INSTITUTO OSWALDO CRUZ MÍRIAN PRISCILA LINS DE LIMA

INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
MÍRIAN PRISCILA LINS DE LIMA
Estudo do envolvimento do receptor nuclear PPAR gama no controle de infecções
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz
como parte dos requisitos para obtenção do título
de Mestre em biologia celular e molecular.
Orientadora: Dra. Adriana Ribeiro Silva
RIO DE JANEIRO
2015
ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
AUTORA: MÍRIAN PRISCILA LINS DE LIMA
ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DO RECEPTOR NUCLEAR PPAR GAMA NO
CONTROLE DE INFECÇÕES
ORIENTADORA: Dra. Adriana Ribeiro Silva
Aprovada em: 14/07/2015
EXAMINADORES:
Dra. Mariana Conceição de Souza – Presidente
Dr. Johnatas Dutra Silva – Membro
Dra. Danielle de Oliveira Nascimento – Membro
Dra. Andrea Surrage Calheiros – Suplente e revisor
Dra. Andressa Bernardi – Suplente
Rio de Janeiro, 14 de julho de 2015.
iii
Dedico esta dissertaçãoa Deus e a minha família que
sempre me deram forças para continuar a caminhada.
iv
“A sabedoria preserva a vidade quem a possui.”
Eclesiastes 7:12
v
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, pois sem Ele nada poderia ser realizado.
Agradeço à minha orientadora, Dra. Adriana Ribeiro Silva e o co-orientador Dr.
Cassiano Felippe Gonçalves de Albuquerque por terem me auxiliado e supervisionado
no mestrado, influenciando positivamente no decorrer desses anos de longos estudos e
trabalhos.
A Dra. Andrea Surrage Calheiros, que colaborou como suplente e revisora, e
Dra. Andressa Bernardi que colaborou como suplente oferecendo conselhos primordiais
para a finalização deste trabalho.
A Dra. Mariana Conceição de Souza, Dra. Danielle de Oliveira Nascimento e
Dr. Johnatas Dutra Silva, participando como presidente e membros da banca
respectivamente, fornecendo observações e levantando pontos relevantes ao trabalho.
Ao Dr. Hugo Caire de Castro-Faria-Neto e à Dra. Patrícia Torres Bozza, antigo
e atual chefes do laboratório de Imunofarmacologia, respectivamente, pois permitiram a
minha participação como integrante deste grupo laboratorial formidável, além de
fornecer os recursos necessários para a realização desta dissertação.
Aos meus amigos que participaram ativamente desta dissertação, como Carlos
André Mandarino, Cristina Lyra, Alessandra Silveira, Victor Brown e Carol
Hildebrandt, Gabriel Gutfilen Schlesinger, pois contribuíram com o esforço, trabalho
árduo e horas investidas neste projeto.
Aos integrantes do Laboratório de Imunofarmacologia que colaboraram direta
e indiretamente me auxiliando com sugestões nas reuniões de laboratório e
proporcionando bons momentos de descontração durante os dias de experimento, como
Isaclaudia Azevedo, André Costa, Dra. Patrícia Reis, Silvio Caetano, Emílio Telles,
Tathiany Igreja e Leandro Andrade.
vi
À Rose Branco, secretária do Laboratório de Imunofarmacologia, pelo apoio
administrativo.
A todos os funcionários do Biotério, da limpeza, vigilantes e secretaria do
Pavilhão Ozório de Almeida.
Aos meus familiares e ao meu noivo por me darem todo o apoio necessário
para o desenvolvimento deste trabalho no período domiciliar, pelos conselhos de
persistência, força e pela paciência que se tornaram primordiais para conclusão desta
dissertação.
A todos que participaram do corpo docente e aos que trabalharam no programa
de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular do Instituto Oswaldo Cruz, pelo
apoio acadêmico e institucional.
vii
SUMÁRIO
Resumo.............................................................................................................................
xi
Abstract............................................................................................................................
xii
Lista de abreviaturas........................................................................................................
xiii
Lista de figuras.................................................................................................................
xv
Capítulo 1: INTRODUÇÃO .........................................................................................
1
1.1 Pulmão........................................................................................................................
1
1.2 Pneumonia .................................................................................................................
1
1.3 Pseudomonas aeruginosa ...........................................................................................
3
1.4 Sepse ..........................................................................................................................
4
1.5 Fisiopatologia da resposta inflamatória .....................................................................
6
1.5.1 Resposta imunológica e inflamatória do hospedeiro...............................................
6
1.5.1.1 Citocinas e quimiocinas .......................................................................................
8
1.6 Neutrófilos .................................................................................................................
10
1.6.1 Visão geral ..............................................................................................................
10
1.6.2 Ativação e migração do neutrófilo .........................................................................
12
1.6.3 Redes extracelulares de neutrófilo .........................................................................
13
1.7 PPARγ ......................................................................................................................
16
1.8 Rosiglitazona .............................................................................................................
18
1.9 Hipótese do estudo ...................................................................................................
19
Capítulo 2: OBJETIVOS..............................................................................................
20
2.1 Objetivo geral ...........................................................................................................
20
2.2 Objetivos específicos/metas .....................................................................................
20
Capítulo 3: MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................
21
3.1 Obtenção dos animais ...............................................................................................
21
3.2 Obtenção e crescimento da Pseudomonas aeruginosa..............................................
21
3.3 Indução de infecção pulmonar pela instilação intratraqueal com Pseudomonas
aeruginosa.......................................................................................................................
21
viii
22
23
3.4 Contagem total e diferencial das células do lavado broncoalveolar .........................
22
3.5 Contagem das unidades formadoras de colônias.........................................................
22
3.6 Análise dos sinais clínicos após instilação intratraqueal de Pseudomonas aeruginosa
22
3.7 Dosagem de DNA ........................................................................................................
23
3.8 Dosagem de citocinas ...................................................................................................
23
3.9 Eliminação bacteriana por NETose em animais submetidos à sepse polimicrobiana
por ligadura e perfuração do ceco ...................................................................................... 24
3.10 Análise estatística ......................................................................................................
24
Capítulo 4: RESULTADOS ............................................................................................
25
4.1. Análise da apresentação dos sinais clínicos causados pela infecção com
Pseudomonas aeruginosa.................................................................................................... 25
4.2. Análise de sobrevida dos animais submetidos à instilação com Pseudomonas
aeruginosa em diferentes cargas bacterianas...................................................................... 26
4.3. Contagem de leucócitos no BAL de animais infectados com Pseudomonas
aeruginosa........................................................................................................................... 26
4.4. Análise da liberação do DNA em meio extracelular no BAL de animais infectados
com Pseudomonas aeruginosa............................................................................................ 27
4.5. Análise do crescimento bacteriano no BAL de animais infectados com
Pseudomonas aeruginosa.................................................................................................... 27
4.6. Efeito do tratamento com rosiglitazona sobre a apresentação dos sinais clínicos
causados pela infecção com Pseudomonas aeruginosa...................................................... 28
4.7 Efeito do tratamento com rosiglitazona na contagem de leucócitos no BAL de
animais infectados com Pseudomonas aeruginosa............................................................. 29
4.8. Efeito do tratamento com rosiglitazona sobre as citocinas presentes no BAL de
animais infectados com Pseudomonas aeruginosa............................................................. 30
4.9. Efeito do tratamento com rosiglitazonana quantificação de DNA extracelular no
BAL de animais infectados com Pseudomonas aeruginosa............................................... 31
4.10. Efeito do tratamento com rosiglitazona sobre o crescimento bacteriano no BAL de
animais infectados com Pseudomonas aeruginosa............................................................ 31
4.11. Efeito do agonista de PPARγ rosiglitazona sobre o conteúdo de DNA extracelular
presente na cavidade peritoneal de animais submetidos à CLP......................................... 32
ix
4.12 Efeito da rosiglitazona (Rosi) sobre a carga bacteriana presente na cavidade
peritoneal de animais submetidos à CLP.............................................................................
33
4.13 Efeito da DNase e rosiglitazona sobre a carga bacteriana presente na cavidade
peritoneal de animais submetidos à CLP...........................................................................
34
Capítulo 5: DISCUSSÃO ................................................................................................
35
Capítulo 6: CONCLUSÕES ............................................................................................
41
Capítulo 7: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................
42
x
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DO RECEPTOR NUCLEAR PPAR GAMA NO CONTROLE
DE INFECÇÕES
RESUMO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
Mírian Priscila Lins de Lima
A pneumonia é uma infecção aguda localizada nos pulmões geralmente
associada à bactéria Gram-negativa, sendo a Pseudomonas aeruginosa um dos
principais agentes etiológicos. O processo infeccioso no trato respiratório está associado
à sepse, caracterizada como síndrome de resposta inflamatória (SIRS) originada por
uma infecção. Há um grande número de pacientes em ventilação mecânica nas unidades
de terapia intensiva com sepse. Durante a invasão de um microorganismo o sistema
imune é ativado dando inicio a uma resposta inflamatória. Os neutrófilos são as
primeiras células a chegarem ao local da infecção. Recentemente, foi descrito um tipo
de morte celular dos neutrófilos denominado NETose, que leva à formação de redes
extracelulares dos neutrófilos (NET). Na NETose componentes do DNA e proteínas são
lançados para o meio extracelular formando as redes, levando à captura e eliminação do
patógeno invasor. Alguns estudos do nosso laboratório e de outros autores mostraram a
relação do receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomos gama (PPARγ)
com o processo inflamatório, capaz de inibir a expressão de genes de mediadores próinflamatórios. A rosiglitazona, uma droga agonista do PPARγ, modulou a resposta
inflamatória na sepse polimicrobiana de origem peritoneal em camundongos. O presente
trabalho analisou o efeito deste fármaco na infecção bacteriana causada pela
Pseudomonas aeruginosa e no modelo de sepse polimicrobiana. Investigamos os efeitos
da instilação de Pseudomonas aeruginosa e do tratamento com rosiglitazona sobre os
sinais clínicos dos camundongos Swiss, o número de leucócitos totais e diferenciais,
produção de citocinas, na formação de NET e no crescimento bacteriano. O tratamento
com rosiglitazona normalizou a frequência respiratória evidenciando um efeito protetor
no foco da infecção, preveniu o aparecimento de outros sinais clínicos da doença,
reduziu a produção de citocinas pró-inflamatórias e aumentou a eliminação bacteriana.
Na sepse abdominal foi utilizado o modelo de ligadura e perfuração do ceco (CLP). A
rosiglitazona também diminui o número de bactérias na cavidade peritoneal no modelo
de CLP. Um possível mecanismo foi observado através do aumento do DNA
extracelular após o tratamento com rosiglitazona, sugerindo a presença de NET. Em
contrapartida, na presença de DNAse para digerir as NET foi possível observar o
aumento de unidades formadoras de colônia nos animais sépticos tratados com
rosiglitazona, mostrando que a formação de NET é essencial para o efeito da
rosiglitazona sobre o crescimento bacteriano. Estes dados indicam que a rosiglitazona
pode ter papel relevante na modulação da inflamação e eliminação bacteriana tendo
efeito protetor dependente de NET.
xi
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
THE INVOLVEMENT OF THE NUCLEAR RECEPTOR PPAR GAMMA IN INFECTION
CONTROL
ABSTRACT
Master degree thesis in Biologia Celular e Molecular
Mírian Priscila Lins de Lima
The pneumonia is an acute infection localized in the lungs usually associated to a Gramnegative bacterium. Pseudomonas aeruginosa is one of the principal etiological agents.
