INFLUÊNCIA DE COMPONENTES DO MEIO DE CULTIVO NA

INFLUÊNCIA DE COMPONENTES DO MEIO DE CULTIVO NA
PRODUÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS PORYarrowia lipolytica
G. C. LEAL, L. V. da SILVA e P.F. F. AMARAL
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Tecnologia, Escola de Química, Departamento de
Engenharia Bioquímica
E-mail para contato: [email protected]
RESUMO – Yarrowia lipolytica possui a capacidade de produzir ácidos cítrico e
isocítrico.Neste presente estudo, verificou-se a influência das concentrações iniciais de
glicerol PA, extrato de lêvedo e de células na produção destes dois ácidos pela cepa Y.
lipolytica IMUFRJ 50682, utilizando planejamento experimental. Nestas condições
obteve-se elevada produção de ácido isocítrico em condições experimentais realizados
em elevada concentração celular inicial, extrato de lêvedo e glicerol. A concentração de
ácido cítrico obtida foi significativamente menor, sendo a maior produção 12,68 g/L no
experimento realizado com menor concentração celular e extrato de lêvedo e em maior
concentração de glicerol.
1. INTRODUÇÃO
Industrialmente, o ácido cítrico é produzido por fermentação submersa por cepas do fungo
filamentoso Aspergillus niger, tendo sacarose como fonte de carbono (Rymowicz et al., 2008; Da
Silva et al., 2009). A crescente demanda por ácido cítrico tem gerado interesse em estudos de
processos alternativos de cultivo envolvendo cepas de levedura. (Rymowicz et al., 2006). Yarrowia
lipolytica possui a habilidade de produzir uma grande variedade de ácidos orgânicos tais como ácido
cítrico e ácido isocítrico (Rymowicz et al., 2008) utilizando fontes renováveis ou materiais residuais
como fonte de carbono, como glicerol, que vem sendo considerado como fonte de carbono para novas
fermentações industriais (Da Silva et al., 2009).
Atualmente a produção de ácido isocítrico não é tão significativa quanto à do ácido cítrico,
devido às dificuldades em seu processo de síntese. Geralmente a produção de ácido isocítrico se dá a
partir de vias químicas ou extração de tecidos de plantas. Adicionalmente há um crescente interesse
na produção de ácido isocítrico devido a seu papel como aditivo nas indústrias de bebida,
farmacêutica, cosmética e de detergentes. (Kamzolova et al., 2008 Herestch et al., 2008). Y.
lipolytica, produz concomitantemente ácidos cítrico eisocítrico, este podendo atingir níveis acima de
50% do total de ácido produzido (Rymowicz et al., 2006). Esta produção é influenciada pelo tipo de
micro-organismo, fonte de carbono e concentração dos micronutrientes acessíveis à levedura
(Rywińska et al., 2010).
Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência da presença de componentes de meio
de cultivo e concentração celular inicial na produção de ácidos cítrico e isocítrico por Y. lipolytica em
meio de cultivo contendo glicerol PA como fonte de carbono, utilizando um planejamento
experimental.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Micro-organismo e Inóculo
Utilizou-se a cepa selvagem Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 isolada de um estuário no Rio
de Janeiro, Brasil (Hagler & Mendonça, 1981).As células foram conservadas por repiques regulares
em meio YPD (% p/v): extrato de lêvedo 1%, peptona 2%, glicose 2% e solidificado com ágar 3 %,
sob refrigeração a 4 ºC. A partir dos tubos contendo as células preservadas em meio sólido YPD, foi
realizado o inóculo, de forma estéril, de 200 mL de meio de cultivo YPD em frascos de Erlenmeyers
de 500 mL. Após crescimento por 72 horas em incubador rotatório a 28 ºC e 160 rpm, as células eram
centrifugadas de forma estéril a 1258 g por 5 minutos e ressuspensas, servindo de inóculo para os
experimentos que serão descritos no item2.2.
2.2. Planejamento Experimental (2k) para Produção de Ácido Orgânicos
Para selecionar a melhor composição do meio de cultivo e concentração celular inicial para a
produção de ácidos cítrico e isocítrico, foi aplicado o método do planejamento fatorial completo 2k,
com k = 3, com o uso do programa Statística versão 7.0. Os fatores fixados e adotados como variáveis
independentes foram concentração de glicerol PA, concentração de extrato de lêvedo e concentração
celular inicial (Tabela 1). A variável de resposta utilizada para a seleção das melhores condições foi a
máxima concentração de ácido cítrico e a concentração de ácido isocítrico.
