influência do estresse agudo de restrição sobre processo

INFLUÊNCIA DO ESTRESSE AGUDO
DE RESTRIÇÃO SOBRE PROCESSO
INFLAMATÓRIO INDUZIDO
PELA CARRAGENINA
estudos, Goiânia, v. 34, n.11/12, p. 919-929, nov./dez. 2007.
ROBERTA BRISTOT SILVESTRIN, KARIN KIELING, GIOVANA
DUZZO GAMARO, EDNA SAYURI SUYENAGA, PATRÍCIA
ARDENGHI
Resumo: o estresse é um fator ambiental que altera respostas fisiológicas envolvendo a liberação de corticóides e
catecolaminas. Os glicocorticóides afetam o sistema imune.
O objetivo deste trabalho é avaliar o efeito do estresse agudo
sobre o processo inflamatório em ratos estressados submetidos
à 2h de restrição e controles. Após o estresse, foi realizado o
modelo de pleurisia induzida pela carragenina. Os resultados
demonstraram diferença nos leucócitos totais antes e depois da
pleurisia apenas no grupo controle. Na contagem diferencial
de leucócitos circulantes, foram encontradas diferenças no
percentual de linfócitos e neutrófilos entre os grupos antes da
indução do processo inflamatório. No exsudato pleural não
foram encontradas diferenças no total de leucócitos e na análise nas células polimorfo e mononucleares em ambos os grupos. Os resultados sugerem que no estresse agudo, após imediata
realização da pleurisia ocorrem alterações imunológicas que
parecem não influenciar o processo inflamatório agudo.
Palavras-chave: imunomodulação, inflamação, pleurisia,
estresse agudo, restrição
O
desenvolvimento tecnológico com a instalação de
indústrias, que podem atuar como fonte local de
poluentes, além do aumento na urbanização gera
um crescimento sem planejamento acarretando na deterio-
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ração do ambiente (SANTOS, 1981; LOMBARDO, 1985;
RIGOTTO, 2003).
A qualidade do meio ambiente constitui fator determinante para
o alcance de uma melhor qualidade de vida através de padrões de
qualidade ambiental (GOMES & SOARES, 2004). Os padrões de
qualidade ambiental variam entre a cidade e o campo, entre cidades
de diferentes países ou de um mesmo país, assim como em diferentes áreas de uma mesma cidade (MACHADO, 1997). Da mesma
forma no ambiente de trabalho, novas tecnologias e novas relações
de trabalho trazem novos valores, novos hábitos e introduzem novos riscos tecnológicos, de natureza física, química , biológica,
mecânica, ergonômica e psíquica (RIGOTTO, 2003).
Estudos têm relacionado o impacto das alterações ambientais
sobre a saúde. Em um estudo a OMS calculou o peso dos fatores
ambientais na carga mundial de doenças, com base no índice AVAI
– anos de vida ajustados em função da incapacidade. Assim, demonstrou que 23% da carga total mundial de AVAI está associada
a fatores ambientais, chegando a 90% nas doenças diarréicas e na
malária, 60% nas infecções respiratórias agudas, 50% nas doenças respiratórias crônicas, 30% nas lesões não-intencionais, 25%
no caso do câncer e 10 % nas doenças cardiovasculares, assim como
nos agravos de saúde mental. Estes dados demonstram que existe
relação entre saúde-ambiente na sociedade contemporânea (OPS,
2000). Somando-se a isso devem ser consideradas questões como
estilo de vida, o hábito de fumar ou o consumo de drogas, o estresse
e o padrão alimentar como fatores ambientais relacionados à gênese das doenças (RIGOTTO, 2003).
O estresse é um fator ambiental que pode ser representado
como uma variedade de eventos que resultam na ativação de sistemas fisiológicos específicos visando à restauração da homeostase
do organismo (HARBUZ & LIGHTMAN, 1992; HERMAN &
CULLINAN, 1997). As respostas ao estresse incluem a ativação
do sistema nervoso autônomo (SNA) e do eixo hipotálamohipófise-adrenal (HHA), a qual acarreta, respectivamente, a secreção de catecolaminas e a liberação de glicocorticóides pelo
córtex adrenal (HARBUZ & LIGHTMAN, 1992; HERMAN &
CULLINAN, 1997). O aumento sérico dos glicocorticóides pode
desencadear alterações biológicas importantes para o organismo,
incluindo o desenvolvimento de algumas disfunções psicológicas
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como depressão, ansiedade ou estresse pós-traumático, além de
algumas doenças sistêmicas como doenças inflamatórias, metabólicas e auto-imunes (McEWEN et al., 1997; ANDERSSON et
al., 2000; BOSCH et al., 2003; WINDLE et al., 2001). Dados da
literatura demonstram que a ativação crônica ou transitória do eixo
HHA e do SNA podem alterar tanto a capacidade funcional quanto o padrão migratório das células do sistema imune (ENGLER,
2004; DHABHAR & McEWEN, 1997; STEFABSKI, 2001).