The respiratory tract infection process is associated with sepsis, characterized as
systemic inflammatory response syndrome (SIRS) caused by an infection. There is a
high number of patients under mechanical ventilation in intensive care units affected
with sepsis. During a microorganism invasion the immune system is activated starting
an inflammatory response. The neutrophils are the first cells to migrate to the infection
site. Recently it was described a new type of neutrophil cellular death called NETosis,
which leads to the neutrophil extracellular trap formation (NET). There is release of
components of DNA and proteins to the extracellular medium forming traps in
NETosis, leading to the capture and elimination of the pathogens. We and other authors
observed the relation between the peroxisome proliferator-activated receptor gamma
(PPARγ) and the inflammatory process. Beyond its role in the lipid metabolism and the
glycemia regulation, PPARγ inhibits the inflammatory mediator gene expression. The
rosiglitazone, a PPARγ agonist, modulated the inflammatory response in polymicrobial
sepsis in mice. The present work aimed to analyze the effect of this drug in the infection
caused by Pseudomonas aeruginosa and in the polymicrobial sepsis model. We
investigated the effects of Pseudomonas aeruginosa instillationin mice and the
treatment with rosiglitazone on the clinical signs, the number of total and differential
leukocytes, cytokine production, NET formation and bacterial growth. Rosiglitazone
treatment stabilized the respiratory rate showing a protective effect in the focus of
infection, as well as a reduction of onset the disease clinical signs. We also observed a
decrease in pro-inflammatory cytokine production and the increased elimination of
bacteria in rosiglitazone-treated septic animals. We performed a cecal ligation and
puncture (CLP)as a model of peritoneal sepsis. Rosiglitazone also decreased the number
of colony forming units in the peritoneal cavity in CLP model. A possible mechanism
was observed by increasing the extracellular DNA after treatment with rosiglitazone,
suggesting NET occurence. In contrast, in the presence of DNAse to digest the NET we
observed an increase of colony forming units in septic animals treated with
rosiglitazone, showing the formation of NET is essential for the effect of rosiglitazone
on bacterial growth. These data indicate that rosiglitazone may have an important role in
modulating inflammation and bacterial clearance having a protective NET dependent
effect.
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
AP-1 – Proteína ativadora-1 (do inglês, Activator Protein-1)
BAL – Lavado broncoalveolar (do inglês, Bronchoalveolar lavage)
BASES - Estudo Epidemiológico de Sepse Brasileira (do inglês, Brazilian Sepsis
Epidemiological Study)
BSA – Albumina sérica bovina
C3b –Complemento 3 b
CC – Quimiocina com motivo CC
CECAL – Centro de Criação de Animais de Laboratório
CD –Aglomerado de diferenciação (do inglês, cluster of differentiation)
CLP – Ligadura e perfuração do ceco (do inglês, cecal ligation and puncture)
DMSO – Dimetilsulfóxido
ERO - Espécies reativas de oxigênio
fMLP - Formil -metionil -leucil - fenilalanina
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
ICAM – Molécula de adesão intercelular
IFN – Interferon
Ig – Imunoglobulina
IL – Interleucina
iNOS – óxido nítrico-sintase induzida
i.p. – Intraperitoneal
i.v. - Intravenoso
LB – Luria Broth
LPS – Lipopolissacarídeo (do ingles, Lipopolyssacharide)
LT – Leucotrieno (do inglês, Leucotriene)
PBS - Tampão Fosfato-Salino (do inglês, Phophate Buffered Saline)
MAPK – Proteína ativadora de mitógeno (do inglês, Mitogen-Activated Protein K).
MCP – Proteína quimioatraente de macrófago (do inglês, Macrophage/Monocyte
Chemotactic Protein)
MIF - Fator inibitório de migração de macrófagos (do inglês, Macrophage migration
inhibitory)
MPO – Mieloperoxidase
NADPH – Fosfato dinucleótido adenina nicotinamida
NET - Redes extracelulares de neutrófilo (do inglês, neutrophil extracellular traps)
NF-ĸB – Fator nuclear kappa – B
NK –Matador natural (do inglês, Natural Killer)
PA – Pseudomonas aeruginosa
PAF – Fator de ativação plaquetária (do inglês, Platelet Activating Factor)
PAMP – Padrões moleculares associados a patógenos (do inglês, pathogen-associated
molecular patterns)
xiii
PAVM - Pneumonia Associada à Ventilação Mecânica
PCR –Proteína C reativa
PGE – Prostaglandina (do inglês, Prostaglandin)
PMA – Forbol - miristato - acetato (do inglês,Phorbol-myristate-acetate)
PPAR - Receptor ativado por proliferadores de peroxissoma (do inglês, peroxisome
proliferator-activated receptor)
PPRE – Região promotora de genes responsivos.
PRR - receptores de reconhecimento padrão.
RXR – Receptor X de retinóides
SIRS – Síndrome da resposta inflamatória sistêmica (do inglês, Systemic Inflammatory
Response Syndrome)
TGF-β - Fator transformador de crescimento β (do inglês, Transforming Growth Factor
β)
TLR – Receptores do tipo toll (do inglês, Toll Like Receptors)
TMB - Tetrametilbenzidina
TNF – Fator de necrose tumoral (do inglês, Tumor Necrosis Factor)
TZD – Tiazolidinediona
UFC – Unidade Formadora de Colônia
UTI - Unidade de Tratamento Intensivo
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Fatores de virulência e suas funções...............................................................
3
Figura 1.2. Modelos de formação do biofilme..................................................................
4
Figura 1.3 Interação neutrófilo-célula endotelial na sepse...............................................
7
Figura 1.4. Mecanismos de atuação dos neutrófilos..........................................................
14
Figura 1.5. Mecanismos de regulação da transcrição gênica por PPARγ ........................
18
Figura 4.1. Análise da apresentação dos sinais clínicos causados pela infecção com
Pseudomonas aeruginosa.................................................................................................... 25
Figura 4.2. Análise de sobrevida dos animais submetidos à instilação com
Pseudomonas aeruginosa em diferentes cargas bacterianas............................................... 26
Figura 4.3. Contagem de leucócitos no BAL de animais infectados com Pseudomonas
aeruginosa........................................................................................................................... 26
Figura 4.4. Análise da liberação do DNA em meio extracelular no BAL de animais
infectados com Pseudomonas aeruginosa......................................................................... 27
Figura 4.5. Análise do crescimento bacteriano no BAL de animais infectados com
Pseudomonas aeruginosa.................................................................................................... 27
Figura 4.6. Efeito do tratamento com rosiglitazona sobre a apresentação dos sinais
clínicos causados pela infecção com Pseudomonas aeruginosa......................................... 28
Figura 4.7. Efeito do tratamento com rosiglitazona na contagem de leucócitos no BAL
de animais infectados com Pseudomonas aeruginosa........................................................ 29
Figura 4.8. Efeito do tratamento com rosiglitazona sobre as citocinas presentes no BAL
de animais infectados com Pseudomonas aeruginosa....................................................... 30
Figura 4.9. Efeito do tratamento com rosiglitazona na quantificação de DNA
extracelular no BAL de animais infectados com Pseudomonas aeruginosa...................... 31
Figura 4.10. Efeito do tratamento com rosiglitazona sobre o crescimento bacteriano no
BAL de animais infectados com Pseudomonas aeruginosa............................................... 31
Figura 4.11. Efeito do agonista de PPARγ, rosiglitazona, sobre o conteúdo de DNA
extracelular presente na cavidade peritoneal de animais submetidos à CLP....................... 32
Figura 4.12. Efeito da rosiglitazona (Rosi) sobre a carga bacteriana presente na
cavidade peritoneal de animais submetidos à CLP............................................................. 33
xv
Figura 4.13. Efeito da DNase e rosiglitazona sobre a carga bacteriana presente na
cavidade peritoneal de animais submetidos à CLP............................................................. 34
Figura 6.1. Rosiglitazona interage com o PPARγ proporcionando a modulação da
produção de citocinas e a eliminação bacteriana através da NETose....... 41
xvi
1.
Introdução
1.1 Pulmão
O pulmão é um órgão com função principal de trocar gases com a atmosfera.
Este órgão frequentemente sofre agressões do meio externo por ser formada de extensa
área de interação com o ambiente. A interação com o meio externo proporciona a troca
de gases, e favorece a susceptibilidade a infecções, como por exemplo, pneumonia (1).
Em sua morfologia, a árvore brônquica abaixo da carina é considerada estéril.
Em indivíduos normais, esta área da árvore brônquica é isenta de microrganismos
infecciosos, diferentemente das vias superiores. Com isso, o trato respiratório possui
defesas composta por barreira anatômica e imunológica. A barreira anatômica é
constituída por segmentação progressiva do trato respiratório, filtração aerodinâmica e
transporte mucociliar. A barreira imunológica é formada por células do sistema imune,
como por exemplo, os macrófagos alveolares (1 e 2).
Os macrófagos alveolares são capazes de reconhecer e fagocitar bactérias. Este
reconhecimento desencadeia um processo complexo e fundamental para a propagação,
manutenção e resolução da resposta de defesa do indivíduo contra a infecção pulmonar.
Contudo, se a atividade destas células está alterada ou é insuficiente, ocorre a migração
de polimorfonucleares na tentativa de controlar a proliferação do agente infeccioso no
espaço alveolar (1 e 2).
O epitélio alveolar é constituído por dois tipos celulares denominado
pneumócito do tipo 1 e 2. O primeiro tipo é composto por células finas e planas
justapostas, e ocupa cerca de 90% da área da superfície alveolar. O segundo é formado
por células de característica robusta e cuboidais capazes de produzir sufarctante,
englobando cerca de 10 % da superfície alveolar. Na injúria pulmonar, elas funcionam
como células tronco do epitélio alveolar, pois não ocorre divisão celular do pneumócito
do tipo 1 (3).
1.2 Pneumonia
A pneumonia é caracterizada como infecção aguda localizada nos pulmões.
Apresenta os sintomas clínicos de tosse, respiração curta rápida, produção de muco,
dores no peito e com presença ou ausência de sintomas sistêmicos não específicos. A
1
disfunção do órgão ocorre em consequência à proliferação do microrganismo invasor, e
ao acúmulo de fluidos e células inflamatórias que migram para o local afetado (4).
O diagnóstico de pneumonia é feito através dos sinais e sintomas de infecção
aguda do trato respiratório inferior. O método de confirmação é através de radiografia
de tórax, que possibilita visualizar características da doença. Outros métodos utilizados
são hemocultura, exames laboratoriais e marcadores biológicos de infecção. O
tratamento é de duas a três semanas com antimicrobianos (5).
Existem diferentes tipos de pneumonia. Os tipos de pneumonia são associados à
origem, apresentação e fatores de risco, ao ser relacionado a indivíduos que foram
submetidos a algum tipo de cuidado médico ou institucional. A pneumonia relacionada
à assistência tem sido definida segundo as Diretrizes Brasileiras para Tratamento das
Pneumonias Adquiridas no Hospital e Associadas à Ventilação Mecânica (5).
A Pneumonia Associada à Ventilação Mecânica (PAVM) é classificada como a
segunda infecção hospitalar mais decorrente, e está relacionada a óbitos por infecções
adquiridas no meio hospitalar. A PAVM ocorre principalmente em pacientes em UTIs,
especialmente, quando associada à Pseudomonas spp. ou Acinetobacter spp.(6-11).
Atualmente existem poucos estudos relacionados à epidemiologia da PAVM
abrangendo o território brasileiro. Porém estudos em 99 hospitais demonstram que a
pneumonia originou infecções, com a maioria dos casos vinculados a pacientes sob
ventilação mecânica (12).
Geralmente de origem bacteriana, a pneumonia possui como principais
causadores agentes Gram-negativos. Infelizmente, esta doença pode evoluir para sepse
de acordo com a gravidade do prognóstico (13).
Os indivíduos diagnosticados com pneumonia, com agente infeccioso
Pseudomonas aeruginosa, possuem maior probabilidade de evoluir para o quadro de
falência múltipla de órgãos e consequentemente ao óbito, comparados com paciente que
possuem outros tipos de pneumonia. Uma das explicações para esta evolução é que a
Pseudomonas aeruginosa pode ocasionar injuria pulmonar epitelial aguda. Através da
injuria, a bactéria dissemina-se na circulação sanguínea, e é capaz de desencadear o
quadro de sepse. Estudos demonstraram que este patógeno pode causar necrose do
tecido epitelial pulmonar, e consequentemente invadir a corrente sanguínea (14). Em
um estudo epidemiológico da sepse em UTIs brasileiras, verificou-se uma elevada mortalidade associada à sepse. Pacientes mais graves e com maior tempo de internação
eram de origem pulmonar (13).
2
1.3 Pseudomonas aeruginosa
A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa de característica
polivalente, capaz de adaptar-se a novos ambiente com rapidez (15). Este patógeno
oportunista, por causar infecções em indivíduos com comprometimento imunológico. A
P.A. é frequentemente associada a infecções hospitalares por pneumonias nosocomiais
(16 e 17).
Os fatores de virulência podem ser relacionados à superfície bacteriana ou
secretados por ela (17). Estes fatores possuem diferentes funções no hospedeiro, que
influenciam na patogenicidade do patógeno (Figura 1.1) (18).
