de dissertação em pdf - Pós

Universidade Federal da Bahia
Escola de Medicina Veterinária
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
SOROEPIDEMIOLOGIA E CARACTERIZAÇÃO DO
VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA DAS GALINHAS
EM FRANGOS DE CORTE E AVES DE FUNDO DE
QUINTAL NA REGIÃO DE FEIRA DE SANTANA, BAHIA,
BRASIL
Elen Fabiane Guimarães Herval
Salvador-Bahia
2011
ELEN FABIANE GUIMARÃES HERVAL
SOROEPIDEMIOLOGIA E CARACTERIZAÇÃO DO
VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA DAS
GALINHAS EM FRANGOS DE CORTE E AVES DE
FUNDO DE QUINTAL NA REGIÃO DE FEIRA DE
SANTANA, BAHIA, BRASIL
Dissertação apresentada à Escola de
Medicina Veterinária da Universidade
Federal da Bahia, como requisito para a
obtenção do título de Mestre em Ciência
Animal nos Trópicos, na área de Saúde
Animal.
Orientador: Prof. Dr. Lia Muniz Barretto Fernandes
Salvador – Bahia
2011
Sistema de Bibliotecas - UFBA
Herval, Elen Fabiane Guimarães.
Soroepidemiologia e caracterização do vírus da bronquite infecciosa das galinhas em frangos
de corte e aves de fundo de quintal na região de Feira de Santana, Bahia, Brasil / Elen Fabiane
Guimarães Herval. - 2011.
85 f. : il.
Orientadora: Profª Drª Lia Muniz Barretto Fernandes.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Salvador, 2011.
1. Galinha - Doenças. 2. Frango de corte - Doenças. 3. Bronquite infecciosa em ave
doméstica. 4. Vírus. 5. Teste imunoenzimático. I. Fernandes, Lia Muniz Barretto.
II. Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia. III. Título.
CDD - 636.5089
CDU - 636.5.09
SOROEPIDEMIOLOGIA E CARACTERIZAÇÃO DO VÍRUS DA BRONQUITE
INFECCIOSA DAS GALINHAS EM FRANGOS DE CORTE E AVES DE
FUNDO DE QUINTAL NA REGIÃO DE FEIRA DE SANTANA, BAHIA,
BRASIL
ELEN FABIANE GUIMARÃES HERVAL
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência
Animal nos Trópicos.
Salvador, 11 de julho de 2011.
Comissão Examinadora:
_______________________________________
Profa. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes
Orientadora
Profa. Dra. Vera Lúcia Costa Vale
Prof. Dr. Robson Bahia Cerqueira
Aos meus pais, pelo incentivo e
por terem me mostrado o
caminho.
AGRADECIMENTOS
Agradeço Àquele que esteve à minha frente em todos os momentos da minha vida,
amparando-me nas horas mais difíceis, mesmo quando não o percebia. Deus, tu sabes o
quanto sou grata, por tudo o que tens feito por mim. Agradeço pela liberdade de pensar,
querer e optar que me destes. Ao teu lado, sei que nunca estarei só.
A toda a minha família, minha base essencial. Em especial, agradeço a minha mãe por
ter sido o exemplo direto de como viver com alegria, mesmo diante de adversidades.
Em um momento difícil, este ensinamento foi o meu alimento. Meu eterno amor, sei
que, assim como meu irmão Du, “aí de cima” está imensamente orgulhosa da pessoa
que tenho me tornado e das minhas conquistas.
Ao meu pai, pelos ensinamentos e por ter sido meu maior estímulo à busca dos meus
objetivos, de maneira honesta e sensata.
A todos os meus irmãos, principalmente ao meu amado Júlio, pelo incentivo constante,
companheirismo e por mostrar que é preciso crescer e continuar.
A minha segunda família, Geovana, Jordana, Stenio e Marina, por muito que fizeram e
por terem confirmado que o amor é a ponte entre vidas que se encontram.
À Lia Fernandes, pelo exemplo de determinação e competência em alcançar objetivos
de maneira ética. Obrigada pela orientação deste trabalho, paciência e por momentos
maravilhosos em que pudemos desfrutar de nossa amizade. Por tudo que fez pela minha
formação, contribuindo para meu aprimoramento profissional e pessoal, sou-lhe grata.
Aos meus amados amigos, pelos muitos telefonemas, abraços e outras demonstrações de
carinho, que serviram de suprimento para iniciar e concluir esta etapa. Laura Nunes,
Paulo Andrade, Tatiane Sales, Leane Gondim, Gisele Carvalho, Adriana Oliveira,
Roberto Borges, André Rocha, Úrsula Chagas, Solange Veras. Não sei como mensurar
o quanto cada palavra proferida por vocês serviu de conforto espiritual e emocional para
mim.
Muitíssimo obrigada, a todos aqueles que, embora não citados, foram peças
fundamentais neste caminhar.
Aos bons momentos compartilhados com as equipes que atuaram no LASABLaboratório de Sanidade Avícola, enquanto estive presente no mesmo.
Ao GESAV – Grupo de Educação em Sanidade Avícola, onde pude exercitar cidadania
através de atividades lúdicas e da troca de experiências com aqueles que acredito serem
as peças principais em um processo de ligação essencial entre as unidades de fomento à
pesquisa e o campo, os agricultores familiares. Ter feito parte e convivido com tantas
pessoas que acreditam nesse projeto foi uma das experiências mais preciosas que obtive.
Meu sincero agradecimento a minha amiga, Suziane Cristina, por ter me acolhido e
apoiado em muitos momentos vividos paralelamente a esta jornada. Com licença, mas
seu lar foi meu QG (quartel general) de inspiração, por diversas vezes.
A todos os mestres, doutores e funcionários da Escola de Medicina Veterinária da
Universidade Federal da Bahia, com os quais convivi durante os anos de academia e que
se tornaram exemplos de dedicação à arte do saber e de compartilhar ideias.
Ao Colegiado de Pós-Graduação da Escola de Medicina Veterinária da Universidade
Federal da Bahia.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de mestrado.
Esta é apenas uma parte resultante da reação em cadeia de amor em que vivo,
diariamente.
“Para ser grande, sê inteiro: nada teu
exagera ou exclui. Sê todo em cada
coisa. Põe quanto és no mínimo que
fazes.”
(Fernando Pessoa)
ÍNDICE
página
LISTA DE TABELAS ............................................................................................
x
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................
xi
LISTA DE ABREVIATURAS ...............................................................................
RESUMO ................................................................................................................
SUMMARY.............................................................................................................
xii
xiii
xiv
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 15
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................
2.1 Definição ..........................................................................................................
2.2 Histórico e distribuição geográfica.....................................................................
2.3 Importância econômica......................................................................................
2.4 Classificação ......................................................................................................
2.4.1 Características estruturais................................................................................
2.4.2 Classificação de estirpes..................................................................................
2.4.2.1 Sorotipos ......................................................................................................
2.4.2.2 Genotipos......................................................................................................
2.4.2.3 Patotipos.......................................................................................................
2.4.2.5 Protectotipo..................................................................................................
2.5 Replicação..........................................................................................................
2.6 Epidemiologia....................................................................................................
2.6.1 Espécies susceptíveis.......................................................................................
2.6.2 Transmissão ....................................................................................................
2.6.3 Patogenia ........................................................................................................
2.6.4 Sinais clínicos.................................................................................................
2.6.5 Lesões anatomopatológicas e microscópicas..................................................
2.7 Imunologia.........................................................................................................
2.8 Diagnóstico.........................................................................................................
2.8.1 Diagnóstico clínico..........................................................................................
2.8.2 Diagnóstico sorológico....................................................................................
2.8.3 Isolamento viral...............................................................................................
2.8.4 Diagnóstico direto...........................................................................................
2.8.4.1 Diagnóstico molecular..................................................................................
2.9 Prevenção e controle..........................................................................................
17
17
17
19
19
19
21
21
22
23
23
24
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26
26
27
28
30
31
31
33
33
35
36
3 OBJETIVOS.......................................................................................................... 40
3.1 Objetivo geral..................................................................................................... 40
3.2 Objetivos específicos.......................................................................................... 40
4 ARTIGO CIENTÍFICO......................................................................................... 41
4.1 Artigo I............................................................................................................... 41
4.2 Artigo II ............................................................................................................. 53
5 CONSIDERAÇÕES GERAIS..............................................................................
67
6 REFERÊNCIAIS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 68
LISTA DE TABELAS
página
Artigo I
Detecção de anticorpos contra o vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas em
frangos de corte e aves de fundo de quintal na região de Feira de Santana, Bahia,
Brasil
TABELA 1 - Frequência de anticorpos anti-Bronquite Infecciosa das Galinhas,
coeficiente de variação de título em lotes de aves de propriedades com sistemas de
criação de frangos de corte e de aves de fundo de quintal do pólo avícola do estado da
Bahia, de junho de 2005 a dezembro de 2007.............................................................. 46
Artigo II
Caracterização do vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas em frangos de corte
e aves de fundo de quintal na região de Feira de Santana, Bahia, Brasil
TABELA 1 - Distribuição sorológica e caracterização molecular de lotes de frango de
corte e de aves de quintal vizinhas, avaliados em municípios do pólo avícola da Bahia,
entre junho de abril de 2008 a março de 2009.................................................................59
LISTA DE FIGURAS
página
REVISÃO DE LITERATURA
FIGURA 1 - Organização do gene do VBI (Adaptado de CAVANAGH, 2005)......... 21
ARTIGO I
Detecção de anticorpos contra o vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas em
frangos de corte e aves de fundo de quintal na região de Feira de Santana, Bahia,
Brasil
FIGURA 1 - Mediana dos títulos de anticorpos IgG para BIG em frangos de corte (A) e
em aves de fundo de quintal (B). Os dados são expressos na forma de títulos obtidos a
partir de DO 650nm. A mediana é mostrada como o topo da barra vertical para cada
conjunto de dados. A diferença entre o grupo A é de 0,0007 e grupo B de p=0,0001 por
Mann-Withney test........................................................................................................ 48
LISTA DE ABREVIATURAS
BIG – Bronquite Infecciosa das Galinhas
VBIG – Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas
Kb – Quilobase
pb - pares de bases
nm - nanômetro
DNA - Ácido desoxirribonucleico
RNA - Ácido ribonucleico
mAbs - anticorpos monoclonais
EUA - Estados Unidos da América
AGPT - teste de precipitação em Ágar-Gel
IH- Teste da inibição da hemaglutinação
SN - Soroneutralização
ELISA - Ensaio de imunoadsorção enzimática
SPF - ave livre de patógeno específico
TOC - cultura de órgão traqueal de embriões de galinhas
VN - vírus neutralização
IFD - Imunofluorescência direta
PCR - Reação em cadeia da polimerase
RT-PCR - Transcriptase Reversa através de Reação em Cadeia da Polimerase
RFLP - polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição
pb - pares de bases
mm - milímetro
HERVAL EFG. Soroepidemiologia e caracterização do vírus da bronquite infecciosa
das galinhas em frangos de corte e aves de fundo de quintal na região de Feira de
Santana, Bahia, Brasil. Salvador, Bahia, 2011. 85p. Dissertação (Mestrado em Medicina
Veterinária Tropical) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia,
2011.
RESUMO
A Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG) é uma enfermidade altamente contagiosa,
causada por um Coronavírus que gera impacto econômico negativo sobre o setor
avícola mundial. Amostras de soro de frangos de corte em idade de abate com (FCcR) e
sem problemas respiratórios (FCsR) e de aves de fundo de quintal de quatro meses a
três anos de idade com (AFQcR) e sem problemas respiratórios (AFQsR), oriundas do
pólo avícola da Bahia, foram analisadas por meio de ELISA indireto para titulação de
anticorpos contra o Vírus da Bronquite Aviária (VBIG) e sua detecção molecular
através de RT-PCR e nested-PCR. A freqüência de aves com títulos de anticorpos
contra VBIG em FCcR, FCsR, AFQcR e AFQsR foram, respectivamente, 70,45%,
69,96%, 86,11% e 85,51%. Os lotes de aves vacinadas contra VBIG dos grupos FCcR e
FCsR
apresentaram
uma
grande
variação
nos
títulos
sorológicos
estando,
respectivamente, 80,95% e 70,73% das amostras acima da faixa de coeficiente de
variação (CV) de 60%. Esse padrão irregular da resposta imune provavelmente esta
relacionado à variação individual, falhas na aplicação da vacinação e possivelmente a
infecção com vírus de campo. A alta freqüência de reações sorológicas positivas em
AFQ, não vacinadas, indica elevada endemia do VBIG nesse sistema de produção. Foi
identificado o sorotipo Massachusetts, H120, em cinco propriedades de FC e em 2
propriedades de AFQ. Esses dados sugerem que as aves de fundo de quintal podem ser
reservatórios desse vírus, constituindo risco de infecção para a criação comercial de
galinhas. Outros estudos devem ser realizados no sentido de melhor conhecer a
circulação do agente em aves de fundo quintal, uma vez que este foi o pioneiro no
Estado da Bahia.
Palavras-chave: Bronquite Infecciosa, ELISA, frangos de corte, galinha de quintal, RTPCR, nested-RT-PCR.