Existem evidências da modulação da resposta imunológica via
receptores específicos para hormônios e neurotransmissores envolvidos neste processo (DHABHAR & McEWEN, 1997;
STEFABSKI, 2001).
Estudos prévios demonstram que o estresse pode causar
imunomodulação dependendo das características do agente
estressor, levando em conta intensidade, tipo (fisiológico, psicológico) e tempo de exposição (agudo ou crônico) (BAUER et al.,
2001b; GAMARO, 1998). Dados da literatura têm demonstrado
que a exposição aguda ao agente estressor produz uma redução no
número e no percentual de linfócitos e monócitos, e um aumento
no número de neutrófilos (BAUER et al., 2001a,b).
A resposta ao estresse é resultado da interação entre as características individuais e as demandas do meio, ou seja, as discrepâncias entre o meio externo e interno e a percepção do indivíduo
quanto à capacidade de resposta. Esta resposta ao estressor compreende aspectos cognitivos, comportamentais e fisiológicos visando a propiciar uma melhor percepção da situação e de suas
demandas, assim como um processamento mais rápido da informação disponível, possibilitando uma busca de soluções, selecionando condutas adequadas e preparando o organismo para agir
de maneira rápida e vigorosa. As situações ambientais podem ser
provocadoras de estresse e agrupadas como: acontecimentos vitais (life events), acontecimentos diários menores e situações de
tensão crônica (MARGIS et al., 2003). Modelos animais são de
grande importância para avaliar os efeitos do estresse sobre os organismos. O modelo de estresse de restrição está relacionado com
alterações em diversos parâmetros neuroendócrinos, incluindo a
liberação catecolaminérgica pelo sistema nervoso autônomo e a
ativação do eixo HHA resultando na secreção aumentada de
glicocorticóides (BAUER et al., 2001b; GAMARO et al., 1999).
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Levando em conta o exposto acima, o presente trabalho tem
por objetivo verificar a relação entre a exposição a um estresse
agudo de restrição e o processo inflamatório agudo, induzido pela
carragenina em ratos.
Foram utilizados ratos Wistar machos adultos com 3 meses
de idade e peso entre 250-330g, obtidos do Biotério do Centro
Universitário FEEVALE. Os animais foram divididos em dois
grupos (6 animais por grupo): controles (não submetidos ao
estresse) e estressados. Os animais do grupo estressado foram
submetidos a uma única sessão de estresse de restrição. Os animais foram mantidos por 2h em cilindros plásticos de diâmetro
regulável, com abertura para ventilação respiratória, o que lhes
restringia os movimentos (GAMARO, 1998; GAMARO et al.,
1999). A aplicação do estresse foi pelo período da manhã. Após o
término da sessão de estresse os animais os animais foram subdivididos em dois grupos: 0h e 24h levando em conta o tempo em
que seriam expostos ao modelo de pleurisia, imediatamente (0h)
ou 24h após a sessão de estresse (24h).
Os animais foram previamente anestesiados com éter-etílico
e submetidos à coleta de sangue venoso periférico a partir da cauda, gerando a confecção de câmaras de Newbauer e esfregaços
sanguíneos, para contagem de leucócitos total e diferencial, respectivamente para obtenção da amostra antes do processo inflamatório. Logo após, os animais foram operados e receberam 0,1
mL de suspensão 1mg/mL de carragenina em solução salina
(cloreto de sódio a 0,9%) diretamente na cavidade pleural e
retornaram às caixas, onde permaneceram por 4 h, para desenvolvimento da inflamação pleural, segundo técnica descrita por
Spector (SPECTOR, 1956). Após este período, os animais foram
reanestesiados para coleta do sangue periférico da cauda e do
exsudato pleural para a determinação do número de células
circulantes e do exsudato após o processo inflamatório. Os dados
foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM) e
analisados pelo teste t de Student.
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MATERIAIS E MÉTODOS
RESULTADOS
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Na Figura 1 observa-se que o grupo controle apresentou diferenças significativas em relação ao número de leucócitos totais após a
indução do processo inflamatório (teste t student p < 0,05). O mesmo
efeito é observado em relação ao número de linfócitos e neutrófilos
como demonstrado nas figuras 2 e 3 (teste t student p < 0,05).
Figura 1. Efeito do estresse agudo de restrição sobre o número de leucócitos periféricos
totais avaliados antes e depois da indução do processo inflamatório.