A coordenação dos atores de virulência está relacionada a um sistema de
comunicação denominado quorum sensing. Este sistema de comunicação possui
autoindutores que coordena o comportamento bacteriano, conforme a densidade
populacional. Assim, de acordo com a proliferação bacteriana, o nível de autoindutores
aumenta proporcionalmente, facilitando a transcrição gênica de novos fatores de
virulência (19).
Figura 1.1. Fatores de virulência e suas funções. Adaptado de Baron's Medical Microbiology 4th
edition, 2000 (20).
A Pseudomonas aeruginosa ainda é capaz de produzir biofilme como
mecanismo de proteção. O biofilme é composto por secreções da própria bactéria, que
por envolver a bactéria, forma uma barreira protetora contra anticorpos, fagocitose e
antibióticos (21 e 22). O biofilme pode ser formado a partir da adesão da Pseudomonas
3
aeruginosa pelo flagelo e pili (Figura 1.2a), ou a partir de um muco já presente no
hospedeiro (Figura 1.2b) (17).
Figura 1.2. Modelos de formação do biofilme. Adaptado de Williams, Dehnbostel et al. 2010
(17). Formação de biofilme através do modelo de infecção transitória, onde a bactéria induz a
formação do biofilme (a) e pelo modelo de infecção persistente, onde o desenvolvimento do
biofilme se dá a partir do muco já presente no hospedeiro (b).
1.4 Sepse
A síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS) é definida pela
combinação de diferentes sintomas clínicos. Contudo, quando a síndrome é relacionada
à presença de microrganismos é denominada de sepse. O choque séptico é um dos
resultados da evolução da sepse. O choque séptico ocorre quando a perda da volemia no
hospedeiro é irreversível, mesmo com técnicas de reposição volêmica (23 e 24).
A sepse é um dos principais fatores de mortalidade em UTIs, com quadro de
choque séptico. No desenvolvimento desta resposta, devem ser considerados três fatores
importantes: o local da infecção, a interferência na homeostase hemodinâmica
(caracterizada por fluxo sanguíneo comprometido e perda do líquido para o espaço
intersticial), resposta inflamatória local e generalizada. Este quadro desencadeia
disfunção de órgãos em sua evolução, e resulta em pelo menos um órgão afetado. Sua
manifestação clínica está relacionada com a presença de mediadores inflamatórios.
4
Estes mediadores são liberados por células de defesa e endoteliais, que proporcionam a
lise dos patógenos. A lise origina a liberação de endotoxinas e exotoxinas de bactérias
Gram-negativas e positivas, respectivamente, com prevalência de Gram-negativas (15,
25-29).
Os microrganismos presentes na microbiota natural da flora bacteriana do ser
humano, tornam-se patógenos oportunistas ao aproveitarem a debilidade imunológica
para se prolifera. Estes patógenos podem estar presentes na sepse ao desencadear o
processo inflamatório, o que normalmente não aconteceria se o organismo estivesse
imunologicamente apto a combater infecções. Não podemos descartar também a origem
através de parasitas, fungos e vírus, visto que, a sepse é originada por um processo
inflamatório, cuja a presença de microorganismo patogênico é capaz de resultar em tal
quadro (25-27, 29, 30-33). A Pseudomonas aeruginosa é um dos patógenos que podem
ser encontrados no organismo ao participar da microbiota natural, com capacidade de se
adaptar em novos ambientes. Entretanto, pode ser reconhecida como oportunista ao
originar infecções, como pneumonia, ao se desenvolver rapidamente em organismos
com resposta imune precária, como dito anteriormente (15-17).
A sepse pode ser diagnosticada com a presença de taquipnéia, variação da
temperatura corpórea, taquicardia e aumento ou diminuição do número de leucócitos.
Quando a sepse está estabelecida, ainda podem ocorrer prognósticos negativos que
resultam na fase grave. A fase grave apresenta quadro clínico de hipoperfusão ou
hipotensão tecidual e disfunção orgânica. Este quadro clínico desencadeia a fase do
choque séptico, visto que, a expansão volêmica e administração de vasoconstritores não
são suficientes para reverter a hipotensão arterial (30 e 34) .
Os estudos de métodos que auxiliem na contenção, reversão e diminuição dos
quadros clínicos iniciais e evolutivos são de relevância mundial. No território brasileiro,
dados obtidos através do Estudo Epidemiológico de Sepse Brasileira (do inglês BASES)
demonstram que o Brasil possui uma estatística semelhante aos da literatura mundial. O
alvo inicial do estudo focou em cinco UTIs localizadas no Sul e Sudeste do Brasil. O
estudo demonstrou que cerca de 25% dos indivíduos que são diagnosticados com
alguma das fases da sepse, localizam-se em (UTIs). Dentro desta porcentagem de
indivíduos, ainda 34,7% são por sepse, 47,3% sepse grave e 52,2% choque séptico (35).
Levando em consideração o lado econômico, os custos apresentam-se
dispendiosos. Existem perdas de produtividade devido ao longo período de internação
dos pacientes diagnosticados, uso de equipamentos, medicamentos e uma equipe
5
profissional associada, além da elevada taxa de mortalidade agregada (35 e 36). O
tratamento comum é voltado para o controle da infecção e correção dos distúrbios
hemodinâmicos (37). Infelizmente, no Brasil, os custos com pacientes internados em
UTIs equivalem a 17,34 bilhões de reais, o que totaliza, em torno de 30 a 35% dos
custos globais com a área da saúde (35).
1.5 Fisiopatologia da resposta inflamatória
1.5.1 Resposta imunológica e inflamatória do hospedeiro
Durante a invasão de algum microorganismo, ou em situações que prejudiquem
a homeostase do organismo, o sistema imune é ativado dando inicio a uma resposta
inflamatória. Esta resposta busca neutralizar estes agentes e inicia a reparação do tecido
lesionado. O processo começa controlando e destruindo a ameaça e termina quando a
reparação tecidual é completa (38).
O processo inflamatório, em resposta a um agente infeccioso ou reações que
desencadeiam tal resposta, é fundamental para a contenção do agente. Porém o
organismo pode responder de maneira exacerbada ao estímulo. Desta forma, ocorre uma
desregulação do sistema evoluindo para sepse. Este resultado prejudica a resolução do
processo infeccioso, e origina os sintomas que definem o diagnóstico através dos dados
clínicos (31 e 39).
A resposta do sistema imune pode ser dividida em dois tipos: a) imunidade inata,
responsável pela resposta inicial na sepse, tendo como alguns receptores de
reconhecimento padrão o Toll-like (TLR) e CD14, que identificam os PAMPs (padrão
molecular associado à patógeno, do inglês pathogen-associated molecular patterns). O
TLR2 e TLR4 identificam componentes de bactérias Gram-positivas e negativas,
respectivamente (23 e 40); e b) imunidade adaptativa, com a presença de células B.
Estas células liberam imunoglobulinas que facilitam a apresentação de antígenos para
células fagocíticas e células T. Este processo origina uma complexa trama de
mecanismos, que regulam a modulação de respostas imunológicas frente a diferentes
antígenos (41).
6
Figura 1.3. Interação neutrófilo-célula endotelial na sepse. Larosa & Opal 2007 (24).
Durante o processo inflamatório ocorre a liberação de mediadores químicos, de
origem endógena. Estes mediadores procedem de proteínas plasmáticas ou de células
presentes no local do estímulo inflamatório. A liberação dos mesmos proporciona
respostas vasculares e celulares, como o recrutamento de leucócitos (Figura 1.3). Os
mediadores estão presentes, tanto no início da inflamação, como na regulação das
respostas do organismo do hospedeiro. Eles são parte fundamental do processo,
podendo desempenhar funções isoladamente ou em conjunto. Estas funções influenciam
na amplitude e na evolução da resposta inflamatória (Figura 1.3) (38).
Alguns mediadores são: as aminas vasoativas, sendo os primeiros mediadores
secretados durante o processo inflamatório, capazes de alterar a vascularização dos
vasos sanguíneos (8, 42 e 43). O ácido araquidônico, que ao sofrer ação das enzimas
ciclooxigenase e lipoxigenase, produz eicosanóides, que regulam diversos processos no
organismo. Além de influenciar na homeostasia, ao participar na manutenção do sistema
cardiovascular e renal, e na inflamação (44).
Além disso, há o fator de ativação plaquetária (PAF), um fosfolipídeo que atua
como mediador intracelular. O PAF é capaz de exercer sua função em diversas células
do organismo (45); e espécies reativas de oxigênio, que são formadas por células que
7
participam da defesa imunológica, como por exemplo, neutrófilos. As espécies reativas
de oxigênio estão diretamente envolvidas na resposta inflamatória, e influenciam na
disfunção endotelial. Esta influencia é exercida através da oxidação de proteínas
importantes envolvidas na sinalização celular (46).
1.5.1.1 Citocinas e quimiocinas.
Citocinas são pequenas moléculas de polipeptídeos ou glicoproteínas
extracelulares e hidrossolúveis. Elas, em sua maioria, estão relacionadas com a resposta
do organismo a infecções ou doenças. E exerce função por diferentes mecanismos,
como por exemplo, parácrino (em células vizinhas) e autócrino (nas próprias células
produtoras) (47).
A ativação gênica de citocinas é compatível com a resposta de células ao
estresse. Geralmente, a sinalização é feita através de cascatas, tendo em vista que, as
próprias citocinas estimulam outras células a produzirem mais citocinas. Com isso,
apenas um composto pode agir em diversas células, caracterizando a pleiotropia. Além
disso, diferentes células podem secretar as mesmas citocinas (47).
As citocinas não são classificadas de acordo com as células de origem ou quanto
a sua atividade biológica. Elas são agrupadas em interleucinas com numeração
sequencial de 1 até 35, fator de necrose tumoral (TNF), quimiocinas (citocinas
quimiotáticas), interferons (IFN) e fatores de crescimento mesenquimal (47-49).
Esses mediadores participam da diferenciação, proliferação e sobrevida celular.
Ainda, regulam a atividade de outras citocinas influenciando a resposta inflamatória. A
influencia sob a resposta inflamatória pode ser exacerbada com a produção de citocinas
pró-inflamatórias ((interleucinas (IL) 1, 2, 6, e TNF (fator de necrose tumoral)) ou
atenuada com anti-inflamatória (IL-4, IL-10, IL-13 e TGFβ (fator transformador de
crescimento β)), conforme o local e estímulo (47, 50 e 51).
As principais citocinas, que participam da resposta sistêmica à infecção capazes
de estimular receptores celulares específicos do sistema imunológico, são interleucina 1
beta (IL-1β), IL-6, IL-8 e fator de necrose tumoral-α (TNF-α). A presença destas
citocinas pode estimular a liberação de outros mediadores de acordo com o estímulo,
como por exemplo, os produtos derivados do ácido araquidônico, fator de ativação
plaquetária (PAF), peptídeos vasoativos e outras citocinas (47 e 49).
8
A IL-1 pode ser produzida por macrófagos, monócitos, células não
imunológicas, como fibroblastos e células endoteliais em resposta a um estímulo, seja
devido à lesão celular, processo infeccioso, invasão de patógenos e inflamação. Existem
duas subfamílias descritas: IL-1α e IL-1β, e interagem com os mesmos receptores IL1RI e IL-1RII. O primeiro é caracterizado como receptor ativo e o segundo não possui
molécula de transdução e é inativo funcionalmente (47, 49 e 51).
A sinalização de IL-1α é relacionada com as membranas celulares e atua através
de contato célula-célula. Por outro lado, a IL-1β é sintetizada a partir de uma proteína
precursora, pro-IL-1β, não sendo secretada na forma ativa até passar pela metabolização
pela enzima caspase-1. A IL-1β ainda pode ativar a ciclooxigenase-2, o que causa
inflamação sistêmica, e resulta na formação de prostaglandina E2 (PGE2) no
hipotálamo, originando febre. Também é capaz de influenciar na produção de
substância-P, óxido nítrico e moléculas de adesão endotelial, desempenhando função na
dor pós-operatória. O antagonista do receptor de IL-1, o IL-1ra é liberado durante lesão
tecidual, competindo com os receptores de ligação, e atua como autorregulador
endógeno. Os efeitos biológicos do IL-1 têm início através da translocação do fator
nuclear NF- κB e AP-1, comuns a diversos genes induzidos pela IL-1 (47 e 51).