Os experimentos foram realizados em frascos de Erlenmeyer de 1000 mL contendo 400 mL de
meio de cultivo, a 28 ºC (BARTH & GAILLARDIN, 1997) e 250 rpm em incubador rotatório
(shaker) por 170 horas com amostragem diária de crescimento celular, pH, dosagens de glicerol,
ácido cítrico e isocítrico. O meio de cultivo foi preparado em meio mineral tamponado, constituído de
(em g/L): KH2PO4: 12; Na2HPO4 .7H2O: 22,66; MgSO4.7 H2O: 1,5; CaCl2.2H2O: 0,2; FeCl3. 6H2O:
0,15; ZnSO4.7 H2O: 0,02; MnSO4.H2O: 0,06.
Tabela 1 - Fatores e níveis utilizados no planejamento experimental 2k, com k=3.
Nível
Variáveis independentes
Concentração de glicerol (g/L)
Concentração de extrato de lêvedo (g/L)
Concentração celular (g/L)
-1
30,0
0,1705
1,0
0
70,0
0,5853
10,5
1
110,0
1,0
20,0
2.3. Métodos Analíticos
Quantificação do crescimento celular: Medidas de densidade óptica a 570 nm e os valores
foram convertidos para mg p.s/mL usando-se um fator de conversão previamente determinado pela
curva de peso seco.
Determinação da concentração de ácidos orgânicos: Foram determinadas por HPLC (Waters
1525) em uma coluna de ácidos orgânicos constituída de polímero de octadecilsilano (YMC-Pack
ODS-AQ, S-5 μm, 12nm) acoplada a um detector ultravioleta a 214 nm. A coluna foi eluída com 20
mM de KH2PO4, pH = 2,45 e metanol 70% à 35ºC, utilizando uma vazão de 0,5 mL/min.
Determinação da concentração de glicerol: por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC,
Shimadzu), utilizando coluna Aminex HPX-87H, 300 x 7,8mm (Bio-RadLaboratoriesLtd) e detector
de índice de refração (Shimadzu RID-10). A fase móvel utilizada foi ácido sulfúrico 0,005 M (0,80
mL/min) e a temperatura da coluna mantida a 60 ºC.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Com o objetivo de investigar o efeito das concentrações de glicerol, extrato de lêvedoe de
concentração celular inicial na produção de ácido cítrico e isocítrico por Yarrowia lipolytica, foi
realizado um planejamento experimental, conforme Tabela 2.
Tabela 2- Planejamento experimental e respectivos resultados para o planejamento experimental
2k, k = 3
Extrato de Concentração
PAC
QAC
PAIC
QAIC
Glicerol
Lêvedo
Celular
(g/L)
(g/L)
(g/L.h)
(g/L)
(g/L.h)
(g/L)
Inicial (g/L)
30 (-1)
0,1705 (-1)
1,00 (-1)
8,00
0,04
8,61
0,18
110 (+1) 0,1705 (-1)
1,00 (-1)
12,68
0,07
16,03
0,09
30 (-1)
1,00 (+1)
1,00 (-1)
9,25
0,10
14,78
0,15
110 (+1)
1,00 (+1)
1,00 (-1)
2,25
0,02
42,20
0,25
30 (-1)
0,1705 (-1)
20,00 (+1)
1,02
0,01
15,50
0,60
110 (+1) 0,1705 (-1)
20,00 (+1)
4,24
0,02
31,58
0,33
30 (-1)
1,00 (+1)
20,00 (+1)
7,06
0,04
13,11
0,08
110 (+1)
1,00 (+1)
20,00 (+1)
3,33
0,02
39,86
0,83
70 (0)
0,583 (0)
10,5 (0)
1,7
0,01
37,82
0,51
70 (0)
0,583 (0)
10,5 (0)
1,9
0,01
37,72
0,51
70 (0)
0,583 (0)
10,5 (0)
1,45
0,01
39,0
0,54
Analisando a tabela 2, observou-se que em todas as 11 condições experimentais os valores
obtidos de produção ácido isocítrico superaram a produção de ácido cítrico. Comparando os níveis
mínimo e máximo para a variável glicerol e fixando as variáveis extrato de lêvedo e concentração
celular inicial, observou-se que a concentração de ácido isocítrico produzida foi maior quando o
glicerol foi utilizado no nível máximo. Analisando a variável extrato de lêvedo nos níveis mínimo e
máximo e fixando as demais, observou-se que a concentração de ácido isocítrico obtida foi maior no
nível máximo de extrato de lêvedo.