HERVAL EFG. Seroepidemiology and Characterization of Infectious Bronchitis Virus
in Broilers and Backyard Chicken from Bahia, Brazil. Salvador, Bahia, 2011. 93p.
Dissertation (Master of Science in Tropical Veterinary Medicine) - School of Veterinary
Medicine, Federal University of Bahia, 2011.
ABSTRACT
The Infectious Bronchitis of Chickens (BIG) is a highly contagious disease caused by a
coronavirus that generates negative economic impact on the poultry industry worldwide.
Serum samples of broilers at slaughter age with (FCcR) and no description of
respiratory problems (FCsR) and backyard chickens four months to three years with
(AFQcR) and without respiratory problems (AFQsR) originated from the poultry center
of Bahia, were analyzed by ELISA for titration of antibodies to Avian Bronchitis Virus
(VBIG) and its molecular detection by RT-PCR and nested-PCR. The frequency of
birds with antibody titers in VBIG FCcR, FCsR, AFQcR and AFQsR were respectively
70.45%, 69.96%, 86.11% and 85.51%. Lots of birds vaccinated against VBIG, FCcR
and FCsR groups showed a wide variation in serological titers being respectively
80.95% and 70.73% of the samples over the range of coefficient of variation (CV) of
60%. This irregular pattern of immune response is probably related to individual
variation, failures in the application of vaccination and possibly infection with field
virus. The high frequency of positive serological reactions in AFQ, unvaccinated,
indicates the high endemicity VBIG this system of production. Massachusetts serotype
was identified, H120, five FC properties and two AFQ properties. These data suggest
that backyard chickens can be reservoirs of this virus, making the risk of infection to
commercial breeding chickens. Other studies should be conducted to better understand
the circulation of the agent in backyard poultry background, since this was the pioneer
in the state of Bahia.
Key-words: Infectious Bronchitis, ELISA, broilers, backyard chickens, RT-PCR,
nested-RT-PCR.
15
1 INTRODUÇÃO
A Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG) está amplamente disseminada em todos os
continentes. O agente etiológico desta enfermidade é um Coronavírus que se replica
inicialmente no tecido epitelial do trato respiratório superior, podendo ter tropismo para
outro tecidos, de acordo com o sorotipo a que pertence, e causar lesões que prejudicam
o desempenho dos órgão afetados e consequentemente a saúde e o desempenho
produtivo das aves domésticas (CAVANAGH & Naqi, 2003; CAVANAGH, 2007). A
BIG é considerada endêmica no Brasil com prevalências que chegam até a 85,42% em
frangos de corte (SANDRI et al, 2008).
O comprometimento do sistema respiratório, renal e reprodutivo de aves por este agente
ocasiona queda da produção de ovos e de sua qualidade, redução no ganho de peso e
condenação de carcaça, quadros que podem ser agravados por infecções secundárias
causadas por outros vírus ou bactérias (CAVANAGH & Naqi, 2003). Isto representa
perdas significativas e risco para desenvolvimento do setor avícola mundial, o qual está
em constante expansão produtiva.
O Brasil lidera o ranking internacional de exportação de frangos, à frente de países
como EUA, Tailândia e China, apresentando constante crescimento no setor avícola
mundial (FAO, 2009). Somente em 2010, o Brasil produziu 12.230 milhões de
toneladas de carne de frango, tendo um crescimento de 11,38% em relação ao ano
anterior, impulsionado principalmente pelo incremento do consumo de carne de frango
(44,09kg/habitante/ano) e expansão nas exportações. Este resultado o aproximou da
China, segundo maior produtor mundial cuja produção foi de 12.550 milhões de
toneladas. O primeiro lugar é ocupado pelos EUA que teve uma produção de 16.648
milhões de toneladas (UBABEF, 2010).
O nordeste brasileiro vem apresentando destaque na produção do país, sendo a Bahia o
maior produtor de carne de frango dentre os estados que fazem parte da nova fronteira
agrícola brasileira (BA, MA, PI e TO), alcançando em 2009 o alojamento de 107,47
milhões de aves, e um crescimento de 13,3%, bem acima da média nacional de 6,2%.
Os altos índices de desempenho do setor avícola nesse Estado devem-se a instalação de
16
indústrias na região, as quais foram atraídas pelas características edafoclimáticas
regionais e disponibilidade de insumos e grãos que propiciam a criação de frangos
(SEAGRI, 2011).
A manutenção da sanidade de plantéis de aves é imprescindível para a sustentação da
produção avícola. Sabe-se que a avicultura industrial ainda tem como um dos principais
problemas do setor, a ocorrência de enfermidades respiratórias, e que a BIG é
considerada a de maior freqüência nos sistemas intensivos de produção (ZAVALA,
2005; GUTIERREZ-RUIZ et al., 2000).
As técnicas de utilizadas para monitoramento sorológico como o ELISA indireto e as de
biologia molecular tem sido de grande importância no diagnóstico das infecções e
caracterização dos tipos de VBIG. Diversos estudos vêm sendo feitos utilizando o RTPCR padrão, nested ou multiplex baseados nas sequências dos genes que codificam as
glicoproteína S do vírus. O nested-RT-PCR tem sido destaque para diagnosticar
amostras de campo por conta da sua maior sensibilidade e capacidade de detectar o
agente em amostras que possuam diminuta quantidade de RNA alvo.
17
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Definição
Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG) é uma enfermidade aguda de ocorrência
mundial que acomete principalmente galinhas (Gallus gallus) de idades diversas e de
ambos os sexos, e pode induzir sinais clínicos dos mais variados em aves. Embora o
vírus da Bronquite Infecciosa tenha tropismo por diversos órgãos, o principal quadro
desta doença é o respiratório, que pode ser agravado quando há infecção concomitante
com outros patógenos virais e/ou bacterianos no trato respiratório (CAVANAGH &
NAQI, 2003; DI FÄBIO& ROSSINI 2000).
2.2 Histórico e distribuição geográfica
O primeiro diagnóstico da BIG foi feito em 1931 por Shalk e Hawn na Cidade de
Dakota do Norte, EUA, sendo descrita como doença de aves jovens, que ocasionava
sintomatologia respiratória (CAVANAGH & NAQI 2003). A etiologia viral foi
determinada em 1936 por Beach e Schalm (BJILENGA et al., 2004). O impacto da BIG
na produção e qualidade dos ovos de poedeiras comerciais e a promoção do controle
através de vacinação foram inicialmente relatados por Van Roekel e colaboradores no
ano de 1951 (DARBYSHIRE, 1985). Em 1963, Cumming apontou o vírus da Bronquite
Infecciosa (VBIG) como responsável pela síndrome nefrite-nefrose relatada na
Austrália. Desde a sua descoberta, contínuas pesquisas a respeito desta doença e da sua
profilaxia têm sido feitas, no entanto a BIG permanece sendo uma importante causa de
perdas para o setor avícola.
No Brasil, o primeiro relato da BIG foi realizado em 1957 por Hipólito, no Estado de
Minas Gerais. Entretanto, a BIG só veio manifestar-se de forma epizoótica, a partir de
1973, quando a avicultura brasileira passava de artesanal a industrial, com altos índices
de crescimento (DA SILVA, 2003). Ainda em 1973, duas amostras nefropatogênicas do
VBIG foram isoladas pela primeira vez (HIPÓLITO et al., 1973). Em 1979, a vacinação
18
oficial contra este agente foi introduzida com o uso de cepas Massachusetts, H52 e/ou
H120 (ITO, 2006).
Presume-se que até 1989 os isolados de campo do VBIG no Brasil eram classificados
como sorotipo Massachusetts (ITO, 2006). Contudo, diversos estudos vêm sendo
realizados e demonstram a presença de estirpes relacionadas não somente ao sorotipo
Massachusetts, mas a variantes dos outros sorotipos descritos do vírus, ou ainda novos
sorotipos,
isolados
por
diferentes
ferramentas
laboratoriais
a
exemplo
da
vírusneutralização (DI FABIO et al., 2000), de técnicas de biologia molecular, da
análise por enzima de restrição e do sequenciamento parcial do gene S1 (SANTIAGO,
2001).
A enfermidade tem sido mundialmente relatada em aves domésticas, sendo o VBIG
isolado na América do Norte, Europa (CAPUA et al, 1999), América do Sul
(ALVARADO et al., 2005; VILLARREAL et al., 2007a), Ásia (WANG et al, 1996;
LIU et al., 2005), África (EL HOUADFI et al., 1986; MEIR et al., 2004) e Oceania
(CUMMING, 1963; IGNJATOVIC et al, 1996). Corriqueiramente, surtos têm ocorrido
em aves cujos lotes foram vacinados contra a VBIG, apesar da realização da imunização
ser um procedimento rotineiro e de grande importância para o setor avícola (ITO, 2006;
CAVANAGH & NAQI 2003).
A BIG está amplamente disseminada em diversas regiões do Brasil, havendo na
atualidade a descrição de um significativo número de diagnósticos da doença, em
criações avícolas comerciais. Estirpes de campo e novas variantes deste vírus foram
isoladas recentemente em Minas Gerais (SOUZA et al., 2001), no Rio Grande do Sul
(RAUBER et al., 2002), em São Paulo e no Paraná (BRENTANO et al., 2007), e isto
pode estar comprometendo a eficácia do controle da doença no país (MONTASSIER et
al., 2004).
19
2.3 Importância econômica
As inúmeras perdas e elevados custos causados pela Bronquite Infecciosa geram um
impacto econômico negativo sobre a produção do setor avícola mundial e decorrem de
prejuízos advindos pela redução do ganho de peso e conversão alimentar das aves,
aumento de condenação de carcaças durante o abate por aerossaculite, queda da
produção de ovos de poedeiras e matrizes, baixa qualidade interna e externa de ovos,
surgimento de falsas poedeiras em função de atrofia do aparelho reprodutivo,
infertilidade de machos, aumento da suscetibilidade a infecções secundárias e
consequentemente da mortalidade (CAVANAGH & NAQI, 2003).
A Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e a Organização de Alimentos e
Agricultura (FAO) mantêm a BIG em suas listas de doenças transmissíveis de
notificação anual e de importância sócio-econômica. Portanto, a ocorrência de surtos
pode gerar uma imagem negativa da produção de um país no comércio internacional
(OKINO & MONTASSIER, 2006).
2.4 Classificação
2.4.1 Características estruturais
O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG) pertence ao gênero Coronavirus da
família Coronaviridae na ordem Nidovirales (CAVANAGH & NAQI, 2003). Tal
gênero está organizado em três grupos de acordo com suas características genéticas e
antigênicas, sendo o Grupo I e o Grupo II, composto pelos que acometem
principalmente os mamíferos; e o Grupo III, no qual estão inseridos o Coronavirus de
peru (Turkey coronavirus - TCoV), faisão (pheasant coronavirus – PhCoV), pato (Duke
coronavirus - DCoV), pombo (Pigeon coronavirus - PCoV), ganso (Goose coronavirus GCoV), e o VBIG (CAVANAGH, 2005; CAVANAGH, 2007). O VBI difere das
espécies de coronavirus que acometem mamíferos significatimente, tanto na estrutura
genômica quanto na antigenicidade, mas possui estreita relação com os Coronavirus de
20
perus (Turkey coronavirus –TcoV) e de faisões (pheasant coronavirus - PhCoV)
(CAVANAGH et al., 2002).
O Coronavírus é um vírus envelopado que tem 120nm de diâmetro, de genoma
constituído de RNA de fita simples, não segmentado e sentido positivo, com tamanho
entre 27.4 e 31 kb (CAVANAGH & NAQI, 2003). VBI possui um genoma que codifica
as quatro proteínas estruturais: a glicoproteina S (spike), a glicoproteína de membrana
(M) pesando 23kDa, a proteína de nucleocapsídio (N) com peso de 45 kDa e a proteína
de envelope (E) uma pequena proteína importante auxiliar da proteína M na montagem
do vírus (BOURSNELL, 1987; CAVANAGH, 2005), sendo que os genes responsáveis
pela codificação das três primeiras (S, M, N), estão inserido em 8kb na porção
3´terminal do genoma ( LAUDE et al, 1995). A proteína N tem papel importante na
replicação viral, montagem e imunidade, atuando como sequência de RNA guia na
síntese do RNAm viral e também como uma liga para o RNA viral formando um
nucleocapsídio helicoidal. (IGNJATOVIC et al., 2006; LAUDE et al, 1995).
A proteína S é um peplômero, consistindo em um múltiplo de duas ou três cópias das
subunidades S1 (92 kDa) e S2 (84 kDa), que são glicoproteínas. A S2 é uma estrutura
altamente conservada, presente em Coronavírus de várias espécies. A Proteína S liga-se
aos receptores celulares causando adsorção a célula-alvo do hospedeiro (CAVANAGH
& NAQI, 2003) e é responsável pela indução da neutralização de anticorpos, sendo a
parte mais variável da S1, a mais importante neste processo de indução. Estas referidas
regiões hipervariáveis (Hypervariable regions – HVRs) têm sido identificadas na região
dos primeiros 395 aminoácidos da subunidade S1 e consistem na HVR1, HVR2 e
HVR3, localizados dentro da sequência de aminoácidos 38-67, 91-141, e 274-387,
respectivamente (ALVARADO et al., 2005; CAVANAGH, 2005; WANG & HUANG,
2000). A proteína S, também influi no tropismo celular do Coronavírus (CASAIS et al.,
2003).