A IL-6 é considerada uma citocina pró-inflamatória. Esta citocina tem como
principais indutores LPS, TNF-α e IL-1, sendo secretada por vários tipos celulares. Ela
é capaz de promover a maturação e ativação de neutrófilos, maturação de macrófagos e
diferenciação de linfócitos-T citotóxicos e células de morte natural (47 e 51). Ela é
caracterizada como principal mediador de indução e controle da síntese e liberação de
proteínas de fase aguda pelos hepatócitos, em respostas a estímulos como traumas ou
injúrias teciduais. A IL-6 pode ser utilizada como marcador de ativação pró-inflamatória
por possuir alta meia vida, além de ações anti-inflamatórias, ao liberar receptores
solúveis de TNF e IL-1 (47 e 51).
As quimiocinas são peptídeos de baixo peso molecular. Elas são capazes de
induzir a quimiotaxia de leucócitos, regulados por receptores com 7 domínios
transmembranares acoplados à proteína G. Elas compõem uma família dividida em
quatro grupos, CXC, CX3C, CC e C, e diferem conforme a posição de cisteínas na
sequência de aminoácidos (47, 52 e53).
Existe ampla variabilidade na ligação, expressão de receptor e respostas de
quimiocinas em diferentes tipos celulares; também há receptores de quimiocinas que
regulam as respostas inflamatórias e imunes. No entanto, agentes externos com
9
capacidade de estimular processos inflamatórios, como patógenos, também são capazes
de mimetizar quimiocinas (33 e 81).
Quando ocorre a liberação e expressão de agentes quimiotáticos, os leucócitos se
dirigem rapidamente ao local, possibilitando pronta resposta de defesa contra
microorganismos. Esta interação origina mudanças bioquímicas e celulares, dentre elas,
modificações no fluxo de íons, potencial transmembranar, forma da célula, produção de
superóxido e locomoção de leucócitos aumentada (47 e 53).
Há fatores quimiotáticos derivados de peptídeos do fragmento C5a e C3a,
moléculas lipídicas, além do LTB4 e PAF. Foram descritas citocinas quimiotáticas
seletivas para leucócitos em experimentos in vitro e para induzir acumulação de células
inflamatórias in vivo (53 e 47).
Durante os quadros de sepse ocorre a produção de diferentes quimiocinas, entre
elas está a MCP-1/CCL2/CCL2 (122), uma proteína da família CC com atividade em
monócitos, células T, células NK, basófilos e mastócitos (54-56), além disso, também
possuindo envolvimento em patologias como, aterosclerose, artrite reumatóide e
esclerose múltipla (57 e 58).
Segundo estudos feitos por Matsukawa A. e cols. (1999), a neutralização desta
proteína é capaz de reduzir a produção de IL-13 e IL- 12 e aumentar TNF-α e IL-10, no
entanto, o pré-tratamento de camundongos aumentou a taxa de letalidade e diminuiu a
eliminação bacteriana e migração de leucócitos após CLP (59). Projetos feitos por nosso
grupo laboratorial demonstraram que o MCP-1/CCL2 regula positivamente a IL-10, e
controla negativamente o MIF no modelo de sepse peritoneal, sugerindo um papel
imunoregulador da MCP-1/CCL2 no controle do equilíbrio entre a produção de
citocinas pró e anti-inflamatórias no quadro de sepse (60).
1.6 Neutrófilos
1.6.1 Visão geral
No século XIX, Paul Ehrlich caracterizou os neutrófilos, com o auxílio de
diferentes métodos de coloração, cuja fonte de estudo era o sangue humano. Com este
método, ele verificou tipos celulares que possuem núcleo multilobulado que corava - se
em corantes neutros (61).
10
A origem deste tipo celular é mieloide proveniente da medula óssea. Possui
núcleo fragmentado entre 3 a 5 lóbulos, denominados como polimorfonucleares ou
granulócitos, devido à presença de grânulos no citoplasma. Os grânulos são
componentes fundamentais, pois auxiliam na eliminação do patógeno por sua ação
microbicida, através das hidrolases ácidas, proteases e peptídeos antimicrobianos. As
substâncias microbicidas entram em contato com o microrganismo por fusão com o
fagossomo ou por exocitose, associados ou não com redes extracelulares (62).
Reconhecidos como componentes na imunidade inata, os neutrófilos fazem parte
das primeiras células de defesa fagocitária a chegarem ao local da infecção. Estas
células possuem em seu interior mieloperoxidase, e outras substâncias com atividade
microbicida, principalmente, contra bactérias extracelulares. Os neutrófilos estão
presentes em processos inflamatórios, e são capazes de produzir secreção purulenta. São
as células brancas mais presentes no sangue, equivalendo a dois terços da população de
células medulares, e possuem a capacidade de reconhecer, ingerir e destruir agentes
patogênicos sem a influência da resposta imune adaptativa (63 e 64).
Embora estejam em grande quantidade, eles são de vida curta em comparação
aos macrófagos, possuindo vida média de 6h a 12h in vitro (65). Em análise
comparativa com outras espécies, estão presentes em 30% na corrente sanguínea dos
roedores, 50% nos chimpanzés e 70% em humanos (61).
Existem três tipos de grânulos: primário ou azurófilo, caracterizado pela
presença de mediadores como defensinas, elastase e catepsina; secundário, associados à
secreção de lactoferrina, por exemplo; e terciário, tendo as proteínas catepsinas e
gelatinases como principais. Apresentam vesículas secretoras originadas a partir do
processo de endocitose citoplasmática, em momentos finais no processo de
amadurecimento (34).
A formação dos grânulos tem ordem sequencial de início, onde se forma o
grânulo primário, consequentemente o secundário e após o terciário finalizando com as
vesículas secretoras. A liberação dos neutrófilos para a corrente sanguínea é dada
através da influência de quimiocinas. Estes mediadores também podem manter a
quantidade disponível de neutrófilos no sangue constante, na presença de um estímulo
que desencadeie a migração destas células (63 e 66).
Os neutrófilos são sensíveis a agentes quimiotáticos e citocinas, assim como,
substâncias liberadas por mastócitos e basófilos. A sua capacidade fagocítica está
relacionada com a ligação de seus receptores à opsoninas, IgG, C3b e TLRs.
11
Normalmente, os neutrófilos sofrem processos apoptóticos em condições fisiológicas
normais. No entanto, este processo é um agravante para o aumento de anticorpos
circulantes, e gera um alto nível de permeabilidade celular. Devido a permeabilidade,
ocorre a formação de edema tecidual, através da lise de tecidos adjacentes no processo
de destruição dos microrganismos, e ativação de células endoteliais que secretam óxido
nítrico, responsável pela vasodilatação, influenciando no choque séptico (26, 53, 67-71).
O reconhecimento através da interação do microrganismo com o receptor de
superfície celular, localizado no neutrófilo, desencadeia o processo de fagocitose,
caracterizado pelo englobamento do agente através de uma vesícula fagossômica. Os
mecanismos envolvidos na eliminação do agente infeccioso podem ser dependentes, ou
não de mecanismos que necessitem da presença do oxigênio (72 e 73).
A atividade dependente é direcionada pela enzima NADPH oxidada, que ao
interagir com a membrana do fagossoma, proporciona a transferência de dois elétrons
para molécula de oxigênio formando o ânion superóxido (O2-). Esta interação dá início a
uma sequência de reações, que colocam o microrganismo em contato com espécies
reativas de oxigênio (ERO), e culmina em sua eliminação (72-75).
Recentemente um novo processo de eliminação bacteriana por neutrófilo foi
caracterizado e denominado redes extracelulares de neutrófilo (NET). Estas redes são
capazes de capturar e eliminar agentes patógenos (67).
1.6.2 Ativação e migração do neutrófilo
Após o estímulo inicial contra o patógeno, ocorre a migração dos neutrófilos.
Este processo se inicia com o direcionamento destas células para o local afetado,
penetração na barreira endotelial e passagem pela membrana basal (Figura 1.3). Logo
após, ocorre a reprogramação da transcrição celular para amplificar o sinal inflamatório
contra o agente infeccioso, através da liberação de citocinas e quimiocinas. Esta
liberação auxilia no recrutamento de mais células de defesa. Em seguida, ocorre a
chegada do neutrófilo no local, que por sua vez participa na contenção e eliminação do
microrganismo, através de seus mecanismos microbicidas, atuando em conjunto ou
separadamente (66).
No local afetado existe a liberação de substâncias que desencadeiam o processo
infeccioso. Estas substâncias podem ser do próprio microrganismo como, por exemplo,
olipolissacarídeo de bactéria Gram negativa (LPS), ou do hospedeiro em resposta ao
12
estímulo, como o TNF-α, IL-8 e IL-1β. Estes mediadores atuam estimulando o
endotélio a expressar selectinas e moléculas de adesão intracelular (ICAM), e podem
induzir a ativação das integrinas dos leucócitos (figura 1.1) (34). Através desse
processo, os neutrófilos são capazes de interagir com essas moléculas devido à
participação de proteínas constitutivamente expressas, como por exemplo, a
glicoproteína ligante de P-selectina 1, L-selectina e o grupo da família de β2 integrinas.
A ligação com as selectinas proporciona a ativação e o rolamento destas células de
defesa. Em seguida, ocorre a expressão das β2 integrinas. Consequentemente, ocorre a
adesão, dando origem ao processo de transmigração endotelial (76 e 77) (Figura 1.3).
Sendo assim, com a saída do endotélio, via membrana basal e o acesso ao local
da infecção que originou o estímulo, o neutrófilo enfrenta um gradiente inflamatório.
Este gradiente o direcionará em nível molecular para a conclusão do seu processo de
ativação. O processo pode ser através da ligação do fMLP ao receptor fMLP 1 e a
interação entre a IL-8 com o CXCR2, ocasionando a ativação de variadas vias de
sinalização, como por exemplo, as MAPK, que são kinases ativadas por mitógenos, ou
pela ativação de receptores purinérgicos via ATP (78 e 79).
Concomitantemente, ocorre o estímulo através de receptores de reconhecimento
padrão (PRR), presente no hospedeiro, que desencadeiam o processo de produção de
ERO e início da fagocitose. Componentes desta família podem reconhecer diferentes
características bacterianas. O TLR-4, por exemplo, reconhece o LPS e a partir disso
origina a ativação do fator de transcrição NF-κB (71 e 80).
Após o estímulo inicial, desenvolvimento do processo infeccioso e ativação do
neutrófilo, finalmente dá-se a eliminação do agente patogênico através dos processos de
degranulação, fagocitose ou pela NETose isoladamente ou em conjunto. Os neutrófilos
são capazes de desenvolver um processo microbicida ocasionando a destruição do
patógeno e também de células adjacentes. Sendo assim, a ativação e resolução do
processo infeccioso devem ser bastante reguladas, visto que, dependendo do estímulo,
um ou vários mecanismos são ativados para a destruição e controle do patógeno (66).
1.6.3 Redes extracelulares de neutrófilo
Inicialmente, dados da literatura relatavam apenas dois tipos de métodos
antimicrobianos adotados por neutrófilos que abrangem a fagocitose, e degranulação
formada pela liberação do conteúdo granular para o meio extracelular (26 e 81).
13
Porém, em 2004 Brinkmann e cols, caracterizaram outro tipo de eliminação
microbicida. Observou-se que os neutrófilos também são capazes de gerar fibras
extracelulares, conhecidas como NET (Redes extracelulares de neutrófilo, do inglês
neutrophilic extracellular traps). A NET é caracterizada como armadilhas compostas
por grânulos e substâncias nucleares, responsáveis por prender e matar bactérias
extracelulares, compondo uma barreira impedindo sua difusão (Figura 1.4) (26, 53, 6771).
Figura 1.4. Mecanismos de atuação dos neutrófilos. Adaptado de Mócsai, A. 2013 (82).
A NETose é um novo tipo de morte celular do neutrófilo no qual os
componentes do DNA e proteínas associadas são lançados para fora destas células de
defesa formando as redes. A captura e eliminação do patógeno invasor ocorre em meio
extracelular. Esta morte difere da necrose e apoptose, pois não ocorre a fragmentação de
DNA ou exposição de fosfatidilserina na membrana externa da célula. No entanto, o
envelope nuclear se mantém intacto. Em estudos utilizando sobrenadantes de cultura de
neutrófilos necróticos ou apoptóticos, não foi possível a detecção de NET-DNA
associado. Outras pesquisas demonstraram que o tratamento com inibidores de caspases
e de necrose não foram capazes de interferir no processo de NETose, evidenciando uma
14
forma independente dessas vias. Observou-se que a formação de ERO e a ativação da
NADPH oxidase se faz importante para a produção da NET (83).
