrófagos com rNTPDase por 30 minutos reduz a
capacidade fagocítica dessas células.
50
CONCLUSÃO
51
Conclui-se com esse trabalho que a e-NTPDase de Leishmania é uma importante
molécula envolvida na adesão e consequente internalização do parasito por macrófagos
e, além disso, a enzima tem papel na modulação da resposta macrofágica de forma a
reduzir a capacidade leishmanicida do macrófago, favorecendo o estabelecimento da
infecção.
52
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