** diferença significativa entre a contagem de leucócitos antes e depois da
indução da pleurisia (teste t de Student, p<0,05). Leucócitos totais (a):
Número total de leucócitos antes da indução do processo inflamatório;
Leucócitos totais (d): Número total de leucócitos depois da indução do
processo inflamatório
Nestes animais houve um aumento de leucócitos totais e
neutrófilos (teste t student p < 0,05) acompanhados por uma diminuição no número de linfócitos (teste t student t p < 0,05). Nos
animais submetidos à pleurisia imediatamente após o estresse (0h)
apresentaram aumento no número de neutrófilos no sangue periférico (t student p < 0,05) embora seus níveis já estivessem aumentados em relação aos controles antes da indução da inflamação
(Figura 3). Este mesmo grupo de animais apresentou um padrão
diferenciado na avaliação do número total de linfócitos, não demonstrando diferenças na contagem destas células antes e depois
do processo inflamatório além de uma contagem reduzida em
relação ao grupo controle, quando comparado antes da indução da
inflamação (t student p > 0,05) (Figura 2).
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Figura 3. Efeito do estresse agudo de restrição sobre o número de neutrófilos periféricos
avaliados antes e depois da indução do processo inflamatório. ** diferença
significativa entre a contagem de neutrófilos antes e depois da indução da
pleurisia (teste t de Student, p<0,05). a diferença significativa entre a contagem
de neutrófilos periféricos antes da indução do processo inflamatório entre os
grupos controle e agudo 0 h (teste t de Student, p<0,05). Neutrófilos (a):
Número de neutrófilos antes da indução do processo inflamatório; Neutrófilos
(d): Número de neutrófilos depois da indução do processo inflamatório
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Os animais estressados e submetidos ao evento inflamatório
24h após o estresse apresentaram um padrão de contagens celulares similares aos animais do grupo controle no que se refere aos
neutrófilos e linfócitos (Figuras 2 e 3). Analisando o número total
de leucócitos na figura 1 os grupos submetidos ao estresse agudo
e ao processo inflamatório imediatamente ou 24h após o estresse
(0h e 24h) apresentaram um padrão geral muito semelhante ao
grupo controle, embora não tenha sido observada diferença significativa antes e depois da inflamação (t student p > 0,05). Em
relação ao padrão celular encontrado na cavidade pleural após 4h
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Figura 2. Efeito do estresse agudo de restrição sobre o número de linfócitos periféricos
avaliados antes e depois da indução do processo inflamatório. ** diferença
significativa entre a contagem de linfócitos antes e depois da indução da
pleurisia (teste t de Student, p<0,05). b diferença significativa entre a contagem
de linfócitos periféricos antes da indução do processo inflamatório entre os
grupos controle e agudo 0 h (teste t de Student, p<0,05). Linfócitos (a): Número
de linfócitos antes da indução do processo inflamatório; Linfócitos (d):
Número de linfócitos depois da indução do processo inflamatório
da injeção de carragenina não foram encontradas diferenças entre
os grupos estressados e o grupo controle, sugerindo que a migração leucocitária para o sítio da inflamação parece não sofrer influência do estresse agudo de restrição (Figura 4).
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Figura 4. Efeito do estresse agudo de restrição sobre o exsudato pleural coletado da
cavidade pulmonar após 4h da injeção de carragenina. Não houve diferença
significativa entre os grupos (teste t de Student, p>0,05). Exsudato: Número
total de células do exsudato dos diferentes grupos avaliados; PMN: Número
de células polimorfonucleares encontradas no exsudato dos diferentes grupos
testados; MN: Número de células mononucleares encontradas no exsudato
dos diferentes grupos testados.
DISCUSSÃO
Diversas pesquisas realizadas nas últimas décadas têm sugerido que o estresse pode ser um fator de predisposição para o
desenvolvimento de várias doenças (McEWEN et al., 1997;
ANDERSSON et al., 2000). As alterações imunológicas induzidas
pelo estresse têm sido consideradas como uma das causas do risco
aumentado de doenças como câncer, doenças auto-imunes e infecções (BOSCH et al., 2003; WINDLE et al., 2001 ) vinculadas
com alterações ambientais as alterações fisiológicas em resposta
ao estresse são desencadeadas pela ativação do eixo HHA e sistema nervoso autônomo via liberação de hormônios corticosteróides
e catecolaminas para auxiliar nos mecanismos de adaptação do
organismo ao estresse, inclusive na modulação do sistema
imunológico (HARBUZ & LIGHTMAN, 1992 ).
Para examinar a influência do estresse sobre o sistema
imunológico de ratos foi utilizado nesse trabalho, o modelo de
estresse de restrição associado à técnica de indução de pleurisia
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pela carragenina. Dados da literatura demonstraram que este tipo
de estresse causa elevação dos níveis séricos de corticosterona nos
animais estressados, imediatamente após a exposição ao estresse
(GAMARO, 1998).