O genoma do VBI codifica ainda cinco proteínas acessórias não estruturais, que embora
não sejam necessárias para a replicação in vitro, podem ter um papel na patogênese do
vírus, são elas : 3ª, 3b, 3c, 5a, e 5b (CASAIS et al., 2005). O final 5’ e 3’ do genoma
apresentam uma região não codificada (unstranslated region – UTR) (SAWICKI et al.,
2007). A organização geral do genoma tem a sequência apresentada na Figura 1.
21
Figura 1. Organização do gene do VBI (Adaptado de CAVANAGH, 2005).
2.4.2 Classificação de estirpes
A classificação das estirpes do VBI pode ser feita para a identificação do sorotipo, a
partir de técnicas sorológicas como Vírus-Neutralização ou uso de anticorpos
monoclonais contra a proteína S; para a identificação do genótipo a partir de técnicas
baseadas nas sequências de nucleotídeos do isolado comparado com amostras de
referência (DE WIT, 2000, FARSANG et al., 2002); ou ainda, para a identificação do
patotipo, em função da capacidade de uma amostra do VBIG causar lesão em dado tipo
célula ou tecido (CAVANAGH & NAQI, 2003).
2.4.2.1 Sorotipo
Há mais de 50 sorotipos de VBIG descritos mundialmente desde o primeiro isolamento
do vírus (CAVANAGH & NAQI, 2003; LEE & JACKWOOD, 2000). O número de
sorotipos existentes mundialmente é desconhecido, porém mais de 50 sorotipos foram
descritos (IGNAJATOVIC & SAPATS, 2000). Dentre os sorotipos do VBI
identificados, estão o Massachusetts (Mass), Beaudette, Connecticut, Arkansas, Gray e
Holte, Holland (H), CR84 e CR88, sendo que são relatadas mais freqüentemente as
ocorrências de surtos por H42, Massachussets 41, Connecticut, Iowa 97, Iowa 609 e
JMK (TREVISOL & BRENTANO, 2006; PICAULT et al., 2004; DI FÁBIO &
ROSSINI, 2000).
Os sorotipos do VBI são determinados de acordo com as características da glicoproteína
S, codificada pela fração mais variável do genoma, mais especificamente S1, e cuja
diversidade permite o escape aos anticorpos neutralizantes vacinais. Alterações na
22
antigenicidade e tropismo a tecido de estirpes de VBI tem sido atribuídas à alta
variabilidade e ocorrência de mutações na sequência S1(QUINN et al., 2005);
CAVANAGH & NAQI, 2003). Sendo assim, aqueles vírus que compartilham epítopos
comuns entre si na glicoproteína S pertencem ao mesmo sorotipo.
Embora a glicoproteína S1, usualmente, sirva como suporte dos testes de diagnósticos
voltados para a identificação e caracterização das amostras virais (CAVANAGH &
NAQI, 2003; SANTIAGO et al., 1999), pesquisas vem sendo desenvolvidas tendo
como foco o gene N, uma vez que mutações, inserções e deleções também podem
ocorrer neste, permitindo que surjam novos sorotipos (IGNJATOVIC et al., 2006; LEE
& JACKWOOD, 2000).
Além da alta propensão à mutação inerente ao RNA genômico, o uso contínuo de
vacinas vivas atenuadas e de vacinas múltiplas formuladas com diferentes estirpes de
VBIG e a circulação do vírus em populações de pássaros imunes podem ser
responsáveis pelo surgimento de novos sorotipos variantes, ocasionando surtos mesmo
em aves vacinadas (IGNJATOVIC et al., 2006; CAVANAGH, 2005). Portanto, novos
sorotipos podem surgir a partir da interação de diferentes vírus circulantes em um
mesmo hospedeiro (TREVISOL & BRENTANO, 2006).
Existem poucos estudos epidemiológicos no Brasil, que possam inferir sobre as
características antigênicas dos sorotipos de VBIG circulantes no país (SOUZA et al.,
2001). Contudo este quadro tende a se modificar com o incremento de linhas de
pesquisa voltadas para o VBIG.
2.4.2.2 Genotipos
As características genéticas do genoma ou de parte dele são usadas na determinação e
classificação das estirpes de VBIG quanto ao genótipo. A informação acerca do genoma
é objetiva e disponibiliza dados essenciais para estudos epidemiológicos, no entanto a
campo, quando relacionados à função biológica do vírus ou a sua antigenicidade, estes
23
não são plenamente obtidos através da genotipagem, uma vez que esta técnica volta-se
para informações da estrutura primária da proteína, enquanto que as estruturas,
secundária e terciária, são de grande importância na determinação da função biológica e
da antigenicidade viral (DE WIT, 2000).
Os genótipos podem ser determinados por diversas técnicas de biologia molecular, cujo
alvo é uma parte genótipo-específica do genoma viral, que normalmente é uma região
do gene da proteína S (BOCHKOV et al., 2006; JACKWOOD et al., 2007), gene da
proteína M (REN X et al., 2009), do gene N (FARSANG et al., 2002; DOMAŃSKABLICHARZ et al., 2009) ou ainda da região conservada UTR (ADZHAR et al., 1996,
SAWICKI et al., 2007).
2.4.2.3 Patótipos
A classificação quanto ao patótipo está associada ao tropismo e às lesões causadas pelo
vírus, desta maneira as amostras de VBIG podem ser classificadas em patótipo
respiratório, com alterações diversas neste sistema; patótipo renal, cujas cepas são ditas
nefropatogênicas
(MEIR,
2004);
patótipo
entérico,
composto
por
cepas
enteropatogênicas (AMBALI & JONES, 1990; VILLARREAL et al., 2007a). Há ainda
cepas, que acometem o trato reprodutivo de fêmeas e machos (CAVANAGH & NAQI,
2003; BOLTZ et al., 2004; VILLARREAL et al., 2006), e relacionadas à miopatia
muscular peitoral (YU et al., 2001).
2.4.2.4 Protectotipo
Os protectotipos são classificados a partir de técnicas de diagnóstico que consideram a
função biológica do vírus, de forma que cepas que induzem proteção a outra pertencem
ao mesmo protectotipo (DE WIT, 2000). Os VBIGs de diferentes genotipos e sorotipos
possuem não somente diferentes epitopos, como também epitopos comuns de grande
24
importância na imunidade cruzada (CAVANAGH et al., 1997) e na resposta imune
mediada por célula (BOOTS et al., 1992).
As técnicas empregadas para a determinação do protectotipo são consideradas
laboriosas, caras e requerem condições para isolamento viral além de um grande
número de animas, a exemplo do Estudo de Imunização cruzada (CIS-cross-imunization
study) (GELB et al., 1991; COOK et al., 1999). Uma técnica in vitro tem sido usada
como alternativa de menor custo em relação a anterior trata-se do teste de imunização
cruzada (CIT) com emprego de culturas de células de anéis traqueais (TOC)
(DHINAKAR & JONES, 1996).
2.5 Replicação
A S1 é responsável pela adsorção do vírus à célula alvo. Ao penetrar na célula, a
replicação do VBIG ocorre no citoplasma e a elaboração das suas partículas virais no
Retículo Endoplasmático Rugoso e no Complexo de Golgi da célula. Os vírions
produzidos são liberados por exocitose, de maneira que não ocorre a lise celular, em um
período médio de incubação de 18 à 36h (CAVANAGH & NAQI, 2003). Apesar da
replicação do VBIG, geralmente, iniciar-se nas células epiteliais ciliadas da mucosa do
sistema respiratório, ela pode ocorrer em outros tecidos, sendo observadas lesões na
superfície epitelial da traquéia, rins, testículos, oviduto e trato intestinal, a depender do
sorotipo (CHEN et al., 1996; CAVANAGH, 2003; DHINAKAR & JONES, 1997;
PEREIRA et al., 2006).
2.6 Epidemiologia
2.6.1 Espécies susceptíveis
25
O Vírus da Bronquite Infecciosa acomete aves da espécie Gallus gallus (galinhas),
independente de sexo e idade (CAVANAGH & NAQI, 2003) sendo considerado
espécie específico (CAVANAGH et al., 2003).
A ocorrência de BIG, causada por coronavirus, vem sendo relatada em outras espécies
de aves como peru (Meleagris gallopavo) (GERLACH, 1994; GUY et al., 2000;
CAVANAGH et al., 2001), faisão (Phasianus colchicus) (CAVANAGH et al., 2002),
pavão (Pavo cristatus), cerceta (Anas crecca) (LIU et al., 2005), galinha-D’angola
(Numida meleagridis), em avestruzes, psitaciformes e pombos (GERLACH, 1994).
Isolados de pombos mostraram similaridade genética com o VBIG que acomete
galinhas também na Austrália (BARR et al., 1988). No Brasil, o VBIG foi isolado em
galinha-d’angola (MIYAJI, 1996) e em codornas japonesas (Coturnix japonica) (DI
FABIO et al., 2000). Foi descrito o primeiro caso de soropositividade para VBIG em
pingüins (Eudyptes chrysocomes) (KARESK et al., 1999).
2.6.2 Transmissão
A transmissão do VBIG dá-se entre as aves por meio de contato direto ou indireto, não
necessitando de vetores para sua disseminação. Sendo assim, a ave infectada pode
transmiti-lo à outra saudável por aerossol, muco, secreção conjuntival e, ou, nasal
excretadas, consumo de alimentos ou água contaminados por secreções ou fezes, ou
ainda através de fômites (CAVANAGH & NAQI, 2003). A transmissão do vírus
também pode ocorrer a partir de aves vacinadas com vacinas vivas para aves não
imunizadas e destas para outras não vacinadas (reação de rolagem) ocasionando um
processo respiratório (PENA et al., 2005). O vírus pode ser transmitido pelas aves
portadoras por até 2 meses após a infecção, sendo que as mesmas permanecem
susceptíveis a nova infecção por outro sorotipo (DI FABIO & ROSSINI, 2000).
As fezes constituem-se em uma via de disseminação com amplo período de eliminação
viável do vírus VBIG, cujo isolamento foi possível 20 semanas após infecção (KING &
CAVANAGH, 1992; DI FABIO & ROSSINI, 2000).
26
2.6.3 Patogenia
A patogenia do Vírus da Bronquite Infecciosa é variável devido aos diferentes
tropismos (CAVANAGH & NAQI, 2003). Porém o trato respiratório superior é o sítio
inicial de replicação do vírus, o qual após uma viremia dissemina-se rapidamente para
diversos tecidos e órgãos (DHINAKAR & JONES, 1997).
A mortalidade e morbidade das aves acometidas podem depender da estirpe do vírus,
idade das aves, estado imunológico e ocorrência de infecções bacterianas secundárias
ou co-infecção por outros agentes virais. Dentre os diversos patógenos respiratórios que
podem ocasionar o agravamento do quadro estão o Mycoplasma gallisepticum,
Escherichia coli, Haemophillus paragallinarum, vírus da Doença de Newcastle e vírus
da Doença de Gumboro (CAVANAGH & NAQI, 2003). Aves mais jovens apresentam
quadros mais severos da doença, sendo que em aves adultas são diminuídos os índices
de mortalidade e aumentados índices de lesões renais e no oviduto (CAVANAGH &
NAQI, 2003; DI FÄBIO & ROSSINI 2000).
2.6.4 Sinais clínicos
As manifestações clínicas variam de acordo com o amplo e diversificado tropismo
apresentado pelas diversas cepas do vírus (DHINAKAR & JONES, 1997). Em quadros
respiratórios pode-se observar dificuldade respiratória, estertores, “ronqueira”, tosse e
secreções nasais, que podem ser considerados como característicos após a replicação do
VBIG, mas não são patognomônicos (MENDONÇA et al., 2009).
Em aves jovens observa-se letargia e sintomas respiratórios como descarga nasal,
lacrimejamento, exsudato catarral ou mucoso na traquéia que tendem a desaparecer
entre 10 a 15 dias, se não estiverem presentes infecções secundárias (CAVANAGH &
NAQI, 2003). Além de outros sinais, os frangos de corte apresentam redução no
crescimento, consumo alimentar e ganho de peso, inviabilizando a produção
(SANTIAGO et al., 1999).
27
Matrizes ou aves de postura infectadas podem apresentar declínio na produção e,
posteriormente, alteração do formato, diminuição do tamanho, da qualidade interna e
externa do ovo, o qual passa a apresentar uma casca fina, amolecida, porosa ou
despigmentada (SHANE, 2005).
Foi proposto que o VBI tem papel importante na promoção de Distúrbios entéricos,
ocasionando diarréias severas nas aves infectadas (DHINAKAR & JONES, 1997;
VILLARREAL et al., 2007a).
O vírus foi isolado em testículos de galos apresentando baixa fertilidade, sendo ainda
sugerida uma maior investigação para determinação de sua correlação como
responsável pelo problema (VILLAREAL et al., 2007b).