Diferentes proteínas foram detectadas na NET, entre elas histona, elastase,
mieloperoxidase, pentraxina 3, colagenases e enzimas da via glicolítica (52 e 84).
Atualmente as redes extracelulares já foram descritas em outros tipos celulares
como, mastócitos, eosinófilos, basófilos, monócitos e macrófagos, sendo assim, o termo
ET é usado de uma maneira mais ampla para denominar estas redes (85 e 86). Diversos
estímulos podem estar associados à liberação da NET como, por exemplo, bactérias
Gram-negativas e positivas, LPS, fungos, protozoários, PMA e IL-8. Estas redes são
formadas ativamente, não sendo consequência de um mecanismo de desintegração
celular (17 e 67).
O principal evento da NETose é caracterizado pela descondensação da
cromatina. Inicialmente a elastase migra para o núcleo e degrada parcialmente as
histonas. Logo após, a mieloperoxidase se desloca para o núcleo, e age em sinergismo
com a elastase por algum método desconhecido, independente da atividade enzimática
da MPO. Neutrófilos que possuem deficiência na MPO, na presença de PMA ou
Candida albicans não são capazes de conter o processo infeccioso causado pelo
patógeno (33, 87 e 88).
Pesquisas sugerem três mecanismos para a produção das redes extracelulares: 1)
um dos mecanismos é através da estimulação direta da célula pelo patógeno (83), 2) a
presença do LPS é capaz de induzir a ativação de plaquetas via TLR4 presentes nestas
células modulando a formação da NET (89-93), e 3) engloba o DNA mitocondrial e
caracteriza que a formação também pode ocorre em outros tipos de granulócitos (52,
83,86 e 94). No que condiz ao dano tecidual presente em processos infecciosos, foi
observado que houve uma diminuição do dano ao tecido adjacente, sugerindo a
modulação da resposta inflamatória. No entanto, Gupta e colaboradores verificaram
uma interação de células endoteliais com os neutrófilos, o que explica o dano endotelial
e a diminuição da perfusão tecidual presente na sepse (27 e 64).
Contudo, as bactérias são capazes de esquivar-se da NET. Elas podem produzir
uma catalase bacteriana que consome o peróxido de hidrogênio (H2O2). Esta substância
é um dos componentes fundamentais do metabolismo oxidativo, capaz de induzir a
formação das redes, diminuindo a produção das mesmas. Outra ação é a produção de
nuclease bacteriana (DNAse), capazes de degradar a NET, liberando as bactérias que
foram capturadas. Outro exemplo é a parede celular presente nas bactérias que servem
15
de capsula protetora podendo suprimir a afinidade da ligação da NET ao microrganismo
(81). Porém pouco se sabe sobre seu efeito em Pseudomonas aeruginosa.
1.7 PPARγ
O PPARγ (receptor ativado por proliferadores de peroxissoma,do inglês
peroxisome proliferator-activated receptor) faz parte de uma superfamília de receptores
nucleares, e pode regular a transcrição gênica a partir de diversos mecanismos (fig 1.5).
Ele é expresso principalmente no tecido adiposo e em células endoteliais vasculares,
macrófagos e células β pancreáticas. Participa em processos inflamatórios, podendo
estar atuante na fisiologia da inflamação, obesidade, diabetes e na resposta imune. Esta
atuação deve-se a participação na regulação do metabolismo lipídico e lipoproteínas, na
regulação da glicemia e efluxo em lesão aterosclerótica, atenuando a inflamação
ocasionada por macrófagos e neutrófilos. A sua ativação pode inibir a expressão de
genes pró-inflamatórios. Seus agonistas exógenos são da classe das tiazolidinedionas
(TZD), ou também chamadas de glitazonas (71, 95-98).
A descrição dos PPARs foi feita através da sua participação na proliferação de
peroxissomos, que são organelas plasmáticas responsáveis pelo metabolismo de H2O2,
mecanismo de eliminação bacteriana (99-101).
Existem três isotipos de PPAR descritos em mamíferos (102):

O PPAR α possui ácidos graxos livres como ligantes endógenos e fibratos e
fármaco utilizado para tratamento da hiperlipidemia como principais ligantes
exógenos. Ele pode ser encontrado no fígado, músculo, coração, endotélio e rins
e está envolvido na oxidação de ácidos graxos livres, na transcrição de fatores
que possuem atividade anti-inflamatória e em metabolismo de lipoproteínas
(103).

O PPARβ/δ possui participação na regulação do metabolismo do colesterol, e
está presente no fígado, intestino, músculo e tecido adiposo (103).

O PPAR γ é principalmente expresso no tecido adiposo, porém também pode
estar presente no endotélio vascular. Este isotipo possui três isoformas descritas,
a isoforma do tipo um (PPARγ1), expresso na maioria dos tecidos; tipo dois
(PPARγ2) expresso no tecido adiposo; e tipo três (PPARγ3) expresso no tecido
adiposo, cólon, macrófagos e células T. Ele é capaz de regular a transcrição
16
gênica por diversos mecanismos. A regulação direta dá-se através da sua
ativação por ligantes lipídicos. Esta ativação confere alterações conformacionais
na molécula, o que permite a dimerização com o receptor nuclear de ácido 9-cisretinóico (receptor X de retinóides ou RXR). Esta ligação proporciona o
recrutamento de moléculas co-ativadoras, tornando-se capaz de interagir com a
região promotora de genes responsivos denominados PPRE (do Inglês PPARγ
Responsive Elements). A interação favorece a transcrição de genes codificadores
de proteínas atuantes na modulação do processo inflamatório. Contudo, existem
formas de ligação indireta que também podem modular este processo, como
ligação do complexo PPARγ/RXR com moléculas necessárias para outros
fatores de transcrição. Esta forma de ligação, impede a expressão de proteínas
pró-inflamatórias, dentre elas a inibição da expressão de genes pró-inflamatórios
através da inibição da ativação da MAPK (98, 102, 104-106).
O PPARγ tem sido apontado como um alvo terapêutico para o tratamento da
sepse (98). Além disso, estudos também evidenciaram sua participação no controle
do processo inflamatório e diminuição bacteriana na pneumonia por Streptococcus
pneumoniae em modelo murino (107).
17
Figura 1.5. Mecanismos de regulação da transcrição gênica por PPARγ. Menezes, CC.
2011 (108). Regulação direta do PPARγ pela ligação do complexo à região PPRE (a).
Regulação indireta através da captura de moléculas ativadoras de fatores transcricionais (b),
captura dos fatores transcricionais (c) e inibição da MAPK que ativa fatores transcricionais (d).
1.8 Rosiglitazona
A Rosiglitazona é um medicamento da classe das TZDs agonista do PPARγ,
proporcionando efeitos no metabolismo da glicose, aumento da ação antiinflamatória e
melhora na função endotelial, originando diminuição em marcadores de inflamação
como a PCR, fibrinogênio, ativação do NF-kB, citocinas e moléculas de adesão
vascular. Os agonistas do PPARγpodem induzir a diferenciação dos macrófagos e elevar
a expressão de marcações de superfícies celulares, como CD11/18, CD14 e CD36 em
monócitos. Sendo assim, eles podem contribuir para o controle da inflamação e na
formação de edema tecidual (95).
18
As glitazonas possuem atividade imunomodulatória em diferentes sistemas do
organismo, dentre eles, o trato respiratório. Foi demonstrado que esta classe participa da
modulação com efeitos anti-inflamatórios in vitro, com atuação nos macrófagos,
inibindo a liberação de H2O2 e a expressão de iNOS(109) e atuando também nos
neutrófilos através da inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias participantes
na ativação de linfócitos e liberação de IL-12, TNFα e IL-8 (110).
O nosso grupo mostrou o papel do PPARγ na modulação da sepse
polimicrobiana em camundongos, aumentando a sobrevida, controlando a inflamação e
aumentando a capacidade do hospedeiro de eliminar as bactérias. Além disso, este
composto possui efeito anti-inflamatório no tratamento de algumas doenças e em alguns
casos auxilia na diminuição da migração de neutrófilos em modelos de artrite, asma e
por instilação de endotoxina de bactéria Gram negativa(111).
1.9 Hipótese do estudo.
Acreditamos que é possível modular a inflamação e controlar a multiplicação
bacteriana com a administração da rosiglitazona que é um agonista do receptor PPARγ e
assim modular a evolução do quadro infeccioso. Assim, será possível associar o
aumento da capacidade de eliminação bacteriana através da NET e a modulação da
resposta inflamatória pela presença da Rosiglitazona.
19
2 Objetivos:
2.1 Objetivo Geral:
Analisar o efeito do tratamento com rosiglitazona na infecção bacteriana.
2.2 Objetivos específicos/metas:
2.2.1 Investigar os efeitos da instilação de Pseudomonas aeruginosa e do
tratamento com rosiglitazona sobre os sinais clínicos dos camundongos;
2.2.2 Investigar os efeitos da instilação de Pseudomonas aeruginosae do
tratamento com rosiglitazona sobre o número de leucócitos totais e diferenciais e na
produção de citocinas;
2.2.3 Investigar os efeitos da instilação de Pseudomonas aeruginosae
tratamento com rosiglitazona na formação de NET e no crescimento bacteriano.
2.2.4 Investigar o efeito do tratamento com rosiglitazona na formação de NET
em animais submetidos à sepse polimicrobiana por ligadura e perfuração do ceco
(CLP);
2.2.5 Investigar o efeito do tratamento com rosiglitazona na eliminação
bacteriana por NETose em animais submetidos à sepse polimicrobiana por CLP.
20
Metodologia
3.1 Obtenção dos animais:
Os camundongos Swiss webster machos pesando entre 25 e 30 gramas foram
obtidos do Centro de Criação de Animais de Laboratório (CECAL) da Fundação
Oswaldo Cruz. Os animais foram mantidos em isoladores ventilados (Gabinete Biotério
mod. EB-273, Insight, Brasil) no biotério do Pavilhão Ozório de Almeida até o
momento do experimento, com livre acesso a água e ração, sendo submetidos a um ciclo
de 12 h de claro/escuro. Os animais receberam uma dose de vermífugo (Drontal Puppy Bayerl) por via oral (gavagem) e foram utilizados uma semana após o tratamento. Os
protocolos utilizados foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da
Fundação Oswaldo Cruz (CEUA-FIOCRUZ), licença nº LW-36/10.
3.2 Obtenção e crescimento da Pseudomonas aeruginosa:
A Pseudomonas aeruginosa foi obtidada Coleção de Culturas de Bactérias de
Origem Hospitalarde Interesse em Saúde (ATCC PA01) localizada no Laboratório de
Pesquisa de Infecção Hospitalar da Fundação Oswaldo Cruz.O crescimento foi feito em
um meio de cultura na placa de Agar. Uma colônia dessa cultura foi isolada ecolocada
para crescer em meio líquido de Luria Broth (LB). O meio líquido com a colônia foi
colocado a 37 °C durante 16 horas e centrifugado a 12.000 g por 5 min. O precipitado
celular foi reconstituído em salina e a densidade ótica quantificada a 660 nm por
espectrofotometria. Densidade óptica = 0,1 equivale a 108 Unidades Formadoras de
Colônia (UFC)/ml.
3.3 Indução de infecção pulmonar pela instilação intratraqueal com Pseudomonas
aeruginosa:
Os animais foram anestesiados pela inalação com isoflurano. Após tosa e
assepsia local a traqueia dos animais foi exposta para realização da instilação com 50
µL da suspensão de Pseudomonas aeruginosa (107 UFC/mLou 108 UFC/mL) ou salina
estéril. Os animais foram suturados com nylon 4.0mm. Todos os camundongos foram
tratados com 10 mg/kg do antibiótico imipenem por via intraperitoneal (i.p.), e alguns
21
deles foram também tratados com rosiglitazona (0,5 mg/kg), ou o veículo da
rosiglitazona salina DMSO 0,1%, sendo administrados i.p. 5 h após a operação.