Como apresentado na tabela 2, a maioria dos ensaios realizados no nível máximo de
concentração celular inicialpromoveu as melhores concentrações de ácido isocítrico produzidas,
porém a condição experimental realizadano nível mínimo de concentração celular inicial e níveis
máximos de glicerol e extrato de lêvedo gerou 42,20 g/L em 170 horas de fermentação, sendo a
maior concentração de ácido isocítrico obtida. Nesta condição experimental a elevada
concentração de extrato de lêvedo favoreceu a cinética de crescimento celular como pode ser
observado na figura 1, alcançando 9,5 g/L de concentração celularem 48 horas de fermentação. O
aumento na biomassa consequentemente aumentou o consumo de glicerol, ao final da
fermentação foi possível observar que mesmo a condição experimental tendo se iniciado com 110
g/L de glicerol no meio de cultivo, ao final da fermentação havia somente 3,5 g/L de glicerol
presente no meio. O aumento na geração de biomassa favoreceu a produção de ácido isocítrico
alcançando ao final da fermentação 42,2 g/L de ácido isocítrico produzido, resultados similares
aos obtidos nos ensaios realizados com concentração celular inicial de 10,5 g/L indicando relação
de elevadas concentrações celulares na produção de ácido isocítrico pela levedura.
Figura 1- Cinética de Concentração celular, consumo de glicerol e concentração de ácido
isocítrico na condição experimental com 110 g/L de glicerol, 1 g/L de extrato de lêvedo e 1 g/L
de concentração celular inicial
Apesar do melhor resultado, em termos de concentração de ácido isocítrico, ter sido obtido na
condição experimental de níveis máximos para glicerol e extrato de lêvedo e no nível mínimo para
concentração celular, observou-se que as melhores produtividades (QAIC) foram obtidas pelos
experimentos realizados no nível máximo e no ponto central da variável concentração celular. A
maior produtividade foi obtida pela condição experimental realizada nos níveis máximos das três
variáveis independentes estudadas, obtendo 0,83 g/L.h e 39,86 g/L de ácido isocítrico. Nestas
condições, a produção já se demonstrou elevada em tempos iniciais devido à elevada concentração
celular inicial. Em 24 horas de fermentação houve produção de 20,1 g/L de ácido isocítrico, dobrando
esta produção em 48 horas, mantendo esta faixa de ácido isocítrico até decair ao final da fermentação,
como está apresentado na figura 2. Comparando com o experimento realizado com mesmo meio de
cultivo, porém com menor concentração celular inicial, percebeu-se a influência quea concentração
celular possui em relação à produção de ácido isocítrico, quando associado com elevadas
concentrações de glicerol e extrato de lêvedo.
Figura 2- Cinética de concentração celular, consumo de glicerol e concentração de ácido
isocítrico na condição experimental com 110 g/L de glicerol, 1 g/L de extrato de lêvedo e 20 g/L
de concentração celular inicial.
Os dados de produção de ácido cítrico foram menores que de isocítrico e o melhor resultado
sendo obtido principalmente em condições experimentais com menor concentração celular, como
apresentado na tabela 2. A melhor produção foi obtida em condição experimental com 110 g/L de
glicerol, 0,1705 g/L de extrato de lêvedo e 1 g/L de concentração celular inicial, obtendo 12,68 g/L e
0,07 g/L.h de ácido cítrico em 170 horas de fermentação.
A figura 3 apresenta o diagrama de Pareto do planejamento experimental calculado
considerando diferentes tipos de interação entre as variáveis independentes e a variável dependente
concentração de ácido isocítrico. Analisando o diagrama foi observado que a variável glicerol foi a
que apresentou um maior efeito significativo sobre a variável de resposta (α = 95%), seguido pela
concentração de extrato de lêvedo. Todas as variáveis sendo significativas estatisticamente com
influência positiva na produção de ácido isocítrico. A interação extrato de lêvedo/concentração celular
apresentou um efeito estatisticamente negativo sobre a concentração de ácido isocítrico, porém a
interação glicerol/extrato de lêvedo possui influência positiva na concentração de ácido isocítrico.
Além disso, a interação glicerol/concentração celular não influenciaram significativamente o valor da
resposta na faixa de concentração estudada.
Figura 3 – Diagrama de Pareto para concentração de ácido isocítrico
Através dos resultados obtidos foi possível obter os coeficientes de regressão do modelo de 1ª
ordem para a concentração de ácido isocítrico em função das variáveis com valores reais e verificar
sua validade através da análise de variância (Tabela 3). Os parâmetros estatisticamente não
significativos foram eliminados do modelo e adicionados aos resíduos.
Tabela 3- ANOVA para concentração de ácido isocítrico.