2.6.5 Lesões anatomopatológicas e microscópicas
O vírus da Bronquite infecciosa das Galinhas causa lesões na traquéia de aves
infectadas, ao acometer as células ciliadas da mucosa do aparelho respiratório
(CAVANAGH & NAQI, 2003). São observadas descamação das células epiteliais e das
secretoras de muco (CHOUSALKAR et al., 2009) do trato respiratório. Opacidade e
exsudato caseoso amarelado podem ser observado nos sacos aéreos acometidos
(DHINAKAR & JONES, 1997), bem como aerossacultite e pneumonia em casos de
coinfecção por Escherichia coli (DWARS et al., 2009).
Dependendo da estirpe responsável pela infecção, também são observadas lesões no
aparelho reprodutivo e urinário das aves, causando nefrite aguda ou crônica
(CAVANAGH & NAQI, 2003; DI FÄBIO & ROSSINI, 2000). Quando o trato urinário
é acometido, pode-se observar aumento da assimetria e peso renal, flacidez e palidez
dos rins, túbulos e ureteres distendidos e com deposição de uratos (CHEN et al., 1996).
Além disso, na nefrite intersticial ductotubular, observa-se degeneração granular,
vacuolização e descamação do epitélio tubular com infiltrado de heterófilos no
interstício durante a fase aguda da doença (DWARS et al., 2009). Uma nova variante
nefropatogênica foi descrita em Israel, recentemente (MEIR et al., 2004). Segundo Di
28
Fábio & Buitrago (2009), muitas aves continuam a ser produtivas se, ao menos, metade
da massa renal permanecer funcional.
O comprometimento do sistema reprodutivo de aves de postura ocasiona uma redução
na produção de ovos e, dependendo da porção em que se encontram as células do
oviduto lesionadas pelo vírus (CHOUSALKAR et al., 2009), pode ocorrer uma perda da
qualidade externa dos ovos, a exemplo da diminuição do tamanho ou deformações da
casca (DHINAKAR & JONES, 1997; SANTOS et al., 2005) ou perda da qualidade
interna, uma vez que uma hipoplasia glandular, leva a uma redução na síntese de
proteínas no albúmen - em destaque a ovomucina e lisozima (MENDONÇA et al.,
2009). Aves acometidas antes de duas semanas de idade podem apresentar
subdesenvolvimento do aparelho reprodutivo (DHINAKAR & JONES, 1997), sendo
tidas como “falsas poedeiras”, exercendo pressão negativa sobre os índices de
produtividade de lotes comerciais.
O VBIG pode causar lesões no epitélio ciliar dos ductos eferentes dos testículos e no
epidídimo, havendo presença de cálculos e comprometimento da produção e da
viabilidade espermática (VILLARREAL et al., 2007b). Em casos de litíase
epididimária, a atrofia dos testículos, leva a retenção de sêmen e baixo nível de
testosterona. Baixos índices de fertilidade tem sido uma queixa constante e preocupante
para o setor avícola na atualidade (ROCHA JR. et al., 2009).
Miopatia nos músculos peitorais, caracterizadas pelo inchaço e palidez, além da
presença de hemorragias faciais na superfície muscular, tem sido correlacionada com a
cepa 793B do VBI e da variante 4/91 (VILLARREAL et al., 2007a; COOK et al., 1996;
DHINAKAR & JONES, 1996). Este processo provavelmente decorre da deposição de
complexos imunes nas paredes dos vasos capilares dos músculos, tendo o vírus uma
relação indireta com essas lesões (DHINAKAR & JONES, 1997).
2.7 Imunologia
29
A reposta humoral e a mediada por célula são importantes para o controle da infecção
por VBIG, por isso injúrias que levem à imunossupressão das aves torna-as susceptíveis
a BIG e demais doenças respiratórias (CATANI et al., 2000).
A produção local de anticorpos para proteção da mucosa óculo-nasal das aves é
garantida principalmente pela glândula de Harder, pequeno órgão linfóide localizado na
fossa orbital, (DHINAKAR & JONES, 1997) e a nível sistêmico, pelo timo (VAN
GINKEL et al., 2008). A glândula de Harder contém grande concentração de
plasmócitos e possui importante papel na resposta vacinal, uma vez que, a maioria das
vacinas comerciais é administrada via ocular ou por spray (SANTIAGO et al., 1999). O
VBIG tem sido isolado em outro órgão linfóide, a Bursa de Fabrícius (EL-HOUADFI et
al., 1986; AMBALI & JONES, 1990).
A proteção imune passiva, via anticorpos maternos, principalmente por IgY (similar a
IgG, só que presente no ovo), transmitida pela matriz aos pintos através do ovo, garante
a resposta aos desafios externo nos estágios iniciais de vida (CARON, 2010).
As imunoglobulinas produzidas em resposta à exposição ao VBIG são a IgM, IgA, IgG.
A IgA presente 5 dias após contato com o agente, está associada à proteção local dos
tecidos, principalmente na mucosa ocular, intestino e trato respiratório da aves. A IgM
aparece após 4-5 dias depois da exposição ao vírus e desaparece entre 10 a 12 dias. A
IgG, também é detectada após 5 dias de infecção, atingindo o pico entre 21 e 25 dias,
com conseguinte redução gradativa de titulação (MOCKETT & DARBYSHIRE, 1981;
BUTCHER & MILES, 1991).
A resposta humoral foi avaliada em aves que receberam duas doses de vacinas vivas,
via ocular, e vacina inativada oleosa na 17a semana, sendo detectados anticorpos IgM
contra VBIG entre quatro e 20 dias após aplicação de vacina viva, e entre seis a nove
dias após a vacina inativada oleosa (MARTINS et al., 1991).
A ativação da resposta imune inata está associada à ação de interferon-gama, como
resultado de ação de macrófagos, citocinas e outros fatores que desencadeiam a
proteção por células adjacentes e facilitam a ativação e migração de linfócitos T aos
sítios de desafio (GUO et al., 2008). Dentre as citocinas liberadas por linfócitos, as de
30
maior importância são a Interleucina-2 (IL-2) e interferon gama (IFN-γ), sendo esta
última a mais estudada em relação ao VBIG (DHINAKAR & JONES, 1997).
Quanto à resposta imune protetora, a atuação das células T-citotóxicas na resposta à
infecção
por
VBIG em
aves
está
estreitamente
ligada
ao
complexo
de
histocompatibilidade maior (MHC) - que se liga ao epitopo do antígeno e o apresenta ao
linfócito-T - e a lise mediada por populações de linfócitos-T CD8+ e CD4-, em um
processo correlacionado com a redução da infecção inicial e dos sinais clínicos
(COLLISSON et al., 2000; CAVANAGH, 2007).
A resposta imune humoral e a mediada por células são balanceadas durante uma
infecção natural. No entanto, após a vacinação, diversos fatores podem exercer pressão
de seleção sobre o vírus, a exemplo de tipo de cepa vacinal, idade da ave, expressão de
MHC-I e MHC-II e níveis de CD4 e CD8 (ZINKERNAGEL, 2003).
A resposta específica ao VBIG, ou seja, a presença de anticorpos ou linfócitos–T
citotóxicos, está associada à integridade da Bursa de Fabrícius e do Timo das aves na
maturidade sexual. Portanto, fatores que afetem o desenvolvimento desses órgãos
comprometem a resposta imune por toda a vida da ave (VAN GINKEL et al., 2008).
2.8 Diagnóstico
O diagnóstico de infecções pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas pode ser
realizado direta ou indiretamente, por detecção de parte do vírus ou pela resposta
sorológica anticorpo específica, através de diversas técnicas (DE WIT et al., 2000),
permitindo que, de acordo com suas características e viabilidade, a presença do VBIG
seja investigada em plantéis através de técnicas como: triagem sorológica, avaliações
histopatológicas, atividade ciliar da traquéia, provas de potencial de desafio e, mais
precisamente, por isolamento e sorotipagem da cepa causal (CARDOSO et al., 2001;
MUÑIZ et al., 2000). O diagnostico rápido do VBI é um ponto critico para o controle da
doença que exerce grande impacto na indústria avícola (CALLISON et al., 2006).
31
2.8.1 Diagnóstico clínico
A inexistência de sinais clínicos patognomônicos para a Bronquite infecciosa, assim
como a ocorrência de quadros subclínicos e atípicos, faz com que seja necessário o
emprego de técnicas apropriadas que permitam, em tempo hábil, o diagnóstico da
presença do VBIG em aves infectadas (ASSAYAG JR. et al., 2004). Portanto, os sinais
e o histórico clínico servem como norteadores para a realização de diagnósticos diretos
ou indiretos do agente em questão.
2.8.2 Diagnóstico sorológico
O diagnóstico sorológico de infecções por VBIG tem sido utilizado como uma
alternativa mais rápida para monitoramento de lotes comerciais e definição de medidas
de biossegurança (CARDOSO et al., 2001; MUÑIZ et al., 2000). A infecção por VBI é
sorologicamente detectada em aves pela demonstração de soroconversão usando pares
de soros ou pela presença de Imunoglobulina M (IgM) específica para VBI (DE WIT et
al., 2000). A detecção dos anticorpos no soro dos animais infectados é possível a partir
de uma semana após a exposição ao vírus, podendo perdurar por 20 a 90 dias. Sendo
assim, a ocorrência de resultados negativos pode ser atribuída ao fato de aves não
apresentarem anticorpos circulantes no momento da colheita ou não ter dado tempo de
iniciar a resposta humoral (DI FÁBIO & ROSSINI, 2000).
A resposta imune contra VBIG vem sendo determinada através do uso de provas
sorológicas como o teste de vírus-neutralização (VN), ELISA indireto (ELISA - I) e
teste da inibição da hemaglutinação (IH) (COOK et al., 1987; CAPUA et al., 1999). No
caso de aves imunizadas, a realização dessas técnicas após a imunização permite a
avaliação de programas de vacinação e concomitantemente a elaboração de estratégias
de controle da doença (CARDOSO et al., 2001; MUÑIZ et al., 2000).
A vírus-neutralização (VN) é a técnica convencional para diagnóstico sorológico do
VBIG em aves (GELB JR. et al., 1991), e tem sido realizada através do uso de meios
como ovos embrionados (GELB JR et al., 1991; DAVELAAR et al., 1984), cultura de
células (OTSUKI et al., 1979) ou culturas de células de anéis traqueais (TOC)
32
(DHINAKAR RAJ & JONES, 1996; COOK et al., 1999; WANG et al., 1997). No
entanto, a VN é pouco usada na rotina laboratorial por ser considerada onerosa e de
difícil execução, pois requer o uso de cultivo celular (DE WIT et al., 2000; DI FABIO
& ROSSINI, 2000).
A técnica de Inibição da Hemaglutinação (IH) permite tanto o sorodiagnóstico quanto a
identificação sorológica do vírus (COOK et al., 1987; CAPUA et al., 1999). A proteína
S possui capacidade hemaglutinante em alguns coronavirus, mas não é o caso do VBIG
(CHARLTON, 1996). Por isso, a realização da IH requer tratamento do vírus com a
fosfolipase tipo C, para a exposição das hemaglutininas (DI FÁBIO & ROSSINI, 2000).
Seu emprego também é considerado laborioso, mas o seu pouco uso está associado à
difícil padronização e alta probabilidade de ocorrência de reações cruzadas dos
anticorpos presentes nos soros das aves (DI FÁBIO & ROSSINI, 2000).
O uso de ELISA para detecção de anticorpos contra o VBI foi relatado por Garcia &
Bankowski (1981). Trata-se da técnica amplamente usada para monitoramento de
desafios de campo de grandes plantéis comerciais, que ao detectar imunoglobulinas IgM
e IgG ainda na primeira semana após infecção ou vacinação, constitui-se em um
indicador de imunidade humoral, permitindo uma análise da resposta pós-vacinal e de
infecção em aves adultas vacinadas (DE WIT et al., 1997; CAVANAGH & NAQI,
2003). Os testes ELISA têm diversas vantagens sobre outros testes de diagnóstico,
dentre elas o seu alto limiar de detecção e por ser uma ferramenta quantitativa e de fácil
aplicação. Possui vantagem comparável aos radioimunoensaios, uma vez que estes têm
limitações relacionadas ao uso de radioatividade (VIDAL & RAZIA, 2006).
Diversos tipos de ELISA vêm sendo desenvolvidos a exemplo do que usa a lectina
Concanavalina A (Com A) no sistema ELISA competitivo (C-ELISA), que foi
elaborado como proposta de método alternativo para a detecção de anticorpos contra o
VBIG (SAKAI et al., 2000). No entanto, o uso de ELISA indireto através de kits
comerciais tem sido amplamente empregado como rotina de monitoramento sorológico
de plantéis comerciais para VBIG permitindo detectar falhas na vacinação, a qualidade
das vacinas e a eficiência do programa vacinal (CARDOSO et al., 2001; SOUZA &
MARTINS et al., 2001).
33
2.8.3 Isolamento viral
O VBIG pode ser isolado a partir de diversos tecidos ou órgãos - traquéia, pulmão, rins,
oviduto e tonsilas cecais - ou ainda, de swabs de traquéia ou de orofaringe
(JACKWOOD et al., 1997; CAVANAGH & NAQI, 2003). Todas as cepas do VBIG
podem ser isoladas do trato respiratório, com a maior concentração do vírus na traquéia
durante os primeiros 3 a 5 dias após a infecção (p.i.). Após este período, o título de vírus
cai rapidamente na segunda semana pós-infecção abaixo do nível de detecção. (DE WIT
et al., 2000).