3.4 Contagem total e diferencial das células do lavado broncoalveolar (BAL):
Os animais foram eutanasiados pela inalação de isoflurano e procedeu-se a
coleta de amostras de BAL 24h após este procedimento. Após assepsia local com álcool
etílico a 70%, foi feita uma incisão medial longitudinal de aproximadamente 1 cm na
pele posterior ao mento do animal. Os lobos da glândula tireóide foram afastados
gentilmente com uma tesoura de ponta redonda e a traquéia foi elevada pela colocação
de uma pinça curva em sua região posterior. Os animais tiveram os músculos adjacentes
seccionados. Em seguida, foi aberto um pequeno orifício na região proeminente da
cartilagem traqueal para a inserção de uma cânula. O lavado broncoalveolar foi obtido
pela infusão de 500µL de PBS seguida pela aspiração do conteúdo, sendo este
procedimento repetido por 3 vezes.
Amostras do BAL foram diluídas em líquido de Turk para a contagem de
células totais. Lâminas obtidas por citocentrifugação foram coradas no panótico rápido
para análise diferencial. Após o procedimento, os animais foram descartados de acordo
com as normas da instituição.
3.5 Contagem das unidades formadoras de colônias (UFC):
Amostras do BAL foram diluídas em salina estéril e plaqueadas em meio agar.
As placas foram colocadas na estufa à 37ºC, durante 24h, e as colônias formadas foram
contadas manualmente.
3.6 Análise dos sinais clínicosapós instilação intratraqueal de Pseudomonas
aeruginosa:
Os camundongos, 24h após instilação de Pseudomonas aeruginosa, são
avaliados de acordo com 10 sinais clínicos: piloereção, lacrimação/olhos fechados, taxa
de respiração, exploração do ambiente, alerta (escape ao toque), atividade locomotora,
alteração de temperatura corporal, força ao agarrar, taxa de respiração após a
manipulação e turgor. Caso o animal possua algum sinal, é dado 1 ponto ao seu escore
22
clínico. Quanto mais sinais ele apresenta, mais é pontuado. Até 1 ponto, o animal é
considerado sadio, de 2 a 3 pontos, é caracterizada uma pneumonia leve, até 7,
pneumonia moderada, e até 10, pneumonia grave, adaptado de Araújo e cols (2012)
(112).
3.7 Dosagem de DNA (formação de NET):
Amostras do BAL foram centrifugadas a 400 g durante 5 min. O sobrenadante
foi coletado e armazenado a -20ºC. A dosagem foi feita com Quant-iT™ PicoGreen®,
por ser um fluorescente ultrassensível é usado para quantificar duplas fitas de DNA em
solução, de acordo com as instruções da Invitrogen. Após diluição do reagente em T.E.
1x, em placa de 96 poços, foram adicionados diferentes concentrações de DNA (curvapadrão) e as amostras nos poços restantes, com conseguinte adição do reagente TE e
PicoGreenem todos os poços utilizados. A placa foi colocada em leitor de fluorescência
após 5 minutos de incubação em temperatura ambiente, com utilização de 480 nm de
excitação e 520 nm de emissão.
3.8 Dosagem das citocinas IL-1, IL-6 e MCP-1 :
Amostras do BAL foram centrifugadas a 400 g durante 5 min. O sobrenadante
foi coletado e armazenado a -20ºC. A dosagem foi feita através do Ensaio
Imunossorvente Ligado à Enzima (Enzyme Liked Immunosorbent Assay, ELISA).
Foram utilizados anticorpos monoclonais específicos (Duo set kit – R&D Systems).
Para essas análises foi utilizado o protocolo da Pharmingen, no qual placas de 96 poços
(Nunc) foram revestidas com anticorpos de captura. As placas foram cobertas com
papel alumínio e incubadas overnight a 4°C. No dia seguinte, após 3 lavagens com
PBS/Tween, os sítios inespecíficos foram bloqueados pela adição de PBS/BSA 1%.
Após 1 h as placas foram lavadas por 4 vezes com PBS/Tween novamente e, em
seguida, foram adicionadas proteínas recombinantes em diferentes concentrações
(curvas-padrão), bem como as amostras do lavado broncoalveolar. Novamente as placas
foram incubadas overnight a 4°C. No último dia após a rinsagem, o anticorpo de
detecção foi adicionado também diluído em PBS/BSA 1% comTween 20 a 0,05 %.
Após 1 h de incubação a temperatura ambiente, adicionou-se avidina-peroxidase
(diluição 1:200, R&D). Passados 30 minutos, as placas foram lavadas com solução de
23
lavagem e em seguida, adicionou-se a solução de TMB (3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina,
Sigma). A reação foi paralisada com a adição de solução de ácido sulfúrico
(Próquimios) 0,4 N (50 μL/poço) e a leitura foi feita no comprimento de onda de 405
nm em espectrofotômetro (Spectra Max, Molecular Devices®).
3.9 Eliminação bacteriana por NETose em animais submetidos à sepse
polimicrobiana por ligadura e perfuração do ceco (CLP).
Os experimentos foram realizados em animais provenientes do Biotério Central
da FIOCRUZ e foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal
(CEUA) da FIOCRUZ. Os camundongos Swiss foram anestesiados via intraperitoneal
com uma solução de cloridrato de ketamina (25 mg/kg) e cloridrato de xilazina (20
mg/kg). Em seguida foi feita a laparotomia e submetidos à sepse polimicrobiana por
ligadura e perfuração do ceco que foi exposto para fora da cavidade, ligado abaixo da
válvula ileocecal e perfurado duas vezes com agulha de calibre 18G para indução da
sepse moderada, em animais do grupo sham (grupo controle) o ceco é apenas exposto.
O ceco foi colocado novamente na cavidade peritoneal e o abdome foi suturado. Ao
final do procedimento foi administrado 1 mL de solução salina estéril, via subcutânea,
como fluido de ressuscitação, com finalidade de prevenir a hipotensão pós-operatória,
após esse procedimento, os animais são tratados por injeção intravenosa com
rosiglitazona 15 minutos após o CLP, na presença e na ausência de DNase (5 mg/kg,
i.p., 1 h após o CLP). O lavado peritoneal foi coletado 6 h após a CLP, colocado em
placas contendo agar e incubado a 37oC por 16 h para a contagem do número de UFC e
o sobrenadante foi recolhido para a dosagem de DNA com PicoGreen, de acordo com
as instruções da Invitrogen.
3.10 Análise estatística:
A análise estatística foi feita pela análise de variância (ANOVA) seguida pelo
teste Neuwman-Keuls no software GraphPad prism versão 5. Os dados quantitativos são
mostrados como valores individuais e mediana ou média + erro padrão da média (EPM)
e o nível de significância foi estabelecido como p < 0,05.
24
4 Resultados
Inicialmente padronizamoso modelo de injúria pulmonar ocasionado pelo
quadro de pneumonia em camundongos tendo a Pseudomonas aeruginosa(PA) como
agente etiológico, onde foi possível observar o escore clínico (fig 4.1) elevado no grupo
que recebeu o patógeno, porém não houve diferença significativa entre as cargas
bacterianas utilizadas.Partindo disso, analisamos a mortalidade entre as mesmas cargas
bacterianas citadas, sendo possível observar 20% de sobrevida nos animais submetidos
à carga de 108 e 100% de sobrevida nos animais instilados com 107 (fig 4.2).Portando,
foi padronizada a carga bacteriana de 107. Logo a seguir, observou-se a migração de
leucócitos (fig 4.3), aumento do DNA extracelular (fig 4.4) e elevada contagem de
unidades formadoras de colônia (fig 4.5). Sendo assim, o modelo foi estabelecido e
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
*
*
Moderada
10
PA
10
PA
a
Sa
lin
8
Leve
7
escore 24 h
utilizado para decorrentes análises ao longo do projeto.
Figura 4.1: Análise da apresentação dos sinais clínicos causados pela infecção com Pseudomonas
aeruginosa(PA). Camundongos Swiss submetidos à instilação intratraqueal com Pseudomonas
aeruginosa(107 UFC/mL ou 108 UFC/mL). Vinte e quatro horas após a instilação foram observados os
sinais clínicos dos animais. Dados representados como valores individuais e mediana (4 < n < 10). (*)
p<0,05 em relação ao grupo salina.
25
sobrevida (%)
100
salina
80
PA 107
60
PA 108
40
20
0
0
24
48
72
96
120
144
168
horas
Figura 4.2. Análise de sobrevida dos animais submetidos à instilação com Pseudomonas
aeruginosa(PA) em diferentes cargas bacterianas. Camundongos Swiss submetidos à instilação
intratraqueal com Pseudomonas aeruginosa(107 UFC/mL ou 108 UFC/mL). Um dia após a instilação
foram observados a taxa de sobrevida. Dados representados como valores individuais e mediana (4 < n <
*
*
4
2
4
2
0
PA
Sa
l
0
6
PA
b)
Células mononucleares (x10 -6)
6
Sa
l
a)
Leucócitos totais (x10 -6)
10).
c)
Neutrófilos (x10 -6)
6
*
4
2
PA
Sa
l
0
Figura 4.3. Contagem de leucócitos no BAL de animais infectados com Pseudomonas aeruginosa
(PA). Camundongos Swiss submetidos à instilação intratraqueal com Pseudomonas aeruginosa. Vinte e
quatro horas após a instilação foram coletadas amostras de BAL para a contagem de leucócitos totais (a),
26
células mononucleares (b) e neutrófilos (c). Dados representados como média +EPM (5 < n <8). (*)
p<0,05 em relação ao grupo salina.
4
DNA (g/mL)
*
3
2
1
PA
Sa
l
0
Figura 4.4.Análise da liberação do DNA em meio extracelular no BAL de animais infectados com
Pseudomonas aeruginosa(PA). Camundongos Swiss submetidos à instilação intratraqueal com
Pseudomonas aeruginosa. Vinte e quatro horas após a instilação foram coletadas amostras de BAL para a
dosagem de DNA. Dados representados como média +EPM (10 < n < 15). (*) p<0,05 em relação ao
grupo salina.
*
UFC/Bal (x10³)
500
400
300
200
100
Sa
l
PA
0
Figura 4.5. Análise do crescimento bacteriano no BAL de animais infectados com Pseudomonas
aeruginosa (PA). Camundongos Swiss submetidos à instilação intratraqueal com Pseudomonas
aeruginosa. Vinte e quatro horas após a instilação foram coletadas amostras de BAL para a contagem de
UFC. Dados representados como média +EPM (6 < n < 8). (*) p<0,05 em relação ao grupo salina.
Após padronização iniciou-se a utilização da rosiglitazona como tratamento e
feita à observação do escore clínico dos animais, convertido em gráfico exibido na
figura 4.6. A figura4.6a demonstra a quantidade de sinais clínicos apresentados pelos
camundongos. Este gráfico mostra que nos animais estimulados com Pseudomonas
aeruginosa (PA) houve um escore característico de pneumonia moderada em relação ao
grupo controle, instilado somente com salina, e que o tratamento com rosiglitazona
(Rosi) diminuiu a apresentação de alguns sinais, diminuindo a gravidade da pneumonia,
passando a ser considerada leve. A figura 4.6b representa somente um sinal clínico, a
27
frequência respiratória, como destaque, uma vez que o alvo da instilação é o pulmão.
Novamente, houve um aumento do escore no grupo Pseudomonas aeruginosa e os
animais que tiveram o tratamento com rosiglitazona não apresentaram nenhuma
alteração respiratória, fig 4.6b.
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
*
os
i
R
PA
PA
Sa
lin
a
+
+
D
M
R
+
D
+
a
Sa
lin
Escore
(frequência respiratória)
Escore 24 h
b)
SO
os
i
+
M
SO
Escore
Escore2424h h
a)
3
*
2
+
1
normal
0
os
i
R
SO
PA
+
M
D
PA
+
+
a
Sa
lin
Sa
lin
a
+
D
R
M
SO
os
i
-1
Figura 4.6. Efeito do tratamento com rosiglitazona (Rosi) sobre a apresentação dos sinais clínicos
causados pela infecção com Pseudomonas aeruginosa(PA). Camundongos Swiss submetidos à
instilação intratraqueal com Pseudomonas aeruginosa foram tratados com rosiglitazona (0,5 mg/kg) 5
horas após o estímulo. Um dia depois da instilação foram observados os sinais clínicos dos animais (a),
em destaque o escore da alteração da frequência respiratória (b). Dados representados como valores
individuais e mediana (4 < n < 10). (*) p<0,05 em relação ao grupo salina. (+) p<0,05 em relação ao
grupo PA.