Fonte de Variação Soma dos Quadrados Grau de liberdade Quadrado Médio F calculado
1184,26
5
236,852
467,1637
Regressão
541,1
3
180,367
355,7535
Lackof Fit
1,014
2
0,507
Erro Puro
1726,374
10
Total
Ácido Isocítrico(g/L): F5;2;0,05=19,30; Ácido Isocítrico (g/L): F3;2;0,05=19,16; Coeficiente de correlação R2
= 69%
De acordo com os dados da Tabela 3, observou-se que o valor do teste F calculado para a
concentração de ácido isocítrico foi cerca de 24 vezes maior do que o valor tabelado para a regressão
e 19 vezes maior do que o valor tabelado para Lackoffit. O coeficiente de correlação para a
concentração de ácido isocítrico foi igual a 69 % indicando que o modelo de 1ª ordem obtido é
estatisticamente significativo e preditivo para as variáveis estudadas. Dessa forma a concentração de
ácido isocítrico pode ser predita em função das concentrações de glicerol, extrato de lêvedo e
concentração celular através da equação (1).
Ácido Isocítrico (g/L) = 4,96 + 0,11X1 + 4,16 X2+ 0,73X3 + 0,23 X1X2 - 0,84 X2X3
Sendo:
X1: Concentração de Glicerol (g/L)
X2: Concentração de Extrato de Lêvedo (g/L)
X3: Concentração Celular (g/L)
(1)
Portanto, o modelo foi considerado adequado para descrever as superfícies de resposta para
analisar as melhores condições da concentração de glicerol, extrato de lêvedo e concentração celular
que levam aos maiores valores de concentração de ácido isocítrico. As superfícies de resposta estão
apresentadas nas Figuras 4 e 5.
A partir dos dados apresentados na Figura 4, percebe-se a que ambas as variáveis
estudadas foram estatisticamente significativas e favorecendo a produção de ácido isocítrico em
concentrações elevadas (nível +1). A interação entre estes fatores é positiva indicando a
necessidade de aumentar a concentração de ambas ao mesmo tempo para favorecer a produção de
ácido isocítrico.
Figura 4 - Superfície de resposta da concentração de ácido isocítrico em relação à
concentração de extrato de lêvedo e a concentração de glicerol PA.
A figura 5 mostra o perfil da concentração de ácido isocítrico em relação às
variáveisextrato de lêvedo e concentração celular no ponto central, com glicerol fixado em 70
g/L. Esta figura mostra que o aumento de ambas as variáveis aumenta a produção de ácido
isocítrico. Indicando que a utilização de baixas concentrações (nível -1) conduz a baixos valores
de finais de produção, não sendo indicados para otimizar o processo.
Figura 5 - Superfície de resposta da concentração de ácido isocítrico em relação à
concentração celular e a concentração de extrato de lêvedo.
4. CONCLUSÃO
A partir de análise estatística foi possível determinar que todas as variáveis possuem influência
positiva na produção e em elevadas concentrações favorecem a produção de ácido isocítrico. A
produtividade de ácido isocítrico está diretamente relacionada à concentração celular e glicerol
obtendo produtividade acima de 0,83 g/L.h no ensaio realizado em elevada concentração celular e
glicerol, corroborando a influência desta interação na produtividade de ácido isocítrico. Em relação à
produção de ácido cítrico, Y. lipolytica demonstrou melhor produção de ácido cítrico em baixas
concentrações celular e de extrato de lêvedo e máxima concentração de glicerol.
5. REFERÊNCIAS
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lipolytica.FEMS Microbiology Reviews, v. 19, p. 21-237, 1997.
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HERETSCH P, THOMAS F, AURICH A, KRAUTSCHEID H, SICKER D, GIANNIS A (2008)
Syntheses with a chiral building block from the citric acid cycle: (2R,3S)-isocitric acid by
fermentation of sunflower oil. Angew Chem Int Ed Engl 47:1958–1960
KAMZOLOVA SV, FINOGENOVA TV, MORGUNOV IG (2008) Microbial production of
citric and isocitric acids from sunflower oil. Food Technol Biotechnol 46:51–59
RYMOWICZ, W.; RYWINSKA, A.; AROWSKA, B.; JUSZCZYK, P. Citric Acid Production from
Raw Glycerol by Acetate Mutants of Yarrowia lipolytica.Chem. Pap., v. 60 (5), p. 391-394, 2006.
RYMOWICZ, W.; RYWINSKA, A.; GLADKOWSKI, W. Simultaneous production of citric
acid and erythritol from crude glycerol by Yarrowia lipolytica Wratislavia K1. Chemical
Papers, v. 62, n. 3, p. 239–246, 2008.
RYWIŃSKA, A.; RYMOWICZ, W.; MARCINKIEWICZ, M. Valorization of raw glycerol for citric
acid production by Yarrowia lipolytica yeast. Electronic Journal of Biotechnology, v. 13, n. 4, 2010.