Os sistemas biológicos usados para isolamento do VBIG são ovos embrionados livres
de patógenos específicos (SPF), cultura celular e cultivo de anéis de traqueia de aves
(TOC) (EPIPHANIO et al., 2002). Entretanto, é necessário o uso combinado de uma
técnica de detecção do VBIG, pois o vírus não causa lesões específicas nos tecidos
(McMARTIM, 1993).
O uso de ovos embrionados SPF permite uma boa replicação do VBIG, sendo que o
pico de concentração de vírus no fluido alantóico encontra-se nos 2 primeiros dias após
a inoculação nos ovos (DARBYSHIRE, 1975). Ao exame do embrião podem-se
visualizar alterações morfológicas, tais como: nanismo, enrolamento, depósito de uratos
nos mesonefrons e morte do mesmo (DI FABIO & ROSSINI, 2000).
A realização de várias passagens em ovos embrionados pode permitir um aumento na
concentração viral antes da realização de métodos para detecção do agente favorecendo
o processo (DE WIT, 2000). Portanto, a série de passagens confere uma adaptação a
algumas amostras de VBIG, tornando a replicação viral e o efeito citopático mais
efetivos (GILLETTE, 1973). Alta sensibilidade para amostras de VBIG adaptadas foi
observada em células de rins de embriões de pintos (CEK) e células de rins de galinhas
(BHATTACHARJEE & JONES, 1997; LUKERT, 1965, 1966; OTSUKI et al., 1979).
2.8.4 Diagnóstico direto
34
O isolamento viral através do uso de anéis traqueais (TOC) tem sido usado com
freqüência por não requerer adaptação das amostras virais para uma boa replicação e
indução da cilioestase (OTSUKI et al., 1990; EPIPHANIO et al., 2002). Além disso, o
isolamento, a titulação e a sorotipagem são bem sucedidos quando o TOC é obtido a
partir de embriões de 20 dias de idade (COOK, 1984). Alguns autores não recomendam
o uso de outros tecidos, além do trato respiratório, para o cultivo de órgãos por
apresentarem baixa sensibilidade (DHINAKAR RAJ & JONES, 1996).
O VBIG pode ser diretamente detectado mediante o uso de anticorpos monoclonais
(Mab), que reagem com um único ou poucos epítopos específicos do vírus (KOCH et
al., 1986) e desta forma dependendo do tipo de Mab, pode ser sugerido que uma mostra
não seja de VBIG ou de determinado sorotipo (CAVANAGH et al., 1998). Outra
maneira de detectar o agente é usando antissoro específico, obtido de um animal
infectado com VBIG, que pode ser empregado como base em outros testes e apresentar
reação direta contra diversos epítopos virais por conter anticorpos policlonais (DE WIT,
2000).
Técnicas de imunohistoquímica (IHC) com anticorpo poli ou monoclonal ou por
hibridização “in situ” auxiliada por sondas de oligonucleotídeos podem detectar
diretamente o VBIG em tecido de aves infectadas (COLISSON et al., 1990).
O teste de precipitação em Ágar-Gel (AGPT) apresenta bons resultados quando são
utilizados vários antissoros ou quando é usado um antissoro com concentrações
diferentes para evitar ocorrência de falso negativo em função do desequilíbrio da
relação antígeno-antissoro (LOHR, 1981). Esta técnica pode ser empregada na detecção
direta do IBV em diferentes órgãos, a exemplo de traquéia (LOHR, 1981) ou ainda na
detecção do VBIG em fluido alantóide de ovos inoculados (GELB et al., 1981).
O teste de imunoflurescência pode ser empregado na detecção de VBIG em ovos
embrionados, cultura de células e TOC, utilizando soro com anticorpos policlonais ou
anticorpos monoclonais (DE WIT et al., 1995).
35
O VBIG pode ser capturado por anticorpos específicos através da técnica ELISA direto
e apresenta melhores resultados em fluido alantóico, se comparado diretamente em
outros tecidos (KOCH et al., 1991; CAVANAGH et al., 1992; NAQI et al., 1993).
2.8.4.1 Diagnóstico molecular
O VBI pode ser detectado por diferentes técnicas que permitem determinar a presença
de todo ou parte do genoma deste agente. Essas técnicas, em geral, são realizadas após a
replicação do vírus e conversão do RNA genômico em cópia de DNA (c-DNA) com
multiplicação do produto, através da técnica de reação em cadeia de polimerase
antecipada pela transcrição reversa pela (RT-PCR). Tal produto pode ser identificado
por RT-PCR com iniciadores específicos (KEELER et al., 1998), sequenciamento de
genes (ANDREASEN et al., 1991; KINGHAM et al., 2000), polimorfismo do
comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) (LIN et al., 1991; KOWN et al., 1993;
CALLISON et al., 2001; MONTASSIER et al., 2008; BOUROGÂA et al., 2009) ou
hibridização (JAKWOOD et al., 1992; KOWN et al., 1993).
A PCR auxilia estudos de caracterização e epidemiologia molecular, através do uso de
primers para amplificação de genes que codificam, por exemplo, a proteína S. Porém o
uso de primers voltados para regiões conservadas agiliza o processo de detecção do
agente quando está em pequena quantidade na amostra (KWON et al., 1993). A técnica
de reação em cadeia de polimerase antecipada pela trancripitase reversa (RT-PCR) tem
sido empregada na identificação de genótipos isolados de VBIG, como um meio rápido,
sensível e específico em adição à técnica de PCR (BOUROGÂA et al., 2009; DI
FABIO & ROSSINI, 2000; JACKWOOD et al., 1992).
As técnicas moleculares vêm sendo aprimoradas e a exemplo uma TaqMan® baseada
em RT-PCR em tempo real foi desenvolvida para detecção do RNA viral do VBIG
diretamente de amostras clínicas, como swab traqueal (CALLISON et al., 2006).
Autores têm referido ainda ao uso da Técnica Multiplex RT-PCR para detectar diversos
genótipos em uma única reação. Tendo múltiplas sequências-alvo, ela gera produtos de
tamanhos diversos a partir do uso de primers específicos para cada genótipo (CAPUA et
al., 1999).
36
A técnica de nested-PCR ou semi-nested PCR é atualmente utilizada com sucesso na
detecção de agentes, mesmo quando o ácido nucleico viral está presente em mínimas
quantidades nos materias de colheita (JACKWOOD et al., 1992). Fundamentada em
uma dupla reação de amplificação, a nested-PCR permite o incremento da sensibilidade
e especificidade do teste (GAMBLE et. al., 1997; FALCONE et al., 1997;
CAVANAGH et al., 1999), apresentando destaque quando comparada a outras técnicas
(DOMAŃSKA-BLICHARZ et al., 2009).
A nested-PCR propicia a sorotipagem das amostras de VBIG quando são utilizados
iniciadores sorotipo-específicos (ROUSSAN et al., 2008; BOUROGÂA et al., 2009;
OKINO et al., 2005). Tem como vantagem identificar o genótipo/sorotipo, não havendo
necessidade de isolamento viral em ovos embrionados ou em cultivos celulares,
viabilizando de maneira positiva o tempo para identificação do agente (CAVANAGH et
al., 1998). O RNA de alguns vírus pode ser detectado, através desta técnica, por 5
semanas enquanto outros por apenas um curto período (CAVANAGH et al. 1998).
2.9 Prevenção e controle
O controle da BIG é um dos mais desafiadores se comparado entre outras doenças
infecciosas avícolas, principalmente por conta do aparecimento ou introdução de novos
sorotipos variantes que impactam sobre a avicultura global, um fator que requer
atenção, pois se sabe que vírus de diferentes tipos podem co-circular dentro de uma
região (CAPUA et al., 1999; LIU et al., 2006) e em muitos países a descoberta e
caracterização de sorotipos nativos são alvos de trabalhos recentes (VILLEGAS, 1997;
BIJLENGA et al., 2004).
Na avicultura industrial mundial, o controle da BIG tem sido feito, com relativo
sucesso, pela combinação de medidas básicas de biosseguridade, que incluem
programas de vacinação que devem ser desenvolvidos de acordo com a região ou país
(PENA, 2005). Tais medidas básicas de biosseguridade incluem o isolamento de aves
doentes; quarentena de aves provenientes de outros plantéis; limpeza e desinfecção de
todo o aviário, no sistema "all-in-all-out"; lotes com idade única; controle de trânsito de
veículos, com entrada e saída no sentido de áreas não infectadas para áreas infectadas;
37
controle do fluxo de pessoas, exigindo-se banhos e indumentária adequados, vazio
sanitário e apresentação de registro sanitário de lotes (MORETTI, 2002; PENA, 2005).
As medidas de controle da BIG são estabelecidas com a adoção de estratégias de
biosseguridade, diagnóstico rápido da infecção pelo vírus e determinação da resposta
imunológica em plantéis de aves de criações industriais (GILBERTONI et al., 2006). O
monitoramento dos plantéis, feito com periodicidade confere maior segurança e controle
preventivo e, usualmente, vem sendo feito através do teste ELISA.
Dados apontam que o plantel de frango de corte brasileiro encontra-se imunizado contra
a BIG em cerca de 80% (JAENISCH, 2003), refletindo a priorização do processo de
imunização das aves através da vacinação, como medida principal de controle da
enfermidade no Brasil. Os programas de controle e vacinação do país devem ser
estabelecidos de acordo com a prevalência da doença, a gravidade dos desafios e as
normas vigentes do Serviço Oficial de Sanidade Animal do Ministério da Agricultura
Pecuária e Abastecimento (MAPA), que configuram critérios norteadores do processo.
Diversas vacinas efetivas estão disponíveis e são empregadas pela indústria avícola
mundial (WANG et al., 1996). Porém no Brasil apenas o sorotipo Massachusetts possui
autorização dos órgãos oficiais, principalmente o ministério da Agricultura pecuária e
Abastecimento - MAPA, para ser usada em vacinais que veiculam o antígeno vivo
(BERNARDINO, 2004). O sorotipo Massachusetts (Mass) é usado rotineiramente na
vacinação de lotes de aves comerciais, através de vacina viva atenuada contendo as
cepas H50 e H120 (CAVANAGH & NAQI, 2003).
As vacinas vivas atenuadas proporcionam uma melhor resposta imunológica local no
trato respiratório das aves (BIJLENGA et al., 2004). Sua administração pode ser feita de
maneira individual, mas preferencialmente é realizada em massa por conta da
praticidade e viabilidade, via aspersão (spray) ou em água de bebida (JAENISCH, 2003;
BACK, 2003). Geralmente as vacinas vivas atenuadas são aplicadas em frangos de corte
ainda com um dia de vida, no incubatório, com o objetivo de reduzir a desuniformidade
da resposta imune vacinal que ocorre quando a vacinação é feita nas granjas avícolas
(CAVANAGH, 2007). Contudo, o emprego deste tipo de vacina deve ser feito com
38
cautela, por representar riscos de virulência ou contaminação residuais (JAENISCH,
2003).
Apesar de a vacinação ser a principal medida de controle da BIG, apresenta-se limitada
pelo fato de diferentes sorotipos não conferirem proteção cruzada na maioria dos casos
(CALLINSON et al., 2006), o que também ocorre com certas cepas do sorotipo Mass,
consideradas por alguns autores como detentoras da capacidade de conferir proteção
cruzada por ser semelhantes aos vírus de campo (BORNE & COMTE, 2003). Essa
baixa proteção cruzada é responsável pela ocorrência de surtos, mesmo com o uso de
vacinas sorotipo- específicas (LIU et al., 2006), somando-se a isso a tendência do vírus
realizar frequentes mutações (WANG et al., 1996) que levam ao surgimento de novas
variantes e a introdução destas na avicultura de determinadas regiões (SANTOS et al.,
2005). Daí a necessidade de se fazer uma detecção rápida e acurada do VBIG em um
lote infectado para que o programa vacinal seja ajustado de maneira mais adequada a
fim de conferir proteção de um lote subsequente em certa granja (CALLINSON et al.,
2006).
São também usadas na vacinação de aves, cepas patogênicas inativadas para melhor
estimular a resposta imune via linfócitos-T auxiliares (ISHIZUKA, 2006). O uso de
vacinas inativadas requer uma sensibilização prévia com vacinas vivas, pois embora
sejam utilizadas para manter a integridade do aparelho reprodutor de lotes de aves
poedeiras ou matrizes, elas não conferem proteção contra infecção das vias respiratórias
superiores e são raramente usadas em frangos de corte (DI FABIO & ROSSINI, 2000).
Essas vacinas garantem uma boa titulação por longos períodos, além da transferência de
anticorpos maternos para os pintos (BACK, 2003).
Para haver êxito na proteção das aves contra o desafio do VBIG, além de ser essencial
identificar os sorotipos prevalentes na região e determinar o potencial de proteção
cruzada das vacinas disponíveis utilizadas pelas granjas comerciais (BUTCHER &
SHAPIRO, 2005) é fundamental que sejam executadas medidas para restringir a
introdução de cepas de VBIG exóticas, com apoio dos órgãos oficiais (IGNJATOVIC et
al., 2000). Possivelmente, o conhecimento inadequado das estirpes presentes nas regiões
do Brasil ainda é uma das principais causas da ocorrência de surtos no país, algo
preocupante, uma vez que uma significante variabilidade genética foi encontrada em
39
amostras de VBIG brasileiros isolados de campo, em estudo recente, a partir da análise
do gene da proteína S1 (MONTASSIER et al., 2008).