A figura 4.7 representa os resultados obtidos na contagem total e diferencial do
BAL. Houve um aumento na quantidade dos leucócitos totais (figura 4.7a),
caracterizado pelo aumento no número de neutrófilos (figura 4.7c) no grupo estimulado
com Pseudomonas aeruginosa. Não houve aumento nas contagens de células
mononucleares (figura 4.7b). O tratamento com rosiglitazona não mostrou efeito sobre o
aumento nas contagens dos leucócitos totais e neutrófilos no tempo analisado.
28
Neutrófilos (x10 -6)
2
+
PA
Sa
l+
R
+
PA
*
*
R
os
i
0
Sa
l
os
i
PA
os
i
Sa
l+
Sa
l
0
4
PA
2
6
R
os
i
4
Células mononucleares (x10 -6)
b)
6
c)
*
R
Leucócitos totais (x10 -6)
a)
*
*
6
*
4
2
os
i
PA
os
i
PA
+
R
R
Sa
l+
Sa
l
0
Figura 4.7. Efeito do tratamento com rosiglitazona (Rosi)na contagem de leucócitos no BAL de
animais infectados com Pseudomonas aeruginosa(PA). Camundongos Swiss submetidos à instilação
intratraqueal com Pseudomonas aeruginosa foram tratados com rosiglitazona (0,5 mg/kg) 5 horas após o
estímulo. Vinte e quatro horas após a instilação foram coletadas amostras de BAL para a contagem de
leucócitos totais (a), células mononucleares (b) e neutrófilos (c). Dados representados como média +EPM
(4 < n < 7). (*) p<0,05 em relação ao grupo salina.
Logo após, analisamos a influência do tratamento com a rosiglitazona sobre as
citocinas pró-inflamatórias induzidas pela infecção com Pseudomonas aeruginosa,
representadas na figura 4.8. A administração da rosiglitazona inibiu significativamente a
produção da IL-1β (fig 4.8a), IL-6 (fig 4.8b) e MCP-1/CCL2/CCL2 (fig 4.8c).
29
0.5
1.0
b)
*
*
Sa
l+
+
os
i
R
Sa
l
os
i
R
R
PA
+
0.0
PA
0.0
PA
0.2
os
i
0.1
Sa
l+
MCP-1 (ng/mL)
+
0.4
PA
0.2
0.6
os
i
+
0.3
1.2
c)
IL-6 (ng/mL)
0.8
Sa
l
IL-1 (ng/mL)
0.4
R
a)
*
0.9
+
0.6
0.3
PA
+
R
os
i
PA
R
os
i
Sa
l+
Sa
l
0.0
Figura 4.8. Efeito do tratamento com rosiglitazona (Rosi) sobre as citocinas presentes no BAL de
animais infectados com Pseudomonas aeruginosa (PA). Camundongos Swiss submetidos à instilação
intratraqueal com Pseudomonas aeruginosa foram tratados com rosiglitazona (0,5 mg/kg) 5 h após o
estímulo. Vinte e quatro horas após a instilação foram coletadas amostras de BAL para a dosagem de IL1β (a), IL-6 (b) e MCP-1/CCL2 (c). Dados representados como média + EPM (4 < n < 14). (*) p<0,05 em
relação ao grupo salina. (+) p<0,05 em relação ao grupo PA.
Em seguida dosamos o DNA presente no meio extracelular no BAL dos animais
de cada grupo.Observamos na figura 4.9, o aumento da quantidade de DNA dosado, o
que sugere uma formação de NET pelo grupo instilado com Pseudomonas aeruginosa
em relação ao grupo controle.Observou-se um aumento ainda maior do grupo que
recebeu rosiglitazona como tratamento, sugerindo uma amplificação da formação de
NET neste grupo, que foi estatisticamente significativo em relação do grupo somente
instilado com o estímulo infeccioso.
30
5
+
DNA (g/mL)
4
*
3
2
1
Sa
lin
os
i
PA
a
+
+
R
PA
R
Sa
lin
os
i
a
0
Figura 4.9. Efeito do tratamento com rosiglitazona (Rosi) na quantificação de DNA extracelular no
BAL de animais infectados com Pseudomonas aeruginosa (PA). Camundongos Swiss submetidos à
instilação intratraqueal com Pseudomonas aeruginosa foram tratados com rosiglitazona (0,5 mg/kg) 5 h
após o estímulo. Vinte e quatro horas após a instilação foram coletadas amostras de BAL para a dosagem
de DNA . Dados representados como média + EPM (10 < n < 15). (*) p<0,05 em relação ao grupo salina.
(+) p<0,05 em relação ao grupo PA.
A figura 4.10 mostra o crescimento bacteriano das amostras do BAL de
camundongos estimulados com a bactéria e o efeito do tratamento com rosiglitazona,
diminuindo a quantidade de bactérias presentes nas amostras,evidenciado através da
contagem de unidades formadoras de colônia.
3
CFU / Bal (x10 )
CFU / Bal (x10³)
500
400
300
+
200
100
PA
+R
os
i
PA
0
Figura 4.10. Efeito do tratamento com rosiglitazona (Rosi) sobre o crescimento bacteriano no BAL
de animais infectados com Pseudomonas aeruginosa (PA). Camundongos Swiss submetidos à
instilação intratraqueal com Pseudomonas aeruginosa foram tratados com rosiglitazona (0,5 mg/kg) 5 h
após o estímulo. Vinte e quatro horasapós a instilação foram coletadas amostras de BAL para a contagem
de unidades formadoras de colônias (UFC). Dados representados como média + EPM (6 < n < 8). (+)
p<0,05 em relação ao grupo PA.
31
Para a avaliação do efeito da rosiglitazona na formação de NET através da sepse
polimicrobiana abdominal, uma das principais causas de mortalidade em UTI seguido
de foco pulmonar inicial, como citado anteriormente, os camundongos foram
submetidos à CLP e tratados com rosiglitazona. Os dados obtidos foram feitos após 6h
da indução de sepse polimicrobiana, pois num período de tempo maior, a enzima DNase
utilizada na análise de unidades formadoras de colônia, foi capaz de induzir hemorragia
na cavidade peritoneal dos animais submetidos ao CLP.
O DNA extracelular foi dosado para a análise da formação de NET no
sobrenadante do lavado peritoneal. Foi possível observar que no grupo tratado com o
agonista de PPARγ houve um aumento do DNA extracelular quando comparado com o
grupo não tratado (Figura 4.11).
2.5
+
DNA (g/mL)
2.0
1.5
*
1.0
0.5
R
os
i
LP
C
LP
+
C
Sh
a
m
0.0
Figura 4.11.Efeito do agonista de PPARγ rosiglitazona sobre o conteúdo de DNA extracelular
presente na cavidade peritoneal de animais submetidos à CLP. Camundongos foram submetidos à
CLP e tratados com rosiglitazona (Rosi; 0,5 mg/kg, i.v.) ou veículo no grupo controle, 15 minutos após a
cirurgia. Seis horas após a indução de sepse o conteúdo de DNA foi dosado no sobrenadante do lavado
peritoneal livre de células. Os dados estão representados como média + EPM de pelo menos 6 animais
para cada grupo (*) p< 0,05 em relação ao grupo sham; (+) p< 0,05 em relação ao grupo CLP + veículo.
Em seguida analisou-se a contagem de UFC do sobrenadante do lavado
peritoneal em animais submetidos ao CLP e tratados com rosiglitazona, sendo
observado na fig. 4.12que houve uma diminuição no número de colônias comparado
com o grupo CLP não tratado.
32
300
UFC x 10-6/Cavidade
*
200
100
+
i.v
.
C
LP
+R
os
i
C
Sh
a
m
+R
Sh
am
os
i
LP
+v
eí
cu
lo
0
Figura 4.12. Efeito da rosiglitazona (Rosi) sobre a carga bacteriana presente na cavidade peritoneal
de animais submetidos à CLP. Camundongos foram submetidos à CLP e tratados com rosiglitazona
(Rosi; 0,5 mg/kg, i.v.) ou veículo no grupo controle, 15 minutos após a cirurgia.Seis horas após a indução
de sepse, alíquotas do lavado peritoneal foram plaqueadas para análise de UFC. Os dados estão
representados em valores individuais e mediana de pelo menos 7 animais para cada grupo. (*) p< 0,05 em
relação ao grupo sham; (+) p< 0,05 em relação ao grupo CLP + veículo.
Além disso, observamos um número de colônias semelhante entre o grupo
tratado com rosiglitazona na presença de DNase, enzima que degrada DNA,e o grupo
CLP (figura 4.13), mostrando que a DNase reverteu o efeito da rosiglitazona no
crescimento bacteriano.
33
UFCx 10-3/Cavidade
#
*
1000
800
600
400
200
e
e
as
as
D
N
+
+
os
i
LP
C
LP
+
R
C
C
LP
+
D
N
R
C
os
i
LP
0
Figura 4.13. Efeito da DNase e rosiglitazona (Rosi) sobre a carga bacteriana presente na cavidade
peritoneal de animais submetidos à CLP. Camundongos foram submetidos à CLP e tratados com
rosiglitazona (Rosi; 0,5 mg/kg, i.v.) ou veículo no grupo controle, 15 minutos após a cirurgia e DNAse
5mg/kg i.p, 1h após cirurgia. Seis horasapós a indução de sepse, alíquotas do lavado peritoneal foram
plaqueadas para análise de UFC. Os dados estão representados em valores individuais e mediana de pelo
menos 7 animais para cada grupo. (*) p< 0,05 em relação ao grupo CLP; (#) p< 0,05 em relação ao grupo
CLP + DNase.
34
5.Discussão
APseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa associada com a
ocorrência de alta taxa de mortalidade frequentemente relacionada com infecções em
UTIs e o diagnóstico de pneumonia nosocomial, atingindo principalmente paciente
imunossuprimidos, como relatado anteriormente(7 e 113). No que diz respeito à sepse
no Brasil, a incidência maior associa o foco original ao pulmão, seguidapelo quadro de
sepse de foco abdominal(13).
A migração de neutrófilos para o local da infecção é primordial no
desenvolvimento favorável da resposta do sistema imune inato no processo
inflamatório. Estas células são mobilizadas para o sítio de infecção por quatro etapas
distintas: marginação, rolamento, aderência e transmigração através da parede dos vasos
em direção a gradientes quimiotáticos (53).
O PPARγ é expresso em neutrófilos que quando ativado pode suprimir a
resposta efetora de leucócitos (71). Além disso, este receptor nuclear pode regular
diferentes processos em células pulmonares parenquimais, dentre eles, diferenciação
celular e apoptose (114 e115).
Alguns estudos demonstraram que o PPARγ
desempenha papel na modulação da resposta inflamatória em modelos animais de
injúria pulmonaraguda (71).Sendo assim, foi analisado o papel do receptor nuclear
PPARγ no decorrer da resposta imune em quadro infeccioso originado por dois focos
distintos, separadamente. Um estudo foi de foco pulmonar causado por Pseudomonas
aeruginosa e o segundo sobre a sepse polimicrobiana abdominal. Na indução de
infecção pulmonar pela instilação intratraqueal com Pseudomonas aeruginosa, os
camundongos foram tratados com 10 mg/kg do antibiótico imipenem por via i.p. na
tentativa de se aproximar de tratamentos por antibióticos utilizados na clínica. Com
isso, a rosiglitazona torna-se um adjuvante no tratamento das infecções analisadas neste
estudo.
Estudos foram feitos para análise da ativação deste receptor, em quadros
inflamatórios induzidos por fumo associado à resposta bacteriana exacerbada. Estes
estudoa evidenciaramque quando este receptor está ativado é capaz de reduzir a
inflamação induzida por cigarro e diminuir a magnitude das exacerbações bacterianas,
sem comprometer a capacidade do sistema imunológico para controlar a infecção (116).
Standiford e cols.(2005), observaram que o tratamento com pioglitazona, que
pertence a família da TZD, foi capaz de diminuir significativamente a inflamação
35
alveolar causada pela injuria pulmonar aguda (71). Nossos resultados mostraram uma
melhora no escore de frequência respiratória comparado com os animais não tratados,
sugerindo uma possível proteção da rosiglitazona, que é da família da TZD e agonista
do PPARγ, no quadro respiratório.