Após a indução do processo inflamatório o grupo controle
apresentou diferenças significativas em relação ao número de
leucócitos totais, linfócitos e neutrófilos, quando comparados às
medidas realizadas antes da indução de inflamação aguda por
carragenina. Nestes animais houve um aumento de leucócitos totais
e neutrófilos (p<0,05) acompanhados por uma diminuição no
número de linfócitos (p<0,05) (Figs. 1, 2 e 3). Este fenômeno de
inflamação aguda envolve hiperemia, estase e aumento na
permeabilidade vascular com formação de edema. Neste modelo
de pleurisia, o maior evento do desenvolvimento da resposta inflamatória é caracterizado pelo rápido influxo de leucócitos
polimorfonucleares (PMNs) para a cavidade pleural. A migração
de PMNs do compartimento vascular para o tecido inflamado
ocorre após sua mobilização da circulação periférica, adesão ao
endotélio próximo ao sítio da inflamação e posterior migração
destas células para o tecido inflamado (SUYENAGA et al., 2002).
Os animais submetidos à pleurisia imediatamente após o
estresse (0h) apresentaram aumento no número de neutrófilos no
sangue periférico (p<0,05) embora os níveis já estivessem aumentados antes da indução da inflamação em comparação aos controles (Fig. 3). Este dado corrobora com trabalhos prévios que
demonstram rápida mobilização de neutrófilos frente a eventos
estressores agudos (BAUER et al., 2001b).
No mesmo grupo de animais foi observado um padrão diferenciado na avaliação do número total de linfócitos, não houve diferença
na contagem destas células antes e depois do processo inflamatório.
O número de linfócitos é reduzido em relação ao grupo controle antes
da indução da inflamação (p<0,05) (Fig. 2). Este tipo de resposta está
de acordo com dados da literatura que demonstram o efeito do estresse
agudo na redução da proliferação linfocitária no sangue periférico.
Estes efeitos podem ser prevenidos por adrenalectomia, demonstrando que os fatores adrenais são parcialmente responsáveis por esta
imunossupressão (BAUER et al., 2001a).
Neste trabalho observamos ainda, que os animais estressados
e submetidos ao evento inflamatório 24 h após a sessão de estresse
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apresentaram um padrão de contagens celulares similares aos animais do grupo controle no que se refere aos neutrófilos e linfócitos
(Fig. 2 e 3). Em relação ao número total de leucócitos (Fig. 1) os
animais dos grupos estressados submetidos ao processo inflamatório imediatamente ou 24h após a sessão de estresse (0h e 24h) apresentaram um padrão geral semelhante ao grupo controle, embora
não tenha sido observada significância estatística antes e depois da
inflamação. No que se refere ao padrão celular encontrado na cavidade pleural após 4h da injeção de carragenina não foram encontradas diferenças entre os grupos estressados e o grupo controle,
sugerindo que a migração leucocitária para o sítio da inflamação
parece não ser afetada pelo estresse agudo de restrição (Fig. 4).
De acordo com os resultados obtidos nesse trabalho podemos
sugerir que o estresse agudo de restrição pode causar alterações
na distribuição periférica das células do sistema imune no que se
refere aos animais submetidos ao processo inflamatório imediatamente após o evento estressor. Os resultados encontrados indicam
que estas alterações parecem não afetar a resposta imunológica
específica avaliada através das contagens celulares do exsudato
pleural após a pleurisia.
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Abstract: stress is an environmental factor that activates corticoid
and cathecolamines release. The glucocorticoid affects the immune
system. This paper aims to evaluate the effects of acute stress and
inflammation in rats submitted to 2h of restraint stress and control.
After stress, the carragenin induced pleurisy model was performed.
Results show that there was a difference on total leukocyte before and
after carragenin administration in both stressed and control group.
Concerning the differential leukocyte count, differences were found
between the two groups in respect of % of lymphocytes and neutrophils
before the inflammatory process induction. In both groups, there were
no differences related to the total of leukocytes in the pleural exsudate,
as well as in the analysis of mono and polimorphonucleated cells.
The data suggest that, in acute stress followed by immediate pleurisy
induction there are specific immunologic alterations demonstrated
by the alteration of the peripheral blood cell, but it does not seem to
influence the inflammatory process immediately.
Key words: immunomodulation, inflammation, pleurisy, acute
stress, restraint
ROBERTA BRISTOT SILVESTRIN
Departamento de Bioquímica - ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
KARIN KIELING
Departamento de Patologia (VPT), Universidade São Paulo.
GIOVANA DUZZO GAMARO
Instituto de Ciências da Saúde, Centro Universitário Feevale.
EDNA SAYURI SUYENAGA
Instituto de Ciências da Saúde, Centro Universitário Feevale.
PATRÍCIA ARDENGHI
Instituto de Ciências da Saúde, Centro Universitário Feevale.
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