Os programas de biosseguridade desenvolvidos e adotados pela indústria avícola,
baseados no monitoramento sorológico, têm sido construídos paralelamente com a
preocupação das empresas do setor com a presença de animais silvestres e criações
informais que para eles representam fontes de infecção do VBIG (THRUSFIELD, 1986;
BERCHIERI JUNIOR, 1997).
Faz-se necessária a investigação do VBIG em frangos de corte e em aves de quintal na
região do pólo avícola da Bahia, pois ela vem apresentando ascensão no mercado
interno brasileiro e contribuindo para o setor de exportação de carne de frango do país.
Diante da importância do controle e necessidade de conhecimento sobre esta
enfermidade, diversos estudos e técnicas vêm sendo desenvolvidas para diagnóstico do
Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas. O presente trabalho propôs-se a verificar a
frequência do VBIG em amostras de soro de Frangos de corte e aves de fundo de
quintal oriundas do pólo avícola da Bahia, além de detectar e caracterizar as amostras
isoladas a partir de pool de swab de tráqueia submetidos a RT-PCR e multiplex nestedRT-PCR.
40
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo geral
Identificar a presença da Bronquite Infecciosa das galinhas em população de frangos de
corte e de galinha de quintal no pólo avícola da Bahia.
3.2 Objetivos específicos
·
Avaliar anticorpos específicos para o vírus da BIG em aves comerciais
vacinadas e em aves de criação caipira, não vacinadas, no pólo avícola do
Estado da Bahia.
·
Identificar genotipos virais através da Bronquite Infeciosa das galinhas pela
metodologia de Trancriptase Reversa através da Reação em Cadeia da
Polimerase, (RT-PCR) e nested- PCR, em amostras de swab traqueal.
41
4 ARTIGOS CIENTÍFICOS
4.1 Detecção de anticorpos contra o vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas em
frangos de corte e aves de fundo de quintal na região de Feira de Santana, Bahia,
Brasil
Antibodies detection against the infectious bronchitis virus in broilers and village
chicken from Bahia, Brazil
HERVAL, Elen Fabiane Guimarães 1; SALES, Tatiane Santana1; de Lima, Jamille
Machado¹; SILVA, Priscila Sousa da1; MAIA, Paulo César Costa²; FERNANDES, Lia
Fernandes2.
1
Universidade Federal da Bahia, UFBA, Escola de Medicina Veterinária, Laboratório de
Sanidade Avícola da Bahia-LASAB, Via de acesso Prof. Lia Muniz Barretto Fernandes, s/n
CEP 41720-010, Salvador, Bahia, Brasil. E-mail: [email protected]
RESUMO
Amostras de soro de frangos de corte em idade de abate com (FCcR) e sem descrição
de problemas respiratórios (FCsR) e de aves de fundo de quintal de quatro meses a três
anos de idade com (AFQcR) e sem problemas respiratórios (AFQsR), oriundas do pólo
avícola da Bahia, foram analisadas por meio de ELISA indireto para titulação de
anticorpos contra o Vírus da Bronquite Aviária (VBIG). A freqüência de aves com
títulos de anticorpos contra VBIG em FCcR, FCsR, AFQcR e AFQsR foram,
respectivamente, 70,45%, 69,96%, 86,11% e 85,51%. Os lotes de aves vacinadas contra
VBIG dos grupos FCcR e FCsR apresentaram uma grande variação nos títulos
sorológicos estando respectivamente, 80,95% e 70,73% das amostras acima da faixa de
coeficiente de variação (CV) de 60%. Esse padrão irregular da resposta imune
provavelmente esta relacionado à variação individual, falhas na aplicação da vacinação
e possivelmente a infecção com vírus de campo. A alta freqüência de reações
sorológicas positivas em AFQ, não vacinadas, indica elevada endemia do VBIG nesse
42
sistema de produção. Portanto, há necessidade de monitoramento dessa infecção para
evitar possíveis surtos e prejuízos aos produtores avícolas.
Palavras-chaves: Bronquite Infecciosa das Galinhas, ELISA, frangos de corte, galinhas
de quintal.
ABSTRACT
Serum samples from broilers at slaughter age with (FCcR) and without description of
respiratory problems (FCsR) and from backyard chickens aging four months to three
years old with (AFQcR) and without respiratory problems (AFQsR) originated from the
poultry production area of Bahia, were analyzed by ELISA for titration of antibodies to
Avian Infectious Bronchitis Virus (IBV). The frequency of birds with antibody titers
against IBV in FCcR, FCsR, and AFQcR AFQsR were respectively 70.45%, 69.96%,
86.11% and 85.51%. Lots of birds vaccinated against IBV, FCcR and FCsRS groups
showed a wide variation in serological titers being respectively 80.95% and 70.73% of
the samples over the range of coefficient of variation (CV) of 60%. This irregular
pattern of immune response is probably related to individual variation, failures in the
application of vaccine and possibly infection with field virus. The high frequency of
positive serological reactions in AFQ, unvaccinated, indicates the high endemicity
VBIG this system of production. Furthermore is necessary to maintain the monitoring
of this infection in order to prevent possible outbreaks and damage to poultry farmers.
Key-words: Infectious Bronchitis, ELISA, broilers, backyard chickens.
INTRODUÇÃO
A Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG) é uma das enfermidades respiratórias que
ocasionam perdas econômicas significativas na avicultura mundial. Desde sua
descoberta em 1931 por SHALK & HAWN na Cidade de Dakota do Norte, EUA
(CAVANAGH & NAQI, 2003), a ocorrência de infecção e altas prevalências têm sido
descritas em diversos continentes, América do Norte, Europa (CAPUA et al., 1994),
América do Sul (ALVARADO et al., 2005; VILLARREAL et al., 2007), Ásia (WANG
43
et al., 1996; LIU et al., 2005), África (EL HOUADFI et al., 1986; MEIR et al., 2004) e
Oceania (IGNJATOVIC & ASHTON, 1996). No Brasil, foi descrita pela primeira vez
em 1957 (HIPÓLITO, 1957), e até o presente é uma das principais enfermidades a
causar perdas significativas ao setor avícola do país (DI FÁBIO & ROSSINI 2000).
Segundo a Organização Mundial de Saúde Animal - OIE (2007), 281 surtos ocorreram
neste país no período de 1996 a 2004.
Causada por um Coronavirus da família Coronaviridae, a Bronquite Infecciosa das
Galinhas (BIG) é uma doença de quadro agudo e rápida disseminação, que acomete
aves da espécie Gallus gallus. A BIG lesa tecidos do trato respiratório superior, do
sistema reprodutivo e urinário, afeta a produtividade e qualidade de ovos, a conversão
alimentar das aves e o rendimento de carcaça ao abate. Esta enfermidade predispõe a
alterações decorrentes de infecções secundárias (NAQI et al., 2003; DI FÄBIO &
ROSSINI 2000).
O controle e a prevenção da BIG no Brasil são realizados com programas vacinais com
o uso da cepa Massachusetts, a única autorizada para imunização pelos órgãos oficiais
(CARDOSO et al., 2006; BERNARDINO, 2004). Mesmo assim há vários relatos de
surtos em aves vacinadas, o que pode ser atribuído às falhas na vacinação ou a uma
possível existência de outros sorotipos ou amostras variantes (CAPUA et al., 1994).
As medidas de controle da BIG poderão ser mais eficientes caso haja monitoramento
sorológico desta enfermidade. O teste de ELISA indireto tem sido amplamente utilizado
para determinar os níveis de anticorpos específicos contra o Vírus da Bronquite
Infecciosa das Galinhas (VBIG) (CARDOSO et al., 2001; CARDOSO et al., 2006), por
possibilitar o monitoramento da resposta à vacinação (IGNJATOVIC & SAPATS,
2000), e auxiliar as investigações soroepidemiológicas devido a sua elevada precisão
(SOARES, 2001).
Há poucos dados na literatura mundial sobre a investigação de anticorpos em aves de
fundo de quintal (HERNANDES-DIVERS et al., 2006, ORIGLIA et al., 2009) e no
Brasil tem sido fortalecido o direcionamento de estudos para investigar a BIG nessas
aves (SANTOS et al., 2008).
44
O objetivo desse estudo foi detectar os títulos de anticorpos específicos contra o vírus
da Bronquite Infecciosa das galinhas, através de um kit comercial de ELISA indireto em
soros de frangos de corte e de aves de fundo de quintal (AFQ), no pólo avícola da
Bahia, servindo como subsídio para avaliação das estratégias de prevenção e controle da
enfermidade.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras
Para o estudo sorológico foram utilizadas 1602 amostras de soro de aves coletadas no
período de junho de 2005 a dezembro de 2007, oriundas de propriedades que possuem
sistema de produção comercial de frango de corte (FC) e de pequenas propriedades de
aves de fundo de quintal (AFQ), localizadas no pólo avícola do Estado da Bahia, em
torno da cidade de Feira de Santana. As amostras foram coletadas e agrupadas da
seguinte forma:
Frangos de Corte (FC): Aves imunizadas com vacina viva atenuada contra Bronquite
Infecciosa das Galinhas, sorotipo Massachusetts, em dose única com um dia de idade,
através de spray. Os soros de FC foram obtidos de aves em idade de abate de 40 dias,
sendo agrupados 749 soros de frangos de corte sem problemas respiratórios (FCsR),
provenientes de 41 lotes; e 423 soros de frangos de corte com problemas respiratórios
(FCcR) de 21 lotes;
Aves de fundo de quintal: Aves não vacinadas contra a BIG, segundo os criadores,
tendo quatro meses a três anos de idade. 430 soros de AFQ, sendo 216 soros de aves de
fundo de quintal com problemas respiratórios (AFQcR) coletados em 11 pequenas
propriedades; e 214 soros de aves de fundo de quintal sem problemas respiratórios
(AFQsR) coletados em 14 pequenas propriedades.
ELISA indireto
Os títulos de anticorpos contra VBIG foram obtidos através do teste de ELISA indireto
(kit comercial - IDEXX Laboratories USA), de acordo com recomendações do
fabricante. As amostras de soro foram testadas no Laboratório de Sanidade Avícola da
45
Bahia – LASAB, da Escola de Medicina Veterinária da UFBA. A leitura dos resultados
foi realizada em um espectrofotômetro (Biorad”, EUA, com filtro de 650nm). Os títulos
relativos de anticorpos foram obtidos à partir da Densidade Ótica - DO das amostras
analisadas através do software Flock Chek (IDEXX Laboratories Inc.), que determina o
coeficiente de positividade ou razão S/P (sample/positive).
A análise estatística dos dados foi realizada pelo software Flock Chek (IDEXX
Laboratories Inc.) que determina os valores de títulos individuais, calcula a média
geométrica (GMT) e o Coeficiente de Variação (CV) dos títulos de anticorpos,
determinando a dispersão das respostas sorológicas nos lotes avaliados. Os valores de
coeficientes de variação dos resultados sorológicos dos lotes de aves foram classificados
de acordo com o método de LEERDAM & LÖREN (2003).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A porcentagem de aves soropositivas encontrada nos lotes de FC avaliados neste
trabalho era esperada em função destas aves terem sido vacinadas contra o VBIG. Ao
contrário, não era esperada uma grande variabilidade de título de anticorpos anti-VBIG
nestes lotes, por terem sido submetidos ao mesmo programa de vacinação. Altos
coeficientes de variação de títulos de anticorpos anti-VBIG foi observado nos lotes de
aves (Tab.1).
46
Tabela 1. Frequência de anticorpos anti-Bronquite Infecciosa das Galinhas, coeficiente de variação
de título em lotes de aves de propriedades com sistemas de criação de frangos de corte e
de aves de fundo de quintal do pólo avícola do estado da Bahia, de junho de 2005 a
dezembro de 2007.
Grupos
Percentagem de aves
positivas
Percentagem de
Variação de título
Coeficiente de Variação de títulos
propriedades com individual
aves positivas*
CV< 40%
CV>60%
FCcR
298/423 (70,45%)
21/21 (100%)
9-13624
1/21(4,76%)
17/21(80,95%)
FCsR
524/749 (69,96%)
40/41 (97,56%)
1-18369
2/41(4,88%)
29/41(70,73%)
AFQcR
186/216 (86,11%)
11/11 (100%)
13-18660
4/11(36,36%)
6/11(54,54%)
AFQsR
183/214 (85,51)
14/14 (100%)
1-16230
2/14(14,29%)
10/14(71,43%)
* Presença de uma ou mais aves soropositivas
FCcR - frangos de corte sem problemas respiratórios, FCsR - frangos de corte sem problemas respiratórios, AFQcR aves de quintal com problemas respiratórios, AFQsR - aves de quintal sem problemas respiratórios.
Todos os lotes do grupo de FCcR apresentaram uma ou mais reações sorológicas
positivas, sendo que seis lotes (28,6%) tiveram menos que 50% de aves soropositivas.