O processo de migração pode ser ativado por diferentes estímulos, como LPS
(52). Stegenga e cols.(2009) demonstraram a diminuição da migração de neutrófilos
com a administração de ciglitazona, componente da família de agonistas do receptor
PPARγ, no modelo de injúria pulmonar por Streptococcus pneumoniae (107).
Em contrapartida, observamos que nos animais tratados com rosiglitazona não
houve a diminuição da migração celularna contagem de neutrófilos, que talvez possa ser
explicado devido a injúria ser causada por outro agente infeccioso, no caso, a
Pseudomonas aeruginosa. Além disso, a expressão de IL-1 pode estar influenciando
nessa migração, ou outro mecanismo que ainda não está bem elucidado. Schultz e cols.,
(2002) utilizaram a mesma bactéria em camundongos nocaute para IL-1β, que
apresentaram migração celular diminuída em comparação ao grupo selvagem (80).
IL- 1β é um dos principais mediadores de reações inflamatórias, podendo ser
produzida por neutrófilos, além de outros tipos celulares como células mononucleares,
atuando como mediadora de inflamação local em baixas concentrações e também
elevando a expressão de moléculas de adesão que interagem com leucócitos, como por
exemplo, os ligantes de integrinas (117). Por se apresentar em maior quantidade na
infecção por Pseudomonas aeruginosa, Schultz et al., (2002) no estudo com
camundongos nocautes para IL-1β, observaram um aumento da resistência contra essa
bactéria (80).
Este dado corrobora com os resultados encontrados neste trabalho, pois houve
um aumento desta interleucina nos animais que receberam Pseudomonas aeruginosa em
comparação com o grupo tratado com rosiglitazona, sugerindo que o aumento da
interleucina está prejudicando o restabelecimento do animal e controle do processo antiinflamatório.
Além disso, quando observados os resultados do grupo de animais que
receberam o tratamento com a rosiglitazona, a citocina IL-1β está diminuída e tiveram
prognóstico positivo com melhora no quadro clínico quando observado os resultados
deste grupo tratado com o agonista do PPARγ em comparação com os inoculados
apenas com a bactéria.
36
A IL-6 é estimulada pela IL-1βe participa tanto da resposta imune inata,tendo
papel de estímulo da produção de neutrófilo, quanto da adaptativa, atuante na
diferenciação de linfócitos B em plasmócitos. É considerada uma citocina regulatória,
pois participa do processo anti e pró-inflamatório (110 e 118).Trabalhos anteriores
mostraram que a IL-6 influencia diretamente no dano causado na inflamação pulmonar,
pois está relacionada com o influxo de polimorfonucleares e formação de edema,
resultando no agravo da função pulmonar e sua deterioração (119).
Neste trabalho foi possível analisar uma diminuição desta interleucina no grupo
tratado com rosiglitazona quando comparado com o grupo não tratado e instilado com
Pseudomonas aeruginosa. É possível verificar que ocorre uma relação de proporção
direta entre a IL-1β e a IL-6, já que ambas encontram-se reduzidas no grupo tratado
com a rosiglitazona, sugerindo que o agonista ao interagir com o PPARγ é capaz de
reduzir a expressão destas citocinas e com isso diminuir o dano causado por elas.
Sugerimos também que a redução da IL-6, que está ligada com o dano da função
pulmonar, foi capaz de originar a proteção da função respiratória observada nos dados
desta dissertação.
O MCP-1/CCL2 é produzido por células imunes perante diferentes estímulos,
um desses estímulos é a IL-1β e endotoxinas, proporcionando a migração de
macrófagos para o local infeccioso.Além disso, o MCP-1/CCL2é capaz de promover
inflamação devido à ativação direta de macrófagos que são responsáveis por liberar
quimiocinas capazes de influenciar na migração de leucócitos (120).Vozzelli e cols.,
(2004) observou que o uso de anti-MCP-1/CCL2reduziu o acúmulo de macrófagos e
neutrófilosno modelo de exposição hiperoxia em pulmões de ratos recém-nascidos
(121). Por outro lado, esta proteína também tem sido alvo de longos estudos em nosso
laboratório em modelos de sepse, onde foi possível observar que animais deficientes
desta proteína tiveram maior suscetibilidade a endotoxemia, com redução nos níveis de
IL-10 (60).
Neste trabalho foi observada uma diminuição do MCP-1/CCL2 nos animais
tratados com a rosiglitazona em comparação com o grupo instilado com Pseudomonas
aeruginosa, sugerindo uma atividade anti-inflamatória do composto por se ligar ao
PPARγ resultando na diminuição da expressão de MCP-1/CCL2. Assim, a redução
deste quimioatraente pode estar ligada com a proteção da função pulmonar.
Estes dados relacionados à produção de citocinas indicam que a rosiglitazona ao
interagir com o receptor nuclear PPARγ pode ter papel relevante na modulação da
37
inflamação, tendo atividade anti-inflamatória, proporcionando a resolução da
inflamação, proteção da função pulmonar e melhora do quadro clínico dos animais.
Logo após a análise das citocinas, foi verificada a formação de redes
extracelulares de neutrófilos.
Os neutrófilos possuem um mecanismo de morte celular denominado NETose,
no qual ocorre o extravasamento do conteúdo celular, composto de DNA e proteínas,
para o meio extracelular formando redes capazes de prender e eliminar patógenos (26 e
67).
Sabe-se que estas redes são formadas a partir da morte destas células de defesa,
pois ocorre o extravasamento do material nuclear (67). Estudos in vitro indicaram que a
rosiglitazona é capaz de induzir NET, em células que receberam o estímulo por LPS e
E. coli mostrando a potencialização da formação de NET e a eliminação bacteriana
induzida pela rosiglitazona (29, 52e100). Nesta dissertação, observamos um aumento da
quantidade de DNA extracelular nos grupos estimulados com a bactéria, indicando que
o organismo estava respondendo a injúria causada pelo processo infeccioso.
Embora não evidenciando diferença na celularidade, ocorreu um aumento do
material nuclear no meio extracelular em amostra do BAL dos camundongos tratados
com rosiglitazona em comparação com o grupo da injúria pulmonar sem o tratamento.
Este dado sugere que a rosiglitazona é capaz de acentuar o fenômeno da formação de
NET. Acreditamos que os neutrófilos que estão sendo estimulados para formar a NET
ao interagir com a rosiglitazona têm seu efeito amplificado, influenciando na morte do
agente patogênico ao impedir sua proliferação.
No que tange o efeito microbicida da NET foi feita a contagem das UFCs das
amostras do BAL. Estudo feito por Stegenga e cols. (2009), analisa a eliminação
bacteriana no tratamento com ciglitazona em modelo de pneumonia induzido por outra
cepa bacteriana. No entanto, o estudo do Stegenga não descreve o mecanismo pelo qual
ocorre a maior eliminação bacteriana na presença da ciglitazona (107).
Como dito anteriormente, a rosiglitazona é um agonista do PPARγ capaz de
induzir NET que por sua vez pode ser responsável pela eliminação bacteriana (29, 52e
100).Nós observamos uma redução das UFCs nas amostras tratadas com rosiglitazona,
sugerindo que a NET produzida através deste composto foi capaz de controlar a
multiplicação bacteriana devido a eliminação da mesma e contenção da infecção
pulmonar, explicando a melhora no escore clínico dos animais tratados.
38
Vale ressaltarque,a modulação da rosiglitazona frente à resposta dos
camundongos num quadro infeccioso originado por Pseudomonasaeruginosa é um
indício da ativação do receptor nuclear PPARγ, uma vez que a rosiglitazona atua como
agonista seletivo deste receptor.
Estudos mostraram que a ativação do PPARγ pode reduzir a liberação de
citocinas pró-inflamatórias e que a rosiglitazona por ser o agonista deste receptor,
auxilia na modulação de respostas inflamatórias e na diminuição da injúria tecidual,
indicando que a capacidade de resposta do hospedeiro para combater a infecção é
melhor na presença do agonista (68).
Os efeitos descritos no parágrafo anterior não foram observados em
camundongos tratados com o GW9662, que é o antagonista do receptor PPARγ.
Estudos feitos no nosso laboratório verificaram que nos animais submetidos à CLP
tratados com GW9662 e rosiglitazona, houve uma reversão da proteção conferida pelo
agonista, sugerindo um efeito dependente de PPARγ na ligação com rosiglitazona (52).
Como visto anteriormente, a sepse é uma das maiores causas de mortalidade
devido à indução da disfunção múltipla de órgãos, sendo assim, os modelos
experimentais de sepse em animais em laboratório, mesmo com suas limitações, são
amplamente utilizados por reproduzir as características, semelhantes deste quadro e a
relevância de tais modelos se encontra no desenvolvimento de novas terapias no
tratamento da sepse e choque séptico (96).
Além da análise da capacidade da rosiglitazona de modular a inflamação, nós
mostramos que este agonista de PPARγ aumenta a eliminação das bactérias na sepse
polimicrobiana. A caracterização da formação das redes extracelulares seria um
mecanismo pelo qual o agonista de PPARγ exerceria o seu efeito.
A NET é capaz de auxiliar na eliminação bacteriana (26 e 67). Nossos resultados
demonstraram que na sepse abdominal o tratamento com DNAse ocasiona um aumento
na contagem de UFC. Tendo em vista que a DNAse degrada o DNA, a presença deste
composto no grupo tratado com rosiglitazona reverte a eliminação bacteriana
proporcionada pela interação do fármaco com o receptor nuclear, reforçando o aumento
da capacidade de eliminação do patógeno no mecanismo dependente de NET através da
interação do agonista com o PPARγ.
Os dados deste trabalho sugerem que o efeito da rosiglitazona é dependente da
sua ligação com o receptor nuclear PPARγ, e que esta interação revela efeito antiinflamatório desta droga, com isso sugerindo que a diminuição da produção de
39
citocinas, pode resultar na proteção da função pulmonar visualizado na frequência
respiratória, melhora no escore clínico e aumento da eliminação bacteriana.
Recentemente observou-se que a família do PPAR, além de promover a
transcrição gênica do metabolismo lipídico e homeostase, também é capaz de modular a
fosforilação de MAP kinase, sugerindo que essa via pode mediar alguns efeitos do
PPAR, contribuindo para seus efeitos farmacológicos (122 e 123). O PPARγ
demonstrou atividade sobre a MAP kinase na síntese de proteína. Um dos mecanismos
pelos quais o receptor de PPARγ regula a resposta imune na presença do estímulo
bacteriano e é regulado poderia envolver a ativação das MAP kinases (100, 122, 124 e
125).
Por fim, a probabilidade do receptor nuclear PPARγ ser o responsável por essa
modulação o faz candidato a um novo alvo terapêutico para doenças infecciosas em
infecções pulmonares, onde um dos principais agentes etiológicos é a Pseudomonas
aeruginosa, e em sepse abdominal no modelo polimicrobiano, o que torna este estudo
relevante para o ambiente hospitalar.
40
6. Conclusões

A injeção intratraqueal de Pseudomonas aeruginosa induziu sinais
clínicos de pneumonia e alterações inflamatórias como acúmulo de leucócitos.

A frequência respiratória foi preservada e houve diminuição dos sinais
clínicos em animais submetidos à instilação com Pseudomonasaeruginosa e
tratados com rosiglitazona.

A administração da rosiglitazona inibiu significativamente a produção da
IL-1β, IL-6 e MCP-1/CCL2induzida pela infecção com Pseudomonas aeruginosa.

A rosiglitazona foi capaz de aumentar a concentração de DNA sugerindo
um aumento da formação de NET e foi capaz de suprimir o crescimento bacteriano
durante a infecção por Pseudomonas aeruginosa e na sepse polimicrobiana.

O efeito protetor da rosiglitazona é dependente de NET, pois em animais
tratados com DNAse houve diminuição da eliminação bacteriana.
v
Figura 6.1. Rosiglitazona interage com o PPARγ proporcionando a modulação da produção de
citocinas e a eliminação bacteriana através da NETose. Rosiglitazona se liga do PPARγ, resultando na
eliminação bacteriana dependente de NET, modulando a inflamação através da diminuição da expressão
de citocinas pró-inflamatórias.
41
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