Em dez lotes foram observados títulos individuais acima de 5000 (47,61%), dentre os
quais dois lotes apresentaram número significativo de aves com títulos acima de 5000 e
com GMT próximo a este valor, sendo sugestivo de infecção por VBIG (BORNE &
COMTE, 2003). Quanto à média geométrica de título (GMT), quatro lotes (19,0%)
estavam dentro da faixa de GMT a entre 3000 e 5000, e sete lotes (33,3%) tiveram
médias geométricas de títulos abaixo de 500.
No grupo FCsR, onze lotes (26,8%) tiveram menos de 50% de soros positivos em
títulos individuais das aves de seus plantéis, o que pode ser atribuída a uma variação
individual da resposta imune (CAVANAGH & NAQI, 2003). Dezoito lotes (43,9%)
apresentaram aves com títulos individuais acima de 5000. Na avaliação da média
Geométrica (GMT), quinze lotes (36,6%) mostraram-se na faixa até 500 e cinco
(12,2%) acima de 3000. 70,73% dos lotes deste grupo apresentaram elevados
coeficientes de variação (CV > 60%).
47
O percentual de lotes com média geométrica de títulos (dados não mostrados) abaixo de
500 nos lotes FCsR e FCcR, respectivamente, 36,6% e 33,3%, salienta a necessidade de
revisão do plano de vacinação destas aves por estar com valores abaixo do necessário
para conferir proteção adequada aos lotes, ou mesmo investigar a ocorrência de doenças
imunossupressoras. Valores de coeficientes de variação (CV) menores que 40%,
refletem excelente uniformidade da resposta vacinal e superiores a 60%, requerem
melhoria no esquema de vacinação (LEERDAM & LÖHREN, 2003). A maioria dos
lotes de FC apresentou coeficientes de variação acima de 60% (Tabela 1) o que sugere
uma falta de padrão da resposta imune vacinal contra a infecção do VBIG em aves com
títulos de anticorpos abaixo do requerido para conferir proteção. COOK (1997) ressalta
que este alto CV pode ser atribuída a falhas de vacinação, relacionadas ao
armazenamento, aplicação da vacina, presença de cloro na água, e surgimento de novas
estirpes do VBIG. Além disso, a imunidade passiva decorrente dos anticorpos maternos,
em concentrações elevadas, pode neutralizar a primeira imunização prejudicando a
primeira resposta imune ativa contra os antígenos desse vírus, o que interfere na
eficiência da vacinação (CARDOSO et al., 2006; MONDAL & NAQI, 2001).
A elevação de títulos pode ser compatível com desafio do VBIG e foi observada por
SALLES et al. (2003), em 62,5% das empresas e 25% dos lotes avaliados em estudo no
Ceará. WUNDERWALD & HOOP (2002), em monitoramento sorológico de aves
ornamentais, encontraram 73,4% das amostras e 92,5% dos lotes positivos, além de
média de títulos igual a 5.399, com títulos variando de 1 a 22.765.
Todas as propriedades do grupo de aves de fundo de quintal (AFQ) apresentaram ao
menos uma ave soropositiva. Dentre as 25 propriedades avaliadas, apenas duas
apresentaram menos de 70% de soropositividade na criação, e dez propriedades tiveram
100% de animais soropositivos. Ambos os grupos, com (AFQcR) e sem problemas
respiratórios (AFQsR), apresentaram a soropositividade de aves muito próxima,
respectivamente, 86,11% e 85,51%, além de aves com altos títulos individuais de
anticorpos anti-BIG, de até 18660 (Tab.1). Foi observada uma diferença significativa
entre os títulos de anticorpos dos dois grupos, sendo mais expressivo no grupo AFQcR
(sintomático) (Fig.1).
48
A alta frequência de anticorpos encontrada nesse sistema de exploração não era
esperada, pois as aves não foram vacinadas. Os resultados obtidos sugerem a existência
de contato contínuo com o agente e aves assintomáticas com altos títulos de anticorpos,
permitindo inferir que há uma endemia desse vírus no campo. Nossos resultados estão
acima do encontrado no estado do Rio Grande do Sul, onde a prevalência em aves de
fundo de quintal foi de 65% (SANTOS et al., 2008); e são similares aos encontrados no
Equador, onde a prevalência foi de 85% (HERNANDES-DIVERS et al., 2006), na
Nigéria com 84% (OWADE, et al., 2006) e Paraguai, onde apresentou 80% (ORIGLIA
et al., 2009). Investigações acerca de enfermidades como a BIG em aves de fundo de
quintal são raras em todo o mundo. No entanto, outros estudos também relataram uma
alta prevalência de soropositivos nessas aves para VBIG, a exemplo do descrito em
comunidades do estado de Yucatan, México, onde houve soroprevalência de até 97,6%
das aves deste tipo de criação (GUTIERREZ-RUIZ et al., 2000).
CONCLUSÃO
A identificação de grande variação na resposta imune de lotes vacinados contra o
VBIG, na região de Feira de Santana-BA, é uma indicação de que haja falha na
imunização contra VBIG nas granjas estudadas. A elevada freqüência de anticorpos
anti-VBIG em aves de fundo de quintal, sugere o contato destas aves com o agente. Os
resultados apresentados nesse trabalho reforçam a necessidade de conhecimento da
49
situação da doença no Estado e de propagação de planos de controle dessa enfermidade,
para evitar o comprometimento sanitário dos plantéis e de sua produtividade, no Estado
da Bahia.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela concessão de bolsa de mestrado ao primeiro autor e ao Sr. Raimundo
Coutinho Junior pelo apoio na análise estatística dos dados.
REFERÊNCIAS
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BERNARDINO, A. Programas de vacinação. In: MENDES, A.A; NAAS, I.A.;
MACARI, M. (Eds.). Produção de frangos de corte. Campinas: FACTA, 2004. p.179199.
BORNE, P.M.; COMTE, S. Vacinas e vacinação na produção avícola. Gessuli Guias.
São Paulo: Ceva, 2003.140 p.
CAPUA, I.; GOUGH, R.E.; MANCINI, M.; CASACCIA, C.; WEISS, C. A novel
infectious bronchitis strain infecting broiler chickens in Italy. Journal of Veterinary
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53
4.2 Caracterização do vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas em frangos de
corte e aves de fundo de quintal na região de Feira de Santana, Bahia, Brasil
Characterization of Infectious Bronchitis Virus in Broilers and Village Chicken from
Bahia, Brasil
HERVAL, Elen Fabiane Guimarães 1* ; SALES, Tatiane Santana 1 ; GONDIM, Leane
Souza Queiroz ; MAIA, Paulo César Costa3 ; FERNANDES, Lia4 .
1
Médico(a) Veterinário(a) – Pesquisador(a) do Laboratório de Sanidade Avícola da Bahia
da Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, UFBA, Salvador, Bahia,
Brasil.
²Médica Veterinária
³Médico Veterinário – Professor do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Escola
de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador, Bahia, Brasil.
4
Médica Veterinária - Coordenadora do Laboratório de Sanidade Avícola da Bahia, Professora
do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Escola de Medicina Veterinária – UFBA,
Salvador, Bahia, Brasil.
*Endereço para correspondência: [email protected]
RESUMO
A Bronquite Infecciosa das galinhas causa perdas signnificantes ao setor avícola
mundial. Amostras de soro de frangos de corte em idade de abate com descrição de
problemas respiratórios (FCsR) e de aves de fundo de quintal de quatro meses a três
anos de idade com (AFQcR) criadas próximo às propriedades com galpões comerciais,
oriundas do pólo avícola da Bahia, foram analisadas por meio de ELISA indireto para
titulação de anticorpos contra o Vírus da Bronquite Aviária (VBIG) e sua detecção
molecular através de RT-PCR e nested-RT-PCR. Baixos títulos de anticorpos foi
encontrados nos frangos de corte, sendo que 33,33% dos lotes apresentaram títulos
acima de 4000. Todas as criações de aves de fundo de quintal apresentaram elevados
valores de títulos individuais de anticorpos de até 17703. Foi identificado o sorotipo
Massachusetts, H120, em cinco propriedades de FC e em 2 propriedades de AFQ. Esses
54
dados sugerem que as aves de fundo de quintal podem ser reservatórios desse vírus,
podendo haver co-circulação junto à criação comercial de frangos.
Palavras-chave: Bronquite Infecciosa das Galinhas, ELISA, frangos de corte, galinhas
de quintal, RT-PCR.
ABSTRACT
The Infectious bronchitis of chicken significant causes losses to the poultry industry
worldwide. Serum samples of broilers at slaughter age with description of respiratory
problems (FCsR) and backyard poultry (AFQ) at four months to three years of age built
next to commercial properties with sheds, poultry coming from the pole Bahia, were
analyzed by ELISA for titration of antibodies against avian bronchitis virus (VBIG) and
its molecular detection by multiplex nested RT-PCR. Low titers of antibodies was
found in broilers, and 33.33% of the lots had titers higher than 4,000. All poultry farms
backyard showed high levels of antibodies to individual titles up to 17,703.
Massachusetts serotype was identified, H120, in five FC properties and two FQA
properties. These data suggest that backyard birds can be reservoirs of this virus, there
may be co-circulating with the commercial breeding chickens.
Key-words: Infectious Bronchitis, ELISA, broilers, backyard chickens, RT-PCR.
INTRODUÇÃO
A Bronquite Infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença viral aguda com distribuição
mundial e considerada uma enfermidade de importância econômica em decorrência das
perdas que gera a indústria avícola. O vírus acomete principalmente o trato respiratório
das aves, mas também causa lesões nos rins, intestinos e ovidutos (DI FÁBIO &
ROSSINI, 2000).
O setor avícola realiza o monitoramento da BIG em plantéis rotineiramente através do
teste ELISA indireto usado pelo por ser de fácil aplicação e baixo custo (SOARES,
2001). No entanto, a confirmação da detecção do material genético e a determinação do
tipo do vírus podem ser feitas por técnicas baseadas na biologia molecular que possuem
maior acurácia, menor tempo na obtenção de resultados e capacidade de determinar
55
variantes do vírus. O VBIG pode ser identificado por RT-PCR com iniciadores
específicos (KEELER et al., 1998), seqüenciamento de genes (ANDREASEN et al.,
1991; KINGHAM et al., 2000), polimorfismo do comprimento de fragmentos de
restrição (RFLP) do gene S1 (LIN et al., 1991; KWON et al., 1993; CALLISON et al.,
2001; MONTASSIER et al., 2008; BOUROGÂA et al., 2009) ou hibridização
(JAKWOOD et al., 1992; KWON et al., 1993). A objetividade das informações
genéticas obtidas com os diversos métodos de biologia molecular proporciona dados
essenciais para os estudos epidemiológicos (DE WITT et al., 2010) e o nested-RT-PCR,
possui grande destaque por permitir detectar o agente em pequena quantidade de
amostra.
No Brasil diversos estudos vêm sendo realizados para caracterizar as estirpes locais que
acometem frangos de corte, matrizes e poedeiras (DI FÁBIO et al., 2000;
MONTASSIER et al., 2008). No entanto, são raros os relatos sobre investigação da
doença em aves de fundo de quintal (SANTOS et al., 2008).
O presente trabalho teve como objetivo detectar anticorpos contra o vírus da Bronquite
Infecciosa das Galinhas em frangos de corte e aves de fundo de quintal e determinar
qual o VBIG estava circulando entre essas aves por meio de swabs de traquéia através
de multiplex nested-PCR, tipo-específico, na região de Feira de Santana, pólo avícola
da Bahia.
MATERIAL E MÉTODOS
No período de junho de abril de 2008 a março de 2009, nove lotes de Frangos de corte
com problema respiratório (FCcR) foram selecionados, bem como, nove propriedades
de AFQ localizadas a uma distância inferior a 200 metros de cada uma dessas criações
comerciais, para realização de titulação de anticorpos e detecção viral do VBIG.
Amostras de soro e swab foram obtidas concomitantemente e agrupados quanto o
aviário de frango de corte e a criação de aves de fundo de quintal circunvizinha,
identificadas por grupos de A a I.
56
Sorologia - Amostras usadas na avaliação sorológica para seleção de lotes para posterior
investigação viral.
Foram analisadas 450 amostras de soro, 255 obtidas de nove aviários de frango de corte
com problemas respiratórios e 225 amostras de nove criações de aves de fundo de
quintal à menos de 100m de distância do grupo anterior. Em cada lote / propriedade,
foram coletadas 25 amostras de soro.
As amostras de sangue dos frangos de corte e das galinhas de quintal foram coletadas,
através da punção da veia braquial e após a retração do coágulo, os soros foram
transferidos para tubos tipo eppendorf devidamente identificados e mantidos congelados
a -20oC até a avaliação sorológica, realizada no Laboratório de Sanidade Avícola da
Bahia – LASAB, UFBA.
Swabs de traquéia
Foi utilizado um pool de 10 swabs de traquéia de cada lote/propriedade para a extração
do RNA, perfazendo um total de 18 pools de swab de traquéia. Os swabs foram
estocados em temperatura de -20°C até serem encaminhados para processamento no JF
Laboratório (Campinas-SP), onde foi utilizada a técnica Nested RT – PCR para a
detecção viral.
Foram preenchidas fichas com informações sobre o histórico clínico das aves em cada
uma das propriedades de criações comerciais e de fundo de quintal estudadas.
ELISA indireto
Os títulos de anticorpos contra VBIG foram obtidos através do teste de ELISA indireto
(kit comercial - IDEXX Laboratories USA), realizado no Laboratório de Sanidade
Avícola da Bahia – LASAB, da Escola de Medicina Veterinária da UFBA, de acordo
com recomendações do fabricante. A leitura dos resultados foi realizada em um
espectrofotômetro (Biorad”, EUA, com filtro de 650nm). Os títulos
relativos de
anticorpos foram obtidos à partir da DO das amostras analisadas através do software
Flock Chek (IDEXX Laboratories Inc.), que determina o coeficiente de positividade e
calcula o coeficiente acima de 0,2 como amostra positiva pela fórmula:
S/P=
DO da amostra - média DO do controle negativo
DO do controle positivo - DO do controle negativo
57
*DO=Densidade Ótica
Amostras com S/P>0,2 tiveram resultado positivo.
A análise estatística dos dados foi realizada pelo software Flock Chek (IDEXX
Laboratories Inc.) que determina os valores de títulos individuais, calcula a média
geométrica (GMT) e o Coeficiente de Variação (CV) dos títulos de anticorpos,
determinando a dispersão das respostas sorológicas nos lotes avaliados. Os valores de
coeficientes de variação dos resultados sorológicos dos lotes de aves foram classificados
de acordo com o método de Leerdam e Lören (2003).
Extração de RNA
As amostras de swabs traqueais foram colocadas em água MiliQ, e em seguida foram
congeladas e descongeladas três vezes, sendo centrifugadas a 14.000g por 20 minutos.
Após colher o sobrenadante foram adicionados solução GIT, fenol (pH 4,0), acetato de
sódio 2M e B-mercaptoetanol. Em seguida, realizou-se a agitação e adição de solução
de clorofórmio álcool isoamílico, procedendo-se na sequência uma nova centrifugação.
A fase aquosa (sobrenadante) foi transferida para outro tubo contendo isopropanol, para
precipitação de RNA, e centrifugada a 12.000g x 4°C por 15 minutos. Desprezou-se o
sobrenadante e lavou-se o “pellet” com etanol 75%. O RNA foi dissolvido em água
MiliQ e incubado a 56°C por 10 minutos.
RT-PCR e nested -PCR
Detecção do VBIG
Os primers externos UTR41S (5´ATG TCT ATC GCC AGG GAA ATG TC 3´) e
UTR11A ( 5´ GCT CTA ACT CTA TAC TAG CCT A 3´) foram usados na PCR inicial
objetivando amplificar um segmento com 266pb da região não traduzida 3´-UTR,
comum aos vírus da BIG; os primers internos UTR 41S e UTR 31A (5´GGG CGT CCA
AGT GCT GTA CCC 3´) foram usados objetivando a amplificação do produto com
179pb da região 3’UTR (interno ao produto da PCR inicial). Os iniciadores utilizados e
as condições de reação foram realizadas como descrito por Cavanagh et al. (2002). Este
nested-RT-PCR foi realizado em 30 ciclos com um perfil térmico de 94°C por 1min,
48° por 1,5’ e 72°C por 2’.
58
Tipificação de variante do VBIG
Os produtos positivos da reação anterior foram submetidos a uma nova reação de RTPCR utilizando primers oligonucleotídeos específicos para a região hipervariável do
gene S1 e descritos por Capua et al. (1999). Os primers IBVS (5´ YAC TGG YAA TTT
TTC AGA TGG 3´) e IBVAS (5´CWC TAT AAA CAC CYT TRC A 3´) foram usados
na PCR inicial objetivando amplificar um segmento com 458pb.; Depois da primeira
rodada de amplificação do gene S1, os primers IBVNA (5´ CAG ATT GCT TRC AAC
CAC C 3´), 793S (5´AGT AGT TTT GTG TAT AAA YCA 3`), D274S (5´ ATA CAA
TTA TAT CAA ACC AGC 3´) e H120S (5´AAT ACT ACT TTT ACG TTA CAC 3´)
foram usados na multiplex nested-RT-PCR, objetivando a amplificação de fragmento
com 153pb, 217pb e 295pb, respectivamente, sendo referentes aos sorotipos 4/91, D274
e Mass. O multiplex nested-RT-PCR foi realizado em 35 ciclos com um perfil térmico
de desnaturação a 94°C por 1min, anelamento a 55° por 1,5’ e polimerização a 72°C por
2’.
Todas as reações tiveram uma etapa prévia de desnaturação a 94°C por 5 min e
concluída por uma extensão final a 72°C por 10’. Os produtos foram analisados em um
gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio (0,5πg/ml) usando um transiluminador
ultravioleta.
RESULTADO E DISCUSSÂO
Observou-se um pequeno número de aves soropositivas nos lotes de frango de corte
(FC) e com títulos individuais mínimos e máximos com valores discrepantes em cada
lote (Tab.1). Isso pode ser atribuído a diversos fatores que envolvem o manejo da
vacinação até a resposta individual dessas aves.
As aves de fundo de quintal
apresentaram uma alta soropositividade com valores significativamente elevados de até
17703. Isto permite sugerir que estas aves entraram em contato com o vírus de
bronquite Infecciosa e que pode haver endemia desse vírus no campo. Embora haja
poucos estudos sobre a freqüência de anticorpos contra a BIG em aves de fundo de
quintal, alta prevalência tem sido encontrada no Equador, 85% (DIVERS, 2006); no
Paraguai, 80% (ORIGLIA et al., 2009); no México, 97,6% (GUTIERREZ-RUIZ et al.,
59
2000) e na Nigéria com 84% (OWOADE, et al., 2006). No Brasil SANTOS et al.
(2008) encontraram 65% de prevalência em aves de fundo de quintal, no Estado do Rio
Grande do Sul.
Tabela 1 - Distribuição sorológica e caracterização molecular de lotes de frango de corte e de aves de quintal
vizinhas, avaliados em municípios do pólo avícola da Bahia, entre junho de abril de 2008 a março de 2009.
FC
ELISA
Grupo
Município
Títulos
Amostras
individuais
soropositivas
min-máx
AFQ
nested –RT- PCR
Reação
Genotipo
ELISA
Títulos
Amostras
individuais
soropositivas
min-máx
nested – RT- PCR
Reação
Genotipo
A
Conceição da
Feira
267-4614
23/25
Positivo Mass,H120
24-8356
18/25
negativo
B
Conceição da
Feira
1-4757
4/25
Positivo Mass,H120
1408-8226
25/25
Negativo
C
Conceição da
Feira
1-1313
2/25
Positivo Mass,H120
392-8151
24/25
Negativo
D
São Gonçalo
1-653
1/25
Negativo
457-8911
25/25
Negativo
E
São Gonçalo
1-738
1/25
Negativo
69-9370
23/25
Negativo
F
São Gonçalo
1-7625.
6/25
Positivo Mass,H120
80-8304
22/25
Positivo Mass,H120
G
São Gonçalo
4-1097
9/25
Positivo Mass,H120
379-9241
12/25
Positivo Mass,H120
H
Feira de Santana
12-848
5/25
Negativo
150-17703
23/25
Negativo
39-6993
24/25
Negativo
I Feira de Santana
27-1490
10/25
Negativo
FC - frangos de corte, AFQ - aves de fundo de quintal
―
―
―
―
―
―
―
―
―
―
―
O VBIG foi detectado nas amostras de swab de cinco dos nove lotes de frango de corte
testados (55,6%), grupos A, B, C, F e G. Em relação às aves de fundo de quintal, apenas
duas propriedades (22,3%) apresentaram aves positivas para o VBIG através do
multiplex nested-PCR (grupo F e G). Todos os produtos obtidos com a multiplex
nested-PCR foram positivos para o sorotipo Mass, H120. Os resultados referentes à
identificação e caracterização do VBIG em FC e AFQ selecionadas, estão dispostos na
tabela 1.
A detecção do VBIG, cepa Mass H120 nos FC era esperada, pois estas aves foram
vacinadas. No entanto, a detecção de VBIG (Mass H120) em aves de fundo de quintal,
não vacinadas, confirma a presença deste agente em pequenas criações. A detecção de
60
VBIG nas amostras de Swab pode ser decorrente de infecção inicial no trato respiratório
superior, onde o agente replica-se nas células epiteliais e secretoras de muco da traquéia
(DHINAKAR RAJ & JONES, 1997).
Diversas variantes do sorotipo Mass e até mesmos genótipos exclusivamente brasileiros
tem sido isoladas no Brasil (ABREU et al., 2006; MONTASSIER et al., 2006;
VILARREAL et al., 2007). Isolados de surto de BIG, em plantéis de aves vacinadas em
São Paulo, entre 1987 e 1991, tiveram pouca relação sorológica com o sorotipo Mass
(ROCHA, 2000); e dos 15 isolados no período entre 1972 e 1989, em Minas Gerais,
apenas nove pertenciam ao sorotipo Massachusetts (RESENDE, 2003). Os resultados
obtidos em nosso trabalho indicam a presença do sorotipo Mass H120, estirpe vacinal,
na região estudada.
A identificação do sorotipo Mass H120, e a proximidade com as criações comerciais,
pode sugerir que essas tenham adquirido o vírus vacinal através de fômites, uma que
vez pode ocorrer escape do vírus entre lotes e granjas próximas em função de uso
inadequado de vacinas vivas (MENDONÇA et al., 2009), mas isso requer maiores
estudos. Esta hipótese de transmissão do vírus vacinal pode ser considerada de acordo
com estudos que indicaram a transmissão de aves vacinadas para lotes de aves
susceptíveis (FARSANG et al., 2002).
Tendo em vista, a realização de nested-RT-PCR para os tipos Mass, D274 e 4/91, podese concluir que estes dois últimos sorotipos não estavam presentes nas aves analisadas
neste estudo, conforme resultados encontrados.
Medidas de biosseguridade vêm sendo adotadas no setor de indústria avícola, como a
vacinação, havendo a preocupação com a presença de animais silvestres e criações
informais que podem ser consideradas como fontes de infecção de agentes virais. A
presença de sintomas respiratórios nos frangos de corte avaliados pode ter decorrido do
fenômeno de reações de rolagem, no qual há passagem lateral do vírus vacinal para aves
não vacinadas e destas para outras também não vacinadas (PENA et al., 2005), ou ainda
pela ação de agentes imunodepressores.
61
A proximidade entre as propriedades pode ser levada em consideração na propagação
do vírus. O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, órgão Federal
brasileiro, determina a distância mínima de 3 km entre estabelecimentos de reprodução
e criações comerciais ou outros locais de risco sanitário (BRASIL, 2007), o que serve
de parâmetro para perceber a estreita proximidade entre os grupos estudados neste
trabalho.
A produção da criação de aves de fundo de quintal é de grande importância econômica e
social para diversas famílias, principalmente por elas considerarem a criação de mais
fácil manejo e rentável (JUGESSUR et al., 2006), sendo estas razões para que medidas
de controle de enfermidades nessas criações possam ser elaboradas por órgão oficiais
para esse setor.
A determinação do tipo de VBIG presente na região de estudo é de grande importância
sendo necessárias mais pesquisas para isolamento e caracterização do mesmo,
principalmente em função da escassez de dados sobre a condição sanitária das aves de
criação caipira que são de grande importância no meio rural, e fomentada por
programas governamentais.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho demonstram uma elevada resposta sorológica ao
VBIG em aves de fundo de quintal sugerindo contato com o agente. A detecção de
estirpe vacinal, H120, tanto em plantéis de frangos de corte e criações de aves de fundo
de quintal circunvizinhas reforça a necessidade de monitoramento contínuo do vírus
também nestas criações, na região de estudo. A determinação do tipo de VBIG nos dois
tipos de criação é fundamental para o conhecimento da situação da doença no Estado da
Bahia e propagação de planos de controle da enfermidade, evitando assim o
comprometimento sanitário dos plantéis e de sua produtividade.
62
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela concessão de bolsa de mestrado ao primeiro autor, ao JFL laboratório em
Campinas, São Paulo, pelo auxílio na execução de técnicas de biologia molecular.
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5 CONSIDERAÇÕES GERAIS
A frequência de anticorpos contra o vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas (VBIG) foi
determinada, através de ELISA indireto, em frangos de corte e aves de fundo de quintal do
pólo avícola da Bahia. A grande variação na resposta imune de lotes de frango de corte
vacinados contra o VBIG, observada neste estudo, indica uma possível falha na
imunização contra o vírus nas granjas e a elevada freqüência de anticorpos anti-VBIG
em aves de fundo de quintal, sugere que estas aves entraram ou mantém contato
contínuo com o agente.
A nested PCR para Bronquite Infecciosa das Galinhas utilizada neste estudo
possibilitou a identificação do Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas em swabs de
traquéia de frangos de corte vacinados e de aves de fundo de quintal naturalmente
infectadas pelo vírus.
Foi identificado o sorotipo Massachusetts, H120, em frangos de corte vacinados e em
aves de fundo de quintal criadas a menos de 100 metros de distância das propriedades
de criação comercial, demonstrando a circulação do vírus na região avaliada. Mais
estudos devem ser realizados para mensurar o risco de circulação de sorotipos entre
granjas comercias e criações de aves de fundo de quintal, uma vez que estas últimas
podem ser portadores assintomáticos do vírus.
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